CN103520373A - 一种从茶果皮中提取酪氨酸酶抑制剂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及酪氨酸酶抑制剂的提取方法，旨在提供一种从茶果皮中提取酪氨酸酶抑制剂的方法。该方法包括以下步骤：向干燥后粉碎的茶果皮中加入乙醇水溶液提取，离心过滤得到滤渣和提取液；向滤渣中加入缓冲液浸提，超声提取、离心过滤得到提取液；再将之前的提取液真空浓缩，然后加入氯仿萃取得到萃余液；最后得到的提取液和萃余液混合，浓缩后冷冻干燥得到酪氨酸酶抑制剂。本发明通过极性区别提取有效提高了目标物的萃取精度，并通过酶法结合超声提取大大提高了提取的效率，适用于产业化生产；制备的酪氨酸酶抑制剂是一种天然高效的酪氨酸酶抑制剂，且对酪氨酸酶的抑制效果显著；本发明技术可以有效提高茶果皮资源的经济效益。
Description
技术领域
本发明是关于酪氨酸酶抑制剂的提取方法，特别涉及一种从茶果皮中提取酪氨酸酶抑制剂的方法。
背景技术
酪氨酸酶是一类广泛存在于微生物、动物、植物和人体的铜结合酶，它具有单酚酶活性和二酚酶活性，能将酪氨酸羟化，产生L-3,4-二羟基苯丙氨酸（L-DOPA），然后再将L-DOPA进一步氧化成多巴醌，进一步形成黑色素，是人体各类色斑形成的关键酶。同时，酪氨酸酶也是果蔬褐变的关键酶。大部分水果蔬菜在保存和运输过程中容易发生褐变，从而影响其外观和价值。因此，酪氨酸酶抑制剂能有效阻滞人体各类色斑的形成，同时能有效防止果蔬褐变，在医药、化妆品、食品工业及农业领域均有着广阔的应用前景。
近年来，从植物中提取安全而有效的天然酪氨酸酶抑制剂备受关注。茶果皮是茶叶籽油加工过程中产生的副产物。随着2009年茶叶籽油被卫生部列入新资源食品后，茶叶籽油大规模生产，造成大量的茶果皮产生。目前，对于如何有效利用茶果皮资源还鲜见报道。更未见从茶果皮中提取酪氨酸酶抑制剂的报道或专利。
发明内容
本发明的主要目的在于克服现有技术中的不足，提供一种能有效利用茶果皮资源，且能提取出天然酪氨酸酶抑制剂的方法。为解决上述技术问题，本发明的解决方案是：
提供一种从茶果皮中提取酪氨酸酶抑制剂的方法，包括干燥和粉碎茶果皮，包括以下具体步骤：
步骤A：称取干燥后粉碎的茶果皮，以茶果皮和乙醇水溶液为1g：20ml～1g：30ml的比例，向茶果皮中加入乙醇水溶液，在50～60℃下提取3～4小时后，离心过滤得到滤渣和提取液；
步骤B：以步骤A中得到的滤渣和缓冲液为1g：20ml～1g：30ml的比例，向步骤A得到的滤渣中加入缓冲液，在40～60℃下浸提2～3小时，然后超声提取10～20min后离心过滤，得到提取液；所述缓冲液为PH是4～5，含占茶果皮干重2～4%纤维素酶的缓冲液；
步骤C：将步骤A中得到的提取液真空浓缩到原体积的1/5～1/15，然后以提取液和氯仿的体积比为1：1的比例，加入氯仿进行萃取，得到萃余液；
步骤D：将步骤B中得到的提取液和步骤C中得到的萃余液混合，浓缩后冷冻干燥，即得到从茶果皮中提取的酪氨酸酶抑制剂。
作为进一步的改进，所述步骤A中的乙醇水溶液是指体积浓度为95%的乙醇水溶液。
作为进一步的改进，所述步骤A中离心过滤的条件是5500～6500rpm，离心时间25～35min。
作为进一步的改进，所述步骤B中缓冲液的纤维素酶的活力不小于25000U/g。
作为进一步的改进，所述步骤B中的缓冲液是指磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。
作为进一步的改进，所述步骤B中超声提取的频率是200～300W。
作为进一步的改进，所述步骤B中离心过滤的条件是3000～4000rpm，离心时间25～35min。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明通过极性区别提取有效提高了目标物的萃取精度，并通过酶法结合超声提取大大提高了提取的效率，适用于产业化生产。同时，本发明中制备的酪氨酸酶抑制剂是一种天然高效的酪氨酸酶抑制剂，且对酪氨酸酶的抑制效果显著。此外，本发明技术可以有效提高茶果皮资源的经济效益。
附图说明
图1为本发明实施例中提取的酪氨酸酶抑制剂对酪氨酸酶活性的抑制作用对比图。
具体实施方式
下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细描述：
