CN108680553A - 一种基于荧光共振能量转移检测烟碱的方法 - Google Patents

一种基于荧光共振能量转移检测烟碱的方法 Download PDF

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李志强
吴俊�
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Abstract

本发明公开了一种基于荧光共振能量转移检测烟碱的方法，包括以下步骤：(1)回归方程的拟合：将若干不同浓度的烟碱标准溶液中加入浓度和体积一定的水溶性金属量子点溶液和水溶性碳量子点溶液，用弱酸溶液稀释至一定体积，然后分别测定其荧光强度F和F0，得到(F‑F0)/F0与烟碱浓度关系的回归方程；F和F0分别为金属量子点在烟碱存在及没有烟碱存在时的荧光强度；(2)样品测定：测定未知浓度的烟碱溶液的F和F0，将得到的F和F0代入步骤(1)得到的回归方程，即可计算出未知浓度的样品烟碱的含量。本发明的方法利用了碳量子点与金属量子点间发生荧光共振能量转移提出检测烟碱的新的方法，该方法稳定性好、灵敏度高、选择性好且操作方法简单、绿色环保。

Description

一种基于荧光共振能量转移检测烟碱的方法
技术领域
本发明涉及一种基于荧光共振能量转移检测烟碱的方法。属于检测技术领域。
背景技术
烟碱，又名尼古丁，属于吡啶族生物碱，是烟草中的特有成分。近年来随着医药、烟草行业、农业、化工等诸多领域的迅速发展，市场上对天然烟碱的需求量与日俱增。快速、简便、准确地测定烟碱样品及烟碱制品中烟碱的含量是企业生产所必需的。现有的烟碱分析检测方法有重量分析法、滴定分析法、旋光法、红外光谱定量分析法、原子吸收分光光度法、色谱分析法、电位分析法、极谱分析法等，而这些方法各有利弊，但一般灵敏度不高且选择性较差。荧光共振能量转移是指在不同的荧光基团中，若一个荧光基团(供体)的荧光发射光谱与另一个基团(受体)的吸收光谱有一定的重叠，当两个基团间的距离合适时(一般小于50nm)，即可观察到荧光能量由供体向受体转移的现象，即供体荧光猝灭和受体荧光增强。碳量子点是一类粒径一般小于10nm的新型碳材料。它具有优异的光学性能、可调的激发和发射行为、较高的荧光稳定性、较低的毒性和良好的生物相容性等特点；金属量子点是一种半导体纳米晶体颗粒，具有宽的激发光谱和窄的发射光谱，光稳定性好、化学稳定性强等特点。量子点作为荧光探针在分析化学领域的应用成为热点。
本发明利用碳量子点与金属量子点间发生荧光共振能量转移构建新型的能量转移体系，提出检测烟碱的方法，为首次提出。
发明内容
本发明利用碳量子点与金属量子点间发生荧光共振能量转移，碳量子点作为能量供体，金属量子点作为能量受体，构建新型的能量转移体系，提出新的检测烟碱的方法。该方法操作简单，灵敏度高，检测时间短。
本发明的技术方案如下：
一种基于荧光共振能量转移检测烟碱的方法，包括以下步骤：
(1)回归方程的拟合：将若干不同浓度的烟碱标准溶液中加入浓度和体积一定的水溶性金属量子点溶液和水溶性碳量子点溶液，用弱酸溶液稀释至一定体积，然后分别测定其荧光强度F和F0，得到(F-F0)/F0与烟碱浓度关系的回归方程；F和F0分别为金属量子点在烟碱存在及没有烟碱存在时的荧光强度；
(2)样品测定：将未知浓度的烟碱溶液样品中加入浓度和体积与步骤(1)相同的水溶性金属量子点溶液和水溶性碳量子点溶液，用弱酸溶液稀释至一定体积，然后分别测定其荧光强度F和F0，将得到的F和F0代入步骤(1)得到的回归方程，即可计算出未知浓度的样品烟碱的含量。
