CN103487527A

CN103487527A - 乳粉及乳粉制品中过氧化苯甲酰的测定方法

Info

Publication number: CN103487527A
Application number: CN201310472422.4A
Authority: CN
Inventors: 张春艳; 卢华卫; 云环; 郑书展; 潘国卿; 刘来俊; 白国涛; 李刚
Original assignee: INNERMONGOLIA ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU
Current assignee: INNERMONGOLIA ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU
Priority date: 2013-10-11
Filing date: 2013-10-11
Publication date: 2014-01-01

Abstract

本发明公开了乳粉及乳粉制品中过氧化苯甲酰的测定方法，包括以下步骤：1）样品提取：准确称取乳粉或乳粉制品，置于比色管中，加入乙腈溶液混匀；2）苯甲酸的制备：移取步骤1）所得溶液中的上层乙腈提取液于圆底离心管中，加入50%碘化钾溶液，混匀，静置，氮吹浓缩；3）定容和过滤：用5%甲醇水溶液对步骤2）中所得苯甲酸溶液进行定容，然后过滤；4）测定：对步骤3）定容过滤后的苯甲酸溶液进行柱分离，然后用液相色谱仪进行测定。本发明的方具有简便、快捷、检出限低、准确性好等特点，适用于乳粉及乳粉制品中过氧化苯甲酰的测定。

Description

乳粉及乳粉制品中过氧化苯甲酰的测定方法

技术领域

本发明涉及过氧化苯甲酰的测定方法，特别涉及乳粉及乳粉制品中过氧化苯甲酰的测定方法。

背景技术

我国食品添加剂使用卫生标准（GB2760-2011）中规定，增白剂过氧化苯甲酰是不允许添加到乳制品产品中。而事实上，企业为追求经济利益，在乳粉中非法添加过氧化苯甲酰的事件时有发生。

目前文献报道的过氧化苯甲酰测定方法有液相色谱法和气相色谱法，测试基质主要针对小麦粉和大米粉的研究，还没有针对乳粉及乳粉制品中过氧化苯甲酰的检测研究。由于乳粉所含蛋白质、脂肪很高，采用常规的用于小麦粉和大米粉的过氧化苯甲酰测定方法测试方法导致样品结块，无法提取样品中添加的过氧化苯甲酰测试。

因此，提供一种具有简便、快捷、准确性好等特点，适用于乳粉中过氧化苯甲酰的测定方法就成为该技术领域急需解决的技术难题。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种具有简便、快捷、准确性好等特点，适用于乳粉及乳粉制品中过氧化苯甲酰的测定方法。

本发明的上述目的是通过以下技术方案达到的：

乳粉及乳粉制品中过氧化苯甲酰的测定方法，包括以下步骤：

1）样品提取：准确称取乳粉或乳粉制品，置于比色管中，加入乙腈溶液混匀；

2）苯甲酸溶液的制备：移取步骤1）所得溶液中的上层乙腈提取液于圆底离心管中，加入50质量%碘化钾溶液，混匀，静置，氮吹浓缩，得苯甲酸溶液；

3）定容和过滤：用5质量%甲醇水溶液对步骤2）中所得苯甲酸溶液进行定容，然后过滤，得定容过滤后的苯甲酸溶液；

4）测定：对步骤3）定容过滤后的苯甲酸溶液进行柱分离，然后用液相色谱仪进行测定。

一种优选技术方案，其特征在于：所述步骤4）中所述柱分离所用的分离柱是ZORBAX SB-C18柱。

一种优选技术方案，其特征在于：所述步骤4）中所述液相色谱仪用的流动相为甲醇︰乙酸铵溶液体系。

一种优选技术方案，其特征在于：所述甲醇︰乙酸铵溶液体系中甲醇：乙酸铵的比例为5：95。

一种优选技术方案，其特征在于：所述步骤4）中所述液相色谱仪用的检测波长为227纳米（nm）。

本发明的优点在于：通过乙腈提取样品中过氧化苯甲酰，并用碘化钾将提取的过氧化苯甲酰还原成具有紫外吸收的苯甲酸，取上清液进行氮吹浓缩，定容过滤后，用SB-C18柱分离，用高效液相色谱仪进行测定，建立了乳粉及乳粉制品中过氧化苯甲酰的测定方法。本发明公开的过氧化苯甲酰的测定方法具有简便、快捷、检出限低、准确性好等特点。

