CN1157919A - 溶液中成分的光学测定方法 - Google Patents

Abstract

对于含有蛋白质的试样溶液5，照射来自光源22的单一波长的激发光，接受来自该试样溶液5的散射光，用分光器52分光后，得到光散射光谱。该散射光谱中，相对于激发波长的偏移波数来说，使用100～3100cm^-1的光散射光谱的强度或其中适当范围的积分值，测定蛋白质。对体液照射激发光，测定预先选择任意波数范围的多个波数下的喇曼散射光谱强度，用多变量回归分析同时定性、定量分析体液试样中的多种成分。

Description

溶液中成分的光学测定方法

本发明涉及光学地测定试样溶液中的蛋白质及尿、血液、血清、血浆、唾液、汗等体液中的各种成分的方法。

尿蛋白，正常情况下，一天排泄20～80mg，但在各种病态时，尿中排泄的蛋白质有变化。也就是，由于尿中蛋白量是诊断病态的指标，所以其测定精度及准确度要求高水平。另外，尿中排泄的各种蛋白质，对于不同疾病有各种指标，所以要个别地加以鉴别，即需要特异检查法。

作为测定尿蛋白量的方法，以往使用在尿中添加蛋白沉淀试剂，由生成的沉淀层厚度，概测蛋白质浓度的Esbach法(使用苦味酸)及末吉法(使用氯化银)等，但这些方法，在特异性及精度上存在问题。目前，使用比浊由水杨酰磺酸及三氯醋酸引起混浊的方法(比浊法)及利用蛋白质与色素结合的比色法。

比浊法时，根据蛋白质种类，而浊度不同。缺乏特异性。被测定物质是强碱性时，完全中和酸性沉淀试剂，成为假阴性的原因。另外，也有混浊度的观察未标准化，产生个人差异的问题。

对于比色法，血红蛋白及各种球蛋白还不能像白蛋白那样进行锐敏反应，另外，在被测定物质是高度缓冲成碱性时，成为假阳性。而且色调的判别困难。

由于尿经过一段时间，有效成分会发生变化，改变了其性质，所以尿样检查需迅速进行。但是，对于比色法，是使其与pH指示剂进行反应，用其色调判定变化，对于比浊法，是通过加热及添加酸，使蛋白质沉淀，判定其混浊度。也就是，比色法及比浊法，由于需要它们进行反应，所以繁杂、缺乏迅速性。

在临床检查中，作为测定体液中成分的方法，有试剂法、试纸法、化学发光法、免疫测定法、酶法、色谱法等。

试纸法所用的试纸，大多是用粘结剂等，将含在纤维素中反应试剂的反应部分固定在塑料载体上使其干燥的。当反应部分含有湿气时，会在试剂间发生反应，另外由于高温及光也会变性，使灵敏度降低，所以装有试纸的容器必须密闭、避免高温地进行保存，必须在有效期内使用。例如尿检查的试纸法，对于pH、蛋白质、葡萄糖、酮体、胆红素、潜血、尿胆素原、细菌感染、比重等项目，可在1分钟内，同时进行多项测定，但是试剂部分的反应，除了内因性的促进物质及阻碍物质之外，还由于反应温度及湿度，受到影响，而且只能是半定量。试纸法的判定方法，主要是比色法，其反应机理主要是酶反应及氧化还原反应等化学反应。对于试剂法，主要是通过指示剂及酶、化学反应的比色法及在蛋白测定中使用的比浊法。

酶法，对于被测定物质的特异性高，且简便，但有由于体液自身具有的色调，有隐蔽阳性反应的危险，进而，在进行氧化还原反应时，有由于内因性、外因性的各种氧化、还原反应物质，抑制反应，产生假阴性、假阳性的危险性。

但是，由于上述任何方法都是通过媒介反应进行测定的间接测定方法，所以有潜在的误差。概括地说，在用比色法进行判定时，对比判定的结果，容易产生误差，通过化学反应的，其特异性低。另外，由于在体液中大量存在影响其检查的物质，所以会阻碍反应，发生假阳性反应，呈现与阳性反应不同的色调，隐蔽阳性反应。使用原来酶的体系不稳定，通过化学反应的体系，容易受到共存物质的影响。另外，在检查项目的临床的意义相互关联(胆红素与尿胆素原、蛋白与潜血、葡萄糖与酮体)时，同时进行多项试验的综合判定是有用的，但分别进行各项目试验繁杂，而且容易受干涉物的影响。多项目试纸价格高，且难判定，所以敬而远之。

对于试剂法、试纸法及酶法，需要有作为消耗品的试剂、试纸或酶等，另外也存在使用前的试剂等的保存稳定性及使用后的废弃问题。进而，也有由于试剂及试样添加量等操作时的错误引起误差的可能性，操作繁琐，受到不是测定目的的抗坏血酸等其他成分的干涉的缺点。对于试剂法及酶法，可对单成分进行定量测定，但不能同时进行多成分测定，另外，对于试纸法，可同时测定多成分但存在只能半定量的缺点。

对于化学发光法，需要发光的物质；对于通过抗原抗体反应的免疫测定法，一般需要洗净，有工时多、干涉物影响及非特异吸附的缺点。

对于色谱法，需要有分离等前处理，另外，混合试样中的目的物质不能直接定量。

本发明的第1个目的在于提供一种不通过上述媒介反应，可简单而迅速地测定溶液中蛋白质的定量方法。

本发明的第2个目的在于提供一种不需要作为消耗品的试剂、试纸或酶等，进而，没有这些消耗品使用前保存安全性及使用后的废弃问题，也没有成为产生误差原因的繁琐操作及由其他成分的干拢作用等问题，从而，同时定量测定体液中多种成分的方法。

本发明者们发现了被测定物质中的蛋白质和其他成分具有固有的光散射光谱。本发明就是利用其光散射光谱，由其峰强度或适当的波数范围的累积强度，定量测定各主要成分浓度的。

测定溶液中蛋白质浓度的本发明第1种情况，是在含有蛋白质的试样溶液中，照射单一波长的激发光，接受来自该试样溶液的散射光，分光后得到光散射光谱，在该散射光谱中作成对于激发波长的偏移波数，使用100～3100cm^-1光谱的波峰强度或其中适当范围的积分值定量地测定蛋白质的测定方法。

来自蛋白质水溶液试样的光散射光谱主要是宽广的荧光光谱，但根据蛋白质的种类和激发波长，在荧光光谱上，重叠出现尖锐的喇曼散射光谱。因此，在本发明的第1种情况时，作为对象的光散射光谱，同时包括了荧光和喇曼散射。

蛋白质是白蛋白时，最好使用从激发波长偏移到810～840cm^-1的光谱波峰强度或者从激发波长632.8nm偏移到256～1620cm^-1或从激发波长514.4nm偏移到837～3060cm^-1的光谱的适当范围的积分值。

蛋白质是γ-球蛋白时，最好使用从激发波长偏移到175～195cm^-1、425～450cm^-1、640～670cm^-1、820～845cm^-1、845-870cm^-1、1370～1400cm^-1、1575～1620cm^-1、1850～1900cm^-1、2000～2200cm^-1、2350～2400cm^-1或2400～2460cm^-1的光谱波峰强度。

蛋白质是血红蛋白时，最好使用从激发波长偏移到640～670cm^-1、820～845cm^-1、1370～1400cm^-1、1575～1620cm^-1、1850～1900cm^-1、2000～2200cm^-1、2350～2400cm^-1或2400～2460cm^-1的光谱波峰强度。

同时定量测定体液中多种成分的本发明的第2种情况时，从被测定物质中的各体液中成分得到固有喇曼散射光谱，利用该光谱可以从光谱强度或光谱积累强度或者任意波数范围多个波数的喇曼散射光谱强度定性、定量地测定各成分。