优选地，所述的弱酸溶液为pH 6.0～6.5缓冲溶液，所述缓冲溶液为磷酸二氢钠和磷酸氢二钠组成的缓冲溶液。
优选地，所述荧光强度F和F0的测定为：以300nm为激发波长，激发和发射狭缝均为5nm，测定600nm的荧光强度。
优选地，所述水溶性荧光碳量子点溶液为聚乙烯亚胺液体的碳量子点溶液，其制备方法为：称取聚乙烯亚胺液体加入到水中，混匀后加热，冷却至室温后过滤，然后透析处理，即得到水溶性荧光碳量子点溶液。
优选地，所述水溶性金属量子点溶液为到水溶性CdS金属量子点溶液，其制备方法为：将CdCl2溶液和巯基乙酸混合均匀后，调节pH至碱性，除去混合液中的氧气后，加入Na2S水溶液，反应完毕后即可得到水溶性CdS金属量子点溶液。
优选地，所述未知浓度的烟碱溶液样品可以为卷烟的烟碱溶液样品、电子烟烟液的烟碱溶液样品或烟叶的烟碱溶液样品。
一种基于荧光共振能量转移分别检测卷烟、电子烟烟液和烟叶中烟碱的方法，具体包括步骤如下：
(1)回归方程的拟合：在10mL具塞比色管中依次加入20～40μL水溶性金属量子点溶液、60～80μL水溶性碳量子点溶液及将适量烟碱的标准溶溶液，用pH 6.0～6.5缓冲溶液稀释至刻度，摇匀，静置8-10min，以300nm为激发波长，激发和发射狭缝均为5nm，测定600nm的荧光强度F和F0，得到(F-F0)/F0与烟碱浓度关系的回归方程；F和F0分别为金属量子点在烟碱存在及没有烟碱存在时的荧光强度；
(2)样品处理
①卷烟样品：准确称取市售某品牌的香烟烟丝1.000g置于100mL烧瓶中，加入100mL无水乙醇，浸泡24h，分出滤液，再加入100mL无水乙醇浸泡24h，滤出，合并滤液，定容于250mL容量瓶中，得烟碱提取液；
②电子烟烟液样品：将电子烟烟液溶于异丙醇水溶液，异丙醇水溶液的浓度为体积百分比5～15％，涡旋混合1～3min，离心分离，并取离心后的异丙醇水溶液层清液作为样品溶液；所述的离心时间5～10min，离心速率3000～6000r/min；
③烟叶样品：称取干燥的烟叶粉末1.000g置于烧杯中，加入0.5mol/L HCI溶液30mL，在小火上微沸10min，趁热抽滤，再用热水洗涤残留物3次，滤液合并，加入0.5mol/LNaOH溶液调pH至7，用水定容至250mL容量瓶中得烟碱提取液；
步骤(1)和2不分先后；
(3)样品测定：在10mL具塞比色管中依次加入20～40μL金属量子点溶液、60～80μL碳量子点溶液及步骤(2)制备的烟碱提取液5mL，用pH 6.0～6.5缓冲溶液稀释至刻度，摇匀，静置8-10min，以300nm为激发波长，激发和发射狭缝均为5nm，测定600nm的荧光强度F和F0，将得到的F和F0代入步骤(1)得到的回归方程，即可计算出未知浓度的样品烟碱的含量。
所述的水溶性荧光碳量子点溶液的制备方法包括：称取10.0g聚乙烯亚胺液体，加入到90mL超纯水中，超声5min使其充分混匀，并转移至聚四氟乙烯反应釜，于200℃加热5h，自然冷却至室温后，先用孔径为0.22μm滤膜过滤，后用截留分子量为3500D的透析袋进行透析处理24h，得到水溶性荧光碳量子点溶液。
所述的水溶性金属量子点溶液的制备方法包括：将50mL 0.01mol/L CdCl2溶液、250μL巯基乙酸加入250mL三口烧瓶中，磁力搅拌下混合均匀后，缓慢加入1.0mol/L NaOH调节pH至11，在N2保护下搅拌30min除去混合液中的氧气后，逐滴加入5mL 0.1mol/L Na2S·9H2O水溶液，继续在N2保护下搅拌4h，即可得到水溶性CdS金属量子点溶液。
