CN102854177A - 用拉曼光谱法对待测样品中高铁血红蛋白含量MetHb%进行测定的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了用拉曼光谱法对待测样品中高铁血红蛋白含量MetHb%进行测定的方法，通过确定拉曼光谱法PR-MetHb%推导算式，对待测样品进行拉曼光谱检测并得到其高铁血红蛋白含量MetHb%。本发明具有灵敏度高、结果准确、重复性好、实验步骤简单、分析速度快、试剂无污染、安全的优点，甚至样品无需进行提前处理，隔着包装即可直接进行检测，可以进行实时原位无损检测。本发明可针对无基质血红蛋白、血液代用品或血液中高铁血红蛋白含量的测定，应用前景广阔。

Description

用拉曼光谱法对待测样品中高铁血红蛋白含量MetHb%进行测定的方法

技术领域

本发明涉及对血液保存或血液代用品中高铁血红蛋白(MetHb)含量的测定方法，特别是涉及一种用拉曼光谱法测定高铁血红蛋白(MetHb)含量的方法。

背景技术

目前，供血短缺的情况日益凸显，血液代用品的研发势在必行，高铁血红蛋白（MetHb）含量这一指标在血液代用品质量控制中必不可少。其中,基于血红蛋白的氧载体（HBOCs）是目前研究较多的一类血液代用品，美国FDA已将高铁血红蛋白（MetHb）含量作为HBOCs产品必检指标。现有对血液或血液代用品中MetHb含量的测定方法主要都是利用可见光或紫外光光源产生的光谱测定，主要有氰化物法、计算分光光度法和等吸收点法（阚雪梅，et al.，高铁血红蛋白含量测定方法研究进展.军事医学科学院院刊，(04):p.385-388.）。血液代用品制备过程中会涉及到血红蛋白的改构，改构的血红蛋白光学性质改变，并且其粒径小于可见光波长，测量时引起光散射，导致测量结果不准确。

以上方法用于血液代用品质控时分别存在以下缺陷：

氰化物法测定原理是利用弱酸性条件下加入氰化物与MetHb结合形成MetHb·CN，从而使MetHb的特征吸收峰消失。加入氰化物前后吸收值的变化与MetHb的含量成正比。本测定方法基于吸收值的变化，除MetHb外其他成分在加入氰化物前后吸收值不发生变化，方法准确度不受溶液中其他成分的影响。氰化物法适用于几乎所有红细胞和无基质血红蛋白样品（血红蛋白溶液），不受种属差异的限制。对于HbV（微囊包裹的血红蛋白）等容易引起光散射或膜难以破坏不能完全释放血红蛋白的样品，不能使用以血红蛋白光学吸收特性为基础的测定方法，包括氰化物法。氰化物遇酸或紫外线照射可产生剧毒的HCN气体，试剂保存时间短，所以，氰化物法不适合HBOCs（血红蛋白氧载体）的在线检测。

计算分光光度法是利用物质在一定波长处吸收值与浓度之间呈线性关系及多组分物质在某波长处吸收值等于各组分吸收值之和建立的。利用分光光度计直接测定样品在多个波长处的吸收值来计算MetHb含量，主要有三波长法、四波长法和连续波谱法。计算分光光度法原理多被各种血气分析仪采用。计算分光光度法易受血红蛋白种属来源和溶液pH影响。它是将红细胞溶血后释放血红蛋白，测定样品在某些波长处的吸收值，操作简单、快速、安全，但是计算公式推导过程相对复杂。在推算MetHb含量计算公式时需要特定条件下各成分的消光系数ε，对于文献中无法查到的ε需要实验计算，相对麻烦。

等吸收点法是相同浓度的两种物质在某波长处的吸收值相同，该波长称为这两种物质的等吸收点。如文献（高铁血红蛋白简易测定法，刘兰廷，黄如衡，军事医学科学院院刊，1986年第10卷第3期，229-233）报导，使用兔血进行实验得到，相同浓度的O₂Hb(氧和血红蛋白)和MetHb吸收曲线在某波长处相交，即两者的消光系数相同，当样品总浓度相同，O₂Hb与MetHb比例不同，在该波长处的吸收值仍相同。等吸收点法是利用等吸收点和郎伯比尔定律得到MetHb含量的计算公式：

