CN103450134B - 香豆素衍生物的制备及其在防治脑部重大疾病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一类新的香豆素化合物及其药学上可接受的盐，这类化合物的制备方法，含有这类化合物的药物组合物，这类化合物在制备预防或治疗脑疾病的药物中的应用，尤其是预防或治疗神经元损伤、神经炎症相关疾病，特别是预防或治疗帕金森氏症、痴呆、脑缺血、抑郁、脑卒中。

Description

香豆素衍生物的制备及其在防治脑部重大疾病中的应用

技术领域

本发明涉及香豆素类衍生物，以及该类化合物的一种新的医药用途，尤其在预防和治疗脑卒中、痴呆、帕金森氏症、抑郁等脑部神经、精神疾病中的应用；属于医药技术领域。

背景技术

随着现代社会的飞速发展，生活、工作节奏的加快，加之社会人口的日趋老龄化，脑部重大疾病包括神经系统疾病和精神障碍疾病（尤其是脑卒中、痴呆、帕金森、抑郁等）已经严重危害到人类的健康，不仅降低患者的生活质量，而且给患者家庭带来沉重的经济负担，亦将成为严重的社会问题。

现代医学认为神经元的异常损伤、丢失是脑卒中、痴呆、帕金森、抑郁等脑部重大疾病的共同病理特征，通过减少神经元的丢失数量或延缓神经功能衰减的速度，以及促进神经元的再生恢复神经功能是防治脑部疾病的重要策略。目前临床应用的神经保护剂有钙通道阻滞剂，如尼莫地平已广泛应用于缺血性脑血管病的治疗；NMDA受体拮抗剂，如美金刚批准应用于阿尔茨海默病的治疗；神经营养因子，如重组NGF、BDNF等；改善脑能量代谢药物如吡拉西坦、二氢麦角碱等；自由基清除剂如生育酚、依达拉奉等以及神经节苷脂类药物。此外，其它一些抗神经、精神系统疾病药物也可通过不同机制对神经元产生保护作用。虽然临床上使用的药物种类繁多，但由于存在或疗效不够好，或有较严重的副作用问题而限制了应用。因此开发有效治疗脑部重大疾病的药物具有良好的社会效应和经济效益。

目前越来越多的证据表明，神经炎症、小胶质细胞的激活与神经、精神系统疾病密切相关。尽管还不清楚神经炎症过程的实质及其影响疾病进程的机制，但现已发现许多急、慢性神经变性、精神障碍疾病均与神经炎症的参与密切相关。小胶质细胞是中枢神经系统中的主要吞噬细胞，是神经炎症的主要参与者。在健康的脑中，静息状态的小胶质细胞发挥正常吞噬功能；当小胶质细胞被中度激活时，它能清除过多的神经毒素、死亡细胞及细胞碎片，维持中枢神经系统的稳态；当小胶质细胞被持续激活时，它可与MCP-1等化学因子结合，继而与神经元结合，在炎症、创伤、缺血及中枢神经系统的变性疾病、精神障碍性疾病中发挥作用。随着人们对小胶质细胞在中枢神经系统中重要地位的认识，以小胶质细胞为靶标，通过调控小胶质细胞来减轻神经元的损伤已成为新药研发方向之一。

香豆素是广泛存在于自然界中的一种内酯类化合物，在芸香科和伞形科植物中存在最多，其次是豆科、兰科、木樨科、茄科和菊科植物，少数来自微生物。香豆素及其衍生物具有明显的生物活性，对人体具有抗氧化、降血糖、抗骨质疏松、抗高血压、抗凝血、抗菌、抗癌等多种药理作用；最近研究发现，香豆素及其衍生物还具有神经保护、抗高尿酸血症、保肝等生物活性。其中抗凝血作用的研究最为成熟，在治疗血拴方面，临床用药有苄丙酮香豆素(华法令)、醋硝香豆素、新抗凝(sintrom)和双香豆素。本发明人研究发现，一些哌嗪香豆素能够抑制趋化素样因子1（CKLF1）与其受体CCR4的相互作用。

发明内容

本发明涉及一些香豆素衍生物，该衍生物是采用多种神经细胞损伤模型，筛选出的具有神经保护作用的化合物。本发明还涉及使用该化合物防治重大脑疾病，特别是与神经元损伤、神经炎症相关疾病例如帕金森氏症、痴呆、脑缺血、抑郁等。

具体而言本发明涉及一些香豆素衍生物结构如下：

本发明化合物药学可接受盐，是指分子中的氨基与无机酸或有机酸形成的酸加成盐。在此，无机酸包括硫酸、磷酸、盐酸、氢溴酸、硝酸、亚硫酸、戊酸、甲磺酸、乙磺酸、甲苯磺酸、水杨酸、苯甲酸等；有机酸包括甲酸、乙酸、丙二酸、乳酸、肉桂酸、琥珀酸、草酸、柠檬酸、马来酸、富马酸、苹果酸、扁桃酸、酒石酸、磺酸等。本发明中对于药学可接受盐不加限制。

本发明第二方面提供了这类化合物的制备方法，具有上述新化合物可以通过以下反应式合成：

反应式1:

反应式2：

反应式3：

反应式4：

反应式5：

反应式6：

反应式7：

反应式8：

本领域技术人员可对上述步骤进行变动以提高收率，他们可根据本领域的基本知识确定合成的路线，如选择反应物，溶剂和温度。这样的改动或变动均在本发明的范围内。还可以通过使用各种常规保护基以避免副反应的发生从而提高收率。这些常规的保护方法可参见例如T.Greene，Protecting Groups in Organic Synthesis（the Fourth Edition,John Wiley&Sons,Inc.）。改进的方法和路线都属于本专利保护范畴。

