CN112147127A - 一种葡萄糖异构化过程中果糖含量的分析方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种葡萄糖异构化过程中果糖含量的分析方法及其应用是通过以下技术方案实现的：步骤1，建立葡萄糖异构化过程中果糖含量的快速分析模型；步骤2，采集待测样品的拉曼光谱；步骤3，计算待测样品的拉曼光谱与所述快速分析模型中所用参比样本光谱的系列夹角值，再求取系列夹角值的方差值D；步骤4，将所述方差值D的数值代入步骤1的快速分析模型中即可得到待测样品的果糖含量。本发明还公开该方法在监测葡萄糖异构化过程中的应用。本发明通过建立葡萄糖浆异构化过程中果糖含量的拉曼光谱快速分析模型，应用于葡萄糖浆异构化过程分析，无需每次标准测量步骤，适用于现场和过程连续测量，便于生产过程产品的质量监控。

Description

一种葡萄糖异构化过程中果糖含量的分析方法及其应用
技术领域
本发明涉及葡萄糖异构化过程分析技术领域，尤其涉及一种葡萄糖异构化过程中果糖含量的分析方法及其应用。
背景技术
目前果糖的定量分析方法主要有高效液相色谱法、气相色谱法、分光光度法和核磁共振方法等，但这些方法存在成本高、污染环境、操作技术要求高等缺点。且多以离线方法为主，在分析效率、便捷性等方面都受到一定的限制，不能够满足葡萄糖异构化过程实时分析的要求。
拉曼/近红外光谱技术具有测定速度快、样品制备简单、不耗费化学试剂、操作简便、成本低、无污染等优点。近红外光谱用于体系果糖含量分析，多是利用偏最小二乘法以及不同光谱处理和数学处理相结合，构建葡萄糖、果糖和蔗糖含量的近红外光谱分析模型，用外部验证样品集进行验证，然后利用所建模型的对待测样品进行含量预测。该方法建模样本量大，建模成本高，模型预测准确度由建模样本的分布情况决定。
本发明通过建立葡萄糖浆异构化过程中果糖含量的拉曼光谱快速分析模型，应用于葡萄糖浆异构化过程分析，不采用需要大量样本的多变量统计建模方法，无需复杂建模可实现体系光谱直接定量，而且不受测量条件变化的影响，操作方便，建模成本低。
发明内容
果葡糖浆中两种主要成分是果糖与葡萄糖，谱图中会出现波峰重叠和偏移现象，难以单纯依靠某个峰或某个波段的光谱特征响应实现果糖的定量分析。
葡萄糖浆异构化过程体系的拉曼光谱中各组分出峰出现重叠和覆盖，导致峰值偏移、峰型改变和并合等情形，各组分响应缺乏良好的选择性，混合物中被测组分的直接测量的准确性就受到影响。
为了解决上述现有技术中的不足，本发明通过建立葡萄糖浆异构化过程中果糖含量的拉曼光谱快速分析模型，应用于葡萄糖浆异构化过程分析，便于生产过程产品的质量监控，具体提供了一种葡萄糖异构化过程中果糖含量的分析方法及其应用。
本发明的一种葡萄糖异构化过程中果糖含量的分析方法及其应用是通过以下技术方案实现的：
步骤1，建立葡萄糖异构化过程中果糖含量的快速分析模型；
步骤2，采集待测样品的拉曼光谱；
步骤3，计算待测样品的拉曼光谱与所述快速分析模型中所用参比样本光谱的系列夹角值，再求取系列夹角值的方差值D；
步骤4，将所述方差值D的数值代入步骤1的快速分析模型中即可得到待测样品的果糖含量。
进一步地，步骤1中，所述快速分析模型是通过以下步骤建立的：
步骤1)，葡萄糖异构化：将质量分数为40％～55％的葡萄糖浆与葡萄糖异构酶反应一段时间后，得到反应液；
步骤2)，测定步骤1)得到的反应液中果糖质量分数，以此作为基液，按一定配比添加果糖(AR)或50％质量分数的葡萄糖溶液，配制得到一系列果葡糖浆样本；各样本果糖含量间隔3％～5％，各样本果糖质量分数在3％～35％的范围内，样本数为7～10个；
步骤3)，采集各样本的拉曼光谱，每个样本采集三次取平均值；
