ES2222779B1 - Procedimiento de deteccion de proteinas prionicas infectivas (prpsc) por espectroscopia raman-laser. - Google Patents
Procedimiento de deteccion de proteinas prionicas infectivas (prpsc) por espectroscopia raman-laser.Info
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Abstract
Procedimiento de detección de proteínas priónicas infectivas (PrPSc) por espectroscopia Raman-laser. La presente invención proporciona un procedimiento, por espectroscopía Raman-laser, para la detección de proteínas priónicas infectivas (PrPSc) en muestras biológicas de animales afectados de una EET, y su aplicación es extensible a sangre de, entre otros, bovinos, caprinos, humanos y aves. El procedimiento de esta invención, cualitativo y cuantitativo, incluye una primera etapa encaminada a obtener la fracción de la sangre donde están más concentradas las proteínas priónicas infectivas. Los resultados obtenidos por el procedimiento descrito en esta invención sobre el análisis de priones han concordado al 100% con los tests de biodiagnóstico post-mortem de muestras de cerebro realizadas en los correspondientes animales de los que se realizaron extracciones sanguíneas.
Description
Procedimiento de detección de proteínas priónicas
infectivas (PrP^{Sc}) por espectroscopia
Raman-láser.
La invención concierne a un primer sector
correspondiente al área de la seguridad alimentaria, con
subsiguiente aplicación a un segundo sector de la salud y de la
ganadería, en concreto al diagnóstico de EETs en animales vivos.
El escrapie o tembladera es el modelo del grupo
de enfermedades neurodegenerativas, progresivas y de desenlace
fatal, denominadas Encefalopatías Espongiformes Transmisibles
(EETs) animales, entre las que se encuentran la Encefalopatía
Espongiforme Bovina (EEB), la enfermedad crónica caquetizante del
ciervo y la encefalopatía espongiforme transmisible del visón. Otras
enfermedades de este grupo que afectan al hombre son la nueva
variante de la enfermedad de Creutzfeldt Jacob (vCJD), la
enfermedad de
Gerstmann-Sträussler-Jakob y el
insomnio familiar fatal.
Actualmente, el diagnóstico de las EETs tanto
humanas como animales, se basa en la sospecha clínica de la
enfermedad y la confirmación mediante los métodos de diagnóstico
validados y autorizados por la Unión Europea (Reglamento 1248/2001)
para el diagnóstico del escrapie. Todos ellos están basados en
técnicas post-mortem, estableciéndose el uso
de pruebas de diagnóstico rápido para las muestras procedentes del
programa de vigilancia activa, y los métodos establecidos por la OIE
(Organización Internacional de Epizootías) para las muestras
procedentes del Programa de vigilancia pasiva y la confirmación de
los resultados positivos o dudosos de pruebas de diagnóstico
rápido. Estos últimos se basan en la demostración de las lesiones
histopatológicas en el sistema nervioso central y la detección de la
acumulación de las isoformas anormales de las proteínas PrP
(PrP^{sc}) mediante inmunohistoquímica o inmunoblotting.
Las enfermedades priónicas tienen un amplio
espectro de manifestaciones clínicas (demencia, ataxia, insomnio,
paraplegia, etc.) y a nivel molecular se caracterizan por la
presencia de depósitos de proteínas priónicas infectivas
PrP^{sc}
Existe una necesidad urgente para la puesta a
punto de un test analítico rápido y no invasivo de proteínas
priónicas in vivo que evite el sacrificio, como se ha
mencionado, de animales libres de enfermedad y permita la
reconstitución de rebaños con garantía de animales sanos. Bajo esta
perspectiva, la sangre es un fluido biológico de fácil extracción
que se puede utilizar para análisis de proteínas priónicas, sin
necesidad de recurrir a biopsias de tejido cerebral u otros órganos.
En la literatura relacionada con este tema, se ha descrito un test
capaz de detectar proteínas PrP^{sc} en sangre utilizando una
combinación de competición antígeno-anticuerpo y
electroforesis capilar (Schmerr y Jenny, Electrophoresis,
19, 409-414 (1998); Schmerr y cols., J.
Chromatogr. A, 853, 207-214 (1999)). El test es
laborioso y dificil de estandardizar, y depende de una relación de
señales más que de una medida directa de proteínas PrP^{Sc}
Además, los resultados obtenidos con muestras afectadas de escrapie
no se han reproducido en muestras de otras encefalopatías
espongiformes transmisibles (Brown y cols., J. Lab. Clin.
Med., 137, 5-13 (2001)).
La espectroscopía de fluorescencia de correlación
cruzada (Bieschke y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97,
5468-5473 (2000)) se ha utilizado para la detección
de priones en líquido cerebroespinal de pacientes con la enfermedad
de Creutzfeldt-Jakob (CJD). Pero de 24 pacientes
afectados de CJD solamente 5 resultados espectroscópicos fueron
positivos, lo que representa solamente un 20% de aciertos.
En el documento de patente DE 19918141 Al (26
Oct. 2000) se describe por Matthias y cols. un método para el
diagnóstico de mieloencefalopatía espongiforme transmisible (BSE y
escrapie) usando inmunoensayos y RT-PCR. En otro
documento de patente WO 2000052197 Al (8 Sep. 2000) se describe por
Prusiner y Safar un método de detección de proteínas priónicas en
sangre coagulada de Syrian hamsters.