第2种情况的第1方案中，对于将要测定的体液中各成分，预先选择该成分的浓度和喇曼散射光谱强度的相关良好的波数，作为该成分固有的测定波数，对体液照射激发光，测定被测各成分在各种测定波数下喇曼散射光谱强度，利用对各成分在各种测定波数下喇曼散射光谱强度和该成分浓度预先作成的标准曲线，同时定性、定量分析体液中的各成分。测定波数下的喇曼散射光谱强度是指喇曼散射光谱峰的峰高。代替峰高也可以测定含有该测定波数的测定波数范围的喇曼散射光谱峰的峰面积，来定性、定量。

第2种情况的第2方案中，对于体液试样照射激发光，以被测体液中多种各成分浓度和喇曼散射光谱强度的相关性良好的波数作为各成分固有的测定波数，测定这些测定波数下的喇曼散射光谱强度，或者测定任意波数范围的多个波数的喇曼散射光谱强度，用多变量回归分析同时定性、定量分析体液试样中的多种成分。

对于被测各体液中成分，选择其单成分水溶液的浓度和该固有喇曼散射光谱强度间的相关系数R0.8以上，优选的是0.9以上的波数作为该成分固有的测定波数。相关系数R按下式求出。 $R=\frac{\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}\left\{(\mathrm{xi}-X)(\mathrm{yi}-Y)\right\}}{\sqrt{\left[\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{(\mathrm{xi}-X)}^2\right][\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{(\mathrm{yi}-Y)}^2}}$

xi：体液中成分的各点浓度

yi：对于xi喇曼散射光谱强度

X：体液中成分的各点浓度平均值

Y：喇曼散射光谱强度的平均值

对于各成分优选的测定波数或测定范围如下：

对于白蛋白从590～650cm^-1附近、800～860cm^-1附近、2342～2402cm^-1(参照图17)中选择；

对于球蛋白从158～218cm^-1附近、402～462cm^-1附近、623～683cm^-1附近、807～867cm^-1附近、822～862cm^-1附近、1353～1413cm^-1附近、1562～1622cm^-1附近、1847～1907cm^-1附近、2095～2155cm^-1附近、2340～2400cm^-1附近、2403～2463cm^-1附近(参照图47)中选择；

对于血红蛋白从807～867cm^-1附近、893～953cm^-1附近、1353～1413cm^-1附近、1562～1622cm^-1附近、1840～1900cm^-1附近、2095～2155cm^-1附近、2340～2400cm^-1附近、2403～2463cm^-1附近(参照图48)中选择；

对于葡萄糖从200～554cm^-1附近、810～944cm^-1附近、2590～2940cm^-1附近(参照图19)中选择；

对于乙酰醋酸锂从799～859cm^-1附近、1353～1413cm^-1附近、1840～1900cm^-1附近、2347～2407cm^-1附近、2907～2967cm^-1附近(参照图45)中选择；

对于β-羟基丁酸从1420～1480cm^-1附近、1557～1617cm^-1附近、1600～1660cm^-1附近、2870～2971cm^-1附近(参照图46)中选择；

对于丙酮从775～845cm^-1附近、1050～1110cm^-1附近、1207～1267cm^-1附近、1399～1459cm^-1附近、1680～1740cm^-1附近、2911～2971cm^-1附近(参照图25)中选择；

对于双牛胆红素从927～987cm^-1附近、1233～1293cm^-1附近、1586～1616cm^-1附近(参照图49)中选择；

对于尿胆素从332～2900cm^-1选择任意的位置；

对于亚硝酸钠，从783～843cm^-1附近、1318～1378cm^-1附近(参照图50)中选择；

对于尿素从501～561cm^-1附近、567～627cm^-1附近、978～1048cm^-1附近、1033～1093cm^-1附近、1138～1198cm^-1附近、1583～1643cm^-1附近(参照图21)中选择；

对于尿酸从640～700cm^-1附近(参照图51)中选择；

对于叶酸从631～691cm^-1附近、816～876cm^-1附近、901～961cm^-1附近、1355～1415cm^-1附近、1562～1622cm^-1附近、1847～1907cm^-1附近、2093～2153cm^-1附近、2339～2399cm^-1附近、2400～2460cm^-1附近(参照图52)中选择；

对于抗坏血酸从800～860cm^-1附近、1673～1733cm^-1附近、2919～2979cm^-1附近(参照图53)中选择；

对于维生素B₂从404～464cm^-1附近、626～686cm^-1附近、798～858cm^-1附近、860～920cm^-1附近、1317～1377cm^-1附近、1546～1606cm^-1附近、1834～1894cm^-1附近、2106～2166cm^-1附近、2360～2420cm^-1附近、2419～2479cm^-1附近(参照图54)中选择；

对于肌酸1水合物从800～860cm^-1附近、1563～1623cm^-1附近(参照图55)中选择；

对于肌酸肝从538～598cm^-1附近、580～640cm^-1附近、665～725cm^-1附近、817～877cm^-1附近、868～928cm^-1附近、1021～1081cm^-1附近、1550～1610cm^-1附近、2868～2900cm^-1附近、2900～2950cm^-1附近、2950～2996cm^-1附近(参照图56)中选择；

对于α-淀粉酶从393～453cm^-1附近、631～691cm^-1附近、792～852cm^-1附近、868～928cm^-1附近、1333～1393cm^-1附近、1546～1606cm^-1附近、1834～1894cm^-1附近、2334～2394cm^-1附近(参照图57)中选择；

对于β-淀粉酶从376～436cm^-1附近、622～682cm^-1附近、783～843cm^-1附近、868～928cm^-1附近、1334～1394cm^-1附近、1546～1606cm^-1附近、1834～1894cm^-1附近、2665～2725cm^-1附近(参见图58)中选择；

对于氨从3190～3250cm^-1附近、3292～3350cm^-1附近、3377～3437cm^-1附近(参照图59)中选择；

对于肌醇从404～464cm^-1附近、805～865cm^-1附近、1014～1074cm^-1附近、1438～1498cm^-1附近、2966～3026cm^-1附近(参照图60)中选择；

对于半乳糖从466～526cm^-1附近、835～895cm^-1附近、1032～1092cm^-1附近、1237～1297cm^-1附近、1332～1392cm^-1附近、1438～1498cm^-1附近、2946～3006cm^-1附近(参照图61)中选择；

对于果糖从569～629cm^-1附近、772～832cm^-1附近、1044～1106cm^-1附近、1237～1297cm^-1附近、1438～1498cm^-1附近、2966～2996cm^-1附近(参照图62)中选择。

体液检体包括上述成分中的2个以上成分时，希望在体液检体上照射单一波长的激发光接收来自该体液检体的散射光，得到的喇曼散射光谱中，对于各成分，在上述设定的波数区域，且以互相不重叠的波数区域的光谱强度为基础，算出各成分浓度。

多变量回归分析运算是使用主成分回归分析法(PCR法)及部分最小二乘法(PLS法)等的多变量回归分析法，进行数据分析。对于多变量回归分析法，由于可一次地使用多个光谱强度进行回归分析，所以与单回归分析相比，可进行高精度定量分析。重回归分析最经常使用，但需要多个试样，在各波数的光谱强度之间的相关高时，其定量分析精度变低。另一方面，多变量回归分析法的PCR法，可将在多个波数区域中的光谱强度集束成相互无关的主成分，进而，可消除不需要的杂波数据，所以可得到高的定量分析精度。另外，PLS法，在主成分萃取时，也可利用试样浓度数据，可得到与PCR法同样高的定量分析精度。关于多变量回归分析，可参考“多变量解析”(中谷和夫著、新曜社)。

为了从由于各种变动要因引起复杂变动的光谱中，取出需要的信息，用计算机进行的数据处理，起了很大作用。代表性的处理方法是在市售的近红外装置等中安装了处理用的软件。另外，作为市售的软件，有COMO社的安斯克兰帕。所谓的代表性的处理方法，是指上面列举的重回归分析及PLS法、主成分回归分析等。