步骤4)，采用荧光褪色差分法，选择一阶或2阶求导，对步骤3)所得样本原始光谱进行降噪处理，然后选择果糖含量25％～35％的样本为参比样本，计算各样本降噪处理后的拉曼光谱与参比样本光谱系列夹角的方差值D；
步骤5)，以果糖质量分数为横坐标，方差值D为纵坐标，得到果糖含量与角度方差值的关联方程，即为所述葡萄糖异构化过程中果糖含量的快速分析模型。
进一步地，所述方差值D是通过以下方法得到的：
确定移动窗口宽度，从最小波数点向波数点增大方向每移动一次窗口，计算得到一个各样本光谱与参比样本光谱的夹角，待窗口移动到最大波段波数，得到系列夹角值，然后求取系列夹角值的方差值D。
进一步地，所述移动窗口宽度为波段波数的1/30～1/15，所述波段为样本拉曼光谱响应特征波段。
进一步地，步骤1)中所述葡萄糖异构酶的用量为每克葡萄糖浆5mg～12.5mg。
进一步地，步骤1)中所述酶异构化条件为pH＝6～9，温度50℃～65℃。
进一步地，步骤1)中所述反应时间为24h。
进一步地，步骤2)中，采用间苯二酚-分光光度法或高效液相色谱分析法测定得到的反应液中果糖质量分数。
进一步地，步骤3)中，集拉曼光谱的积分时间为9s，平滑点数为0，激发波长为532nm，功率等级为9，拉曼位移范围为150cm-1～3500cm-1。
一种葡萄糖异构化过程中果糖含量的分析方法在监测葡萄糖异构化过程中的应用，根据所述方差值D的数值变化实现对葡萄糖浆异构化过程的监控。
一种实时监控葡萄糖异构化过程状态的方法，配制含一定量葡萄糖的溶液(g1)，分别计算不同时间下，反应液拉曼光谱与g1溶液拉曼光谱的夹角值方差值EE*，以EE*值为纵坐标，反应时间为横坐标，作反应趋势曲线，通过夹角值EE*增大的趋势判断葡萄糖异构化过程，夹角值EE*增大的趋势越趋于平缓说明反应越完全，反之，反应不完全。
本发明相比于现有技术而言具有以下有益效果：
本发明通过建立葡萄糖浆异构化过程中果糖含量的拉曼光谱快速分析模型，应用于葡萄糖浆异构化过程分析，无需每次标准测量步骤，适用于现场和过程连续测量，便于生产过程产品的质量监控。
本方法获得的果葡糖浆中果糖含量与夹角值的关系不受光度变化的影响，通过选择合适的特征响应波数范围，二者在一定含量范围内存在线性相关性，且相关性不受测量条件变化的影响。
本发明不采用需要大量样本的多变量统计建模方法，无需复杂建模可实现体系光谱直接定量，而且操作方便，建模成本低。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。
图1为异构化反应液、样本S8(参比样本)、葡萄糖及果糖拉曼光谱；
图2为葡萄糖异构化反应趋势曲线图。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。本发明中未详细说明的结构或工作原理属于现有技术和本领域的公知常识，本技术领域的技术人员应当知晓。
本发明实施例中所使用的试剂：
果糖(BR，国药集团化学试剂有限公司)，
葡萄糖(食品级，广东光华科技股份有限公司)，
间苯二酚(AR，上海凌峰化学试剂有限公司)，
盐酸(36.0％～38.0％，AR，西陇科学股份有限公司)，
葡萄糖异构酶(2000U/g，食品级，浙江一诺生物科技有限公司)。
实施例1
本实施例提供一种葡萄糖异构化过程中果糖含量的分析方法，包括以下步骤：
步骤1，建立葡萄糖异构化过程中果糖含量的快速分析模型：
所述快速分析模型是果糖含量与角度值方差值的关联方程，通过以下步骤建立:
步骤1)，葡萄糖异构化：将质量分数为45％的葡萄糖浆在pH＝6，温度55℃的条件下按照每克葡萄糖浆7.5mg的用量比加入葡萄糖异构酶，反应时间24h，得到反应液。