La gran variedad de métodos descritos en la
literatura son, en su mayor parte, de tipo inmunológico y
laboriosos, de tal manera que se necesita más de una jornada de
trabajo. Asimismo, de las manifestaciones públicas de S. B. Prusiner
(conferencia en España en el verano de 2001) y entrevista muy
reciente con el Profesor J. J. Badiola se desprende que los métodos
hasta ahora probados no son fiables. La laboriosidad de los métodos
descritos en la literatura tiene una incidencia directa en el
control de carne en mataderos, ya que la consecución de un método
rápido de biodiagnóstico evitaría un tiempo de almacenamiento de
estos artículos y por tanto, un ahorro tanto de energía de
refrigeración, como de espacio para almacenamiento. Recientemente,
se ha puesto a punto un método por microespectroscopía infrarroja
para diferenciar post-mortem tejido cerebral
de roedores sanos y afectados de escrapie (Kenipp y cols.,
Biochim. Biophys. Acta, 1501, 189-199 (2000);
Naumann y cols., Patente WO 00/72007 A2, 30 Nov. 2000). Pero hasta
ahora no existen antecedentes sobre la aplicación in vivo de
la espectroscopía Raman-láser a la determinación de
proteínas priónicas infectivas PrP^{Sc} en sangre de ovinos
afectados de escrapie. El método descrito en esta invención que
incluye la utilización de esta técnica es sensible y rápido, tiene
la ventaja de que se aplica in vivo sobre una muestra
biológica, entre otras, de fácil extracción como es la sangre; y a
diferencia de los métodos de inmunoensayo y otras técnicas
espectroscópicas como la de fluorescencia, ultravioleta y
electroforesis capilar, no exige el uso de anticuerpos y es por
tanto un método directo, y finalmente proporciona datos
bioanalíticos orientativos sobre el sacrificio selectivo de
determinados animales de un rebaño, con el consiguiente ahorro
económico.
La presente invención proporciona un
procedimiento, por espectroscopia Raman-láser, para
la detección de proteínas priónicas infectivas (PrP^{Sc}) en
muestras biológicas de animales afectados de una EET, y su
aplicación es extensible a sangre de, entre otros, bovinos,
caprinos, humanos y aves. El procedimiento de esta invención
incluye una primera etapa encaminada a obtener la fracción de la
sangre donde están más concentradas las proteínas priónicas
infectivas.
infectivas.
La presencia de priones se pone de manifiesto de
forma cualitativa mediante la aparición de bandas Raman en el
intervalo comprendido entre 1665 y 1680 cm^{-1}, muchas veces en
forma de hombros que se hacen bien visibles mediante espectroscopía
de derivadas.
Aparte de este procedimiento espectroscópico
cualitativo, la existencia de proteínas priónicas infectivas en una
muestra se puede determinar calculando los porcentajes de estructura
\beta, que sufre un aumento en estas proteínas infectivas con
respecto a los controles.
Los resultados obtenidos por el procedimiento
descrito en esta invención sobre el análisis de priones han
concordado al 100% con los tests de biodiagnóstico
post-mortem de muestras de cerebro realizadas
en los correspondientes animales de los que se realizaron
extracciones sanguíneas.
La aplicación más inmediata de esta invención es
el uso de este procedimiento de detección de proteínas infectivas
(PrP^{Sc}) para el diagnóstico de animales infectados de EETs o
para el estudio de la evolución de dicha enfermedad.
La presente invención se basa en que los
inventores han observado que las proteínas priónicas infectivas
(PrP^{Sc}) pueden ser identificadas, cualitativa y
cuantitativamente, de forma específica a partir de muestras
biológicas de animales infectados. Dicha presencia puede
constatarse de forma diferenciada en un mismo animal que sufre una
infección priónica a lo largo del tiempo, tras un proceso de
obtención específico de dichas proteínas priónicas infectivas en una
fracción celular y de detección posterior de las mismas por
espectroscopia Raman-láser.
La presente invención proporciona un nuevo
procedimiento de detección de la proteínas priónicas infectivas
marcadoras, PrP^{Sc}, en la que se basa el diagnóstico de las
Encefalopatías Espongiformes Transmisible (EET) en animales, y que
comprende los siguientes pasos:
- a)
- obtención de una fracción de lisado de elementos celulares procedentes de muestras biológicas animales, enriquecida en PrP^{Sc}, y
- b)
- la identificación, por espectroscopia Raman-láser, de las proteínas marcadoras PrP^{Sc} en dicha fracción de lisado.
Tal como se utiliza en la presente invención, el
término "ETT" se refiere a enfermedades provocadas por las
proteínas infectivas PrP^{Sc} en animales y humanos, entre otras,
el escrapie (llamado también tembladera) de ovinos y caprinos,
encefalopatía espongiforme bovina (EEB), la enfermedad crónica
caquetizante del ciervo, y la encefalopatía espongiforme
transmisible del visón y gatos. Otras enfermedades de este grupo
que afectan al hombre son: la nueva variante de la enfermedad de
Creutzfeldt-Jakob (vCJD), la enfermedad de
Gerstmann-Sträussler-Jakob, el
insomnio familiar fatal, kuru, etc. (Prusiner, New Engl. J.
Med., 344, 1516-1526 (2001)). Por otro lado, tal
como se utiliza en la presente invención, el término
"animales" se refiere a animales que pueden ser infectados por
proteínas PrP^{Sc}, entre otros, ovejas, vacas, cabras, visones,
ciervos, roedores, gatos y humanos.
