CN103529013A - 一种基于dcdr光谱技术的精浆果糖快速检测的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基于DCDR光谱技术快速检测精浆中果糖含量的方法。该方法是通过精浆超滤液制备，分离过滤精浆样品中的大部分蛋白及杂质，而后进行液滴沉积处理，在400～1800cm-1波数范围，采集拉曼光谱信号，结合拉曼光谱技术，测量果糖特征峰627cm-1的强度，同时对比标准浓度果糖溶液中的对应特征峰的强度比值，开展精浆果糖含量的快速检测，建立有望应用于临床批量精浆样品的快速检测的客观、有效方法。本发明的优点是：需要测量和分析的时间较短，样品用量少，检测快速，费用低。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于液滴沉积拉曼光谱（DCDR）技术快速检测精浆中果糖含量的方法，具体说就是，通过精浆样品的过滤处理及液滴沉积实现果糖的局部富集，然后通过其特征谱峰的测量，结合光谱强度比值法获得精浆果糖含量的快速测量。
背景技术
精浆果糖是男性附性腺精囊所分泌的特征性物质，是精子在精液中主要的糖类能源，直接参与精子的获能和受精过程。当精囊腺功能紊乱时，精液内果糖含量也降低，低果糖容易引起精子活力不足，导致不育。因而精浆果糖的测定对判断男性生育能力具有重要意义。2003年李德忠等对76例不育患者和32例生育者精浆果糖浓度测量发现，不同精子密度不育症患者中，精浆果糖含量有明显差异。Buchet WM等研究发现，非阻塞性无精子症患者精浆果糖浓度高于正常生育组，提示可能是无精子症时精子对果糖的利用减少，或精囊分泌果糖的量增加所致。此外，精浆中的果糖含量，还可作为鉴别无精子症病因的主要依据，无精子症患者精液中有果糖，说明阻塞是在精囊以上，属单纯输精管阻塞，不影响精囊中果糖的正常排出；如果精液中无果糖，则可说明患者存在着精囊和输精管的不发育或缺如。最后，果糖含量还间接的反映睾丸间质细胞分泌睾酮的功能，雄性激素不足可造成果糖含量降低。目前临床针对精浆果糖含量的测量主要为吲哚法。缺点是：依赖检测试剂盒，需在浓盐酸环境下反应，由于浓盐酸易挥发，易造成反应重复性差，且标本检测量大时，操作时间的延长，影响更为明显。同时，强酸还易污染腐蚀仪器。此外，试剂盒检测存在操作步骤繁琐，耗时，不适合临床开展大范围的应用。
因此，如何实现精浆中果糖含量的简便、低成本、快速检测，是目前急需解决的关键技术问题。
发明内容
本发明目的在于就现有精浆中果糖含量测量方法存在样品处理步骤繁琐、操作复杂、需较多耗材的情况下，提供一种操作简便、快速、成本低、易于普及推广的精浆中果糖含量定量检测的方法。
为实现本发明的目的采用的技术方案是：
1、精浆超滤液制备
液化后的精液样品，离心机上以3000g离心力离心10分钟，移液枪吸取上层精浆溶液1～3ml，缓慢注入到Amicon ultra-4离心管中（截止蛋白分子量为3kDa），然后在eppendorf离心机上以7500g离心力离心10-18分钟，获得精浆超滤液保存备用。
2、精浆超滤液的液滴沉积处理
为实现精浆超滤液中果糖的局部富集，吸取10μl的精浆超滤液滴加于光滑、干燥的Ramchip基底（Z&S tech, USA）中，而后放入恒温干燥箱进行加热干燥，干燥温度为28～30℃，干燥时间为12～16分钟，最终形成精浆超滤液的液滴沉积。
3、拉曼光谱测量
采用Renishaw Invia显微拉曼光谱系统，将形成的精浆超滤液的液滴沉积置于显微镜下，采用20倍物镜（N.A.=0.4, Leica）聚焦，设置CCD曝光时间为22～26s，400～1800cm-1波数范围，采集拉曼光谱信号。重复测量三次，取其平均值。
4、果糖为内标的DCDR定量检测