适用于定量分析的数据处理的大的流程是1)制作成校正模型2)校正模型的评价3)未知试样的定量。

在进行校准时，需要以足够的精度测定适当个数用作标准曲线的试样。得到的光谱，根据需要进行前处理。作为代表性的前处理，有光谱的平滑化及微分、正规化，其中任何一种都是一般的处理。

接着，所说校准，就是建立光谱数据与目的特性的分析值之间的数学关系式即模型的处理。模型的制作是使用标准曲线制作用试样的分析值和光谱数据，通过统计顺序，而进行的。

为了正确评价制作的标准曲线对于未知试样预测的精度，通过评价用试样，可求出对于未知试样的测定误差。在判定标准曲线的精度不够时，根据需要，变更处理法的种类及参数，修正标准曲线。

认为精度足够的标准曲线在进行未知试样的分析时，作为由光谱数据预测目的特性值的关系式使用，用于定量未知试样浓度。

图1表示多变量回归分析的一般顺序的流程图。进行标准曲线制作用试样(分析值已知)的喇曼散射光谱测定，根据需要，进行平滑化及正规化等的前处理后，从得到的喇曼散射光谱数据(在各波数的喇曼散射光谱强度)，使用多变量回归分析，进行校准后，制成校准模型。

接着，进行用以评价该校准模型的评价用试样(分析值已知)的喇曼散射光谱的测定，根据需要，进行平滑化及正规化等前处理后，将得到的喇曼散射光谱数据，代入校准模型中，将评价用试样的实测值，与来自校准模型的计算值进行比较，评价校准模型的精度。精度不够时，回到标准曲线制作用试样的光谱测定及前处理、校准模型制作等阶段，根据需要，进行变更处理，对于校准模型加以修正，通过评价用试样的喇曼散射光谱数据，反复进行评价。若判定达到足够精度时，将通过未知试样(未知分析值)的喇曼散射光谱测定得到的喇曼散射光谱数据，代入该校准模型中，计算浓度。

本发明是将尿及血液等体液作为检体，作为临床检查的手段来使用的。白蛋白和球蛋白是肾病症状群及肾炎等指标、血红蛋白是尿路系统等的炎症及肿瘤指标、葡萄糖是糠尿病指标、乙酰醋酸锂、β-羟基丁酸及丙酮，是酮酸中毒指标，胆红素是肝、胆道疾病指标、尿胆素原是肝、胆道疾病及溶血性疾病指标、亚硝酸钠是尿路系统细菌感染等的指标。尿中尿素对于了解体内蛋白代谢、肝、肾功能等是有用的，若它们增加，可考虑服用体蛋白异化的亢进及奎宁等药物，若减少，可导致肝实质障碍及肾功能不全。进而，尿中尿素量，也表明是尿比重的指标(“新订临床检查研修手册3”小酒井望、乐事日报社)，一般，渗透压、折射率、尿比重相关良好，三者的判定可用比重代用(“临床检查法提要”金井正光、金原出版株式会社)。进而尿酸是尿路结石及高尿酸血症、叶酸是伴随胃及肠切除的吸收不良症候群及恶性肿瘤、肌酸是类甾醇肌病、肌酸酐是肌肉疾病及肾疾病、急性胰腺炎及胰腺闭塞、氨是代谢异常及重症肝疾病等的指标。

另外，由于胆红素不溶于水，进行实验时，使用双牛胆红素。所谓的双牛胆红素是牛磺酸抱合型胆红素，基本骨架相同，2个羰基是与牛磺酸进行脱水结合的。若与You-Zing Hsieh等(Langmuir 1987，3，1141-1146)进行的胆红素的SERS(表面增强喇曼分光法)光谱进行比较，由于除了本次得到的喇曼光谱的690.065cm^-1附近的峰以外，大致是相同的光谱，除此以外，可以说是来自胆红素的峰。另外，由于认为CH₂作横向扰动的957.5cm^-1附近的峰中，也含有牛磺酸部分的CH₂的振动，所以对于胆红素，可预想到相对强度会变低一些。

另外，关于尿胆素，由于尿胆素原不稳定，遇到空气氧化变成尿胆素，所以用尿胆素进行测定。尿胆素是通过氧化尿胆素原的一个-NH-，成为-N＝的。该-NH-的峰位置是3530～3480cm^-1，由于与作为溶剂的水的O-H伸缩振动(3650～3400cm^-1)的位置重叠，而被隐蔽起来，所以预想两者的光谱大致相同。

白蛋白的2372.8cm^-1附近的峰，可认为是由于NH⁺伸缩振动引起的。

可以认为球蛋白的188.232cm^-1附近的峰及432.919cm^-1附近的峰是由CCC的振动、653.937cm^-1附近的峰是由CH₂、CH的振动、837cm^-1附近的峰是由CH₂的振动、852cm^-1附近的峰是由CH₂CH的振动，1383.49cm^-1附近的峰是由酰胺III的振动、1592.41cm^-1附近的峰是由酰胺II的振动、1877.64cm^-1附近的峰是由CH₂的振动、2125.39cm^-1附近的峰是由CC的振动、2370cm^-1附近的峰是由NH⁺的振动、2433cm^-1附近的峰是由SH的振动引起的。

可认为血红蛋白837cm^-1附近的峰是由CH²的振动、923.373cm^-1附近的峰是由CH₃的振动、1383.49cm^-1附近的峰是由酰胺III的振动、1592.41cm^-1附近的峰是由酰胺II的振动、1870.82cm^-1附近的峰是由CH₂的振动、2125.39cm^-1附近的峰是由CC的振动、2370cm^-1附近的峰是由NH⁺的振动、2433cm^-1附近的峰是由SH的振动引起的。另外，由于共振喇曼分光法的氧基血红蛋白的光谱记载在“喇曼分光学”(P.R.CAREY著)上，可作为参考。

可以认为D-葡萄糖的405cm^-1附近的峰是由CCO的振动、524cm^-1附近的峰由基本骨架振动、648cm^-1附近的峰由CC的振动、779cm^-1附近的峰及840cm^-1附近的峰是由CH的振动、914cm^-1附近的峰是由CH和COH的振动、1054cm^-1附近的峰是由CH的振动、1076cm^-1附近的峰是由CH和COH的振动、1276cm^-1附近的峰及1346cm^-1附近的峰是由COH的振动、1426cm^-1附近的峰是由CH₂的振动、1640cm^-1附近的峰是由HOH的振动、2900cm^-1附近的峰是由CH和CH₂的振动引起的。

可认为乙酰醋酸锂的829.379cm^-1附近的峰、1383.49cm^-1附近的峰及1870.82cm^-1附近的峰是由CH₂的振动、2937cm^-1附近的峰是由CH₃和CH₂的振动引起的。

可认为β-羟基丁酸的1450.98cm^-1附近的峰是由CH₂的振动和CO₂ ^-的振动、1587.69cm^-1附近的峰是由CO₂ ^-的振动、1630cm^-1附近的峰是由CO的振动、2900cm^-1附近的峰是由CH₂的振动、2959cm^-1附近的峰是由CH₃的振动引起的。

可认为丙酮的805cm^-1附近的峰、1080cm^-1附近的峰、1429cm^-1附近的峰及2940cm^-1附近的峰是由CH₃的振动、1237cm^-1附近的峰是由CH₃C的振动、1710cm^-1附近的峰是由CO的振动引起的。

可认为双牛胆红素的690.065cm^-1附近的峰是由CC的振动、957.5cm^-1附近的峰及1458.88cm^-1附近的峰是由CH₂的振动、1263.96cm^-1附近的峰是由CH₂的振动及CO的振动、1616.29cm^-1附近的峰是由CC的振动及CO的振动引起的。

尿胆素其自身具有的荧光强，没有喇曼峰。

可认为亚硝酸钠的813cm^-1附近的峰及1339.5cm^-1附近的峰是由NO的振动引起的。

可认为尿素的531.939cm^-1附近的峰、1008cm^-1附近的峰及1168.35cm^-1附近的峰是由CN的振动、597.248cm^-1附近的峰是由CO的振动、1613.67cm^-1附近的峰是由CO及NH₂的振动引起的。