El término "muestra biológica" en la
presente invención se refiere no sólo a fluidos biológicos de
animales, por ejemplo: sangre, suero, plasma, líquido
cefalorraquídeo y linfático, y orina, sino también a muestras
biológicas provenientes de tejidos que han sido homogeneizadas por
procedimientos mecánicos, sonicación o cualquier otro procedimiento
conocido en el estado de estas técnicas, y solubilizadas. Tal como
se utiliza en la presente invención, el término "fracción de
lisado de elementos celulares" se refiere a la fracción de la
muestra biológica donde se encuentran concentradas las proteínas
priónicas infectivas.
Un objeto particular de la presente invención es
un procedimiento de detección de proteínas priónicas infectivas,
mediante el cual, la obtención de una fracción de lisado de
elementos celulares de muestras biológicas de animales, enriquecida
en PrP^{Sc}, (procedimiento a) de la presente invención
(ver ejemplo 1)), comprende los siguientes pasos:
- -
- extracción de sangre, 6-8 mililitros, con EDTA 1,4 mM,
- -
- centrifugación refrigerada a 4ºC (6.000-8.000 rpm) durante 30 minutos,
- -
- resuspensión del pelet de los elementos celulares con aproximadamente 10 ml de disolución salina isotónica comercial (NaCl 154 mM, osmomolaridad de 307 miliosmomolar mOsm/L, pH \cong 4,5-7), invirtiendo el tubo suavemente repetidas veces y con breves agitaciones opcionales en Vórtex, dependiendo del estado de agregación de la muestra, hasta conseguir la completa disgregación del pelet,
- -
- choque osmótico de los elementos celulares resuspendidos con aproximadamente 60 ml de agua Milli-Q (Millipore), y centrifugación de la suspensión resultante a 10.000-12.000 rpm,
- -
- eliminación completa del sobrenadante y de una fracción mucosa, por decantación o aspiración exhaustiva (libre de proteínas PrP^{Sc}), con el fin de obtener un pelet acuoso concentrado en priones. Una muestra del pelet acuoso final se recogió del fondo del tubo mediante homogeneización con pipeta Pasteur para sus posteriores análisis.
Otro objeto particular de la presente invención
es un procedimiento más rápido que el procedimiento a) de
detección de proteínas priónicas infectivas, mediante el cual la
obtención de una fracción de lisado de elementos celulares de
muestras biológicas de animales, enriquecida en proteínas
PrP^{Sc}, (procedimiento b) de la presente invención (ver
ejemplo 1)), comprende los siguientes pasos:
- -
- extracción de sangre, 6-8 ml con EDTA 1,4 mM,
- -
- dilución directa de la muestra con 8-10 volúmenes de agua Milli-Q (Millipore),
- -
- agitación suave por inversión repetida del tubo, y centrifugación a 12.000 rpm durante media hora.
- -
- eliminación exhaustiva del sobrenadante y de la fracción mucosa por decantación y/o aspiración. Una muestra del pelet acuoso se utilizó para sus posteriores análisis.
Otro objetivo particular de la presente invención
es lograr un procedimiento de detección de proteínas priónicas
infectivas (PrP^{Sc}) mediante el cual la identificación
cualitativa por espectroscopía Raman-láser de estas
proteínas en la fracción de lisado (ver ejemplo 2) comprende los
siguientes pasos:
- a)
- medida del espectro Raman de dicha fracción en la región amida I comprendida entre 1600 y 1700 cm ^{-1}, en la se hacen visibles las estructuras \beta de las proteínas PrP^{Sc}, y
- b)
- la identificación de proteínas PrP^{Sc} en dicha fracción cuando se observe una señal característica entre 1665 y 1680 cm^{-1}, o más preferentemente entre 1670-1675 cm^{-1}.
Otro objeto particular de la presente invención
es un procedimiento de detección cuantitativa de proteínas
priónicas infectivas mediante el cual la identificación por
espectroscopía Raman-láser de proteínas PrP^{Sc}
en la fracción de lisado (ver ejemplo 2) comprende los siguientes
pasos:
a) medida del espectro Raman de dicha fracción en
la región espectral amida I comprendida entre 1600 y 1700
cm^{-1},
b) sustracción de la contribución espectral del
agua, hemoglobina y residuos aromáticos de cadenas laterales de
proteínas en esta región,
c) determinación del porcentaje de estructuras
proteicas \beta, y
d) identificación cuantitativa de la presencia de
PrP^{Sc} en dicha fracción cuando se observe un porcentaje de
estructura proteica \beta de, al menos un 10%, o preferentemente
mayor del 15%.
Otro objeto particular de la presente invención
es un procedimiento de detección de proteínas PrP^{Sc}, que
incluye parte de la metodología de la presente invención y el uso
de otra técnica de espectroscopía vibracional que identifica
igualmente estas proteínas en la misma región amida I
(1600-1700 cm^{-1}), como es la espectroscopía
infrarroja.
Otro objeto particular de la presente invención
es el empleo de todos los procedimientos descritos, según la
presente invención, para el diagnóstico de EETs en animales y
humanos, así como en la valoración de la evolución de la enfermedad
a lo largo del tiempo.
Figura 1. Espectros Raman de un pelet acuoso de
elementos celulares de sangre de ovino sano (control), obtenido por
el procedimiento a. Espectro original (superior),
bandas amida I (medio) y espectro de segunda derivada
(inferior).
Figura 2. Espectros Raman de un pelet acuoso de
elementos celulares de sangre de ovino con síntomas neurológicos de
escrapie, obtenido por el procedimiento a. Espectro original
(superior), bandas amida I (medio) y espectro de
segunda derivada (inferior).