（1）用移液枪吸取保存备用的精浆超滤液，分成A、B两等份，其中A中加入等体积量浓度为20mg/ml的果糖溶液，并吸取10μl滴加到Ramchip基底形成液滴沉积；从B中吸取10μl也滴加到Ramchip基底形成液滴沉积；分别测量液滴沉积中心位置400～1800cm-1波数范围的拉曼光谱，记录并比较两者在627cm-1峰位的光谱强度值，确定627cm-1为果糖的重要特征峰，其强度值可客观反映果糖含量的改变。
（2）吸取10μl的精浆超滤液和购买的粉末状标准样果糖配制成已知浓度为10mg/ml的果糖溶液分别静置于光滑、干燥的Ramchip基底。利用恒温干燥箱下进行加热干燥12～16分钟，完成液滴沉积。测量并记录精浆超滤液的果糖特征峰627cm-1的强度值，同时以已知浓度（10mg/ml）的果糖溶液为参考，通过特征峰的强度比值计算出超滤液中果糖的浓度含量。
本发明与对应样品的精浆果糖试剂盒定量检测结果与DCDR方法检测的果糖浓度值进行比较，样品处理步骤简单，几乎无需实验耗材，可快速（35分钟内）检测，易于普及推广。
附图说明
图1是本发明中精浆超滤液液滴沉积分布透射图。
图2是本发明中精浆超滤液和混有果糖的精浆超滤液DCDR光谱比较图。
图3是本发明中精浆超滤液液滴沉积中的果糖空间分布图。
图4是本发明采用试剂盒定量检测11个精浆超滤液果糖浓度和DCDR方法检测的果糖浓度的比较，相对标准误差（%SE）仅为10.23%。
具体实施方式
实施例1
1、精浆超滤液制备
取液化后的精液样品，离心机上以3000g离心力离心10分钟，移液枪吸取上层精浆溶液3ml，缓慢注入到Amicon ultra-4离心管中（截止蛋白分子量为3kDa），然后在eppendorf离心机上以7500g离心力离心15分钟，获得精浆超滤液68μl保存备用。
2、精浆超滤液的液滴沉积处理
吸取10μl的精浆超滤液滴加于光滑、干燥的Ramchip基底（Z&S tech, USA）中，而后放入恒温干燥箱（DHG-9240，上海一恒）进行加热干燥，干燥温度为30℃，干燥时间为16分钟，形成精浆超滤液的液滴沉积。
3、拉曼光谱测量
采用Renishaw Invia显微拉曼光谱系统，将形成的精浆超滤液液滴沉积置于显微镜下，采用20倍物镜（N.A.=0.4, Leica）聚焦，设置CCD曝光时间为25s，400～1800cm-1波数范围，采集拉曼光谱信号。重复测量三次，取其平均值。
4、果糖为内标的DCDR定量检测
（1）用移液枪吸取保存备用的精浆超滤液24μl，分成A、B两等份，其中A中加入12μl浓度为20mg/ml的果糖溶液，混合均匀后吸取10μl滴加到Ramchip基底形成液滴沉积；从B中吸取10μl也滴加到Ramchip基底形成液滴沉积；分别测量液滴沉积中心位置400～1800cm-1波数范围的拉曼光谱，记录并比较两者在627cm-1峰位的光谱强度值，确定627cm-1为果糖的重要特征峰。结果见图2精浆超滤液和混有果糖的精浆超滤液DCDR光谱比较图。
（2）用移液枪吸取10μl的精浆超滤液和以购买的标准样果糖（纯度≥99%，购于Sigma Aldrich）浓度为10mg/ml的果糖溶液分别静置于光滑、干燥的Ramchip基底（Z&S tech, USA）。利用恒温干燥箱下进行加热干燥12分钟小时，完成液滴沉积。测量并记录精浆超滤液的果糖特征峰627cm-1的强度值，同时以已知浓度（10mg/ml）的果糖溶液为参考，通过特征峰的强度比值计算出超滤液中果糖的浓度含量。
实施例2
1、精浆超滤液制备
取液化后的精液样品，离心机上以3000g离心力离心10分钟，移液枪吸取上层精浆溶液1ml，缓慢注入到Amicon ultra-4离心管中（截止蛋白分子量为3kDa），然后在eppendorf离心机上以7500g离心力离心16分钟，获得精浆超滤液54μl保存备用。
