CN104027347B

CN104027347B - 甲基-β-环糊精在制备防治BmNPV感染家蚕细胞药物中的应用

Info

Publication number: CN104027347B
Application number: CN201410226494.5A
Authority: CN
Inventors: 黄金山; 郝碧芳; 沈兴家; 程晨; 梁飞
Original assignee: Jiangsu University of Science and Technology
Current assignee: Jiangsu University of Science and Technology
Priority date: 2014-05-26
Filing date: 2014-05-26
Publication date: 2016-05-11
Anticipated expiration: 2034-05-26
Also published as: CN104027347A

Abstract

甲基-β-环糊精在制备防治BmNPV感染家蚕细胞药物中的应用，提供一种以MβCD为有效成分，防治BmNPV入侵细胞的药物。该药物在深入研究病毒入侵机制、杆状病毒感染宿主的受体研究方面有重要意义。当MβCD浓度在8mM以上时能完全抑制病毒感染。本发明在防治脓病的蚕用药物研发及生产中，具有重要的应用推广价值。

Description

甲基-β-环糊精在制备防治BmNPV感染家蚕细胞药物中的应用

技术领域

本发明属于分子生物学与病毒学领域，涉及甲基-β-环糊精(Methyl-β-cyclodextrin，简称MβCD，也有表示为MBCD，Me-βCD，MeBCD)在制备防治BmNPV感染家蚕细胞药物中的应用。

背景技术

家蚕血液型脓病是养蚕业三大病毒病中危害最为严重的一种病害，其传染性极强，近年来养蚕生产中较为普遍发生，并不时发生部分农户或一定养蚕区域内绝产的情况。血液型脓病是由家蚕核型多角体病毒(Bombyxmorinucleopolyhedrovirus，BmNPV)引起的，该病毒属杆状病毒科、核型多角体病毒属，是一种具有囊膜、双链DNA病毒，它在病毒复制过程中会形成两种病毒粒子，即包涵体来源病毒粒子与芽生病毒粒子，前者随着食物进入家蚕中肠感染部分中肠细胞，被感染中肠细胞会产生大量芽生病毒粒子，新生的芽生病毒粒子进而感染其它组织导致细胞裂解，虫体最终死亡。病蚕、蛹、蛾的尸体、脓汁及被之污染的蚕粪、蚕具、蚕茧，带有大量的病毒，具有强烈的传染性，是血液型脓病的主要的传染源。

目前主要是通过抗血液型脓病家蚕品种的培育以及严格消毒、良桑饱食以提高蚕体抵抗性能来预防该病的发生。

在抗病育种方面，江苏科技大学蚕业研究所育种专家通过长期的杂交选育，培育出有高度抵抗性实用品种“华康2号”[徐安英，林昌麒，钱荷英，孙平江，张月华，刘明珠，李龙.耐家蚕核型多角体病毒病蚕品种“华康2号”的育成.蚕业科学，2013，(39)2：275-282]；转基因抗性育种近几年也取得一定的进展，已有学者将抗病毒蛋白在家蚕中肠内过量表达，或者利用RNAi技术抑制病毒基因表达，[1.JiangL.，etal.，ResistancetoBombyxmorinucleopolyhedrovirusviaoverexpressionofanendogenousantiviralgeneintransgenicsilkworms.ArchVirol，2012.157(7)：1323-8.2.Isobe，R.，etal.，UseofRNAitechnologytoconferenhancedresistancetoBmNPVontransgenicsilkworms.ArchVirol，2004.149(10)：1931-40.]，但由于转基因操作复杂、低效性导致研究困难，而且转基因的品种后代不稳定性都限制了其在实际生产应用。传统的抗病育种周期很长，并且目前生产上蚕农饲养的经济性状良好的一代杂交种的血液型脓病的抗性很弱，家蚕的BmNPV抗性品种培育在近期难于满足实际生产的需求，还需加强对抗性品种培育的遗传学、基因组学尤其是抗性相关基因与经济性状相关基因间的相关关系的研究，提高抗NPV品种的经济性状和实用价值。

生产上主要是通过加强养蚕前严格的消毒尽量杜绝BmNPV的感染，消毒剂主要成分是氯制剂，但该类消毒剂的强腐蚀性、酸碱度和溶解性一直是困扰其发展的问题；还有一些复合氯制剂，溶解性得到了一定的改善，复合后溶液的消毒效果和强碱性的稳定性又有减弱；生产上还有使用甲醛熏蒸蚕具、蚕室达到预防的效果，但是无论碱性消毒剂还是甲醛，都有强的刺激性，因此，在生产上通过使用治疗药物，解决家蚕血液型脓病的流行和暴发问题是蚕农或部分技术人员非常迫切的期望，已有试验研究证明B-丙内酯等化学物品对家蚕BmNPV感染后的发病具有明显的抑制效果[吕鸿声.昆虫病毒与昆虫病毒病[M].北京：科学出版社，1982，405-407]，我们前期大量实验结果表明：MβCD可以防治BmNPV入侵家蚕细胞，病毒感染细胞过程包括吸附、进入、复制以及病毒粒子包装及释放[GeorgeFRohrmann.BaculovirusMolecularBiology：ThirdEdition.2013：Bethesda(MD)]，所以病毒进入宿主细胞是病毒感染的关键起始点，如果能够限制病毒的入侵，则可以在源头上防治家蚕脓病的发生，达到防治的效果。目前MβCD应用于病毒及BmNPV防治方面尚无专利和文献报道。