测定尿试样时，通过以每小时的排泄量为一定的肌酸酐的浓度作为基准，将其他尿成分的浓度规格化，可校正因尿量变化的尿成分浓度。

对于本发明，可不通过酶反应及化学反应等的媒介反应和中间反应，直接定量试样。由于不使用试剂，难以受到共存物质的影响，可排除伴随反应的误差。由于从取样到测定，不需要进行反应等操作，所以可简便，且迅速地进行测定。

本发明由于是高灵敏度的，所以对微量变化及微量成分的检测也是有效的。这样，本发明适用于尿中微量蛋白的定性及定量检测。

本发明中，向体液试样中照射激发光关于要从得到的光谱测定的多个体液成分，得到适当波数位置的强度，可定量分析体液中的成分，不需要试纸及试剂等消耗品，另外，也没有使用后的废弃问题。

另外，即使在有体液中其他成分的干涉时，通过利用多变量回归分析法等方法，可同时定性、定量分析体液中的多个成分。

图1是适用多变量回归分析法时的表示从光谱测定到浓度定量的程序的流程图。

图2是概略表示实施本发明的测定装置的方框图。

图3是表示使用全息陷波滤波器作为测定对象光学调节部的滤波装置，对于试样，与激发光成180度方向，接受测定对象光的测定装置的配置图。

图4是表示使用全息陷波滤波器作为测定对象光学调节部的滤波装置，对于试样，与激发光成90度的方向，接受测定对象光的测定装置的配置图。

图5A是表示使用全息分光器作为测定对象光学调节部的滤波装置，对着试样，与激发光成180度的方向，接受测定对象光的测定装置的配置图。

图5B是表示在图5A的全息分光器部分的概略断面图。

图6A是表示使用带通滤波器作为测定对象光学调节部的滤波装置，对着试样，与激发光成90度方向，接受测定对象光的测定装置的配置图。

图6B是表示带通滤波器的概略断面图。

图7是表示使用带通滤波器作为测定对象光学调节部的滤波装置，对着试样与激发光成180度方向，接受测定对象光的测定装置的配置图。

图8是表示使用流动室时，被测定物质的流入及排出路径的透视图。

图9是从白蛋白水溶液试样得到的光散射光谱，A是以He-Ne激光的632.8nm的波长光作为激发光照射的情况、(B)是以Ar激光的514.5nm波长光作为激发光照射的情况。

图10是表示图9(A)的光散射光谱时的光谱强度或面积与试样中白蛋白浓度的相关关系的图，(A)是偏移波数在829cm^-1位置的光谱强度的结果、(B)是偏移波数256～1620cm^-1范围面积的结果。

图11是从γ-球蛋白水溶液试样得到的光散射光谱，(A)是以He-Ne激光的632.8nm波长光作为激发光照射的情况、(B)是以Ar激光的514.5nm波长光作为激发光照射的情况。

图12(A)～(C)是表示在图11(A)的光散射光谱中，偏移波数分别为837.257cm^-1、1383.49cm^-1、1592cm^-1位置的光谱强度与试样中的γ-球蛋白浓度的相关关系图。

图13(D)～(F)是表示在图11(A)的光散射光谱中，偏移波数分别为1877cm^-1、2125cm^-1、2370cm^-1位置的光谱强度与试样中的γ-球蛋白浓度的相关关系图。

图14是从血红蛋白水溶液试样得到的光散射光谱，(A)是以He-Ne激光的632.8nm的波长光作为激发光照射的情况，(B)是以Ar激光的514.5nm波长光作为激发光，照射的情况。

图15(A)～(C)是表示在图14(A)的光散射光谱中，偏移波数分别为1870cm^-1、2125cm^-1、2370cm^-1的位置的光谱强度与试样中的血红素浓度的相关关系图。