下面通过附图和具体实施方式对本发明做进一步说明，但并不意味着对本发明保护范围的限制。

附图说明

图1是本发明实施例1碘化钾溶液浓度反应条件实验比较曲线（碘化钾溶液浓度对还原反应的影响）。

图2是本发明实施例1碘化钾溶液加入量反应条件实验比较曲线（碘化钾溶液添加量对还原反应的影响）。

图3是本发明实施例1碘化钾溶液反应时间条件实验比较曲线（过氧化苯甲酰与碘化钾最佳反应时间）。

具体实施方式

实施例1

1材料和方法

1.1仪器与设备

液相色谱仪（1100型），配二极管阵列检测器和在线脱气机；漩涡仪；离心机；氮吹仪（N-EVAP112型）；0.22（微米）μm针式滤膜。

1.2试剂和材料

除另有规定外，试剂均为分析纯，水为去离子水。

乙腈（色谱级）；乙酸铵（分析纯）；碘化钾溶液(50质量%)，过氧化苯甲酰乙腈标准液（1000毫克/升（mg/L））。

1.3色谱条件

色谱柱：ZORBAX SB-C18柱，250毫米（mm）×4.6毫米（mm）i.d，5.0-Micron，带预柱。

流动相为甲醇︰0.02mol/L乙酸铵=5：95，流速为1.0毫升/分钟（mL/min）；柱温为30℃；进样量为20微升（μL）；测定波长苯甲酸227纳米（nm）。

1.4操作步骤

1.4.1样品提取

准确称取2.5克（精确至0.01克）市售乳粉或乳粉制品，置于25毫升（mL）离心管中，准确加入乙腈溶液10毫升（mL），立即用均质器混匀2分钟（min），静置2分钟（min），（若上清液浑浊，以5000转（r）离心机离心5分钟（min）），移取5毫升（mL）上层乙腈提取液于5毫升（mL）圆底离心管，加入50质量%碘化钾溶液0.2毫升（mL），混匀，1分钟（min），静置2分钟（min）后，氮吹浓缩，用5质量%甲醇水溶液定容，过0.22微米（μm）针式滤膜，上机测定。

1.4.2标准品制备

用乙腈配制0.01，0.02，0.04，0.1，0.2，0.4，1.0，2.0，4.0，8.0毫克/升（mg/L）过氧化苯甲酰标准系列溶液，分别移取5.0毫升（mL）到5毫升（mL）圆底离心管，加入50质量%碘化钾溶液0.2毫升（mL），混匀，1分钟（min），静置5分钟（min），40℃氮吹浓缩，用5质量%甲醇水溶液定容2.0毫升（mL），过0.22微米（μm）针式滤膜，上机测定。

2结果与讨论

2.1样品提取、净化条件的选择

据文献报道，过氧化苯甲酰微溶于水，溶于甲醇、乙醇等有机溶剂。通过实验发现，过氧化苯甲酰用水溶解，不能与碘化钾溶液发生还原反应，只能溶于甲醇等溶液才能发生还原反应。根据这一特点，本发明实验了采用甲醇进行样品中过氧化苯甲酰的提取，发现由于样品中含有蛋白质、脂肪较多，甲醇总是易导致样品结块，提取不易，而通过试验各种有机溶剂，发现采用乙腈提取样品，样品分散极好，不易结块，还极易提取样品中的过氧化苯甲酰，提取效率较高，但提取液直接上机检测，其溶液色谱分离上效果却非常不好，与样品杂质分不开，本发明人通过反复实验，意外发现，采用将提取液乙腈用氮气浓缩（吹干）并用2mL5%甲醇水溶液定容，所测结果极佳，达到了前处理简便、快捷、且准确性高而且检出下限低等特点。

2.2过氧化苯甲酰与碘化钾溶液反应条件的选择

本发明通过用过氧化苯甲酰乙腈溶液5.0毫克每升（mg/L）与不同碘化钾溶液浓度、加入量及反应时间长短进行了条件实验，试验结果表1-表3，制成图，分别见图1-图3。通过图1-图3以及表1-表3，可以看出，当碘化钾浓度达50质量%，即饱和溶液情况下，过氧化苯甲酰乙腈溶液与碘化钾溶液反应效率最高，在此基础上，当50%碘化钾溶液加入量达0.2毫升（mL）时，反应效率最大且生成苯甲酸量最稳定，因此选择0.2毫升（mL）为加入量。当加入50质量%碘化钾0.2毫升（mL），过氧化苯甲酰乙腈溶液与碘化钾溶液反应时间影响不大，且生成苯甲酸量基本稳定，本发明实验选择反应时间为5分钟(min)。

表1碘化钾溶液浓度对还原反应影响条件实验

碘化钾浓度%（质量）	20%	30%	40%	50%
					苯甲酸色谱峰面积	272.5	367.7	421.3	489.2

表2碘化钾添加量对还原反应影响条件实验

表3还原时间长短对反应影响条件实验

2.3分析条件的选择

2.3.1色谱柱的选择

目前通常采用的色谱柱均为普通C18柱，本发明对ZORBAX SB-C18、sunfineC18及X-bridge，250毫米（mm）×4.6毫米（mm）i.d，5-Micron柱测试进行比较，标准品均可获较好分离，只是ZORBAX SB-C18在7.7分钟（min）出峰，且与样品中杂质峰能很好分离，sunfineC18柱在13.7分钟（min）出峰，峰型拖尾且色谱吸收较弱，X-bridge在8.8分钟（min）左右出峰，但色谱吸收较弱，低浓度信噪比低，因此，采用ZORBAX SB-C18柱可达到较好测试结果。