Figura 3. Espectros Raman de un pelet acuoso de
elementos celulares de sangre de ovino sano (control) obtenido por
el procedimiento b. Espectro original (superior),
bandas amida I (medio) y espectro de segunda derivada
(inferior).
Figura 4. Espectros Raman de un pelet acuoso de
elementos celulares de sangre de ovino con síntomas neurológicos de
escrapie obtenido por el procedimiento b. Espectro original
(superior), bandas amida I (medio) y espectro de
segunda derivada (inferior).
Figura 5. Espectros Raman de pelets acuosos de
elementos celulares de sangre de ovino con síntomas neurológicos de
escrapie obtenidos por el procedimiento b. A, primera
extracción sanguínea; B, segunda extracción sanguínea 30 días
después. Espectro original (superior), bandas amida I
(medio) y espectro de segunda derivada (inferior).
Esta invención se ilustra con más detalle en los
siguientes Ejemplos
Con el fin de identificar las fracciones con
mayor presencia de proteínas priónicas infectivas (PrP^{Sc}) a
partir de fluidos biológicos, una serie de muestras de sangre de
ovinos negativos y positivos, (sin (controles) y con síntomas
neurológicos de escrapie respectivamente), plasmas y sueros
correspondientes, se analizaron espectroscópicamente tal como se
indica en el Ejemplo 2 de la presente invención. Los resultados que
se obtuvieron fueron en todos ellos negativos. En el caso concreto
de la sangre, la interferencia de la gran cantidad de hemoglobina
presente, unida a la baja concentración de estas proteínas, impidió
su detección. También por la interferencia de la hemoglobina, los
análisis de la fracción de todos los elementos celulares de la
sangre, libres de suero o plasma, y obtenidos por centrifugación y
posterior resuspensión en disolución salina isotónica, resultaron
también negativos. De ahí la necesidad de obtener posteriormente
una fracción de los lisados de todos estos elementos celulares en
donde las proteínas PrP^{Sc} estén concentradas y libres
mayoritariamente de hemoglobina.
Por tanto, un objetivo esencial fue conseguir
esta fracción de la sangre de animales en donde están localizadas
las proteínas priónicas infectivas (PrP^{Sc}) con una
concentración suficiente que genere una señal espectroscópica
medible. En los siguientes ejemplos se obtuvo a partir de ovinos,
sanos o con síntomas neurológicos de escrapie, Para ello se
siguieron dos procedimientos alternativos: a) separando previamente
los elementos celulares por centrifugación, lisándolos y
posteriormente concentrándolos de nuevo por centrifugación, y b)
lisando directamente los elementos celulares de la sangre sin
fraccionamiento previo de ésta. Obviamente este segundo
procedimiento es más rápido que el anterior.
El procedimiento a) se llevó a cabo como sigue.
Se realizaron extracciones de sangre en condiciones estériles de
animales sanos pertenecientes a un rebaño negativo (controles) y de
otros ovinos procedentes de un rebaño positivo en el que se habían
detectado diversos casos de escrapie y en el que se había llevado a
cabo una selección genotípica por su sensibilidad a la enfermedad.
Esta selección consiste en llevar a cabo el genotipado del animal
para el gen PrP con el fin de determinar la susceptibilidad c
resistencia genética del individuo a la enfermedad de escrapie. En
función de la combinación alélica obtenida para determinados
codones (136, 1554 y 171 dentro del gen PrP), se asocia a los
distintos genotipos. En nuestro caso concretamente, se seleccionan
aquellos animales con genotipos sensibles (grupos mayoritarios de
riesgo 3 y 4), es decir, con una mayor susceptibilidad a padecer la
enfermedad. El riesgo 4 corresponde a la combinación ARQ/ARQ o
ARH/ARQ, y el riesgo 3 a ARR/ARH c ARH/AHQ (National Scrapie Plan
for Great Britain). Para cada extracción de sangre, se partió de
6-8 mililitros que contenían EDTA 1,4 mM y se
introdujeron en un tubo apropiado de centrífuga, de
30-50 ml con tapón enroscable. El tubo se sometió
durante 30 minutos a una centrifugación refrigerada a 4ºC
(6.000-8.000 rpm), usando una centrífuga Sorvall,
modelo RC5C con rotor SS34. El plasma se separó por succión c
decantación de la parte superior del tubo, y el pelet con los
elementos celulares, que contienen gran cantidad de hemoglobina, se
recogió en el fondo del mismo. Esta fracción se resuspendió con
aproximadamente 10 ml de disolución salina isotónica comercial
(NaCl 154 mM, osmomolaridad 307 miliosmomolar mOsm/L, pH
4,5-7) invirtiendo el tubo suavemente repetidas
veces y con breves agitaciones opcionales en Vórtex, dependiendo
del estado de agregación de la muestra, hasta conseguir la completa
disgregación del pelet. Una buena disgregación facilitó un posterior
choque osmótico efectivo.