所述pH 6.0～6.5缓冲溶液由磷酸二氢钠和磷酸氢二钠组成的缓冲溶液。
本发明的测量原理如下：其中碳量子点为聚乙烯亚胺水溶性荧光碳量子点；金属量子点为水溶性CdS金属量子点。图1为碳量子点的吸收光谱和发射光谱以及金属量子点的吸收光谱和发射光谱。其中a为碳量子点的吸收光谱，b为金属量子点的吸收光谱，c为碳量子点的发射光谱，d为金属量子点的发射光谱。金属量子点的吸收光谱为423nm，碳量子点的发射光谱为440nm，两者波长相差17nm，具备了能量共振转移的条件。图2为固定碳量子点的浓度改变金属量子点浓度的光谱图；金属量子点荧光强度明显增加，碳量子点发射强度猝灭强度小；图3为固定金属量子点的浓度改变碳量子点浓度的光谱图；金属量子点荧光强度明显增加。这些都证明了在碳量子点与金属量子点之间发生了能量共振转移。图4为不同烟碱浓度对金属量子点荧光强度增强的光谱图，可见其具备了测定烟碱条件。
本发明的有益效果：
1、本发明的检测方法将具有优良光学性质的碳量子点与金属量子点应用于荧光共振能量转移，以碳量子点作为能量供体，以金属量子点作为能量受体，构建了新型的能量转移体系，烟碱能够使体系中的金属量子点荧光强度增强，建立了烟碱的高灵敏度及选择性的检测方法。
2、申请人发现，在弱酸条件下，金属量子点的荧光增加值与烟碱的浓度在一定范围内呈良好的线性关系，从而建立了测定痕量烟碱的新方法。
3、本发明的方法具有稳定性好、灵敏度高、选择性好等优点，能较好地克服现有方法中存在的一些缺陷。为首次提出。
4、本发明的方法仪器简便，操作方法简单、快速，没有用到有机溶剂，绿色环保。
附图说明
图1为碳量子点的吸收光谱和发射光谱以及金属量子点的吸收光谱和发射光谱。其中a为碳量子点的吸收光谱，b为金属量子点的吸收光谱，c为碳量子点的发射光谱，d金属量子点的发射光谱。
图2为固定碳量子点的浓度改变金属量子点浓度的光谱图。
图3为固定金属量子点的浓度改变碳量子点浓度的光谱图。
图4为不同烟碱浓度对金属量子点荧光强度增强的光谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步地说明，但本发明的保护范围并不限于此。
实施例1：卷烟样品中烟碱的测定
1、水溶性碳量子点溶液的制备：称取10.0g聚乙烯亚胺液体加入到90mL超纯水中，超声5min使其充分混匀，并转移至聚四氟乙烯反应釜，于200℃加热5h，自然冷却至室温后，先用孔径为0.22μm滤膜过滤，后用截留分子量为3500D的透析袋进行透析处理24h，得到水溶性碳量子点溶液。
2、水溶性金属量子点溶液的制备：将50mL 0.01mol/L的CdCl2溶液、250μL的巯基乙酸加入250mL三口烧瓶中，磁力搅拌下混合均匀后，缓慢加入1.0mol/L的NaOH调节pH至11，在N2保护下搅拌30min除去混合液中的氧气后，逐滴加入5mL的0.1mol/L Na2S·9H2O水溶液，继续在N2保护下搅拌4h，即可得到水溶性CdS金属量子点溶液。
3、回归方程的拟合：将1、20、40、60、80、100mg/L的烟碱标准溶液各0.5mL转移到10mL具塞比色管中，分别加入20μL步骤2得到水溶性金属量子点溶液、60μL步骤1得到的水溶性碳量子点溶液，用pH 6.0磷酸盐缓冲溶液稀释至刻度，摇匀，静置8min，分别以300nm为激发波长，激发和发射狭缝均为5nm，在600nm处测定的荧光强度，得到回归方程(F-F0)/F0＝0.2187C(μg/mL)+0.0809，相关系数r＝0.9991，其中F和F0分别表示金属量子点在烟碱存在及没有烟碱存在时的荧光强度。