$\mathrm{MetHb}\%=\frac{\mathrm{Ex}-\mathrm{rE}}{E(R-r)}$

式中，Ex、E分别为635nm与590nm的吸光度；R为100％高铁血红蛋白在635nm和590nm吸光度的比例常数，r为100％血红蛋白在635nm和590nm吸光度的比例常数。等吸收点法r值误差较大，制备100％血红蛋白溶液是利用中性NaCN与MetHb作用形成MetHb·CN，消除MetHb在635nm处最大吸收峰原理，但是MetHb·CN存在干扰，使r值误差较大，590nm处Hb和低浓度MetHb吸收曲线较陡，各种误差因素对590nm处的光密度值影响较大。

如上所述，现有MetHb含量测定方法均是以血红蛋白的光学吸收特性为基础的，遵循朗伯-比尔定律，均适用于天然血液样品的检测。但直接用来测定血液代用品中间品如牛血红蛋白原液(原液为制备血液代用品过程中的重要一个步骤，首先要先采牛血，再进行一系列操作以制备纯化了的血红蛋白溶液，此时制备好的血红蛋白溶液即为原液。此时的原液是有一定标准的，比如病毒活性、高铁血红蛋白含量、pH值等指标，该原液属于无基质血红蛋白)或血液代用品产品可能会存在误差，主要原因有三方面，第一，种属来源影响血红蛋白吸收特性。以牛血红蛋白为原材料研制的血液代用品，牛血红蛋白吸收特性有别于人血红蛋白，而现有测定方法都不是针对牛血红蛋白建立的；第二，对牛血红蛋白原液进行碳合处理得到碳合牛血红蛋白原液，而目前尚无权威的用于碳合牛血红蛋白原液中MetHb含量测定的方法；第三，血红蛋白结构和外源性物质等会改变光学吸收，例如用聚乙二醇（Polyethylene glycol,PEG）修饰Hb、用戊二醛或双阿司匹林进行Hb交联等。同时，血红蛋白微囊、颗粒和凝块等会造成光散射，使测定结果不准确。由于技术保密等原因，公开的资料中只查到了MetHb含量控制范围，MetHb含量测定方法一般作为企业内部资料没有公开。在血液代用品的药效学研究中，一般采用血气分析法测定血液样品中MetHb含量。但是，血气分析仪测定原理属于计算分光光度法，不同血气分析仪测定结果差别较大，无法确定MetHb的真实含量。

另外，在血液保存过程中通常也是以MetHb含量为指标检测血样是否合格。而以上这些方法用于在血液保存过程中检测血样是否合格，均需打开包装测定，这样有可能造成血液污染，并造成样品的浪费。

拉曼光谱即拉曼散射产生的光谱，是以激光为光源，从物质分子非弹性散射产生的分子振动光谱来识别和区分不同的化学结构及官能团。一束光入射于样品后有一部分光发生散射，散射光中的大部分波长与入射光相同，而一小部分由于样品中分子振动和转动的作用波长发生偏移。这种波长发生偏移的光的光谱就是拉曼光谱。将获得和分析拉曼光谱以及与其应用有关的方法和技术称为拉曼光谱术。拉曼光谱术是基于分子能级跃迁，从量子力学角度考察样品成分，待测样品的信息隐含在拉曼光谱各拉曼峰的高度、宽度、面积、位置（频率）和形状中。通过拉曼光谱频率(拉曼光谱的横坐标)的分析可以得到官能团、化学键和电子密度等分子结构及其变化的信息。目前，已有拉曼光谱法应用于血红蛋白研究，主要基于血红蛋白结构研究、血红蛋白反应动力学研究，应用研究包括血氧饱和度、血糖浓度的测量，但是在高铁血红蛋白研究方面较少，且多为定性研究，用作其他血红蛋白拉曼光谱峰归属的比对，主要针对于结构研究，应用研究很少，目前尚没有应用拉曼光谱法测定MetHb含量的报道。