La suspensión resultante se sometió a un choque
osmótico con aproximadamente 60 ml de agua
Milli-Q
(Millipore) (unas 10 veces el volumen de sangre inicial), invirtiendo el tubo suavemente. Esta suspensión se centrifugó a 10.000-12.000 rpm, obteniéndose nuevamente un sobrenadante y un pelet. Mediante decantación o aspiración exhaustiva, se eliminó el sobrenadante y una fracción mucosa (libre de proteína PrP^{Sc}) con el fin de obtener una buena señal espectroscópica resultante de un pelet acuoso concentrado en priones. El análisis espectroscópico de este sobrenadante resultó negativo debido a la interferencia espectroscópica de la hemoglobina presente en gran cantidad. Una muestra del pelet acuoso final se recogió del fondo del tubo mediante homogeneización con pipeta Pasteur para sus posteriores análisis. El análisis espectroscópico del pelet revela que está constituído por una mezcla de proteínas y lípidos procedentes fundamentalmente de las membranas de todos los elementos celulares de la sangre, y muestra asimismo que las proteínas priónicas infectivas PrP^{Sc} están concentradas en esta fracción. El procedimiento para obtener esta fracción se ha utilizado por primera vez para la detección de proteínas priónicas en sangre, y demuestra que las proteínas priónicas PrP^{Sc} están preferentemente localizadas en las membranas de los elementos celulares de la sangre. Procede señalar que nuestros intentos de realizar medidas espectroscópicas con muestras secas de pelet, para aumentar la concentración de priones, resultaron fallidos debido a la aparición de fluorescencia intensa que enmascaraba el espectro Raman en cuestión.
(Millipore) (unas 10 veces el volumen de sangre inicial), invirtiendo el tubo suavemente. Esta suspensión se centrifugó a 10.000-12.000 rpm, obteniéndose nuevamente un sobrenadante y un pelet. Mediante decantación o aspiración exhaustiva, se eliminó el sobrenadante y una fracción mucosa (libre de proteína PrP^{Sc}) con el fin de obtener una buena señal espectroscópica resultante de un pelet acuoso concentrado en priones. El análisis espectroscópico de este sobrenadante resultó negativo debido a la interferencia espectroscópica de la hemoglobina presente en gran cantidad. Una muestra del pelet acuoso final se recogió del fondo del tubo mediante homogeneización con pipeta Pasteur para sus posteriores análisis. El análisis espectroscópico del pelet revela que está constituído por una mezcla de proteínas y lípidos procedentes fundamentalmente de las membranas de todos los elementos celulares de la sangre, y muestra asimismo que las proteínas priónicas infectivas PrP^{Sc} están concentradas en esta fracción. El procedimiento para obtener esta fracción se ha utilizado por primera vez para la detección de proteínas priónicas en sangre, y demuestra que las proteínas priónicas PrP^{Sc} están preferentemente localizadas en las membranas de los elementos celulares de la sangre. Procede señalar que nuestros intentos de realizar medidas espectroscópicas con muestras secas de pelet, para aumentar la concentración de priones, resultaron fallidos debido a la aparición de fluorescencia intensa que enmascaraba el espectro Raman en cuestión.
Procedimiento b). Partiendo de los mismos tipos
de sangre descritos en el procedimiento a) se tomaron
6-8 ml de este fluido biológico que contenía también
EDTA 1,4 mM, y se diluyeron con 8-10 volúmenes de
agua Milli-Q (Millipore) con el fin de producir
directamente la lisis de los elementos celulares. Tras una agitación
suave por inversión del tubo, se centrifugó a 12.000 rpm durante
media hora. Se eliminó exhaustivamente el sobrenadante y la
fracción mucosa por decantación y/o aspiración. Una muestra del
pelet acuoso se utilizó para posteriores análisis. Si se deseara una
menor señal espectroscópica de hemoglobina, el pelet se lava
nuevamente con agua Milli-Q, se centrifuga y el
pelet final se separa en las mismas condiciones descritas
anteriormente.
La señal espectroscópica del procedimiento a),
que es más largo de realizar, es no obstante significativamente
mayor (aproximadamente dos veces más intensa) que la obtenida según
el procedimiento rápido b). Ello es probablemente debido a que la
fracción mucosa, que diluye el pelet, es mayor en el procedimiento
b) y por tanto más difícil de separar exhaustivamente.
La presencia de proteínas priónicas infectivas,
por su predominante estructura \beta que es característica de
ellas (Caughey y cols., J. Biol. Chem., 273,
32230-32235 (1998); Prusiner, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 23, 13363-13383 (1998)) puede ser
advertida 1) cualitativamente y 2) cuantitativamente como sigue.
1) Cualitativamente. Las proteínas con estructura
\beta, como las priónicas infectivas, generan bandas por encima
de 1660 cm^{-1}, lo que se ha demostrado mediante estudios de
numerosos polipéptidos y proteínas modelo que poseen esta
estructura. Aunque obviamente pueden existir otras proteínas con un
alto contenido en estructura \beta, la detección de un aumento
relativo, respecto a los controles, de esta estructura con la
evolución de la enfermedad (tal como revela el Ejemplo 5) hay que
atribuirlo inequívocamente a la presencia de proteínas PrP^{Sc}.
Además, las únicas enfermedades que comportan formación de
proteínas con estructura predominante \beta, en su estado
monómero o agregado, son las encefalopatías espongiformes
transmisibles y la enfermedad de Alzheimer. Finalmente, datos
obtenidos por métodos inmunocitoquímicos e inmunoelectroforéticos
(Madec y cols., J. Virol. Methods, 75,
169-177 (19998); Madec y cols., Veterinary. Record,
146, 74-76 (1998)) no mostrados, revelan la
presencia de PrP^{Sc} en la fracción del lisado de los elementos
celulares. Sobre la base de las señales espectroscópicas medidas y
cantidades de muestras obtenidas, mediante esta técnica
Raman-láser se pueden detectar concentraciones de
PrP^{Sc} en sangre menores que 10 µg/ml, que es del mismo orden
de magnitud que la sensibilidad de las espectroscopías de
fluorescencia y ultravioleta (Brown y cols., J. Lab. Clin.
