CN109364053B - 一种小分子化合物在制备抗家蚕杆状病毒感染药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种小分子化合物在制备抗家蚕杆状病毒感染药物中的应用。本发明所涉及的小分子化合物的获得基于主流的分子对接技术，针对家蚕杆状病毒必须的核心基因，利用虚拟建模技术获得其三维结构，分子对接筛选小分子数据库，对所获的小分子化合物进行活性检测，最终获得了本发明中具有有效效果的小分子化合物。当所述小分子化合物使用终浓度在1μg/mL以上时能够完全抑制BmNPV的复制，并且在BmNPV完成对细胞的侵染后能够继续抑制BmNPV的复制，具有治疗效果。本发明可用于防治家蚕血液型脓病的药物研发及生产，具有应用推广价值。

Description

一种小分子化合物在制备抗家蚕杆状病毒感染药物中的应用
技术领域
本发明属于分子生物学与病毒学领域，涉及一种小分子化合物在制备抗家蚕杆状病毒感染家蚕药物中的应用。
背景技术
由家蚕杆状病毒(Bombyx mori Nuclear Polyhedrosis Virus,BmNPV)感染引发的家蚕血液型脓病是目前养蚕生产中最常见、危害又最为严重的一种传染性疾病。目前对于家蚕血液型脓病的治疗尚无特效药物，生产上主要是通过使用化学消毒剂加强养蚕期严格的消毒来防止病毒的感染和扩散，主要有氯制剂、醛制剂，表面活性剂和石灰等；或者通过添食抗生素类药物来减少或推迟危害的产生，蚕农对家蚕血液型脓病治疗药物有迫切的需求。1987年以前有人发现一些化学药物如；9-氨基乳酸吖啶、B-丙内酯、烷基化5’-鸟嘌呤核苷酸、萘啶酮酸等化学物品对家蚕BmNPV感染后的发病具有一定的抑制效果，但其作用主要体现在预防而不是治疗。近年由于蚕药产业研发力量弱、资金投入少等原因，蚕用药物的开发特别是蚕用抗病毒药物的开发没有跟上其他动植物抗病毒药物的步伐。
发明内容
发明目的：为解决现有技术中的问题，本发明提供了一种小分子化合物在制备抗家蚕杆状病毒感染药物中的应用，为所述的小分子化合物提供了一种新的用途。
技术方案：
本发明提供了一种小分子化合物在制备预防或治疗家蚕杆状病毒感染药物中的应用，所述小分子化合物的结构如式(Ⅰ)所示：
Figure BDA0001872017440000011
其中，所述家蚕杆状病毒的感染宿主为家蚕。
所述小分子化合物的有效浓度为0.1～10μg/mL。
进一步的，所述小分子化合物的有效浓度为1～10μg/mL。
所述家蚕杆状病毒为家蚕核型多角体病毒天然株系例如BmBacJS13等，或与所述天然株系具有相同感染特性的基因工程病毒株系。
所述的药物包括活性成分以及药学上可接受的辅料，其中活性成分包含所述的小分子化合物。
有益效果：
本发明所涉及的小分子化合物的获得基于主流的分子对接技术，针对家蚕杆状病毒必须的核心基因，利用虚拟建模技术获得其三维结构，分子对接筛选小分子数据库，对所获的小分子化合物进行活性检测，最终获得了本发明中具有有效效果的小分子化合物。
本发明目标小分子化合物在zinc数据库编号为ZINC95401182，分子式为：C20H28N2O3，结构如式(Ⅰ)所示，现有技术中尚未有任何证据显示其对家蚕杆状病毒或相近病毒具有防治疗效，本发明开拓了其新的用途，可用于制备防治家蚕血液型脓病的药物。当所述小分子化合物使用终浓度在1μg/mL以上时能够完全抑制BmNPV的复制，并且在BmNPV完成对细胞的侵染后能够继续抑制BmNPV的复制，具有治疗效果。本发明可用于防治家蚕血液型脓病的药物研发及生产，具有应用推广价值。
附图说明
图1为利用不同浓度小分子处理细胞后病毒感染细胞荧光图。
图2、利用不同浓度小分子处理细胞后病毒滴度。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
下述实施方式中，小分子化合物在zinc数据库编号为ZINC95401182；分子式为：C20H28N2O3；结构如下式(Ⅰ)所示：
Figure BDA0001872017440000021
实施例1
1.携带绿色荧光蛋白报告基因的BmNPV的构建
BmBacJS13是一株与BmNPV具有相同感染特性的Bacmid(Huang JSetal.Construction of the Bac-to-Bac System of Bombyxmori Nucleopolyhedroviru.VirologicaSinica.2007，22(3)：218-225)。为了便于观察及统计本专利所述的防治效果，将报告基因egfp转座到BmBacJS13的Tn7转座插入位点，其中egfp采用本领域常用序列即可，无特别限定，只要能发挥报告指示作用即可。
本步骤具体方法如下：
将egfp片段克隆至pFastBac1(Invitrogen公司)的EcorI(Takara)和XhoI(Takara)位点，构建供体质粒pFastBac-egfp，通过转座获得BmBac-egfp，将BmBac-egfpDNA转染BmN(家蚕卵巢细胞)细胞后，在荧光显微镜下可观察到绿色荧光表达。将其细胞上清用于感染BmN细胞，感染72小时后收获病毒，用终点稀释法测定病毒滴度，病毒4℃冰箱避光保存用于后续实验。
2.细胞的接种及小分子的储存液配制
(1)分别在35mm的细胞培养皿(Corning)中各接种约105个BmN细胞，每个细胞皿中合2mL的10％FBS(胎牛血清)的TC100昆虫细胞培养基。
(2)27℃培养约12h-24h，待细胞贴壁后，用于以下实验。
(3)小分子的储存液配制
用DMSO配制浓度为10mg/mL的小分子储存液。
3.当小分子的终浓度为0μg/mL，即对照组细胞，携带egfp报告基因的BmNPV对细胞感染效率