发明内容

为解决现有高铁血红蛋白(MetHb)含量测定中的问题，本发明的目的是提供一种样品无需处理、检测时间短、可实时原位检测的测定高铁血红蛋白(MetHb)含量的方法。

本发明所提供的测定高铁血红蛋白(MetHb)含量的方法，是用拉曼光谱法对待测样品中高铁血红蛋白含量MetHb%进行测定，包括以下步骤：

1）针对待测样品的种类制备不同高铁血红蛋白含量的标准溶液：将质量浓度为10％的K₃Fe(CN)₆溶液以不同体积分别与待测样品混合，得到含有不同高铁血红蛋白含量的标准溶液，用已知的检测方法定值标准溶液中高铁血红蛋白的质量浓度MetHb%；

2）用显微共焦拉曼光谱仪对上述含有不同高铁血红蛋白含量的标准溶液进行检测，测定范围在1200-1300cm^-1之间，得到含有不同高铁血红蛋白含量的标准溶液的拉曼光谱；并对该拉曼光谱进行基线校准后再曲线顺滑；

3）确定拉曼光谱法的测定公式：按算式

计算含有不同高铁血红蛋白含量的标准溶液的PR值,其中I₁₂₁₅为拉曼光谱在拉曼频率为1215cm^-1处的峰强度值，I₁₂₂₇为拉曼光谱在拉曼频率为1227cm^-1处的峰强度值；依据PR值与步骤1）定值的MetHb%值确定线性关系式PR=k1·MetHb%+a，k1为斜率,a为截距，再反推确定拉曼光谱法PR-MetHb%推导算式；

4)按步骤2）的操作测定待测样品的拉曼光谱，并按步骤3）的操作得到待测样品的PR值，代入步骤3）确定的拉曼光谱法PR-MetHb%推导算式，得到待测样品的MetHb%结果。

其中，所述待测样品为无基质血红蛋白、血液代用品或血液，待测样品形式为液体原样或袋装样品，所述种类为动物或人；步骤3）线性关系PR=k1·MetHb%+a中的k1和a的数值需要通过测定相应种类已知高铁血红蛋白含量的样品确定。

所述步骤2）中用origin8.0软件对拉曼光谱进行基线校准和曲线顺滑。

所述步骤1）中所述已知的检测方法包括氰化物法、计算分光光度法、血气分析法和等吸收点法。

具体的，针对牛血红蛋白溶液中的高铁血红蛋白含量MetHb%进行测定，所述步骤1）用等吸收点法定值标准溶液中高铁血红蛋白的质量浓度MetHb%；所述等吸收点法包括：在比色皿中加入50μl不同高铁血红蛋白含量的溶液和3mL缓冲液1/60M pH6.6PBS，用紫外/可见分光光度计测量A590和A630的吸光度，代入MetHb含量的计算公式： $\mathrm{MetHb}\%=\frac{\mathrm{Ex}-\mathrm{rE}}{E(R-r)}$

式中，Ex、E分别为630nm与590nm的吸光度；R为100％高铁血红蛋白在630nm和590nm吸光度的比例常数，为1.27±0.01，r为100％血红蛋白在630nm和590nm吸光度的比例常数，为0.05±0.01，定值得到高铁血红蛋白的标准溶液中高铁血红蛋白的质量浓度。

具体的，针对牛血红蛋白溶液中的高铁血红蛋白含量MetHb%进行测定，步骤3）确定的线性关系式为PR=0.427MetHb%+17.2，确定的PR-MetHb%推导算式为MetHb%=(0.0233PR-0.397)×100%。

本发明另一目的在于直接提供一种针对牛血红蛋白溶液中的高铁血红蛋白质量浓度MetHb%进行测定的方法，包括以下步骤：

1）用显微共焦拉曼光谱仪对待测牛血红蛋白溶液样品进行检测，检测范围设置为1200-1300cm^-1，得到样品的拉曼光谱；用origin8.0软件对该拉曼光谱进行基线校准后再曲线顺滑；