本发明从茶果皮中提取酪氨酸酶抑制剂的方法具体步骤包括：
步骤A：称取干燥后粉碎的茶果皮，以茶果皮和体积浓度是95%的乙醇水溶液为1g：20ml～1g：30ml的比例，向茶果皮中加入体积浓度为95%的乙醇水溶液，在50～60℃下提取3～4小时后，以5500～6500rpm离心过滤25～35min，得到滤渣和提取液。
步骤B：以步骤A中得到的滤渣和缓冲液为1g：20ml～1g：30ml的比例，向步骤A得到的滤渣中加入缓冲液，在40～60℃下浸提2～3小时，然后以200～300W的频率超声提取10～20min后，以3000～4000rpm离心过滤25～35min，得到提取液。所述缓冲液是磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，PH是4～5，含占茶果皮干重2～4%纤维素酶的缓冲液，纤维素酶的活力不小于25000U/g。
步骤C：将步骤A中得到的提取液真空浓缩到原体积的1/5～1/15，然后以提取液和氯仿的体积比为1：1的比例，加入氯仿进行萃取，得到萃余液。
步骤D：将步骤B中得到的提取液和步骤C中得到的萃余液混合，浓缩后冷冻干燥，即得到从茶果皮中提取的酪氨酸酶抑制剂。
下面的实施例可以使本专业的专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1
步骤A：称取干燥后粉碎的茶果皮20g，以茶果皮和体积浓度为95%的乙醇水溶液为1g：20ml的比例，向茶果皮中加入体积浓度为95%的乙醇水溶液，在50℃下提取4小时后，离心过滤得到滤渣和提取液，其中离心过滤的条件是5500rpm，离心时间35min；
步骤B：以步骤A中得到的滤渣和磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液为1g：20ml的比例，向步骤A得到的滤渣中加入磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，在40℃下浸提3小时，然后用200W的频率超声提取20min，再用3000rpm的条件离心过滤35min，得到提取液；所述缓冲液为PH是4，含占茶果皮干重2%纤维素酶的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，且纤维素酶的活力不小于25000U/g；
步骤C：将步骤A中得到的提取液真空浓缩到原体积的1/5，然后以步骤A中得到的提取液和氯仿的体积比为1：1的比例，加入氯仿进行萃取，得到萃余液；
步骤D：将步骤B中得到的提取液和步骤C中得到的萃余液混合，浓缩后冷冻干燥，即得到从茶果皮中提取的酪氨酸酶抑制剂1.8g，得率为9%（占茶果皮干重）。
实施例2
步骤A：称取干燥后粉碎的茶果皮20g，以茶果皮和体积浓度为95%的乙醇水溶液为1g：25ml的比例，向茶果皮中加入体积浓度为95%的乙醇水溶液，在55℃下提取3.5小时后，离心过滤得到滤渣和提取液，其中离心过滤的条件是6000rpm，离心时间30min；
步骤B：以步骤A中得到的滤渣和磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液为1g：25ml的比例，向步骤A得到的滤渣中加入磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，在50℃下浸提2.5小时，然后用250W的频率超声提取15min，再用3500rpm的条件离心过滤30min，得到提取液；所述磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液为PH是4.5，含占茶果皮干重3%纤维素酶的缓冲液，且纤维素酶的活力不小于25000U/g；
步骤C：将步骤A中得到的提取液真空浓缩到原体积的1/10，然后以步骤A中得到的提取液和氯仿的体积比为1：1的比例，加入氯仿进行萃取，得到萃余液；
步骤D：将步骤B中得到的提取液和步骤C中得到的萃余液混合，浓缩后冷冻干燥，即得到从茶果皮中提取的酪氨酸酶抑制剂2.3g，得率为11.5%（占茶果皮干重）。
实施例3