图16是表示正常尿的喇曼光谱图。

图17是表示在正常尿中，将白蛋白增量约15mg/ml的试样的喇曼光谱图。

图18是表示尿中的白蛋白浓度和波数为2370.75cm^-1的喇曼散射光强度的相关图。

图19是在正常尿中，将葡萄糖增量到饱和量的试样的喇曼光谱图。

图20是表示尿中的葡萄糖浓度与波数为0～4000cm^-1的喇曼散射光强度的相关图。

图21是表示在正常尿中，将尿素增量约300mg/ml的试样的喇曼光谱图。

图22是表示尿中的尿素浓度与波数1008cm^-1的喇曼散射光强度的相关图。

图23是表示在正常尿中，将丙酮增量到60％(V/V)的试样的喇曼光谱图。

图24是表示尿中丙酮浓度和波数1080cm^-1的喇曼散射光强度的相关图。

图25是表示在正常尿中，将丙酮增量到37.5％(V/V)的试样的喇曼光谱图。

图26是表示在正常尿中，将丙酮增量到17％(V/V)、将尿素增量到25mg/ml及将葡萄糖增量到416μg/ml的试样的喇曼光谱图。

图27是表示在正常尿中，将丙酮增量到17％(V/V)、将尿素增量到50mg/ml及将葡萄糖增量到1.17mg/ml的试样的喇曼光谱图。

图28是表示尿中的尿素浓度与波数1008cm^-1的喇曼散射光强度的相关图。

图29是表示尿中的尿素浓度与波数为1063cm^-1的喇曼散射光强度的相关图。

图30是表示尿中的尿素浓度与波数在1168cm^-1的喇曼散射光谱强度的相关图。

图31是表示尿中的尿素浓度与波数为531cm^-1的喇曼散射光强度的相关图。

图32是表示尿中的尿素浓度与波数为597cm^-1的喇曼散射光强度的相关图。

图33是表示尿中的尿素浓度与波数为1613cm^-1的喇曼散射光强度的相关图。

图34是表示尿中的丙酮浓度与波数为805cm^-1的喇曼散射光强度的相关图。

图35是表示尿中的丙酮浓度与波数为1237cm^-1的喇曼散射光强度的相关图。

图36是表示尿中的丙酮浓度与波数为1429cm^-1的喇曼散射光强度的相关图。

图37是表示尿中的丙酮浓度与波数为2941cm^-1的喇曼散射光强度的相关图。

图38是表示尿中的葡萄糖浓度与波数为2924cm^-1的喇曼散射光强度的相关图。

图39是表示在正常尿中，将白蛋白增量约0.66mg/ml和将乙酰醋酸锂增量约1.4mg/ml的试样的喇曼光谱图。

图40是表示尿中的白蛋白浓度与波数为620cm^-1的喇曼散射光强度的相关图。

图41是表示尿中的乙酰醋酸锂浓度与波数为829cm^-1的喇曼散射光强度的相关图。

图42是表示在正常尿中，将尿胆素增量约0.13mg/ml和将双牛胆红素增量约0.286mg/ml的试样的喇曼光谱图。

图43是表示尿中的尿胆素浓度与波数为2370cm^-1的喇曼散射光强度的相关图。

图44是表示尿中的双牛胆红素浓度与波数为1263cm^-1的喇曼散射光强度的相关图。

图45是表示在正常尿中，将乙酰醋酸锂增量13.3mg/ml的试样的喇曼光谱图。

图46是表示在正常尿中，将β-羟基丁酸，增量到16％(V/V)的试样的喇曼光谱图。

图47是表示在正常尿中，将球蛋白增量30mg/ml的试样的喇曼光谱图。

图48是表示在正常尿中，将血红蛋白增量30mg/ml的试样的喇曼光谱图。

图49是表示在正常尿中，将双牛胆红素增量0.3mg/ml的试样的喇曼光谱图。

图50是表示在正常尿中，将亚硝酸钠增量55.28mg/ml的试样的喇曼光谱图。

图51是表示在蒸馏水中，将尿酸增量到饱和量的试样的喇曼光谱图。

图52是表示在蒸馏水中，将叶酸增量到饱和量的试样的喇曼光谱图。

图53是表示在蒸馏水中，将L-抗坏血酸增量到饱和量的试样的喇曼光谱图。

图54是表示在蒸馏水中，将维生素B₂增到饱和量的试样的喇曼光谱图。

图55是表示在蒸馏水中，将肌酸1水合物增到饱和量的试样的喇曼光谱图。

图56是表示在蒸馏水中，将肌酸酐增到饱和量的试样的喇曼光谱图。

图57是表示在蒸馏水中，将α-淀粉酶增到饱和量的试样的喇曼光谱图。

图58是表示在蒸馏水中，将β-淀粉酶增到饱和量的试样的喇曼光谱图。

图59是表示在蒸馏水中，将氨增量到25％(V/V)的试样的喇曼光谱图。

图60是表示在蒸馏水中，将肌醇增到饱和量的试样的喇曼光谱图。

图61是表示在蒸馏水中，将半乳糖增到饱和量的试样的喇曼光谱图。

图62是表示在蒸馏水中，将果糖增到饱和量的试样的喇曼光谱图。

图63是表示各体液中成分的测定波数的图。

图64是表示对于提取的体液中成分，各自浓度和喇曼散射光强度的相关系数的图表。

图65是表示尿中的多个成分的通过多变量回归分析法算出的计算值和实测值的相关图。

图2～图7中，表示实施本发明测定装置的几个例子。

图2是概略地表示该测定装置的图，它配备有：设置有将激发光源及来自该激发光源的光束分割成试样用光束及校正用光束的光束分离器的激发光源部2、在试样上照射试样用光束的试样部4、备有从在试样上照射试样用光束产生的散射光中除去与激发光相同波长成分，并取出含有萤光及喇曼散射光的测定对象光的滤波器及调节光束的光学系统的测定对象光学调节部6、在激发光源部2调节通过半反射镜分割的校正用光束的校正光学调节部8、将从测定对象光学调节部6射出的光束及从校正光学调节部8射出的校正用光束置于同一光轴上的合波装置10、备有将由合波装置10射出的光束进行分光的分光器及检出用该分光器分光的光谱光的检出器的1个分光处理部12及以通过分光处理部12的检出器检出的分光光谱中的激发光成分的检出强度为基准，具有校正测定对象光强度功能的数据处理部14。

校正用光束是用以校正光源的发光强度变动的，只要不进行这样的校正，就不需要在激发光源部的光束分离器、校正光调节部8及合波装置10。

测定对象光学调节部6的滤波装置，优选的是从其激发光波长包括在陷波区域的全息陷波滤波器、隐蔽激发光波长及其相近的短波长的截止滤波器、具有使激发光波长成分透过、除去，使测定对象光成分反射的特性的带通滤波器、及通过透射或反射除去激发光波长的全息光束分离器中选取任何一种。

另外，分光处理部12，优选的是配置多道光检出器、同时检出要测定的波长区域的多色仪。分光处理部12是多色仪时，可同时检出要测定的波长区域，同时可检出规定区域的测定对象光光谱和激发光。其结果，测定对象光的各波长的检出时间和激发光的检出时间没有差异。但即使测定对象光的各波长的检出时间和激发光的检出时间有差异时，作为分光处理部12，也可以配置波长扫描型的分光器及单道光检出器，依次检出要测定的波长区域。

全息陷波滤波器是只遮蔽所希望的波长区域，可透过其他区域波长光的。通过在该遮蔽区域(陷波区域)含有激发光波长那样设定，从测定对象光学调节部6射出的光束，不含有激发光成分，只含有测定对象光成分。另一方面，由于校正用光束、只含有从光源来的激发光，不经过试样，所以不依靠试样，可忠实地表示来自光源的强度变化。

图3～图7中，详细地表示图2方框图的具体的例子。

图3是表示使用在陷波区域含有激发光波长的全息陷波滤波器，或含有激发光波长并屏蔽其短波长侧的截止滤波器作为测定对象光学调节部6的滤波装置，对于试样，与激发光成180度方向接受测定对象光的实施例。在激发光源部2设置光源22，设置半反射镜26作为将来自光源22的激发光分割成试样用光束20s及校正用光束20r的光束分离器。作为光源22，例如可使用激光装置。作为激光装置，可使用连续发振的Ar离子激光、Kr离子激光、He-Ne激光、He-Cd激光、Nd：YAG激光、半导体激光、或脉冲激光等，可从近紫外区域到近红外区域的广泛波长范围的激光中选择利用。作为激光装置以外的光源，也可将卤素灯等发生多波长的光源与分光器等的波长选择装置组合使用。

在激发光源部2上，为了将试样用光束20s集束在试样部4的试样5上，在光源聚光透镜24及集束透镜28中间设置半反射镜。将试样5放入室中并设置在试样部4。

来自激发光源部2的试样用光束20s，用配置在测定对象光学调节部6的半反射镜32进行反射，照射在试样部4的试样5上。对于测定对象光学调节部6，为了将来自能透过半反射镜32的来自试样5的散射光集束到分光器的入口狭缝50上，设有聚光透镜34、36。对于测定对象光学调节部6，作为在集光透镜34和36之间除去与激发光相同波长成分并取出测定对象光的滤波器，是配置在陷波区域含有激发光波长那样设定的全息陷波滤波器38.全息陷波滤波器例如可从KAISER OPTICAL SYSTEMS。INC.(美国)得到。全息陷波滤波器38，具有可完全遮蔽含有陷波区域的波长光，透过80％以上的陷波区域以外的波长区域的光的特性。

在测定对象光学调节部6的集光透镜36和分光器的入口狭缝50之前，配置半反射镜40，作为合波装置，测定对象光透过该半反射镜40，入射到分光器52中。

在激发光源部2设置将用半反射镜26分割的校正用光束20r导向合波装置的半反射镜40的校正光学调节部8，在校正光学调节部8中设置有：使光量衰减的减光滤波器42、遮蔽在激发光源部2的半反射镜26发生的波长光，并在光源22是激光装置时用以遮蔽激光侧带的带通滤波器46、及弯曲光路的镜子44。用校正光学调节部8，经过半反射镜40，导入到入口狭缝50的校正用光束20r，通过光源聚光透镜24，聚光到入口狭缝50上。

用半反射镜40，将从测定对象光学调节部6射出的测定对象光及从校正光学调节部8导入的校正用光束20r，导入到同一光轴上，经过入口狭缝50，导入到分光处理部12的分光器52中。分光器52是多色仪，它配置有将入射光分光的衍射栅板54及多道光输出器56，所说的多道光输出器56为了在规定的波长区域同时检出由衍射栅板54分光的光谱光，沿着衍射栅板54的分散方向配置多个光检出元件。图2的衍射栅板54是凹面衍射栅板，但也可以是将平面衍射栅板与球面镜组合的称为策尔尼-塔纳型的分光器及使用透过型衍射栅板的分光器。

60是控制各部的动作，处理光检出器56检出的信号的处理运算控制部，在其中也包括以通过光检出器56检出的分光光谱中的激发光成分的检出强度为基准，校正测定对象光的检出强度的作为数据处理部的功能，运算校正光源的变动的喇曼散射光谱，由测定对象光强度，进行试样的定性及定量。62是输出用处理运算控制部60处理的数据的打印及显示等的输出装置。

在图3的实施例中，也可使用具有遮蔽激发光及比其短波长侧的尖锐波长特性的尖锐截止滤波器代替全息陷波滤波器38。

以下说明该实施例的动作原理，来自光源部2的试样用光束24s，用配置在测定对象光学调节部6的半反射镜32进行反射，照射在试样部4的试样5上。来自试样5的散射光经过测定对象光学调节部6，除去与激发光相同波长的成分，经过半反射镜40，从入口狭缝50，入射到分光器52中。另一方面，在激发光源部2用半反射镜26分割的校正用光束20r，经过校正光学调节器8，调节光量，再经过半反射镜40，从入口狭缝50，入射到分光器52中。通过校正用光束20r来校正由于激发光强度的变动而引起的光谱光强度的变动，检出各成分的光散射光谱强度。