2）读取样品的I₁₂₁₅、I₁₂₂₇数据，I₁₂₁₅为在拉曼频率为1215cm^-1处的峰强度值，I₁₂₂₇为在拉曼频率为1227cm^-1处的峰强度值代入算式

$\mathrm{PR}=\frac{I_{1215}}{I_{1215}+I_{1227}}\×100,$ 计算PR值；

3）将计算得到的PR值代入算式MetHb%=(0.0233PR-0.397)×100%，得到待测牛血红蛋白溶液样品中的高铁血红蛋白质量浓度MetHb%。

该方法中，所述牛血红蛋白溶液样品为没有包装的溶液或有透明包装的袋装溶液。

本发明再一目的在于提供一种针对牛血红蛋白溶液中的高铁血红蛋白含量进行实时在线检测的方法，包括以下步骤：

1）在线取需检测的牛血红蛋白溶液样品；

2）用显微共焦拉曼光谱仪对牛血红蛋白溶液样品进行检测，检测范围设置为1200-1300cm^-1，得到样品的拉曼光谱；用origin8.0软件对该拉曼光谱进行基线校准后再曲线顺滑；

3）读取样品的I₁₂₁₅、I₁₂₂₇数据，I₁₂₁₅为在拉曼频率为1215cm^-1处的峰强度值，I₁₂₂₇为在拉曼频率为1227cm_-1处的峰强度值代入算式

$\mathrm{PR}=\frac{I_{1215}}{I_{1215}+I_{1227}}\×100,$ 计算PR值；

4）将计算得到的PR值代入算式MetHb%=(0.0233PR-0.397)×100%，得到待测牛血红蛋白溶液样品中的高铁血红蛋白质量浓度MetHb%。

本发明还一目的在于提供一种针对袋装保存的血液代用品牛血红蛋白溶液中的高铁血红蛋白含量进行无损检测的方法，包括以下步骤：

1）直接将袋装保存的牛血红蛋白溶液作为检测样品；

2）用显微共焦拉曼光谱仪隔袋对样品进行检测，检测范围设置为1200-1300cm^-1，得到样品的拉曼光谱；用origin8.0软件对该拉曼光谱进行基线校准后再曲线顺滑；