(1)取各接种好105细胞的3个培养皿，每个细胞皿中合2mL的10％FBS的TC100昆虫细胞培养基。移去旧的培养基，分别加入2μLDMSO与2mL 10％FBS的TC100培养基，27℃培养30min，加入MOI(感染复数)＝5的BmBac-egfp病毒。
(2)48h后，将3个皿放置于荧光倒置显微镜，观察绿色荧光蛋白表达情况。
(3)取10μL细胞培养液，用终点稀释法测定病毒滴度。
绿色荧光蛋白表达情况见图1中A，结果显示0μg/mL小分子处理细胞时，BmNPV感染的细胞产生大量荧光，病毒滴度Log10(TCID50)为9.45(见图2中A)。
实施例2
小分子的终浓度为0.1μg/mL时，对携带egfp报告基因的BmNPV感染的防治：
(1)取各接种好105细胞的3个培养皿，每个细胞皿中合2mL的10％FBS的TC100昆虫细胞培养基。移去旧的培养基，分别加入0.02μL10mg/mL的小分子储存液与2mL10％FBS的TC100培养基，27℃培养30min，随后加入MOI＝5的BmBac-egfp病毒。
(2)48h后，将3个皿放置于荧光倒置显微镜，观察绿色荧光蛋白表达情况。
(3)取10μL细胞培养液，用终点稀释法测定病毒滴度。
绿色荧光蛋白表达情况见图1中B，结果显示0.1μg/mL小分子处理细胞时，BmNPV感染细胞的荧光与对照相比明显减少，病毒滴度为7.23(图2中B)。
实施例3
小分子的终浓度为0.25μg/mL时，对携带egfp报告基因的BmNPV感染的防治：
(1)取各接种好105细胞的3个培养皿，每个细胞皿中合2mL的10％FBS的TC100昆虫细胞培养基。移去旧的培养基，分别加入0.05μL10mg/mL的小分子储存液与2mL 10％FBS的TC100培养基，27℃培养30min，随后加入MOI＝5的BmBac-egfp病毒。
(2)72h后，将3个皿放置于荧光倒置显微镜，观察绿色荧光蛋白表达情况。
(3)取10μL细胞培养液，用终点稀释法测定病毒滴度。
绿色荧光蛋白表达情况见图1中C，结果显示0.25μg/mL小分子处理细胞时，BmNPV感染细胞的荧光与对照相比明显减少，病毒滴度Log10(TCID50)为6.73(图2中C)。
实施例4
小分子的终浓度为1μg/mL时，对携带egfp报告基因的BmNPV感染的防治：
(1)取各接种好105细胞的3个培养皿，每个细胞皿中合2mL的10％FBS的TC100昆虫细胞培养基。移去旧的培养基，分别加入0.2μL10mg/mL的小分子储存液与2mL 10％FBS的TC100培养基，27℃培养30min，随后加入MOI＝5的BmBac-egfp病毒。
(2)72h后，将3个皿放置于荧光倒置显微镜，观察绿色荧光蛋白表达情况。
(3)取10μL细胞培养液，用终点稀释法测定病毒滴度。
绿色荧光蛋白表达情况见图1中D，结果显示1μg/mL小分子处理细胞时，BmNPV感染细胞的无荧光，检测不出病毒滴度(图2中D)。
实施例5
小分子的终浓度为10μg/mL时，对携带egfp报告基因的BmNPV感染的防治：
(1)取各接种好105细胞的3个培养皿，每个细胞皿中合2mL的10％FBS的TC100昆虫细胞培养基。移去旧的培养基，分别加入2μL10mg/mL的小分子储存液与2mL10％FBS的TC100培养基，27℃培养30min，随后加入MOI＝5的BmBac-egfp病毒。
(2)72h后，将3个皿放置于荧光倒置显微镜，观察绿色荧光蛋白表达情况。
(3)取10μL细胞培养液，用终点稀释法测定病毒滴度。
绿色荧光蛋白表达情况见图1中E，结果显示10μg/mL小分子处理细胞时，BmNPV感染细胞的无荧光，检测不出病毒滴度(图2中E)。
实施例6
小分子的终浓度为1μg/mL时，感染后加入小分子对携带egfp报告基因的BmNPV感染的防治：
取各接种好105细胞的3个培养皿，每个细胞皿中合2mL的10％FBS的TC100昆虫细胞培养基。移去旧的培养基，随后加入MOI＝5的BmBac-egfp病毒；此时设置时间为感染后0小时，3、6、12小时后加入0.2μL 10mg/mL的小分子储存液，27℃培养。
结果显示BmNPV完成对细胞的感染后加入1μg/mL小分子处理细胞时，细胞无荧光，检测不出病毒滴度，对BmNPV也有完全的抑制效果，表示1μg/mL小分子可以对BmNPV感染细胞进行病毒清除和治疗。

Claims (6)

1.一种小分子化合物在制备预防或治疗家蚕杆状病毒感染药物中的应用，其特征在于，所述小分子化合物的结构如式(Ⅰ)所示：
Figure FDA0001872017430000011
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述家蚕杆状病毒的感染宿主为家蚕。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述小分子化合物的有效浓度为0.1～10μg/mL。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述小分子化合物的有效浓度为1～10μg/mL。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述家蚕杆状病毒为家蚕核型多角体病毒天然株系或与其具有相同感染特性的基因工程病毒株系。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的药物包括活性成分以及药学上可接受的辅料，其中活性成分包含所述的小分子化合物。
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