图4是与图3的实施例相同，是使用全息陷波滤波器或截止滤波器作为测定对象光学调节部6的滤波装置的实施例，是表示对着试样在与激发光成90度方向，接受测定对象光的实施例。此时，将试样用光束20s照射在试样5上不需要将来自试样5的散射光入射到测定对象光学调节部6的聚光透镜34的半反射镜32，试样用光束20s用激发光光源部2的光源聚光透镜24及集束透镜28集束，直接照射到试样5上，来自试样5的散射光直接入射到测定对象光学调节部6的聚光透镜34上。

在图3中带通滤波器46配置在校正光学调节部的光路上，但在图4中，配置在通过光束分离器26将来自激发光源部的激发光源的光束分割成试样用光束及校正用光束之前的光路上。通过将带通滤波器46配置在图4的位置上，可遮蔽来自试样用光束及校正用光束两方面激光的侧带。

另外，在图4中，在校正光学调节部的光路上进而配置聚光透镜45，但该透镜45是将校正用光束聚光到狭缝50的位置的光量调节用透镜，在校正用光束的光量足够大时，不需要该透镜45。

图5A是表示使用具有反射激发光并透过喇曼光的特性的全息光束分离器70作为测定对象光学调节部6的滤波装置，对着试样与激发光成180度方向接受测定对象光的实施例。

全息光束分离器70，如图5B所示，将试样用光束20s进行反射，照射在试样5上，在含有测定对象光和瑞利散射光的来自试样5的散射光72中，只透过测定对象光74，入射到测定对象光学调节部6的聚光透镜34中。

图6A是表示使用具有透过并除去激发光波长成分反射测定对象光成分的特性的带通滤波器82，作为测定对象光学调节部6的滤波装置，对着试样，在与激发光成90度方向，接受测定对象光的实施例。

带通滤波器82，如图6B所示，配置在透射聚光型镜80的镜面侧，在与透射聚光型镜80相反侧，配置光束终止器84。来自含有测定对象光及瑞利散射光的试样5的散射光72，用聚光透镜34a、34b，进行聚光，从透射聚光型镜80的背面，通过其入射孔，入射到带通滤波器82中。在带通滤波器82中，瑞利光76透过并被光束终止器84吸收，测定对象光74反射，在透过聚光型镜80的镜面上聚光，经过半反射镜40，从入口狭缝50，入射到分光器中。在校正光学调节部8中，为了将光路弯曲180度，配置2个镜子44a、44b。

图7与图6A相同是使用具有使激发光波长成分透过并除去而反射测定对象光成分的特性的带通滤波器82作为测定对象光学调节部6的滤波装置的例子，是对着试样在与激发光成180度方向上，接受测定对象光的实施例。将试样用光束20s照射在试样5上，配置将来自试样5的散射光入射到测定对象光学调节部6的聚光透镜34a上的半反射镜32。

图8是表示使用流动室时，被测定物质111的流入及排出的路径图。被测定物质111，从检体液流入管线132，流入到室支架130内的流动室中，从开在室支架130的侧面的激发光入射窗134入射的激发光，照射在该流动室中，在流动室中激发起的喇曼光，从喇曼光射出窗136出来，进入到测定对象光学调节部6中。测定后，被测定物质111，通过检体液排出管线138，废弃到废液瓶140中。另外，该检体液排出管线138，也可直接与下水道等水路相通。

在图8的流动室中，将相对于激发光的测定对象光的受光方向θ，作成90°，但不受此限制，只要在0°≤θ＜360°的任何位置上，有喇曼光射出窗136就可以。

图9～图15，表示对于作为尿中蛋白的白蛋白、γ-球蛋白及血红素的各自的水溶液进行测定的结果。

实施例1

图9和图10是关于白蛋白水溶液(来自人体血清)的测定结果。图9(A)是作为激发光源，使用He-Ne激光(输出7mW)，将其632.8nm的波长光作为激发光，照射在试样水溶液上得到的光散射光谱、图9(B)是在相同试样中，作为激发光源，使用Ar激光(输出10mW)将其514.5nm的波长光作为激发光，照射在试样水溶液，得到的光散射光谱。任何一种光谱，都从激发波长在100～3100cm^-1或其以上范围作成宽的形状。

图10(A)是表示利用图9(A)的光散射光谱，测定其偏移波数为829cm^-1的位置的光谱强度与试样中白蛋白浓度的相关关系的结果。图10(B)是表示，在同样的图9(A)的光谱中，测定偏移波数为256～1620cm^-1范围的面积与试样中白蛋白浓度的相关关系的结果。

图10的相关关系，表示了任何相关系数R为0.99以上的良好的结果，通过将这些相关关系作为标准曲线来利用，可定量分析试样中的白蛋白浓度。

实施例2

图11～图13，是关于γ-球蛋白水溶液(来自人体血清)的测定结果。图11(A)是使用He-Ne激光(输出7mW)作为激发光源，将其632.8nm波长光作为激发光照射在试样水溶液中得到的喇曼光谱、图11(B)，是在相同试样中，使用Ar激光(输出10mW)作为激发光源，以其514.5nm的波长光作为激发光照射在试样水溶液中得到的光散光谱.

图11(A)的光谱，是在从激发波长100～4000cm^-1的宽形状光谱中，从激发波长偏移到175～195cm^-1、425～450cm^-1、640～670cm^-1、820～845cm^-1、845-870cm^-1、1370～1400cm^-1、1575～1620cm^-1、1850～1900cm^-1、2000～2200cm^-1、2350～2400cm^-1及2400～2460cm^-1的位置上，具有尖锐峰。图11(B)的光谱，成为从激发波长到100～4000cm^-1的宽形状。

图12和图13的(A)～(F)是表示利用图11(A)的光谱，测定其偏移波数分别为837.257cm^-1、1383.49cm^-1、1592cm^-1、1877cm^-1、2125cm^-1及2370cm^-1位置的光谱强度与试样中γ-球蛋白浓度的相关关系的结果。

(D)的相关关系的相关系数R表0.97以上、其以外的相关关系的相关系数R表示为0.99以上的优良结果。即使对于在其他的偏移波数位置的峰强度及适当的波数范围的积分强度，也可得到与γ-球蛋白浓度之间的优良的相关关系。

通过将这些相关关系作为标准曲线进行利用，可定量分析试样中的γ-球蛋白浓度。

实施例3

图14和图15是关于血红蛋白水溶液(来自牛血清)的测定结果。图14(A)是使用He-Ne激光(输出7mW)作为激发光源，将其632.8nm波长光作为激发光，照射在试样水溶液上，得到的光散射光谱，图14(B)是对于相同的试样，使用Ar激光(输出10mW)作为激发光源，将其514.5nm波长光作为激发光，照射在试样水溶液得到的光散射光谱。

图14(A)的光谱，是激发波长在100～4100cm^-1的宽形状光谱中，在激光波长偏移到640～670cm^-1、820～845cm^-1、1370～1400cm^-1、1575～1620cm^-1、1850～1900cm^-1、2000～2200cm^-1、2350～2400cm^-1及2400～2460cm^-1的位置上具有尖锐峰。图14(B)的光谱，作成激发波长在100～4100cm^-1的宽形状。

图15(A)～(C)，是表示利用图14(A)的光散射光谱，测定其移位波数分别为1870cm^-1、2125cm^-1及2370cm^-1位置的光谱强度与试样中的血红蛋白浓度的相关关系的结果。