步骤2)，采用间苯二酚-分光光度法测定得到的反应液中果糖质量分数为8.94％，以此作为基液，分别添加果糖(AR)溶液配制得到编号为S1～S8的8个葡糖浆样本，使各样本果糖含量间隔为3.0％，得到的S1～S8葡糖浆样本中果糖质量分数依次为4.0％、6.99％、10.0％、13.0％、16.0％、19.0％、22.0％、25.0％。
步骤3)，分别采集样本S1～S8的拉曼光谱，每个样本采集三次取平均值；其中采集参数均为积分时间9s、平滑点数0、激发波长532nm、功率等级9、拉曼位移范围为150cm-1～3500cm-1。
步骤4)，将采集得到S1～S8的各样本光谱导入计算平台；采用荧光褪色差分法，选择一阶求导对各样本原始光谱进行降噪处理；取果糖含量25％的样本S8为参比样本；选择降噪处理后的样本拉曼光谱，截取波段300～1500cm-1作为响应特征波段，设置移动窗口宽度为波段波数点数的1/30，窗口从最小波数点向波数点增大方向移动，每移动一次窗口，计算得到一个各样本光谱与参比样本光谱的夹角，待窗口移动到最大波段波数，得到系列夹角值，然后求取系列夹角值的方差值D。
步骤5)，以果糖质量分数为横坐标，方差值D为纵坐标，得到果糖含量与角度方差值的关联方程，w＝-0.0135D+0.4478，r＝0.9903，即为所述快速分析模型，其中w为果糖质量分数。
步骤2，采集待测样品的拉曼光谱：
采用正交试验设计L16(44)，选取A(pH)、B(温度)、C(葡萄糖质量分数)、D(加酶量)进行4因素4水平正交试验，如表1所示。
表1葡萄糖异构化工艺正交实验因素水平
Figure BDA0002708123490000071
所述16组异构化反应条件见表2。
表2葡萄糖异构化正交实验安排表
Figure BDA0002708123490000072
采集上述16组反应产物溶液的拉曼光谱，依照上述方法计算反应液光谱与参比样本(果糖质量分数为25％的S8号样本)光谱的系列夹角的方差值D，带入关联方程w＝-0.0135D+0.4478中，计算得到不同工艺条件下反应液中果糖含量，并采用间苯二酚-分光光度法测定各样本中果糖含量，结果见表3。
表3不同工艺条件下异构化反应液中果糖含量分析结果
Figure BDA0002708123490000081
采用本实施例方法与间苯二酚-分光光度法分别测定得到反应液中果糖含量的绝对误差在0.04％-1.17％之间，相对误差在0.29％-7.87％之间。
实施例2
本实施例提供一种葡萄糖异构化过程中果糖含量的分析方法，本实施例与实施例1的区别仅在于：
本实施例中，葡萄糖浆的质量分数为40％；pH＝7，温度50℃，加入葡萄糖异构酶的用量为每克葡萄糖浆5mg。
本实施例中，分别以30％质量分数的葡萄糖溶液配制葡糖浆样本，各样本果糖含量间隔4％，样本数为87个，1号葡糖浆样本中果糖质量分数为4.0％，其他样本依次增加4％。
本实施例中，参比样本为果糖质量分数为28％的7号样本。
拉曼光谱采集参数须与实施例1保持一致且保持光源稳定，本实施例方法与间苯二酚-分光光度法分别测定得到反应液中果糖含量的绝对误差在0.01‰～1.10％之间，相对误差在0.36％～8.01％之间。
以本实施例与间苯二酚-分光光度法的测定值计算得到葡萄糖转化率分别为35.46％和36.18％。
实施例3
本实施例提供一种葡萄糖异构化过程中果糖含量的分析方法，本实施例与实施例1的区别仅在于：
本实施例中，葡萄糖浆的质量分数为55％；pH＝9，温度65℃，加入葡萄糖异构酶的用量为每克葡萄糖浆12.5mg。
本实施例中，各样本果糖含量间隔5％，样本数为7个，1号葡糖浆样本中果糖质量分数为1.0％，其他样本依次增加5％。
本实施例中，参比样本为果糖质量分数为35％的7号样本。