2、精浆超滤液液滴沉积处理
吸取10μl的精浆超滤液滴加于光滑、干燥的Ramchip基底（Z&S tech, USA）中，而后放入恒温干燥箱（DHG-9240，上海一恒）进行加热干燥浓缩，干燥温度为30℃，干燥20分钟，形成精浆超滤液的液滴沉积。
3、拉曼光谱测量
采用Renishaw Invia显微拉曼光谱系统，将形成的精浆超滤液液滴沉积置于显微镜下，采用20倍物镜（N.A.=0.4, Leica）聚焦，设置CCD曝光时间为23s，400～1800cm-1波数范围，采集拉曼光谱信号。重复测量三次，取其平均值。其空间分布以情况如图3所示。
4、果糖为内标的DCDR定量检测
（1）用移液枪吸取保存备用的精浆超滤液24μl，分成A、B两等份，其中A中加入12μl浓度为20mg/ml的果糖溶液，混合均匀后吸取10μl滴加到Ramchip基底形成液滴沉积；从B中吸取10μl也滴加到Ramchip基底形成液滴沉积；分别测量液滴沉积中心位置400～1800cm-1波数范围的拉曼光谱，记录并比较两者在627cm-1峰位的光谱强度值，确定627cm-1为果糖的重要特征峰。
（2）用移液枪分别吸取10μl的精浆超滤液和以购买的标准样果糖（纯度≥99%，购于Sigma Aldrich）浓度为10mg/ml的果糖溶液静置于光滑、干燥的Ramchip基底（Z&S tech, USA）。利用恒温干燥箱下进行加热干燥16分钟，完成液滴沉积。测量并记录精浆超滤液的果糖特征峰627cm-1的强度值，同时以已知浓度（10mg/ml）的果糖溶液为参考，通过特征峰的强度比值计算出超滤液中果糖的浓度含量。
Claims (3)
1. 一种基于DCDR光谱技术的精浆果糖快速检测的方法，其特征是：
精浆超滤液制备
液化后的精液样品，离心机上以3000g离心力离心10分钟，移液枪吸取上层精浆溶液1～3ml，缓慢注入到离心管中，然后以7500g离心力离心10～18分钟，获得精浆超滤液保存备用；
精浆超滤液的液滴沉积处理
吸取10μl的精浆超滤液滴加于光滑、干燥的Ramchip基底中，而后放入恒温干燥箱进行加热干燥浓缩，形成液滴沉积的精浆超滤液；
拉曼光谱测量
将形成液滴沉积的精浆超滤液置于显微镜下，设置CCD曝光时间，400～1800cm-1波数范围，采集拉曼光谱信号，重复测量三次，取其平均值；
果糖为内标的DCDR定量检测
（1）用移液枪吸取保存备用的精浆超滤液，分成A、B两等份，其中A中加入等体积量浓度为20mg/ml的果糖溶液，并吸取10μl滴加到Ramchip基底形成液滴沉积；从B中吸取10μl也滴加到Ramchip基底形成液滴沉积；分别测量液滴沉积中心位置400～1800cm-1波数范围的拉曼光谱，记录并比较两者在627cm-1峰位的光谱强度值，确定627cm-1为果糖的重要特征峰。
（2）吸取10μl的精浆超滤液和粉末状标准样果糖配制成已知浓度为10mg/ml的果糖溶液分别静置于光滑、干燥的Ramchip基底，加热干燥12～16分钟，完成液滴沉积，测量并记录精浆超滤液的果糖特征峰627cm-1的强度值，同时以10mg/ml的果糖溶液为参考，通过特征峰的强度比值计算出超滤液中果糖的浓度含量。
2. 根据权利要求1所述的一种基于DCDR光谱技术的精浆果糖快速检测的方法，其特征是所述的精浆超滤液预浓缩时，干燥温度为28～30℃，干燥12～16分钟。
3. 根据权利要求1所述的一种基于DCDR光谱技术的精浆果糖快速检测的方法，其特征是所述的拉曼光谱测量时， CCD曝光时间为22～26s。
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