3）读取样品的I₁₂₁₅、I₁₂₂₇数据，I₁₂₁₅为在拉曼频率为1215cm^-1处的峰强度值，I₁₂₂₇为在拉曼频率为1227cm^-1处的峰强度值代入算式

$\mathrm{PR}=\frac{I_{1215}}{I_{1215}+I_{1227}}\×100,$ 计算PR值；

4）将计算得到的PR值代入算式MetHb%=(0.0233PR-0.397)×100%，得到待测样品中的高铁血红蛋白质量浓度MetHb%。

本发明采用以上方案用拉曼光谱法测定了待测样品中的高铁血红蛋白(MetHb)含量，其具有以下优点：

1、灵敏度高；

2、结果准确，重复性好；

3、实验步骤简单；

4、分析速度快；

5、试剂无污染，安全；

6、样品无需进行提前处理，隔着包装即可直接进行实时原位检测，不破坏样品。

以上优点使得该方法能够得以很好的应用，主要为：

1）血液代用品研发和生产过程中，利用拉曼光谱法对于MetHb含量进行实时在线测量，有助于进行质控管理；

2）血液保存中，应用拉曼光谱法可以对保存的血液质量进行实时原位无损检测，以预知其MetHb含量，监控使用以保证用血安全；

3）法医鉴定中，通过拉曼光谱法测定MetHb含量可以判断血液在体外放置时间的长短，推断出作案时间。

附图说明

图1为已知高铁血红蛋白含量的标准溶液拉曼光谱

图2为图1经基线校准、曲线平滑后的拉曼光谱

图3为制备的高铁血红蛋白标准溶液中PR值与MetHb%的线性关系

图4为待测样品拉曼光谱法与等吸收点法测定MetHb%的线性关系

具体实施方式

拉曼光谱法基于分子能级跃迁，从量子力学角度考察样品成分，通过分析拉曼光谱各拉曼峰的高度、宽度、面积、位置（频率）和形状可得到待测样品的多种信息，如样品的分子官能团结构信息，分子对称性、化学键、电子密度等物理信息。拉曼分析通常是非破坏性的，并且不要求作样品预处理，与样品也不作物理接触。这种既容易又方便的与样品对接的界面方式是拉曼光谱优于其他分析方法最重要的特点之一。另外，激光穿透性强，能穿过由玻璃或塑料制成的包装或透明窗口收集拉曼信息，而且对样品没有损伤。拉曼光谱灵敏度高，可进行微量甚至痕量分析。

基于上述拉曼光谱法的特点，发明人进一步研究得知，拉曼光谱以激光为光源，可穿透粒径较小的血液代用品或血红蛋白。因血红素拉曼散射截面大，Hb类拉曼光谱主要反映血红素环的信息，受其他物质干扰小，且反映了更丰富的分子结构特征信息。对于HBOCs来说，建立拉曼光谱法测量MetHb为血液代用品MetHb控制提供了可行性。

因此，本发明提供了一种用拉曼光谱法对高铁血红蛋白(MetHb)含量进行测定的方法。K₃Fe(CN)₆是血红蛋白溶液的强氧化剂，外加入到血红蛋白溶液中,可以使血红蛋白发生氧化，自旋态、氧化态、Fe-配体、Fe-His(近端组氨酸)的状态均会发生变化（血红素中心的Fe离子包裹其周围的蛋白质亚基中的一个组氨酸，它们之前形成的化学键是否变形可以通过拉曼光谱监测），通过相应拉曼光谱（血红蛋白拉曼光谱）可以监测到这些状态变化，并且可以发现几处峰的变化与高铁血红蛋白的生成量呈良好的线性关系。

本发明用拉曼光谱法对样品中高铁血红蛋白含量（MetHb%）进行测定的方法，可包括以下步骤：

1）针对待测样品的种类制备不同高铁血红蛋白含量的标准溶液：将质量浓度为10％的K₃Fe(CN)₆溶液以不同体积分别与500μl待测样品混合，使其中的血红蛋白氧化成为高铁血红蛋白(MetHb)，得到含有不同高铁血红蛋白含量的标准溶液，用等吸收点法或其它已知的检测方法定值标准溶液中高铁血红蛋白的质量浓度（MetHb%）；

2）用显微共焦拉曼光谱仪对上述含有不同浓度高铁血红蛋白的标准溶液进行检测，测定范围（横坐标）在1200-1300cm^-1之间，得到含有不同高铁血红蛋白含量的标准溶液的拉曼光谱；对含有不同高铁血红蛋白含量的标准溶液的拉曼光谱进行基线校准后再曲线顺滑；

3）确定拉曼光谱法的测定公式：随着高铁血红蛋白含量增大，拉曼峰由1227cm^-1向1215cm^-1偏移。设(I₁₂₁₅为拉曼光谱在拉曼频率为1215cm^-1处的峰强度值，I₁₂₂₇为拉曼光谱在拉曼频率为1227cm^-1处的峰强度值)，通过PR值与不同浓度高铁血红蛋白的标准溶液的MetHb%的线性关系，PR=k1·MetHb%+a，k1为斜率,a为截距，再反推确定拉曼光谱法PR-MetHb%推导公式。

4)按步骤2）操作测定未知高铁血红蛋白含量样品（待测样品）的拉曼光谱,通过测定出的I₁₂₁₅与I₁₂₂₇代入得到样品的PR值，再代入步骤3）确定的拉曼光谱法PR-MetHb%推导公式，得到MetHb%结果。