任何相关关系的相关系数R都显示0.99以上的优良结果。通过利用这些相关关系作为标准曲线，可定量分析试样中的血红蛋白浓度。

实施例4

正常尿的喇曼测定

图16是正常尿的喇曼光谱。1000cm^-1附近的峰是来自尿素的，1650cm^-1附近及3000～3700cm^-1附近的峰是来自作为溶剂的水的。

实施例5

使用喇曼分光法定量尿中白蛋白

图17和18，是对于正常尿进行白蛋白的增量试验的结果。图17是表示在正常尿中，将白蛋白增量约15mg/ml的试样的光谱。由于尿中存在的多个成分以不同的浓度而存在，所以成为复合的光谱。图18表示研究该光谱的2370cm^-1的强度与浓度的相关关系的结果。

实施例6

使用喇曼分光法的尿中葡萄糖的定量

图19及图20是对于正常尿进行葡萄糖增量试验的结果。图19是表示对于正常尿将葡萄糖增量到饱和的试样的光谱。图20是研究该光谱波数0～4000cm^-1的喇曼光谱强度与浓度的相关关系的结果。

实施例7

使用喇曼分光法的尿中尿素的定量

图21及图22是对于正常尿进行尿素的增量试验的结果。图21是表示对于正常尿，将尿素增量300mg/ml的试样的光谱。图22是研究该光谱的1008cm^-1强度与浓度的相关关系的结果。

实施例8

使用喇曼分光法的尿中丙酮的定量

图23及24是对于正常尿，进行丙酮增量试验的结果。图23是表示对于正常尿进行丙酮增量60％(V/V)的试样的光谱。图24是研究该光谱1080cm^-1的强度与浓度的相关关系的结果。

实施例9

使用喇曼分光法的尿中丙酮、尿素及葡萄糖的同时定量

图25～27是对于正常尿，分别以不同浓度添加丙酮、尿素及葡萄糖进行测定的结果。图25是对于正常尿，添加丙酮达37.5％(V/V)的试样的光谱。图26是对于正常尿，添加丙酮为17％(V/V)、尿素为25mg/ml、葡萄糖为416μg/ml的试样的光谱，图27是添加丙酮为17％(V/V)、尿素为50mg/ml、葡萄糖为1.17mg/ml的试样光谱。

图28～图33是关于尿素在1008cm^-1、1063cm^-1、1168cm^-1、531cm^-1、597cm^-1及1613cm^-1的波数位置上，喇曼光谱强度与浓度的相关结果。

另外，图34～37，是关于丙酮在805cm^-1、1237cm^-1、1429cm^-1及2941cm^-1的波数位置，同样地取得相关结果，图38是关于葡萄糖在2924cm^-1的波数位置，同样地取得相关结果。任何一个相关系数R都是0.9以上，得到了优良的结果。

实施例10

使用喇曼分光法的尿中蛋白及乙酰醋酸锂的同时定量

图39～41是对于正常尿，分别以不同浓度添加白蛋白及乙酰醋酸锂进行测定的结果。图39是添加白蛋白为0.66mg/ml、乙酰醋酸锂为1.4mg/ml的试样的光谱。

图40是研究关于白蛋白的620cm^-1的强度与浓度的相关关系的结果。

另外，图41是研究关于乙酰醋酸锂在829cm^-1的强度与浓度相关关系的结果。任何一个相关系数R都是0.9以上，得到了优良结果。

实施例11

使用喇曼分光法的尿中尿胆素及双牛胆红素的同时定量

图42～44是对于正常尿，分别以不同浓度添加尿胆素及双牛胆红素，进行测定的结果。图42是将尿胆素添加到0.13mg/ml、将双牛胆红素添加到0.286mg/ml的试样的光谱。

图43是研究关于尿胆素，2370cm^-1的强度与浓度的相关关系的结果。另外，图44是研究关于双牛胆红素，1263cm^-1的强度与浓度的相关关系的结果。任何一个的相关系数都是0.9以上，得到优良的结果。

实施例12

使用喇曼分光法的尿中成分的检出

图45～50是对于正常尿，分别添加乙酰醋酸锂(13.3mg/ml)、β-羟基丁酸(16％，V/V)、球蛋白(30mg/ml)、血红蛋白(30mg/ml)、双牛胆红素(0.3mg/ml)、亚硝酸钠(55.28mg/ml)，进行测定的结果。

确认任意峰的强度变化，可确认其是否存在。例如，对于图45的乙酰醋酸锂，在829cm^-1时，出现正常尿光谱得不到的喇曼峰。由此，可确认乙酰醋酸锂的存在。同样，只要确认分别出现在图46的β-羟基丁酸的1630cm^-1的峰、特别是图47的球蛋白的852cm^-1的峰、图48的血红蛋白时的1592cm^-1的峰、图49的双牛胆红素时的1616cm^-1的峰、图50的亚硝酸钠时的813cm^-1的峰，就可确认其是否存在。

实施例13

使用喇曼分光法的体液中成分的检出

图51～62是对于蒸馏水，将尿酸、叶酸、L-抗坏血酸、维生素B₂、肌酸1水合物、肌酸酐、α-淀粉酶、β-淀粉酶分别添加到饱和量、氨添加到25％(V/V)、肌醇、半乳糖、果糖，分别添加到饱和量，进行测定的结果。

与实施例12相同，确认任意的峰的强度变化可确认其是否存在。通过分别确认对于图51的尿酸，出现670cm^-1的峰、对于图52的叶酸，出现661cm^-1的峰、对于图53的抗坏血酸，出现1703cm^-1的峰、对于图54的维生素B₂，出现890cm^-1的峰、对于图55的肌酸1水合物，出现830cm^-1的峰、对于图56的肌酸酐，出现695cm^-1的峰、对于图57的α-淀粉酶出现1864cm^-1的峰、对于图58的β-淀粉酶，出现898cm^-1的峰、对于图59的氨，出现3407cm^-1的峰、对于图60的肌醇，出现443cm^-1的峰、对于图61的半乳糖，出现495cm^-1的峰、对于图62的果糖，出现599cm^-1的峰，可确认其是否存在。

图63是表示各成分的测定波数的图表。选择用虚线围起来的波数位置，可以避免峰的重复、混合。另外，只要在测定总蛋白量时选择2370cm^-1附近、测定总酮体时选择2940cm^-1附近进行测定，就可以。

另外，如图64所示，对于任何种被测定物质，所得到的相关系数列于一览表中，可确认本发明的精度。

使用多变量回归分析等的解释方法，可进一步精确地进行测定。

实施例14

使用多变量回归分析的尿中多种成分的同时测定

在正常尿中，分别以任意组合添加尿素150mg/dl、300mg/dl、450mg/dl，添加亚硝酸钠600mg/dl、1.2g/dl、1.8mg/dl，添加丙酮300mg/dl、600mg/dl、900mg/dl，进行光谱测定，用多变量回归分析，进行浓度的定量。

尿中存在的任意物质浓度C，可用下式近似计算。 $C=\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}k\left(\mathrm{\λi}\right)\·A\left(\mathrm{\λi}\right)$

K(λi)：波数λi时的比例常数

A(λi)：波数λi时的喇曼光强度

K(λi)是在多变量回归分析的步骤中决定的以使与分析值已知试样的浓度、与推定浓度的相关系数保持最高。此外，这种计算是预先存贮在市售的处理用软件中后自动进行的，对于每次要得到浓度的尿中物质，适用此公式。

按照图54的流程图进行从光谱测定到浓度定量的处理。本例中，不进行一切前处理，作为处理用的软件是使用パ-キンエルマ社的QUANT+。作为处理方法，采用PCR法。另外在进行全面评价时，可以省去对校正模型精度的评价。

图65是本例中得到的计算值与实测值(参照值)的相关图，相关系数R和SEP对于尿素是0.986和18.13、对于亚硝酸钠是0.992和57.17、对于丙酮是0.956和69.74。其中SEP是预测标准偏差，用以下计算式算出 $\mathrm{SEP}=\sqrt{\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{(\mathrm{di}-D)}^2/{(n-1)}^2}$

di：用校正模型的计算值与实测值之差

D：di的平均值

n：评价用试样的数

SEP值小的表示校准模型的精度高。

Claims (9)

