CN103468759A

CN103468759A - 一种以蓼大青叶为原料制备靛玉红的方法

Info

Publication number: CN103468759A
Application number: CN2013104514457A
Authority: CN
Inventors: 杨大坚; 陈新滋; 徐宏喜; 陈士林; 卞兆祥; 吕爱平; 陈国庆; 张毅
Original assignee: Shanghai University of Traditional Chinese Medicine; Institute of Medicinal Plant Development of CAMS and PUMC; China Academy of Chinese Medical Sciences CACMS; Hong Kong Baptist University HKBU
Current assignee: Shanghai University of Traditional Chinese Medicine; Institute of Medicinal Plant Development of CAMS and PUMC; China Academy of Chinese Medical Sciences CACMS; Hong Kong Baptist University HKBU
Priority date: 2013-09-29
Filing date: 2013-09-29
Publication date: 2013-12-25
Anticipated expiration: 2033-09-29
Also published as: CN103468759B

Abstract

本发明提供了一种以蓼大青叶为原料制备靛玉红的方法，为将鲜活的蓼大青叶粉碎，添加吲哚醌，发酵超过12h；利用蓼大青叶作为原料直接制备靛玉红，不仅是用生物化学方法合成靛玉红，引入吲哚醌，提高了反应的另外一个原料吲哚酮的生物量，同时也增加了蓼大青叶中的靛玉红生物量，操作简便；本发明在发酵的过程中通过控氧和添加吲哚醌有效的将反应方向向靛玉红方向发展；使整个生产产业化可控。

Description

一种以蓼大青叶为原料制备靛玉红的方法

技术领域

本发明设计一种中药材，单体成分的提取方法，更具体的说涉及一种以蓼大青叶为原料制备靛玉红的方法。

技术背景

蓼大青叶来源于蓼科植物蓼蓝(Polygonum tinctorium Ait.)的茎叶，完整叶片展开后呈椭圆形，长3-8cm；蓝绿色或黑蓝色，先端钝，基部渐狭，全缘；叶脉浅黄棕色，于下表面略突起；叶柄扁平，偶带膜质托叶鞘。质脆。气微，味微涩而稍苦。蓼蓝全草中含靛玉红（indirubin），靛蓝（indigo，indigotin），N-苯基-2-萘胺（N-phenyl-2-naphthylamine），β-谷甾醇（β-sitosterol），虫漆蜡醇（laccerol），其地上部分含山柰酚-3-吡喃葡萄糖苷（kaempferol-3-O-β-D-glucopyranoside），吲哚苷（indican）等，据报道，蓼大青叶鲜品中含有的吲哚苷超过4%；蓼蓝中不含靛红烷A、B、C。

靛玉红又名炮弹树碱B，分子量为：262.26；分子结构式为：

靛玉红为一种双吲哚类生物碱；对多种移植性动物肿瘤有抑制作用，能破坏白血病细胞；在其作用下，变性的细胞多呈肿胀、溶解性坏死。实验研究发现，靛玉红还能增强动物的单核巨噬细胞系统的吞噬能力，靛玉红为我国首创的新型结构的抗白血病药物。目前国内用于研究的靛玉红有3中来源：即从中药大青叶、青黛中提取的天然产物，半合成、全合成的靛玉红。

发明内容

研究发现，吲哚苷分子量295.28，分子式：C₁₄H₁₇NO₆，分子结构式为：

属于苷类，碱性条件下较稳定，在中性或弱酸性条件下，可被靛素植物体内自身存在的靛素酶（indhamlsin）或其他内源酶生物化学分解成为相同摩尔的游离吲哚酚阳离子（indoxylanion）。蓼大青叶药材仅含有吲哚苷而不含靛红烷。本发明采用蓼大青叶为反应原料，以吲哚苷为制备靛玉红的主要前体物质；其化学反应方程式如下：

在现有的用蓼大青叶打靛（包括发酵法和酒糟法）中，吲哚苷其在内源酶的作用下发生水解反应，生产吲哚酚阳离子，在有氧的条件下，吲哚酚阳离子会氧化为吲哚酚自由基，吲哚酚自由基的生成由原浸泡液中的溶解氧供氧即可，吲哚酚自由基可能缩合成为靛蓝；但是进一步氧化生成的吲哚满二酮则需要外界额外供氧。化学反应方程式如下：

本发明提供的技术方案，包括以下步骤：

1）在采收12ｈ内的鲜活蓼大青叶中添加水，粉碎，在提取原浆中添加如吲哚醌，充分搅拌，投入密封的发酵罐中，发酵大于24h，得到发酵原料；

2）加热发酵原料，反应大于30min后，过滤，收集水液；

3）用氯仿、一氯甲烷、二氯甲烷、四氯甲烷或乙酸乙酯中的一种或几种的混合物，加热，萃取水液，收集合并有机相；

4）回收有机相，纯化得到靛玉红粗品。

步骤1）所述为在采收12ｈ内的鲜活大青叶中添加药材重量2-5倍的水，粉碎，粉碎的浆液能过目筛，发酵超过12h。

步骤1）在发酵的过程中每间隔1h,搅动发酵原料一次，中搅拌不仅有在发酵过程中补充一定氧气的作用，同时还能控制发酵温度。。

步骤1）在发酵的时间是18-36h均可，但是最优的时间是24h。

步骤3）所述的加热反应中充入惰性气体，排除反应液体中的氧气。

步骤4）所述的纯化为：将有机相回收至干，用氯仿、一氯甲烷、二氯甲烷、四氯甲烷或乙酸乙酯中的一种或几种的混合物加热溶解，按原料:氧化铝（1:2-4）的比例拌，干法湿法装柱，干法上样；收集靛玉红的色谱带，回收，结晶得到靛玉红纯品。