Med., 137, 5-13 (2001)). Este nivel de
detección es debido, por una parte, al procedimiento de obtención
de la fracción celular donde se localizan estas proteínas priónicas,
y por otro lado a que en los monómeros de proteínas PrP^{Sc},
ésta adopta una estructura predominantemente \beta, y en sus
agregados la proporción de esta estructura es prácticamente el
100%. (Caughey y cols., J. Biol. Chem., 273,
32230-32235 (1998); Prusiner, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 23, 13363-13383 (1998); Saborio y
cols., Nature, 411, 810-813 (2001)).
Aunque a veces estas bandas aparecen con una
intensidad relativamente débil en forma de hombro, el uso de la
espectroscopía de segundas derivadas en el dominio de frecuencias
espectrales revelan inequívocamente esta estructura proteica
\beta, como se ilustra en los ejemplos descritos más adelante.
2) Cuantitativamente. Consiste en medir los
porcentajes de estructura \beta existentes en muestras positivas
afectadas de escrapie y comparar dichos porcentajes con los
obtenidos de muestras controles, para lo que se considera la región
espectral amida I comprendida entre 1600 y 1700 cm^{-1}. Debido a
su presencia en la fracción del lisado de los elementos celulares,
es necesario eliminar previamente la contribución del agua mediante
substracción espectral. Para determinar el factor de substracción se
utilizó como criterio la consecución de la misma intensidad a 2100
y 3100 cm^{-1} 1, análogamente al criterio seguido en este tipo
de substracción en disoluciones acuosas de proteínas (Williams J
Mol. Biol., 1566, 581-603 (1983)). Asimismo es
necesario eliminar mediante substracción espectral las bandas de
los restos de hemoglobina y residuos aromáticos de cadenas
laterales de proteínas que se sitúan por debajo de 1630 cm^{-1},
para lo cual se ha utilizado un programa de ajuste, por mínimos
cuadrados, de perfiles espectrales a una suma de funciones de
bandas gaussianas (SpectraCalc, Galactic Industries Corp., Salem,
NH). Una vez restadas las bandas del agua, restos de hemoglobina y
cadenas laterales de residuos aromáticos proteicos, se determinaron
los porcentajes de estructura proteica \beta siguiendo métodos ya
establecidos en la literatura (Alix y col., J. Mol. Struct.,
174, 159-164 (1988)). La Tabla 1 muestra una clara
correlación entre los resultados obtenidos por espectroscopia Raman
sobre porcentajes de estructura proteica \beta en muestras de
lisados celulares de sangre de ovino y los resultados de
diagnóstico post-mortem. Estos últimos
ensayos post-mortem de muestras positivas de
escrapie y negativas se basaron en el análisis del Sistema Nervioso
Central (SNC) con el fin de confirmar/descartar la enfermedad
mediante las técnicas de diagnóstico histopatológico reconocidas
por la Organización Internacional de Epizootías (Office
International des Ipizooties. World Organisation for Animal Health,
O.I.E. Manual of Standards for Diagnostic Tests and Viccines, chap.
X.9, pp. 873-877 (2000)), y por la Unión Europea
(Reglamento de las Comunidades Europeas, Nº 1248, (2001)). Los
casos diagnosticados como positivos según estas técnicas
corresponden a muestras con un contenido en estructura \beta
significativamente superior al de los controles (ovejas nº
1-6). Es decir, ha habido una coincidencia al 100%
en cuanto al diagnóstico de los casos positivos analizados por
espectroscopía Raman-láser y los analizados
mediante los tests de confirmación establecidos por la OIE y las
Comunidades Europeas.
| Nº de oveja | % de estructura \beta | Análisis post-mortem del SNC |
| (histología e inmunohistoquímica^{a}) | ||
| 1 | 4 | - |
| 2 | 5 | - |
| 3 | 6 | - |
| 4 | 5 | - |
| 5 | 6 | - |
| 6 | 7 | - |
| 7 | 26 | + |
| 8 | 10 | + |
| 9 | 26 | + |
| 10 | 40 | + |
| 11 | 22 | + |
| 12 | 29 | + |
| 13 | 32 | + |
| 14 | 29 | + |
| 15 | 18 | + |
| Los porcentajes de estructura \beta se han aproximado al entero porcentual más próximo | ||
| del resultado decimal obtenido. | ||
| ^{a} Técnicas establecidas por la Organización Internacional de Epizootías. |
Ejemplo
2.1
Siguiendo este procedimiento, se introdujeron
aproximadamente 300 \mul de pelet de lisado acuoso, derivado de
una muestra de sangre de oveja control, en un tubo de resonancia
magnética (Wilmad, U.S.A) de 5 mm de diámetro, refrigerado alrededor
de 15ºC mediante un baño termostatizador. Para el análisis
espectral se usó un espectrómetro Raman de transformada de Fourier
de la firma Bruker, modelo RFS 100/S, dotado de un láser de Nd:YAG
que emite a 1064 nm y que fue utilizado como fuente de excitación.