拉曼光谱采集参数须与实施例1保持一致且保持光源稳定，本实施例方法与间苯二酚-分光光度法分别测定得到反应液中果糖含量的绝对误差在0.04‰～1.09％之间，相对误差在0.2％～9.43％之间。
以本实施例与间苯二酚-分光光度法的测定值计算得到葡萄糖转化率分别为36.28％和36.18％。
实施例4
本实施例提供一种葡萄糖异构化过程中果糖含量的分析方法，本实施例与实施例1的区别仅在于：
本实施例中，葡萄糖浆的质量分数为45％；pH＝8，温度60℃，加入葡萄糖异构酶的用量为每克葡萄糖浆10mg。
本实施例中，各样本果糖含量间隔3％，样本数为10个，1号葡糖浆样本中果糖质量分数为3.0％，其他9个样本依次增加3％。
本实施例中，参比样本为果糖质量分数为30％的10号样本。
拉曼光谱采集参数须与实施例1保持一致且保持光源稳定，本实施例方法与间苯二酚-分光光度法分别测定得到反应液中果糖含量的绝对误差在0.01‰～1.05％之间，相对误差在0.57％～7.78％之间。
以本实施例与间苯二酚-分光光度法的测定值计算得到葡萄糖转化率分别为35.98％和36.18％。
实施例5
本实施例提供一种葡萄糖异构化过程中果糖含量的分析方法在监测葡萄糖异构化过程中的应用。
在pH为7，反应温度60℃；葡萄糖质量分数为55％；加酶量10mg/g条件下，进行一组葡萄糖浆异构化反应，从反应4h开始，每隔2h采集一次拉曼光谱数据。
使用实施例1所建立的快速分析模型，依照上述步骤，计算本实施例的反应液光谱与实施例1中参比样本S8光谱的系列夹角的方差值D，带入关联方程w＝-0.0135D+0.4478中，计算得到同反应时间下反应液中果糖含量。
同时每隔2h提取少量反应液，采用间苯二酚-分光光度法，对反应液进行离线的果糖含量测定，将在线检测的快速分析模型预测值与离线的实测值进行比较分析，结果见表4。
表4葡萄糖浆异构化过程果糖含量分析结果
Figure BDA0002708123490000111
由表4可知，本实施例测量值与间苯二酚-分光光度法测量值绝对误差在0.11％-1.29％之间，相对误差在0.55％-9.55％之间，表明将拉曼光谱结合角度转换的方法运用于葡萄糖浆异构化反应的过程分析，预测结果准确性高，稳定性好。
从表4实验结果可以看出，葡萄糖异构化反应速率由高到低，最终到达了一种平衡的状态，具体可以分为三个阶段，第一阶段4h-10h，这一阶段的反应速率较高，果糖含量迅速增长到12.22％(本实施例方法预测值)。第二阶段10h-20h，第二阶段反应速率较低，果糖含量在20h增长到19.14％(本实施例方法预测值)。第三阶段20h-24h，该阶段异构化反应达到平衡状态，果糖含量增长缓慢，果糖含量在24h增长到19.79％(本实施例方法预测值)。以本实施例与间苯二酚-分光光度法的测定值计算得到葡萄糖转化率分别为35.98％和36.18％。
实施例6
本实施例在不建立含量分析模型的情况下，也可以通过计算反应液光谱与参比光谱的角度值，对异构化过程状态的进行实时监控。
配制葡萄糖质量分数为60％的溶液(g1)，分别计算4h-24h不同时间下反应液拉曼光谱与g1溶液拉曼光谱的夹角值方差值EE*。以EE*值为纵坐标，反应时间为横坐标，作反应趋势曲线，如图2(a)所示。
同理，求取4h-24h不同时间反应液拉曼光谱与参比溶液S8拉曼光谱的夹角值EE，EE与时间的关系如图2(b)所示。
图2(a)、(b)展示了反应趋势的变化，随着异构化反应的进行，反应液中葡萄糖含量逐渐减小，而果糖的含量逐渐增加，与参比溶液g1的差异越来越大，而与参比溶液S8的差异却越来越小，反映在图2(a)中即夹角值EE*逐渐增大趋于平缓，图2(b)中则是EE值逐渐减小，然后趋于平缓。说明，可以通过不同时间下反应液拉曼光谱与g1溶液拉曼光谱的夹角值方差值EE*的增长趋势来判断葡萄糖异构化的过程，便于了解葡萄糖异构化是否进行完全，操作方便且结构可靠。