步骤4）所述的纯化为：将有机相回收至干，用50%的甲醇加热溶解，浓缩，冷却结晶，重复结晶操作，得到靛玉红纯品。

本发明的有益技术效果是：1）利用蓼大青叶作为原料直接制备靛玉红，不仅是用生物化学方法合成靛玉红，引入吲哚醌，提高了反应的另外一个原料吲哚酮的生物量，同时也增加了蓼大青叶中的靛玉红生物量，操作简便。

2）本发明在发酵的过程中通过控氧和添加吲哚醌有效的将反应方向向靛玉红方向发展；使整个生产产业化可控。

具体实施方式

实施例1不同制备方法中靛玉红的产率考察

1、传统打靛工艺

采收7-10月的蓼大青叶鲜品，根据文献报道的传统的打靛工艺，主要的操作为：称取大蓼青叶鲜品10kg，粉碎，过滤，得到蓼大青叶浸液；选用优质石灰块2kg,加清水适量煮沸溶化后，过100目筛进行滤过，以去其杂质及石灰渣，将石灰液质均匀地洒入蓼大青叶的浸液中，以木棒不停地搅拌，使水浸液不停地上下翻腾。但是在打靛超过48h后，仍然没出现浸液由青绿→浅绿→灰绿→灰红→灰紫→青色→紫色的现象，停止捣冲与搅拌。我们不采用传统工艺倾去上层液，而是在这步直接检测整个缸内的靛玉红、靛蓝、和吲哚苷的含量；得到打靛法制样组。

2、传统蓼蓝发酵工艺

采收7-10月的蓼大青叶鲜品，根据文献报道的传统工艺，主要的操作为：称取大蓼青叶鲜品10kg，将蓼青叶鲜品置于坑中，用重物压榨，覆土，发酵1周，取出粉碎，直接检测整个缸内的靛玉红、靛蓝、和吲哚苷的含量；得到发酵法制样组。

3、传统酒糟发酵工艺

采收7-10月的蓼大青叶鲜品，根据文献报道的传统工艺，主要的操作为：称取大蓼青叶鲜品10kg，粉碎，过滤，得到蓼大青叶浸液；按每千克蓼大青叶鲜品添加酒糟100g的比例添加酒糟；发酵24h后，充分搅拌蓼大青叶浸液超过48h。直接检测整个缸内的靛玉红、靛蓝、和吲哚苷的含量；得到酒糟发酵制样组。

4、有氧条件下靛玉红制备方法

采收7-10月的蓼大青叶鲜品，称取蓼大青叶鲜品10kg，添加药材重量3倍的水，粉碎，制备得到大青叶原浆，在原浆中添加吲哚醌100g，混合混匀，常温发酵超过24h，每间隔1h搅拌一次；得到发酵原料，加热到90℃；用充氧设备充氧，充分搅拌10h；直接检测整个缸内的靛玉红、靛蓝、和吲哚苷的含量；得到有氧靛玉红制备组。

5、无氧条件下靛玉红的制备方法

采收7-10月的蓼大青叶鲜品，称取蓼大青叶鲜品10kg，添加药材重量3倍的水，粉碎，制备得到大青叶原浆，在原浆中添加吲哚醌100g，混合混匀，密封常温发酵超过24h，每间隔1h搅拌一次；用空气压缩机对大青叶原浆充入惰性气体（氮气），升温至90℃；充分搅拌10h；直接检测整个缸内的靛玉红、靛蓝、和吲哚苷的含量；得到无氧靛玉红制备组。

比较上述5种方法制备靛玉红的方法，具体如表1所示。

表1制备靛玉红的方法中有效成分的比较

注：各组的原药材重量以鲜品计算。

从上述各种靛玉红的制备方法的数据中发现，采用传统的蓼蓝发酵工艺、打靛工艺和酒糟发酵工艺制备靛玉红，靛玉红在反应原料中含量都比较少，尤其是采用打靛工艺制备靛玉红，靛玉红含量极低。采用有氧发酵，无氧加热缩合靛玉红的工艺，产量达到了每千克鲜药材制备靛玉红35g，相对与有氧缩合靛玉红，产量提高了1倍，具体原因应该是，当吲哚酚阳离子大量游离出来以后，在有氧的条件下，可能氧化成为吲哚酚自由基进而缩合成靛白，或者进一步氧化成为吲哚酚，这都会减少母液中的吲哚酚阳离子但是吲哚酮的量减少。