在上述高铁血红蛋白(MetHb)含量的测定方法中，所述待测样品不限于血液保存中的血液、血液代用品、无基质血红蛋白，也可以为动物或人的血液样品，甚至可以为高铁血红蛋白血症患者的血液等，但步骤3）线性关系式中k1和a的数值需要通过测定相应种类已知高铁血红蛋白含量的样品确定。

所述步骤2）中用origin8.0软件对含有不同浓度高铁血红蛋白的标准溶液的拉曼光谱进行基线校准和曲线顺滑。

具体来讲，本发明用拉曼光谱法对牛血红蛋白溶液（无基质血红蛋白样品）中的高铁血红蛋白含量（MetHb%）进行测定的方法，可包括以下步骤：

1）标准溶液的制备：将浓度为10％的K₃Fe(CN)₆溶液0、2、4、6、8、10、13、15、18、40μl分别与500μl牛血红蛋白溶液混合，得到含有不同高铁血红蛋白含量的溶液，用等吸收点法测定溶液中高铁血红蛋白含量，作为标准溶液；

用等吸收点法测定,是在比色皿中加入50μl不同高铁血红蛋白含量的溶液和3mL缓冲液1/60M pH6.6PBS，用紫外/可见分光光度计测量A590和A630的吸光度，代入MetHb含量的计算公式：

（式中，Ex、E分别为630nm与590nm的吸光度；R为100％高铁血红蛋白在630nm和590nm吸光度的比例常数，具体值为1.27±0.01，r为100％血红蛋白在630nm和590nm吸光度的比例常数，具体值为0.05±0.01），定值得到高铁血红蛋白的标准溶液中高铁血红蛋白的质量浓度，分别为6.9%、18.9%、31.1%、41.3%、53.1%、62.1%、76.9%、86.0%、97.2%、98.7%。

等吸收点法高铁血红蛋白(MetHb)含量的测定中波长的确定具有种、属特异性，在实际检测中，不同种、属的动物和人的特征吸收峰（吸光度值）会发生变化，因此需要根据不同种、属的动物和人分别建立标准曲线和直线回归方程。

2）用显微共焦拉曼光谱仪对已确定高铁血红蛋白含量的标准溶液进行检测，检测范围设置为1200-1300cm_-1，得到各标准溶液的拉曼光谱（图1）；用origin8.0软件对该拉曼光谱进行基线校准后再曲线顺滑（图2）；

3）确定拉曼光谱法测定MetHb%的公式：首先从图2中读取各样品的I₁₂₁₅、I₁₂₂₇数据，代入算式

(I₁₂₁₅为图2在拉曼频率为1215cm^-1处的峰强度值，I₁₂₂₇为图2在拉曼频率为1227cm^-1处的峰强度值)，确定PR值（表1）。依据表1数据绘制PR值与标准溶液MetHb%的标准曲线（图3），得到其线性关系（PR=0.427MetHb%+17.2），再推算确定拉曼光谱法测定高铁血红蛋白含量的公式为:MetHb%=(0.0233PR-0.397)×100%。

表1

4）测量待测样品的拉曼光谱，将测得的拉曼光谱进行与步骤2）相同的基线校准和曲线平滑后，用步骤3）的方法确定待测样品的I₁₂₁₅、I₁₂₂₇和PR值，代入公式MetHb%=(0.0233PR-0.397)×100%，即可计算出该样品的MetHb%。

实施例1、应用拉曼光谱法测定未知高铁血红蛋白含量的牛血红蛋白溶液

以牛血红蛋白原液为样品，加入不同体积10%K₃Fe(CN)₆至500μl牛血红蛋白原液样品中得到系列不同含量的高铁血红蛋白溶液（样品11-25），用拉曼光谱法对各溶液中高铁血红蛋白(MetHb)含量进行测定，分别获取1200-1300cm_-1的光谱信息，得到I₁₂₁₅、I₁₂₂₇和PR值，将PR值代入公式：MetHb%=(0.0233PR-0.397)×100%得到各溶液中高铁血红蛋白浓度。通过用前述等吸收点法测定这些溶液的MetHb%，确定拉曼光谱法测定的准确性。测定结果见表2，依此得到的拉曼光谱法与等吸收点法的线性关系见图4。