4、样品处理：准确称取市售某品牌的香烟烟丝1.000g置于100mL烧瓶中，定量加入100mL无水乙醇浸泡24h，分出滤液；再加入100mL无水乙醇浸泡24h烟丝，分出滤液。合并两次得到的滤液，定容于250mL容量瓶中即得卷烟样品的烟碱提取液。
5、卷烟样品中烟碱的测定：移取步骤4制备的烟碱提取液5mL转移到10mL具塞比色管中，分别加入20μL步骤2得到水溶性金属量子点溶液、60μL步骤1得到的水溶性碳量子点溶液，用pH 6.0磷酸盐缓冲溶液稀释至刻度，摇匀，静置8min，以300nm为激发波长，激发和发射狭缝均为5nm，在600nm处测定的荧光强度F和F0(F和F0分别表示金属量子点在烟碱存在及没有烟碱存在时的荧光强度)，将得到的F和F0代入步骤3得到的回归方程得到浓度C；换算得到卷烟样品中烟碱的含量为13.1mg/g。
实施例2电子烟烟液中烟碱的测定
1、水溶性碳量子点的制备：同实施例1。
2、水溶性金属量子点的制备：同实施例1。
3、烟碱工作曲线的制作：将1、20、40、60、80、100mg/L的烟碱标准溶液0.5mL转移到10mL具塞比色管中，依次加入30μL步骤2得到的水溶性金属量子点溶液、70μL步骤1得到的水溶性碳量子点溶液，用pH 6.0磷酸盐缓冲溶液稀释至刻度，摇匀，静置8min，以300nm为激发波长，激发和发射狭缝均为5nm，在600nm处测定的荧光强度，得到回归方程(F-F0)/F0＝0.0298C(μg/mL)+0.0301，相关系数r＝0.9990，其中F和F0分别表示金属量子点在烟碱存在及没有烟碱存在时的荧光强度。
4、样品处理：称取电子烟烟液0.1g试样，精确至0.0001g，加入10mL体积比为10％的异丙醇水溶液，涡旋混合1min，离心分离，并取离心后的异丙醇水溶液层清液作为样品溶液。
5、电子烟烟液中烟碱的测定：移取步骤4制备的烟碱提取液5mL，转移到10mL具塞比色管中，依次加入30μL步骤2得到的水溶性金属量子点溶液、70μL步骤1得到的水溶性碳量子点溶液，用pH 6.5磷酸盐缓冲溶液稀释至刻度，摇匀，静置9min，以300nm为激发波长，激发和发射狭缝均为5nm，在600nm处测定的荧光强度F和F0(F和F0分别表示金属量子点在烟碱存在及没有烟碱存在时的荧光强度)，将得到的F和F0代入步骤3得到的回归方程得到浓度C；换算得到电子烟烟液中烟碱的含量为15.6mg/g。
实施例3烟叶样品中烟碱的测定
1、水溶性碳量子点的制备：同实施例1。
2、水溶性金属量子点的制备：同实施例1。
3、烟碱工作曲线的制作：将1、20、40、60、80、100mg/L的烟碱标准溶液0.5mL转移到10mL具塞比色管中，依次加入40μL步骤2得到的水溶性金属量子点溶液、80μL步骤1得到的水溶性碳量子点溶液，用pH 6.0磷酸盐缓冲溶液稀释至刻度，摇匀，静置10min，以300nm为激发波长，激发和发射狭缝均为5nm，在600nm处测定的荧光强度F，得到回归方程(F-F0)/F0＝0.1203C(μg/mL)+0.1230，相关系数r＝0.9992，其中F和F0分别表示金属量子点在烟碱存在及没有烟碱存在时的荧光强度。
4、样品处理：准确称取干燥的烟叶粉末1.000g置于烧杯中，加入0.5mol/L HCI溶液30mL，在小火上微沸10min，趁热抽滤，再用热水洗涤残留物3次，滤液合并，加入0.5mol/LNaOH溶液调pH至7，用水定容至250mL容量瓶中得到烟叶样品中烟碱提取液。