2.3.2流动相的选择

据文献报道，磷酸盐溶液与乙腈及乙酸铵溶液和甲醇体系是应用于过氧化苯甲酰测定较为广泛的流动相，本发明通过对上述流动相体系实验对比，发现甲醇︰乙酸铵溶液体系，可使样品有很好的峰型，采用乙腈-磷酸盐、乙酸盐体系不能使各组分很好分离。甲醇乙酸铵体系能得到很好分离。本发明针对不同甲醇含量与乙酸铵体系进行比较，当流动相是甲醇：乙酸铵为10:90，样品中杂质峰与过氧化苯甲酰的峰不能完全分离，且随着甲醇量的增大，过氧化苯甲酰的出峰时间向前推移，当流动相甲醇：乙酸铵比例为5:95，刚好可将样品中杂质与待测物分离，再对不同浓度的乙酸铵体系（0.01，0.02，0.03mol/L）进行实验，发现，当乙酸铵浓度增加时，过氧化苯甲酰出峰时间向后推移，通过综合比较，采用甲醇︰浓度0.02摩尔/升（mol/L）乙酸铵溶液为5︰95作为流动相，恒流测试，可获得较好测试结果。

2.3.3检测波长的选择

据文献报道，过氧化苯甲酰测试多数采用210纳米（nm），但也有采用230纳米（nm），本发明试验发现，苯甲酸在210～240纳米（nm）范围处均有吸收，但样品中过氧化苯甲酰生成的苯甲酸在227纳米（nm）处吸收峰最高。

3.1方法的线性范围和检出限

分别用过氧化苯甲酰乙腈标准溶液配制质量浓度为0.01，0.02，0.04，0.1，0.2，0.4，1.0，2.0，4.0，8.0毫克/升(mg/L)的标准溶液5.0毫升（mL），与0.2毫升（mL）50质量%碘化钾溶液反应生成的苯甲酸溶液浓度浓缩定容为2.0毫升（mL），制成浓度相当于0.025，0.05，0.10，0.25，0.5，1.0，2.50，5.0，10.0，20.0毫克/升（mg/L）的过氧化苯甲酰标准系列，在选定的色谱条件下进行测定，进样量20微升（μL），用峰面积与标准工作溶液苯甲酰的绝对量做图。发现标液在质量浓度为0.025～20.0毫克/升（mg/L）的范围内呈线性关系，过氧化苯甲酰0.025毫克每升（mg/L）吸收峰的信噪比（S/N）、检出限结果如表4所示。

表4方法的线性范围和检出限

3.2方法的精密度和回收率

为了评价本发明方法的准确度及精密度，在婴儿奶粉中分别进行0.04，0.08，0.16，0.8，16毫克/千克（mg/kg）（均为质量分数，下同）4个水平的添加回收率和6次平行测定精密度实验，结果如表5所示。由表5可以看出，本发明方法的平均回收率为93.1%～103.6%，变异系数为4.02%～5.44%。

表5婴儿奶粉样品添加回收率和精密度结果（n=10）%

4方法适用性

经采用本发明方法对市售的24种乳粉及其制品进行测试，结果如下：

表6市售乳粉及其制品过氧化苯甲酰测试结果

5结论

本发明方法建立的样品处理条件可将乳粉及其制品中过氧化苯甲酰与样品杂质有效分离，并通过外标法进行定量测定，具有操作简便、实验成本低、准确度高、精密度好等特点，适用于乳粉中过氧化苯甲酰的测定。

本发明方法的优点：

1、独创了采用乙腈提取乳粉中非法添加物过氧化苯甲酰的提取方式；2、使用的还原试剂用量较低；3、检出限可降至0.04毫克/千克（mg/kg）；4、采用氮吹方式加快了前处理时间，提高了检测效率；5、色谱条件采用5：95甲醇乙酸铵溶液，可获得很好的分离效果；6、采用检测波长227纳米（nm），可获更好的吸收峰。

Claims

1.乳粉及乳粉制品中过氧化苯甲酰的测定方法，包括以下步骤：

2.按照权利要求1所述的乳粉及乳粉制品中过氧化苯甲酰的测定方法，其特征在于：所述步骤4）中所述柱分离所用的分离柱是ZORBAX SB-C18柱。

3.按照权利要求1所述的乳粉及乳粉制品中过氧化苯甲酰的测定方法，其特征在于：所述步骤4）中所述液相色谱仪用的流动相为甲醇︰乙酸铵溶液体系。

4.按照权利要求3所述的乳粉及乳粉制品中过氧化苯甲酰的测定方法，其特征在于：所述甲醇︰乙酸铵溶液体系中甲醇：乙酸铵的比例为5：95。

5.按照权利要求1所述的乳粉及乳粉制品中过氧化苯甲酰的测定方法，其特征在于：所述步骤4）中所述液相色谱仪用的检测波长为227纳米。