Claims (10)

1.一种葡萄糖异构化过程中果糖含量的分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，建立葡萄糖异构化过程中果糖含量的快速分析模型；
步骤2，采集待测样品的拉曼光谱；
步骤3，计算待测样品的拉曼光谱与所述快速分析模型中所用参比样本光谱的系列夹角值，再求取系列夹角值的方差值D；
步骤4，将所述方差值D的数值代入步骤1的快速分析模型中即可得到待测样品的果糖含量。
2.如权利要求1所述的一种葡萄糖异构化过程中果糖含量的分析方法，其特征在于，步骤1中所述快速分析模型是通过以下步骤建立的：
步骤1)，葡萄糖异构化：将质量分数为40％～55％的葡萄糖浆与葡萄糖异构酶反应一段时间后，得到反应液；
步骤2)，测定步骤1)得到的反应液中果糖质量分数，以此作为基液，按一定配比添加果糖(AR)或30％质量分数的葡萄糖溶液，配制得到一系列果葡糖浆样本；各样本果糖含量间隔3％～5％，各样本果糖质量分数在3％～35％的范围内，样本数为7～10个；
步骤3)，采集各样本的拉曼光谱，每个样本采集三次取平均值；
步骤4)，采用荧光褪色差分法，选择一阶或2阶求导，对步骤3)所得样本的拉曼光谱进行降噪处理；然后选择果糖含量25％～35％的样本为参比样本，计算各样本降噪处理后的拉曼光谱与参比样本光谱系列夹角的方差值D；
步骤5)，以果糖质量分数为横坐标，方差值D为纵坐标，得到果糖含量与角度方差值的关联方程，即为所述葡萄糖异构化过程中果糖含量的快速分析模型。
3.如权利要求1或2所述的一种葡萄糖异构化过程中果糖含量的分析方法，其特征在于，所述方差值D是通过以下方法得到的：
确定移动窗口宽度，从最小波数点向波数点增大方向每移动一次窗口，计算得到一个各样本光谱与参比样本光谱的夹角，待窗口移动到最大波段波数，得到系列夹角值，然后求取系列夹角值的方差值D。
4.如权利要求3所述的一种葡萄糖异构化过程中果糖含量的分析方法，其特征在于，所述移动窗口宽度为波段波数的1/30～1/15，所述波段为样本拉曼光谱响应特征波段。
5.如权利要求2所述的一种葡萄糖异构化过程中果糖含量的分析方法，其特征在于，步骤1)中所述葡萄糖异构酶的用量为每克葡萄糖浆5mg～12.5mg。
6.如权利要求2所述的一种葡萄糖异构化过程中果糖含量的分析方法，其特征在于，步骤1)中所述酶异构化条件为pH＝6～9，温度50℃～65℃，所述反应时间为24h。
7.如权利要求2所述的一种葡萄糖异构化过程中果糖含量的分析方法，其特征在于，步骤2)中，采用间苯二酚-分光光度法或高效液相色谱分析法测定得到的反应液中果糖质量分数。
8.如权利要求2所述的一种葡萄糖异构化过程中果糖含量的分析方法，其特征在于，步骤3)中，采集拉曼光谱的积分时间为9s，平滑点数为0，激发波长为532nm，功率等级为9，拉曼位移范围为150cm-1～3500cm-1。
9.如权利要求1-8任一所述的一种葡萄糖异构化过程中果糖含量的分析方法在监测葡萄糖异构化过程中的应用，其特征在于，根据所述方差值D的数值变化实现对葡萄糖浆异构化过程的监控。
10.一种实时监控葡萄糖异构化过程状态的方法，其特征在于，配制含一定量葡萄糖的溶液(g1)，分别计算不同时间下，反应液拉曼光谱与g1溶液拉曼光谱的夹角值方差值EE*，以EE*值为纵坐标，反应时间为横坐标，作反应趋势曲线，通过夹角值EE*增大的趋势判断葡萄糖异构化过程，夹角值EE*增大的趋势越趋于平缓说明反应越完全，反之，反应不完全。
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