本发明第三方面还涉及以本发明化合物作为活性成份的药物组合物。该药物组合物可根据本领域公知的方法制备。可通过将本发明化合物与一种或多种药学上可接受的固体或液体赋形剂和/或辅剂结合，制成适于人或动物使用的任何剂型。本发明化合物在其药物组合物中的含量通常为0.1-95重量%。

本发明化合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔、口腔粘膜、眼、肺和呼吸道、皮肤、阴道、直肠等。

给药剂型可以是液体剂型、固体剂型或半固体剂型。液体剂型可以是溶液剂（包括真溶液和胶体溶液）、乳剂（包括o/w型、w/o型和复乳）、混悬剂、注射剂（包括水针剂、粉针剂和输液）、滴眼剂、滴鼻剂、洗剂和搽剂等；固体剂型可以是片剂（包括普通片、肠溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡腾片、口腔崩解片）、胶囊剂（包括硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊）、颗粒剂、散剂、微丸、滴丸、栓剂、膜剂、贴片、气（粉）雾剂、喷雾剂等；半固体剂型可以是软膏剂、凝胶剂、糊剂等。

本发明化合物可以制成普通制剂、也制成是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。

为了将本发明化合物制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种赋形剂，包括稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂。稀释剂可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙等；湿润剂可以是水、乙醇、异丙醇等；粘合剂可以是淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纤维素、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、丙烯酸树脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解剂可以是干淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、碳酸氢钠与枸橼酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠等；润滑剂和助流剂可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸盐、酒石酸、液体石蜡、聚乙二醇等。

还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。

为了将给药单元制成胶囊剂，可以将有效成分本发明化合物与稀释剂、助流剂混合，将混合物直接置于硬胶囊或软胶囊中。也可将有效成分本发明化合物先与稀释剂、黏合剂、崩解剂制成颗粒或微丸，再置于硬胶囊或软胶囊中。用于制备本发明化合物片剂的各稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、助流剂品种也可用于制备本发明化合物的胶囊剂。

为将本发明化合物制成注射剂，可以用水、乙醇、异丙醇、丙二醇或它们的混合物作溶剂并加入适量本领域常用的增溶剂、助溶剂、pH调剂剂、渗透压调节剂。增溶剂或助溶剂可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羟丙基-β-环糊精等；pH调剂剂可以是磷酸盐、醋酸盐、盐酸、氢氧化钠等；渗透压调节剂可以是氯化钠、甘露醇、葡萄糖、磷酸盐、醋酸盐等。如制备冻干粉针剂，还可加入甘露醇、葡萄糖等作为支撑剂。

此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂或其它添加剂。

为达到用药目的，增强治疗效果，本发明的药物或药物组合物可用任何公知的给药方法给药。

本发明的第四方面涉及这类化合物的用途，本发明所述化合物具有抗氧化及清除氧自由基的活性，因而可以用治疗与氧自由基有关疾病，例如脑缺血、脑卒中、阿尔海默此病及帕金森病等。

本发明涉及通式一化合物通过多种神经元损伤模型筛选出的具有神经保护作用的化合物。在优选的实施例中，本发明的化合物具有抑制多种因素诱导神经元损伤活性、抗小胶质细胞激活介导的炎症反应;以及使用该化合物治疗脑疾病，特别是与神经元损伤、神经炎症相关疾病例如帕金森氏症、痴呆、抑郁等的药物的应用;以及预防或治疗与抗氧化活性相关的疾病,如脑缺血、脑卒中、阿尔海默此病、帕金森病等的药物应用。

当给药用于治疗或抑制特定疾病或病症时，应该理解有效剂量可以根据使用的特定化合物、给药方式、疾病的状态和严重程度、治疗条件以及与被治疗个体有关的各种物理因素而变化。在治疗应用中，以足以治疗或至少部分改善疾病和其并发症的数量，将本发明化合物提供给已经患病的患者。该合适的数量被定义为“治疗有效量”。在特殊情况下治疗所使用的剂量必须客观地由治病的医生确定，涉及的变化包括患者的特殊状态、体重、年龄以及反应行为。将所需剂量水平提供给人类。所述剂量可以一次给药或分两次或多次给药。规定的日剂量可以随给药的方式变化。所述剂量能够以任何可用于将活性化合物导入接受者的血液中的方式给药，该方式包括口服、通过植入物、非肠道(包括静脉、腹膜内、关节内和皮下注射)、直肠、鼻内、表皮、眼内(眼滴剂)、阴道和经皮给药。

本发明化合物特别用于治疗与神经元损伤、神经炎症相关的脑部疾病。

本发明进一步提供治疗哺乳动物，包括人类的以下疾病的方法:帕金森氏症、痴呆、脑卒中、抑郁等。所述方法包括对感染的哺乳动物使用本发明的有效量的化合物。

本发明化合物药物组合物的给药剂量依照所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的个体情况，给药途径和剂型等可以有大范围的变化。一般来讲，本发明化合物的每天的合适剂量范围为0.001-150mg/Kg体重，优选为0.1-100mg/Kg体重，更优选为1-60mg/Kg体重，最优选为2-30mg/Kg体重。上述剂量可以一个剂量单位或分成几个剂量单位给药，这取决于医生的临床经验以及包括运用其它治疗手段的给药方案。

本发明的化合物或组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用。当本发明的化合物与其它治疗药物存在协同作用时，应根据实际情况调整它的剂量。

附图说明

图1形态观察IMMLG5645对氧糖剥夺所致PC12细胞损伤的影响。A:Control；B:OGD；C:NGF(50U)；D:IMMLG5645(0.1μM)；E:IMMLG5645(1μM)；F:IMMLG5645(10μM)

图2IMMLG 5645对氧糖剥夺损伤PC12细胞的MTT法测定结果。^###P＜0.001vs.Control，^**P＜0.01，^***P＜0.001 vs.模型组（Model）。