发明内容

解决的技术问题：本发明提供一种化学药物-MβCD的新用途，可应用于防治BmNPV感染家蚕细胞，另一目的是提供使用MβCD用于防治BmNPV感染家蚕细胞的合适浓度。

技术方案：甲基-β-环糊精在制备防治BmNPV感染家蚕细胞药物中的应用。

防治BmNPV感染家蚕细胞的药物，有效成分为甲基-β-环糊精。

具体防治方法为：

1.MβCD对携带egfp报告基因的BmNPV感染的防治

(1)用1×PBS溶解MβCD，配制浓度为38mM的储存液。

(2)分别在35mm细胞培养皿中接种约10⁵个/皿的细胞，贴壁后，用配制好的MβCD储存液加入合细胞培养液贴壁细胞中，使终浓度分别为4mM-20mM，孵育10-120min，孵育细胞温度为20-29℃，以0mMMβCD(即等体积1×PBS)孵育液作为对照。

(3)孵育后，分别去除1×PBS和不同浓度的MβCD孵育液，用无血清的TC-100培养基轻轻冲洗细胞2次，分别用MOI＝10携带绿色荧光蛋白基因的BmNPV病毒感染细胞，27℃感染1h后，用无血清的TC-100培养基轻洗2遍，放置于27℃培养箱培养，培养6h。

2.防治效果的观察与统计分析

6小时后，细胞培养皿放置于激光共聚焦显微镜观察绿色荧光蛋白表达，并统计有荧光表达的细胞数量及总细胞数，T测验分析不同浓度MβCD孵育细胞后，防治病毒入侵细胞的效率。

有益效果：提供一种以MβCD为有效成分，防治BmNPV入侵细胞的药物。该药物在深入研究病毒入侵机制、杆状病毒感染宿主的受体研究方面有重要意义。当MβCD浓度在8mM以上时能完全抑制病毒感染。本发明在防治脓病的蚕用药物研发及生产中，具有重要的应用推广价值。

附图说明

图1是携带绿色荧光蛋白基因的BmNPV重组病毒BmBac-egfp示意图：

BmBacJS13是一株与BmNPV具有相同感染特性的Bacmid[HuangJSetal.ConstructionoftheBac-to-BacSystemofBombyxmoriNucleopolyhedroviru.VirologicaSinica.2007，22(3)：218-225]。为了便于观察及统计本专利所述的防治效果，将hsp70操纵下的报告基因egfp转座到BmBacJS13的Tn7转座插入位点，命名BmBac-egfp，提取DNA，转染家蚕细胞，收获出芽病毒后，继续用于感染家蚕细胞，荧光显微镜下观察到强烈的绿色荧光，70小时后收获病毒，终点稀释法测定病毒滴度。

图2是利用不同浓度MβCD处理细胞后病毒感染细胞荧光图：

细胞培养皿中预先接种约10⁵家蚕细胞，分别用不同浓度MβCD孵育细胞30min后，对照细胞加入相应剂量1×PBS，用MOI＝10携带绿色荧光蛋白基因的BmNPV病毒感染1h，用无血清TC100培养基洗三遍，27℃正常培养，感染后6小时候观察细胞荧光。

图3是不同浓度MβCD处理后细胞感染病毒百分率比较图：

细胞培养皿中预先接种约10⁵BmN细胞，分别用3种不同浓度MβCD处理30min后，对照细胞加入相应剂量1×PBS，用MOI＝10携带绿色荧光蛋白基因的BmNPV感染1h，用无血清TC100培养基洗两遍，27℃正常培养，感染后6小时候观察细胞荧光变化，计算细胞被感染百分率，台酚蓝细胞染色计算细胞存活率，图中数据为三次重复结果。

具体实施方式

实施例1

1.携带egfp报告基因的BmNPV的构建

将hsp70-egfp片段克隆至pFastBacDual(Invitrogen)的BamHI(Takara)和NotI(Takara)位点，构建供体质粒pFastBacDual-hsp70-egfp，通过转座获得BmBac-egfp(示意图见图1)，将BmBac-egfpDNA转染BmN(家蚕卵巢细胞)细胞后，在荧光显微镜下可观察到绿色荧光表达。将其细胞上清用于感染BmN细胞，感染72小时后收获病毒，用终点稀释法测定病毒滴度，病毒4℃冰箱避光保存。