5、烟叶样品中烟碱的测定：移取步骤4制备的烟碱提取液5mL，转移到10mL具塞比色管中，依次加入40μL步骤2得到的水溶性金属量子点溶液、80μL步骤1得到的水溶性碳量子点溶液，用pH 6.0磷酸盐缓冲溶液稀释至刻度，摇匀，静置10min，以300nm为激发波长，激发和发射狭缝均为5nm，在600nm处测定的荧光强度F和F0(F和F0分别表示金属量子点在烟碱存在及没有烟碱存在时的荧光强度)，将得到的F和F0代入步骤3得到的回归方程得到浓度C；换算得到烟叶样品中烟碱的含量为9.2mg/g。
将实施例1-3进行加标回收率及相对标准偏差试验，并将本发明方法与中国烟草行业标准YC/T 468-2013烟草及烟草制品烟碱的测定方法进行比对，结果见表1。
表1加标回收率及相对标准偏差(n＝5)
由表1结果可知：用本发明的荧光共振能量转移测定烟碱的方法与YC/T 246-2008测定方法相比，结果一致。但发明的测定方法处理步骤少，所用时间短，处理成本低，有机溶剂用量少，因而更具优势。从高中低加标回收率可以看出，回收率在93.8-102.1％间，相对标准偏差1.0-2.8％间，说明本发明的方法具有好的准确度及精密度。

Claims (6)

1.一种基于荧光共振能量转移检测烟碱的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)回归方程的拟合：将若干不同浓度的烟碱标准溶液中加入浓度和体积一定的水溶性金属量子点溶液和水溶性碳量子点溶液，用弱酸溶液稀释至一定体积，然后分别测定其荧光强度F和F0，得到(F-F0)/F0与烟碱浓度关系的回归方程；F和F0分别为金属量子点在烟碱存在及没有烟碱存在时的荧光强度；
(2)样品测定：将未知浓度的烟碱溶液样品中加入浓度和体积与步骤(1)相同的水溶性金属量子点溶液和水溶性碳量子点溶液，用弱酸溶液稀释至一定体积，然后分别测定其荧光强度F和F0，将得到的F和F0代入步骤(1)得到的回归方程中，即可计算出未知浓度的样品烟碱的含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的弱酸溶液为pH 6.0～6.5的缓冲溶液，所述缓冲溶液含磷酸二氢钠和磷酸氢二钠的缓冲溶液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述荧光强度F和F0的测定为：以300nm为激发波长，激发和发射狭缝均为5nm，测定600nm的荧光强度。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水溶性荧光碳量子点溶液为聚乙烯亚胺液体的碳量子点溶液；其制备方法为：称取聚乙烯亚胺液体加入到水中，混匀后加热，冷却至室温后过滤，然后透析处理即得到水溶性荧光碳量子点溶液。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水溶性金属量子点溶液为到水溶性CdS金属量子点溶液；其制备方法为：将CdCl2溶液和巯基乙酸混合均匀后，调节pH至碱性，除去混合液中的氧气后，加入Na2S水溶液，反应完毕后即可得到水溶性CdS金属量子点溶液。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述未知浓度的烟碱溶液样品可以为卷烟的烟碱溶液样品、电子烟烟液的烟碱溶液样品或烟叶的烟碱溶液样品。
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