图3IMMLG5645对氧糖剥夺损伤PC12细胞的LDH测定结果。^###P＜0.001vs.Control，^**P＜0.01，^***P＜0.001 vs.模型组（Model）。

图4流式细胞仪检测氧糖剥夺诱导的神经细胞系PC12细胞凋亡。a:Control；b:模型组（Model）；c:NGF(50U)；d:IMMLG5645(0.1μM)；e:IMMLG5645(1μM)；f:IMMLG5645(10μM)

图5IMMLG5645对氧糖剥夺诱导PC12凋亡后DNA断裂的影响1:Control；2:模型组（Model）；3:IMMLG5645(0.1μM);4:IMMLG5645(1μM);5:IMMLG5645(10μM)

图6IMMLG5645对氧糖剥夺所致PC12细胞中自由基生成的影响。

图7采用JC-1染色测定IMMLG5645对氧糖剥夺所致PC12细胞线粒体膜电位的改变。

图8IMMLG5645对氧糖剥夺所致PC12细胞中ATP含量的影响。^###P＜0.001vs.Control，^**P＜0.01 vs.OGD。

图9IMMLG5645对氧糖剥夺所致PC12细胞中Bc1-2、Bax表达的影响。

图10IMMLG5645对氧糖剥夺所致PC12细胞胞浆中Cyt C、Caspase-3表达的影响。

图11ESR方法测定IMMLG5645对羟自由基的直接清除作用。

图12比色法测定IMMLG5645对羟自由基的直接清除作用。

图13IMMLG5645对DPPH的直接清除作用。

图14IMMLG5645对超氧阴离子的直接清除作用。

图15MTT法检测IMMLG5645、LPS对小胶质细胞BV-2生长的影响。

图16可见光观察IMMLG5645对LPS刺激BV-2细胞的影响。

图17Griess法测定IMMLG5645对LPS刺激BV-2细胞释放NO的变化。^##P＜0.01vs.control，^*P＜0.05，^**P＜0.01 vs.LPS。

图18IMMLG5645对LPS刺激BV-2细胞释放TNF-α的影响。^###P＜0.001 vs.control，^**P＜0.01 vs.LPS。

图19IMMLG5645对LPS刺激BV-2细胞释放IL-1β的影响。^###P＜0.001 vs.control，^**P＜0.01 vs.LPS。

图20IMMLG5645对LPS刺激BV-2细胞表达COX-2、iNOS、IL-6的影响。

图21IMMLG5645对LPS刺激BV-2细胞中MAPK信号通路的影响。

图22IMMLG5645对LPS刺激BV-2细胞中NFκB信号通路的影响。

图23IMMLG5645对LPS刺激BV-2细胞中NFκB信号通路的影响。

图24LPS、IMMLG5645作用BV-2细胞后的条件培养基对PC12细胞生长的影响（形态观察）。

图25LPS、IMMLG5645作用BV-2细胞后的条件培养基对PC12细胞生长的影响（MTT法）。^###P＜0.001 vs.control，^**P＜0.01 vs.LPS。

图26LPS、IMMLG5645作用BV-2细胞后的条件培养基对PC12细胞凋亡的影响。

图27LPS、IMMLG5645作用BV-2细胞后的条件培养基对PC12细胞线粒体膜电位的影响。

图28在避暗实验中，IMMLG5645对短暂性脑缺血引起的拟血管性痴呆小鼠受电击次数的影响。^##P＜0.01 vs.空白组（Sham），^*P＜0.05，^**P＜0.01 vs.模型组（Model）。

图29在避暗实验中，IMMLG5645对短暂性脑缺血引起的拟血管性痴呆小鼠逃避电击潜伏期的影响。^##P＜0.01 vs.空白组（Sham），^*P＜0.05，^**P＜0.01 vs.模型组（Model）。

图30在Morris水迷宫训练过程中，IMMLG5645对短暂性脑缺血引起的拟血管性痴呆小鼠到达平台潜伏期的影响。

图31是在Morris水迷宫训练末日撤去平台后，IMMLG5645对短暂性脑缺血引起的拟血管性痴呆小鼠在目标象限停留时间比例的影响。^##P＜0.01 vs.空白组（Sham），^*P＜0.05，^**P＜0.01 vs.模型组（Model）。

图32采用尼氏染色观察IMMLG5645对短暂性脑缺血引起的拟血管性痴呆小鼠海马及CA1区神经元的影响。

图33采用Western blotting检测IMMLG5645对短暂性脑缺血引起的拟血管性痴呆小鼠海马神经元的影响。^##P＜0.01 vs.空白组（Sham），^*P＜0.05，^***P＜0.001 vs.模型组（Model）。

图34采用Morris水迷宫检测IMMLG5645对双侧颈总动脉永久结扎所致慢性脑缺血大鼠逃避潜伏期的影响。

图35IMMLG5645对双侧颈总动脉永久结扎所致慢性脑缺血大鼠在空间探索实验中寻找平台次数的影响。^###P＜0.001 vs.空白组（Sham）;^*P＜0.05 vs.模型组（Model）。

图36采用尼氏染色检测IMMLG5645对双侧颈总动脉永久结扎所致慢性脑缺血大鼠海马、CA1区神经元的影响。

图37采用Western blotting检测IMMLG5645对双侧颈总动脉永久结扎所致慢性脑缺血大鼠海马Bcl-2蛋白表达的影响。^#P＜0.05 vs.空白组（Sham），^*P＜0.05，^***P＜0.001vs.模型组（Model）。

图38采用免疫组化检测IMMLG5645对双侧颈总动脉永久结扎所致慢性脑缺血大鼠海马、CA1区Bc1-2蛋白表达的影响。^##P＜0.01vs.空白组（空白组（Sham）），^*P＜0.05，^**＜0.01,^***P＜0.001vs.模型组（模型组（Model））。