在本发明中反应前体吲哚苷在鲜活大青叶自源酶的条件下，很不稳定，很难单独分离出吲哚酚阳离子和吲哚酚自由基等反应中间体出来进行量化考察。但是从反应的目标产物量的增加，和反应现象证明反应方向是正确的。

实施例2不同发酵时间对靛玉红产量的影响

在蓼大青叶有氧发酵的过程中，对靛玉红影响最大的两个因素是发酵时间和发酵温度，但是由于蓼大青叶采收的时间是7-10月，环境温度一般在25-35℃，发酵罐内的温度一般恒定在35-40℃（每间隔1小时搅拌一次），如果人工控制反应温度，则需要添置控温设备，不利于工业化生产，所以在本实施例中仅仅讨论发酵时间对靛玉红产量的影响。称当年7-10月采收的蓼大青叶6组，每组1kg,采用实施例1中无氧条件下靛玉红的制备方法，发酵时间分别是6h、12h、18h、24h、36h、48h和72h，以整反应完毕考察各组的的靛玉红、靛蓝、和吲哚苷的含量。具体如表2所示。

表2不同发酵时间对靛玉红产率的影响比较

注：各组的原药材重量以鲜品计算。

从上述各组数据可以知道，发酵的最佳时间是18-36h。根据工业化生产的需要可以优选24h。

实施例3靛玉红的提出纯化

采用实施例2中无氧条件下靛玉红的制备方法，取相当于原药材量1kg的的反应液，过滤除去残渣，用15000rpm的离心机除杂，取上清液，浓缩至800ml，加热至60℃；加入500ml二氯甲烷萃取3次，合并有机相；回收有相至密度大于1.1的浸膏，浸膏重量为83.71g；

将上述浸膏拌样到300g氧化铝中，干燥，制成粉末，制备得到上样样品；称取氧化铝1500g，用二氯甲烷混合装柱，干法上样，分别用氯仿、氯仿:乙酸乙酯（9:1）、氯仿:乙酸乙酯（4:1）、氯仿:乙酸乙酯（2:1）、氯仿:乙酸乙酯（1:1）等极性梯度洗脱，洗脱溶剂的替换，以洗脱色带的变化而调整。通过TLC检测确认得到靛玉红色带，结晶纯化，得到靛玉红纯度高于98.5%（内标法）。采用萃取与氧化铝柱色谱分离相结合的方法，相对于反应液中靛玉红的含量，靛玉红的收率达到89%。

采用采用实施例2中无氧条件下靛玉红的制备方法，取相当于原药材量1kg的的反应液，过滤除去残渣，用15000rpm的离心机除杂，取上清液，浓缩至800ml，加热至60℃；加入500ml二氯甲烷萃取3次，合并有机相；回收有相至密度大于1.1的浸膏，浸膏重量为91.35g；

将上述经过用200ml50%加热甲醇溶解，缓慢降温，挥发掉100ml的50%甲醇溶液，有暗褐色晶体析出，待晶体析出完毕，过滤晶体，再用50%加热甲醇溶解，缓慢降温结晶，最后获得，得到靛玉红纯度高于98.5%（内标法）。采用结晶法与萃取相结合的方法，相对于反应液中靛玉红的含量，靛玉红的收率达到62%。

Claims

1.一种以蓼大青叶为原料制备靛玉红的方法，其特征在于：将鲜活的蓼大青叶粉碎，添加吲哚醌，发酵超过12h。

2.根据权利要求1所述的以蓼大青叶为原料制备靛玉红的方法，其特征在于：包括以下步骤：

2）加热发酵原料，反应大于30min后，过滤，收集水液；

4）回收有机相，纯化得到靛玉红粗品。

3.根据权利要求2所述的以蓼大青叶为原料制备靛玉红的方法，其特征在于：步骤1）所述为在采收12ｈ内的鲜活大青叶中添加药材重量2-5倍的水，粉碎，粉碎的浆液能过目筛，发酵超过12h。

4.根据权利要求2所述的以蓼大青叶为原料制备靛玉红的方法，其特征在于：步骤1）在发酵的过程中每间隔1h,搅动发酵原料一次。

5.根据权利要求2所述的以蓼大青叶为原料制备靛玉红的方法，其特征在于：步骤1）在发酵的时间是24h。

6.根据权利要求2所述的以蓼大青叶为原料制备靛玉红的方法，其特征在于：步骤3）所述的加热反应中充入惰性气体，排除反应液体中的氧气。

7.根据权利要求2所述的以蓼大青叶为原料制备靛玉红的方法，其特征在于：步骤4）所述的纯化为：将有机相回收至干，用氯仿、一氯甲烷、二氯甲烷、四氯甲烷或乙酸乙酯中的一种或几种的混合物加热溶解，按原料:氧化铝（1:2-4）的比例拌，干法湿法装柱，干法上样；收集靛玉红的色谱带，回收，结晶得到靛玉红纯品。

8.根据权利要求2所述的以蓼大青叶为原料制备靛玉红的方法，其特征在于：步骤4）所述的纯化为：将有机相回收至干，用50%的甲醇加热溶解，浓缩，冷却结晶，重复结晶操作，得到靛玉红纯品。