Esta línea láser de excitación es particularmente útil para el
análisis de la sangre y sus fracciones, debido a que el problema de
la fluorescencia se obvia prácticamente. La utilización de otras
líneas láser en el visible, debido a su mayor energía, genera
fluorescencia que enmascara el espectro en cuestión. El instrumento
usado en esta invención estaba dotado de un detector de Ge
refrigerado con nitrógeno líquido. Otras condiciones
espectroscópicas de trabajo fueron: resolución, 4 cm^{-1} 1; 300
mw de potencia de la línea excitatriz; velocidad de scanner, 4, 5,0
kHz; ganancia de señal de muestra y fondo, 1; modo de adquisición,
doble sentido, adelante-atrás; modo de test de
correlación, longitud completa de interferograma; filtro de paso
bajo, 1, 16 kHz; función de apodización, Blackman Harris de 4
términos; factor de relleno del cero, 2; modo de corrección de
fase, potencia/búsqueda de ningún pico. En estas condiciones de
trabajo se realizaron 2.000 barridos que se promediaron, con una
duración total de una hora. El espectro Raman resultante de esta
fracción (Figura 1) muestra una banda amida I hacia 1654 cm^{-1},
otra banda significativa hacia 1622 cm^{-1} debido a la presencia
de restos de hemoglobina y una banda débil hacia 1603 cm^{-1}
debido a la fenilalanina y/o grupos carboxilato de cadenas
laterales proteicas. La substracción del agua y de las bandas a
1622 y 1603 cm^{-1} genera el perfil espectral amida I (intermedio
de la Figura 1) debido a esqueletos polipeptídicos de proteínas.
Este perfil contiene un máximo de intensidad hacia 1657 cm^{-1},
resultado del solapamiento de bandas correspondientes a estructuras
\alpha-helicoidales y desordenadas. El espectro de
la segunda derivada de este perfil espectral (inferior de la Figura
1) muestra una banda predominante a 1658 cm^{-1} y, lo que es
digno de destacar es que no aparecen bandas de intensidad
considerable en el intervalo de 1650-1680 cm^{-1}
que sugieran la presencia de cantidades considerables de
estructuras \beta. En efecto, la determinación cuantitativa de
esta estructura \beta dio como resultado 5% aproximadamente (oveja
nº 4 de la Tabla 1).
\newpage
Ejemplo
2.2
Se siguió el mismo procedimiento que en el
Ejemplo 2.1, pero en este caso se trataba de un animal ovino que
aunque no presentaba síntomas neurológicos muy claros estaba
afectado de escrapie, según revelaron los tests
post-mortem.
El espectro Raman correspondiente a la fracción
de los elementos celulares lisados de este animal (Figura 2)
presenta nuevamente bandas hacia 1654 cm^{-1} (estructuras
\alpha-helicoidales y desordenadas) y 1622
cm^{-1} como en el espectro de sangre control (Figura 1), pero
aparece una nueva banda, de intensidad relativa destacada, en forma
de hombro hacia 1670 cm^{-1} (espectros superior e intermedio de
la Figura 2) que se manifiesta claramente en el espectro de la
segunda derivada (espectro inferior de la Figura 2). Lo cual quiere
decir que con respecto a la muestra control se aprecia un gran
aumento en el contenido de estructura \beta. En efecto, la
determinación del porcentaje de esta estructura considerando el
perfil espectral amida I (intermedio de la Figura 2) dio como
resultado 26% aproximadamente (oveja nº 9 de la Tabla 1). Estos
resultados son consistentes con la presencia de proteínas priónicas
infectivas, como revelaron los tests
post-mortem.
Ejemplo
2.3
A diferencia de los Ejemplos 2.1 y 2.2, se siguió
el procedimiento b) correspondiente al lisado directo de la sangre
y se usaron las mismas condiciones espectroscópicas que en los
ejemplos anteriores. Se partió de una muestra de sangre de una
oveja sana (negativa o control). Como sucede con el método de lisado
a), aparece también la banda situada hacia 1621 cm^{-1}
correspondiente a restos de hemoglobina (Figura 3), y el máximo de
intensidad de la banda Raman amida I se sitúa hacia 1657 cm^{-1}
(estructuras \alpha-helicoidales y desordenadas).
Este máximo se desplaza hacia 1654 cm^{-1} tras restar la referida
banda de la hemoglobina (Figura 3, medio), y el correspondiente
espectro de la segunda derivada (Figura 3 inferior) muestra como
banda predominante la situada hacia 1654 cm^{-1} y un ligero
hombro hacia 1675 cm^{-1} que puede estar originado por la pequeña
proporción de estructura \beta que poseen las muestras control
(ver Tabla 1), estando en este caso próxima al 6%.
Ejemplo
2.4
Para el lisado directo de los elementos celulares
se siguió el mismo procedimiento que en el Ejemplo 2.3
(procedimiento b), pero utilizando sangre de una oveja con
síntomas clínicos de escrapie. Se usaron las mismas condiciones
espectroscópicas en ambos ejemplos, y los espectros obtenidos de
esta muestra (Figura 4) difieren notablemente de los
correspondientes al control (Figura 3), sobre todo en lo que se
refiere a la presencia de dos bandas de intensidades similares
situadas hacia 1654 y 1674 cm^{-1}, siendo la última debida a la
presencia de una concentración de estructura \beta (32%)
notablemente superior a la del control (6%). Por consiguiente,
mediante el método de lisado directo de los elementos celulares de
la sangre también se pueden distinguir perfectamente muestras de
sangre de ovinos con síntomas clínicos de escrapie respecto a los
controles. Este lisado directo implica obviamente un procedimiento
más abreviado que el descrito en los ejemplos 2.1 y 2.2, y por tanto
supone un test rápido para la detección in vivo de proteínas
priónicas en sangre de ovinos.