图39IMMLG5645对大脑中动脉阻断大鼠神经功能缺损评分的影响。^*P＜0.05，^**P＜0.01,^***P＜0.001 vs.模型组（Model）。

图40IMMLG5645对大脑中动脉阻断大鼠脑缺血面积的影响。^*P＜0.05，^**P＜0.01,^***P＜0.001 vs.模型组（Model）。

图41IMMLG5645对大脑中动脉阻断大鼠脑组织含水量的影响。^###P＜0.001vs.con;^*P＜0.05，^**P＜0.01 vs.模型组（Model）。

图42IMMLG5645对东莨菪碱所致学习记忆障碍小鼠逃避潜伏期的影响。

图43IMMLG5645对东莨菪碱所致学习记忆障碍小鼠错误次数的影响。^###P＜0.001vs.control;^*P＜0.05，^**P＜0.01，^***P＜0.001 vs.模型组（Model）。

具体实施方式

以下举出实施例对本发明作进一步的说明。但本发明并不限于这些实施例。化学实施例部分

试剂与溶剂

反应所用试剂若无特别说明，均购自Acros Organics(Geel,Belgium)，未经过进一步纯化直接使用。10%钯-碳购自陕西开达化工有限公司。甲酸铵购自北京化学试剂公司。反应所用溶剂若无特别说明，均购自北京化工厂，级别是分析纯。干燥THF的处理：分析纯THF用分子筛浸泡干燥过夜，加入金属钠和二苯基酮，加热回流，溶剂颜色变为蓝色时收集THF。干燥DCM的处理：分析纯DCM分别用5%Na₂CO₃、蒸馏水各洗涤两遍，用无水CaCl₂干燥过夜。过滤，加入P₂O₅加热回流重蒸制得。丙酮：分析纯丙酮用新炒无水K2CO3浸泡干燥。无水Na₂SO₄，无水K₂CO₃，分子筛：马弗炉500℃烘烤12h以上。GF254薄层层析硅胶，柱层析硅胶（60-100目，160-200目），硅胶H均购自青岛海洋化工厂。

仪器

自动HPLC-MS分析仪：

HPLC分析仪为Agilent 1100HPLC系统。Agilent G1312A泵，Agilent G1314A紫外检测器，Agilent G1313A自动进样器，Agilent G1316A柱温箱和分流阀。洗脱条件同上述Gilson HPLC系统。

质谱仪为ThermoFinnigan LCQ-Advantage质谱仪。洗脱液中的5%分流进入质谱仪。质谱检测采用正离子或者负离子扫描方式。离子源：电喷雾离子源(ESI)。

色谱柱：Kromasil C18分析柱(4.6μm，4.6mm×50mm)，购自DIKMA公司。

洗脱条件：流动相为含有0.05%HCOOH的乙腈和水。线性梯度洗脱5:95(v:v)acetonitrile-H2O到95:5(v:v)acetonitrile-H2O，时间5minutes，流速是1mL/min。UV检测波长是254nm

高分辨质谱仪：

Agilent LC/MSD TOF系统。色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18(Rapid resolution,3.5μm,2.1 30mm)。流动相：MeOH:H2O=75:25(v:v)，含有5mmol/L甲酸，等梯度洗脱。时间：5mins，流速：0.40mL/min。质谱检测采用正离子或者负离子扫描方式。离子源：ESI。

核磁共振仪：Varian Mercury，300MHz，400MHz，或500HMz。溶剂为DMSO-d6。

熔点仪：Yanaco微量熔点仪。所测熔点均未校正。熔点用日本Yanaco显微熔点仪测定，温度未经校正。

质谱用Finnigan LCQ-Advantage型质谱仪测定。

实施例1

3-(4-乙酰哌嗪-1-基)-5,7-二羟基-4-甲基-2H-苯并吡喃-2-酮（5A,R=甲基）

按照反应式1，将无水哌嗪1（0.10mol）、0.10mol烘过的碳酸钾溶于无水乙腈，室温剧烈搅拌下，缓慢滴加0.10mol 2的无水乙腈溶液，反应液由乳白色渐变为淡黄色，LC-MS跟踪监测，反应完毕，滤除碳酸钾，旋除乙腈，所得残余物加水，搅拌30min，用EA萃取三次，合并萃取液，无水Na2SO4干燥5h。过滤，除去Na2SO4，滤液减压蒸除溶剂，得棕红色油状物3，不必纯化，直接用于下一步反应。

将间苯三酚（0.10mol）和3（0.10mol）混合溶于无水乙醇中，加入三氟化硼乙醚溶液（0.30mol），加热回流，反应液渐变为棕红色，LC-MS跟踪监测，反应完毕，蒸出大部分溶剂，静置待析出固体后过滤，得乳白色固体粉末4，不必纯化，直接用于下一步反应。

将4（27.6mg,0.10mmol）溶于无水THF,加入乙酸酐（0.10mmol）,室温搅拌反应,30min后，溶液变澄清，HPLC-MS跟踪监测，反应完毕，蒸除THF，加水，EA萃取三次，碳酸氢钠洗涤有机层三次，干燥，浓缩，甲醇重结晶，得黄绿色粉末5A，收率85.0％，m.p.302-304℃。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆,75℃):δ10.235(s,1H),9.986(s,1H),6.268(d,1H,J＝1.2Hz),6.125(d,1H,J＝1.2Hz),3.497(br,4H),2.870(br,4H),2.664(s,3H),2.014(s,3H);HRMS Calcd.For C₁₆H₁₉N₂O₅(M+H⁺)319.1294;found 319.1289.