1.蛋白质的测定方法，其特征是在含有蛋白质的试样溶液中照射单一波长的激发光，接受来自该试样溶液的散射光，分光后得到散射光谱，在该散射光谱中，相对于激发波长的偏移波数来说，使用100～3100cm^-1的光谱波峰强度或其中适当范围的积分值定量测定蛋白质。

2.根据权利要求1的蛋白质的测定方法，其中的蛋白质是白蛋白，使用从激发波长偏移到810～840cm^-1的光谱波峰强度或者从激发波长632.8nm偏移到256～1620cm^-1或从激发波长514.5nm偏移到837～3060cm^-1的光谱的适当范围的积分值。

3.根据权利要求1的蛋白质的测定方法，其中的蛋白质是γ-球蛋白，使用从激发波长偏移到175～195cm^-1、425～450cm^-1、640～670cm^-1、820～845cm^-1、1370～1400cm^-1、1575～1620cm^-1、1850～1900cm^-1、2000～2200cm^-1、2350～2400cm^-1或2400～2460cm^-1的光谱波峰强度。

4.根据权利要求1的蛋白质的测定方法，其中的蛋白质是血红蛋白，使用从激发波长偏移到640～670cm^-1、820～845cm^-1、1370～1400cm^-1、1575～1620cm^-1、1850～1900cm^-1、2000～2200cm^-1、2350～2400cm^-1或2400～2460cm^-1的光谱波峰强度。

5.测定方法，其特征是对于要测定的体液中的各成分，预先选择该成分浓度与喇曼散射光谱强度相关良好的波数作为该成分固有的测定波数，

对于体液试样照射激发光，测定将要测定各成分的各个测定波数下的喇曼散射光谱强度或各个测定波数范围的喇曼散射光谱累积强度，

对于各成分，利用对各个测定波数下的喇曼散射光谱强度或各个测定波数范围的喇曼散射光谱累积强度与该成分的浓度预先作成的标准曲线，同时定性、定量地分析体液中的各成分。

6.根据权利要求5的测定方法，其特征是通过多变量回归分析，同时定性、定量地分析体液试样中的多种成分。

7.根据权利要求5所述的测定方法，其特征是它是在权利要求1或2所记载的各成分浓度与喇曼散射光谱强度良好的波数是相关系数R为0.8以上、优选的是0.9以上的波数的方法，

其中相关系数R是用下式计算出的值 $R=\frac{\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}\left\{(\mathrm{xi}-X)(\mathrm{yi}-Y)\right\}}{\sqrt{\left[\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{(\mathrm{xi}-X)}^2\right]\left[\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{(\mathrm{yi}-Y)}^2\right]}}$

xi：体液中成分的各点浓度

yi：对于xi的喇曼散射光谱强度

X：体液中成分的各点浓度平均值

Y：喇曼散射光谱强度的平均值

8.根据权利要求5的测定方法，其特征是作为要测定的体液成分，含有白蛋白、球蛋白、血红蛋白、葡萄糖、乙酰醋酸锂、β-羟基丁酸、丙酮、双牛胆红素、尿胆素、亚硝酸钠、尿素、尿酸、叶酸、抗坏血酸、维生素B₂、肌酸1水合物、肌酸酐、α-淀粉酶、β-淀粉酶及氨中的至少一种成分，各成分测定的波数或测定的波数范围如下：

对于白蛋白从590～650cm^-1附近、800～860cm^-1附近、2342～2402cm^-1附近选择；

对于球蛋白从158～218cm^-1附近、402～462cm^-1附近、623～683cm^-1附近、807～867cm^-1附近、822～862cm^-1附近、1353～1413cm^-1附近、1562～1622cm^-1附近、1847～1907cm^-1附近、2095～2155cm^-1附近、2340～2400cm^-1附近、2403～2463cm^-1附近选择、

对于血红蛋白从807～867cm^-1附近、893～953cm^-1附近、1353～1413cm^-1附近、1562～1622cm^-1附近、1840～1900cm^-1附近、2095～2155cm^-1附近、2340～2400cm^-1附近、2403～2463cm^-1附近选择；

对于葡萄糖从200～554cm^-1附近、810～944cm^-1附近、2590～2940cm^-1附近选择；

对于乙酰醋酸锂从799～859cm^-1附近、1353～1413cm^-1附近、1840～1900cm^-1附近、2347～2407cm^-1附近、2907～2967cm^-1附近选择；

对于β-羟基丁酸从1420～1480cm^-1附近、1557～1617cm^-1附近、1600～1660cm^-1附近、2870～2971cm^-1附近选择；

对于丙酮从775～845cm^-1附近、1050～1110cm^-1附近、1207～1267cm^-1附近、1399～1459cm^-1附近、1680～1740cm^-1附近、2911～2971cm^-1附近选择；

对于双牛胆红素从927～987cm^-1附近、1233～1293cm^-1附近、1586～1616cm^-1附近选择；

对于尿胆素从332～2900cm^-1的任意位置选择；

对于亚硝酸钠，从783～843cm^-1附近、1318～1378cm^-1附近选择；

对于尿素从501～561cm^-1附近、567～627cm^-1附近、978～1048cm^-1附近、1033～1093cm^-1附近、1138～1198cm^-1附近、1583～1643cm^-1附近选择；

对于尿酸从640～700cm^-1附近选择；

对于叶酸从631～691cm^-1附近、816～876cm^-1附近、901～961cm^-1附近、1355～1415cm^-1附近、1562～1622cm^-1附近、1847～1907cm^-1附近、2093～2153cm^-1附近、2339～2399cm^-1附近、2400～2460cm^-1附近选择；

对于抗坏血酸从800～860cm^-1附近、1673～1733cm^-1附近、2919～2979cm^-1附近选择；

对于维生素B₂从404～464cm^-1附近、626～686cm^-1附近、798～858cm^-1附近、860～920cm^-1附近、1317～1377cm^-1附近、1546～1606cm^-1附近、1834～1894cm^-1附近、2106～2166cm^-1附近、2360～2420cm^-1附近、2419～2479cm^-1附近选择；

对于肌酸1水合物从800～860cm^-1附近、1563～1623cm^-1附近选择；

对于肌酸肝从538～598cm^-1附近、580～640cm^-1附近、665～725cm^-1附近、817～877cm^-1附近、868～928cm^-1附近、1021～1081cm^-1附近、1550～1610cm^-1附近、2868～2900cm^-1附近、2900～2950cm^-1附近、2950～2996cm^-1附近选择；

对于α-淀粉酶从393～453cm^-1附近、631～691cm^-1附近、792～852cm^-1附近、868～928cm^-1附近、1333～1393cm^-1附近、1546～1606cm^-1附近、1834～1894cm^-1附近、2334～2394cm^-1附近选择；

对于β-淀粉酶从376～436cm^-1附近、622～682cm^-1附近、783～843cm^-1附近、868～928cm^-1附近、1334～1394cm^-1附近、1546～1606cm^-1附近、1834～1894cm^-1附近、2665～2725cm^-1附近选择；

对于氨从3190～3250cm^-1附近、3292～3350cm^-1附近、3377～3437cm^-1附近选择；

对于肌醇从404～464cm^-1附近、805～865cm^-1附近、1014～1074cm^-1附近、1438～1498cm^-1附近、2966～3026cm^-1附近选择；

对于半乳糖从466～526cm^-1附近、835、895cm^-1附近、1032～1092cm^-1附近、1237～1297cm^-1附近、1332～1392cm^-1附近、1438～1498cm^-1附近、2946～3006cm^-1附近选择；

对于果糖从569～629cm^-1附近、772～832cm^-1附近、1044～1106cm^-1附近、1237～1297cm^-1附近、1438～1498cm^-1附近、2966～2996cm^-1附近选择。

9.测定方法，其特征是对体液照射激发光，测定预先选择任意波数范围的多个波数下的喇曼散射光谱强度，用多变量回归分析同时定性、定量分析体液试样中的多种成分。

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