Ejemplo
2.5
Se extrajo sangre de una oveja sospechosa de
escrapie, y se repitió una nueva extracción transcurrido un mes,
presentando entonces el animal síntomas neurológicos inequívocos de
la enfermedad. Siguiendo el procedimiento b de lisado de los
elementos celulares y utilizando las mismas condiciones
espectroscópicas que en el Ejemplo 2.1, se obtuvieron dos pelets
acuosos cuyos espectros se incluyen en la Figura 5. Se aprecia en la
Figura 5B (segunda extracción de sangre) un ligero aumento de la
intensidad relativa de la banda hacia 1670 cm^{-1} comparada con
la homóloga de la Figura 5A (primera extracción de sangre), sobre
todo si se consideran los espectros de la segunda derivada. Además,
las determinaciones cuantitativas de concentración de estructura
\beta dieron como resultados 22% y 29% para la primera y segunda
extracción sanguínea respectivamente. Se pone, pues, de manifiesto
que la espectroscopía Raman-láser, usando las
condiciones experimentales descritas en esta memoria, puede
proporcionar información sobre la evolución sintomática de la
enfermedad y su relación con la concentración de proteínas priónicas
infectivas en sangre.
Claims (10)
1. Procedimiento de detección de proteínas
priónicas infectivas en animales caracterizado porque
comprende los siguientes pasos:
- a)
- obtención de una fracción de lisado de elementos celulares, enriquecida en proteínas PrP^{Sc}, a partir de muestras biológicas de animales o humanos, y
- b)
- la identificación por espectroscopia Raman-láser de proteínas PrP^{Sc} en dicha fracción de lisado.
2. Un procedimiento según la reivindicación 1
caracterizado porque el paso a) para obtener la fracción de
lisado de elementos celulares comprende los siguientes pasos:
- -
- extracción de sangre, 6-8 mililitros, con EDTA 1,4 mM,
- -
- centrifugación refrigerada a 4ºC (6.000-8.000 rpm) durante 30 minutos,
- -
- resuspensión del pelet de elementos celulares en aproximadamente 10 ml de disolución salina isotónica (NaCl 154 mM, osmomolaridad 307 miliosmomolar mOsm/L, pH \cong 4,5-7), invirtiendo el tubo suavemente y con breves agitaciones en Vórtex hasta conseguir la completa disgregación del pelet,
- -
- choque osmótico de la suspensión anterior, con aproximadamente 60 m1 de agua Milli-Q (Millipore), (unas 10 veces el volumen de muestra inicial),
- -
- centrifugación de la suspensión resultante a 10.000-12.000 rpm,
- -
- eliminación del sobrenadante y de una fracción mucosa (libre de proteínas PrP^{Sc}), por decantación o aspiración exhaustiva con el fin de obtener un pelet acuoso concentrado en priones. Una muestra del pelet acuoso final se recogió del fondo del tubo mediante homogeneización con pipeta Pasteur para sus posteriores análisis.
3. Un procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque el paso a) para obtener la fracción de
lisado de elementos celulares se realiza según la reivindicación 2
excepto que no se realiza la separación previa entre los componentes
celulares y no celulares de la muestra biológica.
4. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a la 3 caracterizado porque la
identificación de proteínas priónicas infectivas en la fracción de
lisados celulares se realiza mediante un proceso de identificación
cualitativa por espectroscopia Raman-láser que
comprende, al menos:
- a)
- medida del espectro Raman de dicha fracción en la región espectral amida I, comprendida entre 1600 y 1700 cm^{-1}, y
- b)
- la identificación de la presencia de proteínas PrP^{Sc} en dicha fracción cuando se observe una señal característica entre 1660 y 1680 cm^{-1}.
5. Un procedimiento según la reivindicación 4
caracterizada por la identificación de la presencia de
proteínas PrP^{Sc} en la fracción de usados celulares cuando se
observe una señal característica entre 1670-1675
cm^{-1}.
6. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a la 3 caracterizado porque la
identificación de proteínas priónicas infectivas en la fracción de
usados celulares se realiza mediante un proceso de identificación
cuantitativa por espectroscopia Raman-láser que
comprende, al menos:
- a)
- la medida del espectro Raman de dicha fracción en la región espectral amida I comprendida entre 1600 y 1700 cm^{-1},
- b)
- la sustracción espectral de la contribución del agua, hemoglobina y residuos aromáticos de cadenas laterales de proteínas,
- c)
- la determinación del porcentaje de estructura proteica \beta,
- d)
- la identificación cuantitativa de la presencia de proteínas PrP^{Sc} en dicha fracción cuando se observe un porcentaje de estructura proteica \beta de, al menos un 10%.
7. Un procedimiento según la reivindicación 6
caracterizado por la identificación cuantitativa de la
presencia de proteínas PrP^{Sc} en la fracción de usados celulares
cuando se observe un porcentaje de estructura proteica \beta mayor
del 15%.
\newpage
8. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a la 7 caracterizado porque la muestra
biológica puede provenir de un fluido biológico, entre otros,
sangre, suero, líquido cefalorraquídeo y linfático, y orina, o de
un tejido que ha sido solubilizado.
9. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a la 7 caracterizado porque los seres
vivos objeto de análisis pertenecen, entre otros, al siguiente
grupo: ovejas, vacas, cabras, visones, ciervos, gatos, roedores, y
humanos.
10. Uso de un procedimiento según una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a la 9 para el diagnóstico de animales
infectados de EETs y el estudio de la evolución de la infección,
entre otras, de escrapie en ovinos y caprinos, encefalopatía
espongiforme bovina (EEB), la enfermedad crónica caquetizante del
ciervo, la encefalopatía espongiforme transmisible del visón y
gatos, nueva variante de la enfermedad de
Creutzfeldt-Jakob (vCJD), la enfermedad de
Gerstmann-Sträussler-Jakob, el
insomnio familiar fatal y kuru.
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