实施例2

5,7-二羟基-4-甲基-3-(4-(2,2,2-三氟乙酰基)哌嗪-1-基)-2H-苯并吡喃-2-酮（5B,R=三氟甲基）

按照反应式1，将4（27.6mg,0.1mmol）溶于无水THF,加入三氟乙酸酐（0.10mmol）反应，得淡黄色固体5B，收率88.0％，m.p.274-275℃。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ10.457(s,1H),10.220(s,1H),6.258(d,1H,J＝1.8Hz),6.127(d,1H,J＝1.8Hz),3.314－4.500(m,4H),2.800-3.310(m,4H),2.659(s,3H);¹³C NMR(125MHz,DMSO-d₆):δ160.323,158.034,157.942,154.540,150.314,127.565,117.495,115.207,102.131,99.354,94.136,49.441,48.731,46.183,43.711,16.995;HRMSCalcd.ForC₁₆H₁₆F₃N₂O₅(M+H⁺)373.1011;found 373.1012.

实施例3

N-丁基-4-(5,7-二羟基-4-甲基-2-氧-2H-苯并吡喃-3-基)哌嗪-1-酰胺（7A,R=正丁基）

按照反应式1,将4（0.1mmol）溶于无水THF,再加少量DMF助溶,加入正丁基异硫氰酸酯（0.12mmol）,50℃反应，LC-MS跟踪监测，反应完毕，蒸除THF、DMF，硅胶柱层析纯化，洗脱剂为PE:EA=1:2,得标题化合物，为灰白色粉末，收率38％，m.p.245-248℃。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ10.423(s,1H),10.191(s,1H)7.639(t,1HJ＝5.1Hz),6.253(d,1H,J＝2.4Hz),6.118(d,1H,J＝2.4Hz),3.480(m,2H),4.448(br,4H),2.925(br,4H),2.659(s,3H);1.515(m,2H),1.261(m,2H),0.882(t,3H,J＝7.2Hz);HRMS Calcd.ForC₁₉H₂₆N₃O₄S(M+H⁺)392.1644;found.392.1632

实施例4

4-(5,7-二羟基-4-甲基-2-氧-2H-苯并吡喃-3-基)-N-(3-氟苯基)哌嗪-1-硫代酰胺（7B，R=间氟苯基）

按照反应式1,将4（0.1mmol）溶于无水THF,加入间氟苯基异硫氰酸酯（0.12mmol）,50℃反应,LC-MS跟踪监测，反应完毕，蒸除THF、DMF，硅胶柱层析纯化，洗脱剂为PE:EA=1:2,得标题化合物，为淡黄色粉末，收率18.0%;m.p.282-284℃。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆):10.444(s,1H),10.207(s,1H)9.445(s,1H),7.261(m,2H),7.145(t,1H,J＝7.5Hz)6.920(d,1H,J＝8.4Hz),6.265(d,1H,J＝2.1Hz)6.128(d,1H,J＝2.1Hz),4.250(d,2H,J＝6.0Hz),2.634-5.000(m,8H),2.669(s,3H)..

实施例5

4-(5,7-二羟基-4-甲基-2-氧-2H-苯并吡喃-3-基)-N-(4-氟苯基)哌嗪-1-酰胺

m.p.210-213℃;¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ10.424(s,1H),10.188(s,1H),8.566(s,1H),7.460(t,2H,J＝9.0Hz),7.059(t,2H,J＝9.0Hz),6.259(d,1H,J＝2.4Hz),6.120(d,1H,J＝2.4Hz),2.878-3.6(m,8H),2.878(s,3H).HRMS Calcd.For C₂₁H₂₁FN₃O₅(M+H⁺)414.1465;found.414.1457.

实施例6（IMMLG5645）

7-羟基-5-甲氧基-4-甲基-3(4-甲基哌嗪-1-基)-2H-苯并吡喃-2-酮(30)

按照反应式5，第一、二、三步同实施例42.

第四步，称取20（1.8g,3mmol）加丙酮70ml溶解，室温搅拌下依次加入碳酸钾（620mg，4.5mmol）和溴苄（0.36ml,3mmol），继续室温搅拌反应，TLC或LC-MS监测反应完全后，滤出不溶物，滤液减压浓缩的棕黄色油状物26,不经纯化进行下一步反应。

第五步，向盛有棕黄色油状物26的圆底烧瓶中加入四氢呋喃50ml，在0℃搅拌下加入TBAF（946mg,3mmol），之后继续0℃反应，TLC或LC-MS监测反应完全后，减压蒸出溶剂得棕黄色油状物27，不经纯化进行下一步反应。

第六步，向盛有棕黄色油状物27的圆底烧瓶中加丙酮50ml溶解，室温搅拌下加入碳酸钾(414mg,3mmol)，2min后再加入硫酸二甲酯(0.285ml,3mmol)，室温搅拌5mi n后，回流反应，TLC或LC-MS监测反应完全后，滤出不溶物，滤液减压浓缩的红色油状物28，不经纯化进行下一步反应。

第七步，向盛有棕黄色油状物28的圆底烧瓶中加THF50ml，室温搅拌下加入TBAF(1.89g,6mmol)，完毕后继续室温搅拌反应，TLC或LC-MS监测反应完全后，将反应瓶移入油浴中待进行下一步反应。

第八步，在室温下向上述29中间体的反应液中加入钯/碳（636mg,6mmol），甲酸氨（750mg,12mmol），加完后回流反应，40mi n后TLC（DCM：MeOH=7:1）或是LC-MS检测已经反应完全，停止加热，滤出钯/碳等不溶物，滤液蒸出溶剂，DCM溶解后，用饱和的碳酸氢钠水溶液洗涤5-6次，DCM层浓缩后进行柱层析纯化（固定相：200-300目硅胶；流动相：DCM：MeOH=15:1），得浅黄色固体粉末30，产率：18.9%（五步），m.p.199-201℃。¹H NMR(300Hz,DMSO-d₆)δ10.428(s,1H),6.350-6.343(d,1H,J＝2.1Hz),6.269-6.263(d,1H,J=1.8Hz),3.812(s,3H),3.6-2.2(m,8H),2.586(s,3H),2.204(s,3H)；ESI-MS(m/z):305.3;[M+H]⁺(MW=305.35).