表2

表2数据表明：拉曼光谱法与等吸收点法测定MetHb%结果绝对误差在5%内；图4说明等吸收点法与拉曼光谱法测定MetHb%呈良好的线性关系。

实施例2、用拉曼光谱法隔着包装（透明材料的血袋）对-20℃保存的牛血红蛋白溶液的高铁血红蛋白(MetHb)含量进行测定

取-20℃下保存时间在360天-674天的袋装牛血红蛋白溶液（样品编号袋1-袋6）。用显微共焦拉曼光谱仪隔着包装（透明血袋）对袋1-袋6进行检测，检测范围设置为1200-1300cm^-1，得到各袋装样品溶液的拉曼光谱；再用origin8.0软件对该拉曼光谱进行基线校准后再曲线顺滑，得到相应I₁₂₁₅、I₁₂₂₇及PR值，将PR值代入公式：MetHb%=(0.0233PR-0.397)×100%得到各袋装样品中高铁血红蛋白浓度。拉曼光谱测定后再拆袋取样，用血气分析法测定溶液中高铁血红蛋白含量，考察拉曼光谱法准确性，测定结果见表3。

表3

表4数据表明:拉曼光谱法与血气分析法平行测定血袋包装血红蛋白溶液中MetHb%，结果绝对误差在5%内,说明拉曼光谱法测定结果准确性高。此例表明，拉曼光谱法可以对袋装产品进行无损检测，无需拆袋取样，实现了原位无损检测。该实例也表明本发明拉曼光谱法在血液保存过程中检测血样是否合格将有非常实际的意义。

Claims (10)

1.用拉曼光谱法对待测样品中高铁血红蛋白含量MetHb%进行测定的方法，包括以下步骤：

1）针对待测样品的种类制备不同高铁血红蛋白含量的标准溶液：将质量浓度为10％的K₃Fe(CN)₆溶液以不同体积分别与待测样品混合，得到含有不同高铁血红蛋白含量的标准溶液，用已知的检测方法定值标准溶液中高铁血红蛋白的质量浓度MetHb%；

2）用显微共焦拉曼光谱仪对上述含有不同高铁血红蛋白含量的标准溶液进行检测，测定范围在1200-1300cm^-1之间，得到含有不同高铁血红蛋白含量的标准溶液的拉曼光谱；并对该拉曼光谱进行基线校准后再曲线顺滑；

3）确定拉曼光谱法的测定公式：按算式计算含有不同高铁血红蛋白含量的标准溶液的PR值,其中I₁₂₁₅为拉曼光谱在拉曼频率为1215cm^-1处的峰强度值，I₁₂₂₇为拉曼光谱在拉曼频率为1227cm^-1处的峰强度值；依据PR值与步骤1）定值的MetHb%值确定线性关系式PR=k1·MetHb%+a，k1为斜率,a为截距，再反推确定拉曼光谱法PR-MetHb%推导算式；

4)按步骤2）的操作测定待测样品的拉曼光谱，并按步骤3）的操作得到待测样品的PR值，代入步骤3）确定的拉曼光谱法PR-MetHb%推导算式，得到待测样品的MetHb%结果。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述待测样品为无基质血红蛋白、血液代用品或血液，待测样品形式为液体原样或袋装样品，所述种类为动物或人；步骤3）线性关系PR=k1·MetHb%+a中的k1和a的数值需要通过测定相应种类已知高铁血红蛋白含量的样品确定。

3.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于，所述步骤2）中用origin8.0软件对拉曼光谱进行基线校准和曲线顺滑。