步骤A：称取干燥后粉碎的茶果皮20g，以茶果皮和体积浓度为95%的乙醇水溶液为1g：30ml的比例，向茶果皮中加入体积浓度为95%的乙醇水溶液，在60℃下提取3小时后，离心过滤得到滤渣和提取液，其中离心过滤的条件是6500rpm，离心时间25min；
步骤B：以步骤A中得到的滤渣和磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液为1g：30ml的比例，向步骤A得到的滤渣中加入磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，在60℃下浸提2小时，然后用300W的频率超声提取10min，再用4000rpm的条件离心过滤25min，得到提取液；所述磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液为PH是5，含占茶果皮干重4%纤维素酶的缓冲液，且纤维素酶的活力不小于25000U/g；
步骤C：将步骤A中得到的提取液真空浓缩到原体积的1/15，然后以步骤A中得到的提取液和氯仿的体积比为1：1的比例，加入氯仿进行萃取，得到萃余液；
步骤D：将步骤B中得到的提取液和步骤C中得到的萃余液混合，浓缩后冷冻干燥，即得到从茶果皮中提取的酪氨酸酶抑制剂3.1g，得率为15.5%（占茶果皮干重）。
将上述3个实施例的酪氨酸酶抑制剂进行酪氨酸酶抑制效果验证：将从茶果皮中提取酪氨酸酶抑制剂溶解于蒸馏水中，取100μl上述溶液，加入PH为6.8的磷酸盐缓冲液56μl与2.0mmol/L的酪氨酸溶液94μl，待混合均匀后，在冰浴中迅速加入酪氨酸酶溶液50μl(50U)，在37℃中温育10min，于490nm处测定吸光度。
酪氨酸酶抑制率计算如下：
酪氨酸酶抑制率(%)=[(a-b)-(c-d)]/[a-b]×100％
a：未加提取物而加酶的混合液所测的吸光度；
b：未加提取物也未加酶的混合液所测的吸光度；
c：加提取物和酶的混合液所测的吸光度；
d：加提取物而未加酶的混合液所测的吸光度。
如图1所示，从实验数据可以看出，应用本发明技术制备的酪氨酸酶抑制剂对酪氨酸酶具有显著的抑制作用，并且呈现剂量依赖效应，可以应用于美容祛斑等药物和保健品开发，以及果蔬护色保鲜等领域。
Claims (7)
1.一种从茶果皮中提取酪氨酸酶抑制剂的方法，包括干燥和粉碎茶果皮，其特征在于，包括以下具体步骤：
步骤A：称取干燥后粉碎的茶果皮，以茶果皮和乙醇水溶液为1g：20ml～1g：30ml的比例，向茶果皮中加入乙醇水溶液，在50～60℃下提取3～4小时后，离心过滤得到滤渣和提取液；
步骤B：以步骤A中得到的滤渣和缓冲液为1g：20ml～1g：30ml的比例，向步骤A得到的滤渣中加入缓冲液，在40～60℃下浸提2～3小时，然后超声提取10～20min后离心过滤，得到提取液；所述缓冲液为PH是4～5，含占茶果皮干重2～4%纤维素酶的缓冲液；
步骤C：将步骤A中得到的提取液真空浓缩到原体积的1/5～1/15，然后以提取液和氯仿的体积比为1：1的比例，加入氯仿进行萃取，得到萃余液；
步骤D：将步骤B中得到的提取液和步骤C中得到的萃余液混合，浓缩后冷冻干燥，即得到从茶果皮中提取的酪氨酸酶抑制剂。
2.根据权利要求1所述的一种从茶果皮中提取酪氨酸酶抑制剂的方法，其特征在于，所述步骤A中的乙醇水溶液是指体积浓度为95%的乙醇水溶液。
3.根据权利要求1所述的一种从茶果皮中提取酪氨酸酶抑制剂的方法，其特征在于，所述步骤A中离心过滤的条件是5500～6500rpm，离心时间25～35min。
4.根据权利要求1所述的一种从茶果皮中提取酪氨酸酶抑制剂的方法，其特征在于，所述步骤B中缓冲液的纤维素酶的活力不小于25000U/g。
5.根据权利要求4所述的一种从茶果皮中提取酪氨酸酶抑制剂的方法，其特征在于，所述步骤B中的缓冲液是指磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。
6.根据权利要求1所述的一种从茶果皮中提取酪氨酸酶抑制剂的方法，其特征在于，所述步骤B中超声提取的频率是200～300W。
7.根据权利要求1所述的一种从茶果皮中提取酪氨酸酶抑制剂的方法，其特征在于，所述步骤B中离心过滤的条件是3000～4000rpm，离心时间25～35min。
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