实施例7

3-氯-7-羟基-5-甲氧基-2H-苯丙呋喃-2-酮（35）

按照反应式6,

第一步，称取间苯三酚（3.24g,20mmol）溶于20ml饱和的HCl/MeOH溶液中，室温搅拌下加入1（2.77ml,20mmol），继续室温搅拌10h后，TLC（展开剂：DCM:MeOH=5:1）检测，结果显示反应完全，停止搅拌，减压蒸出溶剂，得淡黄色固体残渣，加水超声2min，过滤，得乳白色固体31（4.3g，产率：95.1%）。

第二步，称取31（1.13g,5mmol），加10ml吡啶溶解，在冰浴下加入对甲苯磺酰氯（4.7g,25mmol），然后室温搅拌反应，TLC（展开剂：PE:EA=4:1）检测反应完全后，停止搅拌，减压蒸出大部分溶剂，加EA(100ml)，用水（70ml×3）洗涤3次，EA层浓缩后进行柱层析纯化（固定相：200-300目硅胶；流动相：PE:EA=20:1），浓缩收集液得白色固体32（2.16g），产率：81%。

¹H NMR(300Hz,DMSO-d₆)δ7.78-7.77(d,2H,J＝9.0Hz),7.75-7.74(d,2H,J＝9.0Hz),7.27(s,1H),6.72(s,1H),2.54(s,3H),2.45(s,3H),2.42(s,3H);ESI-MS(m/z):535.9;[M+H]⁺(MW=535.99).

第三步，称取32（2.1g,4mmol）溶于20ml THF中，在冰浴下加入TBAF（1.26g,4mmol），并继续在冰浴下搅拌反应。TLC（展开剂：PE:EA=4:1）检测原料基本消失时，停止反应，减压蒸出THF，加水50ml，用EA（30ml×3）萃取3次，合并EA层，浓缩后进行柱层析纯化（固定相：200-300目硅胶；流动相：PE:EA=15:1），浓缩收集液得乳黄色固体33（1.29g），产率：84.9%。

¹H NMR(300Hz,DMSO-d₆)δ11.140(s,1H),7.805-7.778(d,2H,J＝8.1Hz),7.502-7.476(d,2H,J＝7.8Hz),6.559(s,1H),6.549(s,1H),2.687(s,3H),2.419(s,3H);ESI-MS(m/z):381.8;[M+H]⁺(MW=381.81).

第四步，称取33（380mg,1mmol）溶于15ml丙酮中，室温搅拌下加入碳酸钾（415mg,3mmol），2min后滴加硫酸二甲酯（284μl,3mmol），搅拌5min后回流反应。TLC（展开剂：PE:EA=3:1），跟踪，原料消失时停止加热，滤除不溶物，滤液浓缩后进行柱层析纯化（固定相：200-300目硅胶；流动相：PE:EA=6:1），浓缩收集液得乳黄色固体粉末34（312mg）,产率：79.1%。

¹H NMR(300Hz,DMSO-d₆)δ7.856-7.829(d,2H,J＝8.4Hz),7.524-7.498(d,2H,J＝7.8Hz),6.753-6.745(d,1H,J＝2.4Hz),6.683-6.675(d,1H,J=2.4Hz),3.788(s,3H),2.665(s,3H),2.438(s,3H);ESI-MS(m/z):395.8;[M+H]⁺(MW=395.83).

第五步，称取34（197mg,0.5mmol）溶于10mlTHF中，加入TBAF（315mg,1mmol），室温搅拌反应。TLC（展开剂：DCM:MeOH=15:1）跟踪，显示反应完全后停止搅拌，蒸出THF，加水20ml，用EA（15ml×3）萃取3次，合并EA层，浓缩后进行柱层析纯化（固定相：200-300目硅胶；流动相：DCM:MeOH=200:1），浓缩收集液得浅黄色固体35（48mg）,产率：41%，m.p.>240℃分解。

¹H NMR(300Hz,DMSO-d₆)δ10.70(s,1H),6.424-6.416(d,1H,J＝2.4Hz),6.360-6.352(d,1H,J＝2.4Hz),4.08(s,3H),2.670(s,3H);ESI-MS(m/z):241.6;[M+H]⁺(MW=241.65).

实施例8

5-羟基-7-甲氧基-4-甲基-3(4-甲基哌嗪-1-基)-2H-苯并吡喃-2-酮(25)

按照反应式4，第一步,称取N-甲基哌嗪10（0.96g，9.6mmol）置于250ml圆底烧瓶中，加乙腈80ml溶解，在搅拌下加入碳酸钾（1.7g，12mmol）和氯代乙酰乙酸乙酯1（1.15ml，8mmol），然后在室温搅拌下反应。8h后停止搅拌，滤出不溶物，滤液减压蒸出溶剂，然后加水，用DCM萃取（3次后LC-MS检测水相中不含化合物3），合并DCM层，加无水硫酸钠干燥过夜，次日滤出硫酸钠，滤液浓缩得棕红色油状物18(1.62g)，不纯化待进行下一步反应。

第二步，向盛有油状物18的圆底烧瓶中加无水乙醇80ml溶解，在室温搅拌下慢慢加入称好的间苯三酚（1.3g，8mmol），然后迅速加入2ml三氟化硼乙醚，加完后立即升温至90℃，回流10h后经LC-MS检测，结果显示化合物18基本反应完全。停止加热，减压浓缩至小体积，此时会有固体析出，过滤，所得固体用乙酸乙酯洗涤3次，抽干后得浅黄白色粉末19（1.78g，不是纯品）。