4.根据权利要求1或2或3所述方法，其特征在于，所述步骤1）中所述已知的检测方法包括氰化物法、计算分光光度法、血气分析法和等吸收点法。

5.根据权利要求1或2或3所述方法，其特征在于，针对牛血红蛋白溶液中的高铁血红蛋白含量MetHb%进行测定，所述步骤1）用等吸收点法定值标准溶液中高铁血红蛋白的质量浓度MetHb%；所述等吸收点法包括：在比色皿中加入50μl不同高铁血红蛋白含量的溶液和3mL缓冲液1/60M pH6.6PBS，用紫外/可见分光光度计测量A590和A630的吸光度，代入MetHb含量的计算公式：

式中，Ex、E分别为630nm与590nm的吸光度；R为100％高铁血红蛋白在630nm和590nm吸光度的比例常数，为1.27±0.01，r为100％血红蛋白在630nm和590nm吸光度的比例常数，为0.05±0.01，定值得到高铁血红蛋白的标准溶液中高铁血红蛋白的质量浓度。

6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，步骤3）确定的线性关系式为

PR=0.427MetHb%+17.2，确定的PR-MetHb%推导算式为

MetHb%=(0.0233PR-0.397)×100%。

7.一种针对牛血红蛋白溶液中的高铁血红蛋白质量浓度MetHb%进行测定的方法，包括以下步骤：

1）用显微共焦拉曼光谱仪对待测牛血红蛋白溶液样品进行检测，检测范围设置为1200-1300cm^-1，得到样品的拉曼光谱；用origin8.0软件对该拉曼光谱进行基线校准后再曲线顺滑；

2）读取样品的I₁₂₁₅、I₁₂₂₇数据，I₁₂₁₅为在拉曼频率为1215cm^-1处的峰强度值，I₁₂₂₇为在拉曼频率为1227cm^-1处的峰强度值代入算式

$\mathrm{PR}=\frac{I_{1215}}{I_{1215}+I_{1227}}\×100,$ 计算PR值；

3）将计算得到的PR值代入算式MetHb%=(0.0233PR-0.397)×100%，得到待测牛血红蛋白溶液样品中的高铁血红蛋白质量浓度MetHb%。

8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述牛血红蛋白溶液样品为没有包装的溶液或有透明包装的袋装溶液。

9.一种针对牛血红蛋白溶液中的高铁血红蛋白含量进行实时在线检测的方法，包括以下步骤：

1）在线取需检测的牛血红蛋白溶液样品；

2）用显微共焦拉曼光谱仪对牛血红蛋白溶液样品进行检测，检测范围设置为1200-1300cm^-1，得到样品的拉曼光谱；用origin8.0软件对该拉曼光谱进行基线校准后再曲线顺滑；

3）读取样品的I₁₂₁₅、I₁₂₂₇数据，I₁₂₁₅为在拉曼频率为1215cm^-1处的峰强度值，I₁₂₂₇为在拉曼频率为1227cm^-1处的峰强度值代入算式

$\mathrm{PR}=\frac{I_{1215}}{I_{1215}+I_{1227}}\×100,$ 计算PR值；

4）将计算得到的PR值代入算式MetHb%=(0.0233PR-0.397)×100%，得到待测牛血红蛋白溶液样品中的高铁血红蛋白质量浓度MetHb%。

10.一种针对袋装保存的血液代用品牛血红蛋白溶液中的高铁血红蛋白含量进行无损检测的方法，包括以下步骤：

1）直接将袋装保存的牛血红蛋白溶液作为检测样品；

2）用显微共焦拉曼光谱仪隔袋对样品进行检测，检测范围设置为1200-1300cm^-1，得到样品的拉曼光谱；用origin8.0软件对该拉曼光谱进行基线校准后再曲线顺滑；

3）读取样品的I₁₂₁₅、I₁₂₂₇数据，I₁₂₁₅为在拉曼频率为1215cm^-1处的峰强度值，I₁₂₂₇为在拉曼频率为1227cm^-1处的峰强度值代入算式

$\mathrm{PR}=\frac{I_{1215}}{I_{1215}+I_{1227}}\×100$ 计算PR值；

4）将计算得到的PR值代入算式MetHb%=(0.0233PR-0.397)×100%，得到待测样品中的高铁血红蛋白质量浓度MetHb%。

Images