2.细胞的接种及MβCD(Sigma)的储存液配制

(1)分别在35mm的细胞培养皿(Corning)中各接种约10⁵BmN细胞每个细胞皿中合2mL的10％FBS的TC100昆虫细胞培养基。

(2)27℃培养约12h-24h，待细胞贴壁后，用于以下实验。

(3)MβCD(Sigma)的储存液配制

用1×PBS配制浓度为38mM的MβCD储存液。

3.当MβCD的终浓度为0mM，即对照组细胞，携带egfp报告基因的BmNPV对细胞感染效率

(1)取各接种好10⁵细胞的3个培养皿，每个细胞皿中合2mL的10％FBS的TC100昆虫细胞培养基。移去旧的培养基，分别加入210.4μL1×PBS与789.6μL10％FBS的TC100培养基，27℃培养30min，移去合PBS的培养基，用无血清的TC100培养基洗2遍，轻轻晃动，每次3min。

(2)细胞冲洗完成后，去除冲洗液，加入MOI＝10的BmBac-egfp病毒，感染细胞27℃1h。

(3)1h后，用无血清的TC100培养基洗两遍，轻轻晃动，每次3min，去除冲洗液，加入2mL10％FBS的TC100培养基，27℃培养6h。

(4)6h后，将3个皿放置于荧光共聚焦显微镜(LeicaSP8)，观察绿色荧光蛋白表达情况见图2左上(对照组)，并统计带有荧光的细胞数量。

实施例2

MβCD的终浓度为4mM时，对携带egfp报告基因的BmNPV感染的防治：

(1)取各接种好10⁵细胞的3个培养皿，移去旧的培养基，在3个细胞培养皿中分别加入105.2μLMβCD储存溶液和894.8μL10％FBS的TC100培养基，使培养皿中MβCD的终浓度为4mM，27℃培养30min，移去合有MβCD的培养基，用无血清的TC100培养基洗2遍，轻轻晃动，每次3min。

(4)6h后，将3个皿放置于荧光共聚焦显微镜(LeicaSP8)，观察绿色荧光蛋白的表达(见图2右上)，统计带有荧光的细胞数量，并运用T测验和对照组细胞荧光做比较见图3。结果显示4mMMβCD处理细胞时，BmNPV的感染细胞比率仅为对照的69％。

实施例3

MβCD的终浓度为6mM时，对携带egfp报告基因的BmNPV感染的防治：

(1)取各接种好10⁵细胞的3个培养皿，移去旧的培养基，在3个细胞培养皿中分别加入157.8μLMβCD储存溶液和842.2μL10％FBS的TC100培养基，使培养皿中MβCD的终浓度为6mM，27℃培养30min，移去合有MβCD的培养基，用无血清的TC100培养基洗两遍，轻轻晃动，每次3min。

(3)感染1h后，用无血清的TC100培养基洗两遍，轻轻晃动，每次3min，去除冲洗液，加入2mL10％FBS的TC100培养基，27℃培养6h。

(4)6h后，将3个皿放置于荧光共聚焦显微镜(LeicaSP8)，观察绿色荧光蛋白的表达(见图2左下)，并统计带有荧光的细胞数量，并运用T测验和对照组细胞荧光做比较见图3。结果显示6mMMβCD处理细胞时，BmNPV感染的细胞效率仅为对照4.8％。

实施例4

MβCD的终浓度为8mM时，对携带egfp报告基因的BmNPV感染的防治：

(1)取各接种好105细胞的3个培养皿，移去旧的培养基，在3个细胞培养皿中分别加入210.4μLMβCD储存溶液与789.6μL10％FBS的TC100培养基，使培养皿中MβCD的终浓度为8mM，27℃培养30min，移去合有MβCD的培养基，用无血清的TC100培养基洗两遍，轻轻晃动，每次3min。

(4)6h后，将3个皿放置于荧光共聚焦显微镜(LeicaSP8)，观察绿色荧光蛋白的表达(见图2右下)，并统计带有荧光的细胞数量，运用T测验和对照组细胞荧光做比较见图3。结果显示8mMMβCD处理细胞时，无荧光表达，表明BmNPV的感染完全被抑制了。

最后应当说明的是：以上所述的实施例和实施方式所述的MβCD浓度和处理时间仅用于说明性目的而非限制，但本领域的普通技术人员应当理解，在细胞状态或者细胞培养基理化性质比如酸碱度等等微小的差异，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围，并被包括在本申请的精神和范围之内。

Claims

1.甲基-β-环糊精在制备防治BmNPV感染家蚕细胞药物中的应用。