第三步，称取中间体19(1.78g)加吡啶2ml，在0℃搅拌下加入对甲苯磺酰氯（2.29g，12mmol），加完后室温搅拌反应。TLC或LC-MS跟踪监测，2h内可反应完全。检测反应完全后，向反应液中加水，用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层再用水洗涤3次，加无水硫酸钠干燥过夜，次日过滤，滤液浓缩得红色油状物，经柱层析纯化（固定相：200-300目硅胶；流动相：DCM:MeOH=30:1）,得红色固体粉末20，产率：87.2%。

¹H NMR(300Hz,DMSO-d₆)δ7.78-7.75(d,2H,J＝0.9Hz),7.77-7.74(d,2H,J＝0.9Hz),7.54-7.50(d,2H,J＝1.2Hz),7.53-7.49(d,2H,J＝1.2Hz),7.27-7.21(d,1H,J＝1.8Hz),6.72-6.67(d,1H,J＝1.5Hz),2.54(s,3H),2.45(s,3H),2.42(s,3H)；ESI-MS(m/z):599.6;[M+H]⁺(MW=599.7).

第四步，称取20（1.8g,3mmol）加入THF（50ml）溶解，在0℃搅拌下加入四丁基氟化铵（TBAF,946mg,3mmol），之后继续0℃反应，TLC或LC-MS监测反应完全后，减压蒸出溶剂后，进行硅胶柱层析纯化（固定相：200-300目硅胶；流动相：DCM:MeOH=8:1）,得灰白色固体粉末21，产率：89.1%。

¹H NMR(300Hz,DMSO-d₆)δ11.178(s,1H),7.782-7.755(d,2H,J＝8.1Hz),7.484-7.457(d,2H,J＝8.1Hz),6.464(s,1H),6.369(s,1H),2.922(brs,4H),2.604(s,3H),2.409(s,3H),2.409(br s,4H),2.216(s,3H)；ESI-MS(m/z):445.5;[M+H]⁺(MW=445.51).

第五步，称取21（1.33g,3mmol）加丙酮70ml溶解，室温搅拌下依次加入碳酸钾（620mg，4.5mmol）和溴苄（0.36ml,3mmol），继续室温搅拌反应，TLC或LC-MS监测反应完全后，滤出不溶物，滤液减压浓缩的棕黄色油状物22,不经纯化进行下一步反应。

第六步，向盛有棕黄色油状物22的圆底烧瓶中加THF50ml，室温搅拌下加入TBAF(1.89g,6mmol)，完毕后继续室温搅拌反应，TLC或LC-MS监测反应完全后，减压蒸出溶剂得棕黄色油状物23,不经纯化进行下一步反应。

第七步，向盛有棕黄色油状物23的圆底烧瓶中加丙酮50ml溶解，室温搅拌下加入碳酸钾(414mg,3mmol)，2min后再加入硫酸二甲酯(0.285ml,3mmol)，室温搅拌5min后，回流反应，TLC或LC-MS监测反应完全后，滤出不溶物，滤液减压浓缩的红色油状物24。

第八步，在室温下向盛有中间体24的反应瓶中加入钯/碳（636mg,6mmol），甲酸氨（750mg,12mmol），加完后回流反应，40min后TLC（DCM：MeOH=7:1）或是LC-MS检测已经反应完全，停止加热，滤出钯/碳等不溶物，滤液蒸出溶剂，DCM溶解后，用饱和的碳酸氢钠水溶液洗涤5-6次，DCM层浓缩后进行柱层析纯化（固定相：200-300目硅胶，流动相：DCM：MeOH=15:1），得浅黄色固体粉末25，产率：24.5%（四步），m.p.184-186℃。

¹H NMR(300Hz,DMSO-d₆)δ:10.620(s,1H),6.365-6.356(d,1H,J＝2.7Hz),6.310-6.302(d,1H,J＝2.4Hz),3.742(s,3H),3.6-2.2(m,8H),2.628(s,3H),2.190(s,3H)；ESI-MS(m/z):305.4;[M+H]⁺(MW=305.35).

实施例9

3-氯-5-羟基-7-甲氧基-2H-苯丙呋喃-2-酮

按照反应式6,第一、二、三步同实施例54.

第四步，称取33（760mg,2mmol）溶于10ml丙酮中，依次加入碳酸钾（553mg,4mmol）、MOMCl（300μl,4mmol），然后室温搅拌反应。TLC（展开剂：PE:EA=3:1）跟踪检测，显示反应完全后，滤除不溶物，滤液浓缩后进行柱层析纯化（固定相：200-300目硅胶；流动相：PE:EA=6:1），浓缩收集液得浅黄色固体粉末36（726mg）,产率：85.6%。

¹H NMR(300Hz,DMSO-d₆)δ:7.829-7.801(d,2H,J＝8.4Hz),7.518-7.492(d,2H,J＝7.8Hz),6.852-6.846(d,1H,j=1.8Hz),6.705-6.700(d,1H,J＝1.5Hz),5.225(s,2H),3.372(s,3H),2.712(s,3H),2.434(s,3H);ESI-MS(m/z):4253.9;[M+H]⁺(MW=425.86).

第五步，称取36（297mg,0.7mmol）溶于10mlTHF中，室温下加入TBAF（442mg,1.4mmol），并搅拌反应。TLC（展开剂：PE:EA=3:1）跟踪检测，显示原料消失后，停止搅拌，蒸出THF，加水10ml，用EA（10ml×3）萃取3次，合并EA层，浓缩后进行柱层析纯化（固定相：200-300硅胶；流动相：PE:EA=10:1），浓缩收集液得浅黄色固体37（160mg）,产率：84.6%。

¹H NMR(300Hz,DMSO-d₆)δ10.69(s,1H),6.534-6.527(d,1H,J＝2.1Hz),6.403-6.397(d,1H,J＝1.8Hz),5.300(s,2H),3.442(s,3H),2.716(s,3H);ESI-MS(m/z):271.7;[M+H]⁺(MW=271.67).

第六步，称取37（135mg,0.5mmol）溶于10ml丙酮中，室温下加入碳酸钾（207mg,1.5mmol）、硫酸二甲酯（142μl,1.5mmol），室温搅拌5mi n后，回流反应。TLC（展开剂：PE:EA=4:1）跟踪检测，显示反应完全后，停止加热，滤除不溶物，滤液浓缩后进行柱层析纯化（固定相：200-300目硅胶；流动相：PE:EA=10:1），浓缩收集液得浅黄色固体38（110mg）,产率：78%。

¹H NMR(300Hz,DMSO-d₆)δ6.617-6.009(d,1H,J＝2.4Hz),6.497-6.489(d,1H,J＝2.4Hz),5.264(s,2H),3.842(s,3H),3.516(s,3H),2.775(s,3H);ESI-MS(m/z):285.7;[M+H]⁺(MW=285.7).

第七步，称取38（85mg,0.3mmol）溶于5mlMeOH中，加入0.5ml浓盐酸，回流反应。TLC（展开剂：DCM:MeOH=20:1）检测，显示反应完全后停止加热，反应液直接进行柱层析纯化（固定相：200-300目硅胶；流动相：DCM:MeOH=200:1），浓缩收集液得浅黄色固体39（30mg）,产率：41.7%，m.p.>252℃分解。

¹H NMR(300Hz,DMSO-d₆)δ10.935(s,1H),6.484-6.475(d,1H,J＝2.7Hz),6.381-6.374(d,1H,J＝2.1Hz),3.776(s,3H),2.709(s,3H);ESI-MS(m/z):241.6;[M+H]⁺(MW=241.65).

实施例10

5,7-二羟基-4-甲基-3(2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙基)-2H-苯并吡喃-2-酮

按照反应式2，称取间苯三酚（2mmol）加苯15ml溶解，室温下加入8（2mmol）和PBr3（6mmol），然后回流反应。1h后，反应瓶中有沉淀析出，分别去液体和固体进行LC-MS检测，结果显示固体主要是目标产物，而液体中没有目标物。固体经石油醚洗涤3次后即得较纯的目标物9。

称取9（1mmol）用2-丁酮10ml溶解，室温下加入碳酸钾（5mmol）、碘化钾（1mmol）及10（5mmol），然后回流反应。1.5h后TLC（DCM:MeOH=7:1）检测9基本消失，故停止加热，滤除不溶物，滤液浓缩后进行硅胶柱层析纯化（流动相：DCM:MeOH=10:1），得深黄色固体，产率：74.5%，m.p.>229℃分解。

¹H NMR(300Hz,DMSO-d₆)δ10.243(br s,2H),6.246-6.238(d,1H,J＝2.4Hz),6.121-6.114(d,1H,J＝2.4Hz),3.327(br s,2H),2.648-2.597(t,2H,J1＝6.9Hz,J2＝8.4Hz),2.513(s,3H),2.412(br s,2H),2.322-2.273(t,2H,J1＝7.1Hz,J2＝6.9Hz),2.322-2.273(br s,4H),2.130(s,3H)；ESI-MS(m/z):319.4;[M+H]⁺(MW=319.38).

实施例11

5,7-二羟基-4-甲基-3(2-(4-甲基哌嗪-1-基)-2-氧乙基)-2H-苯并吡喃-2-酮(17A,n=1)

按照反应式3，称取乙醇钠（2mmol）用无水乙醇溶解，在冰浴下慢慢滴加12（3mmol）的乙醇溶液，滴完后在油浴上加热，待温度升至56-60℃时，再慢慢滴加13A（n=1,2mmol）的无水乙醇溶液，室温搅拌2天后，再移入油浴回流反应，2h后停止加热，待反应液冷至室温后加入无水乙醚，过滤，滤除不溶物，滤液减压浓缩，最后得棕黄色油状物14A(n=1)，不需要纯化待进行下一步反应。

称取间苯三酚（2/1.1mmol）加入到盛有14A的反应瓶中，再加入饱和的盐酸甲醇溶液（10mmol），封好瓶口，室温搅拌反应，10h后，LC-MS检测显示原料间苯三酚消失，故停止搅拌。减压浓缩反应液，所得残渣用石油醚反复洗涤，然后加乙醇析出固体，此固体经LC-MS检测主要是目标产物15A(n=1)，故准备进行下步反应。

称取15A和等重量的碳酸钾置于反应瓶中，加50%的乙醇水溶液溶解，然后回流反应，3h后加水稀释，再用1N HCl中和至PH=3-4，静置过夜，第二天析出针状晶体，此晶体即为纯的16A(n=1)，产率：25.6%。

¹H NMR(300Hz,DMSO-D₆)δ12.340(s,1H),10.537(s,1H),10.260(s,1H),6.294-6.288(d,1H,J＝1.8Hz),6.165-6.159(d,1H,J＝1.8Hz),3.491(s,3H),2.471(s,2H)；ESI-MS(m/z):251.2;[M+H]⁺(MW=251.21).

称取16A（0.2mmo l）、BOP（0.24mmol）、TEA（0.3mmol）置于反应瓶中，加THF溶解，再加入N-甲基哌嗪（0.4mmol），室温搅拌反应，1.5h后反应液中已有固体析出，过滤，得白色固体52mg，此固体经LC-MS检测即为纯的目标产物17A(n=1)，为乳白色固体粉末，产率78%，m.p.>300℃。

¹H NMR(300Hz,DMSO-d₆)δ10.476(s,1H),10.233(s,1H),6.294-6.288(d,1H,J＝1.8Hz),6.157-6.150(d,1H,J＝2.1Hz),3.572(s,2H),3.572(m,2H),3.424(m,2H),2.394(s,3H),2.343(m,2H),2.243(m,2H),2.187(s,3H)；ESI-MS(m/z):333.3;[M+H]⁺(MW=333.36).

实施例12

5,7-二羟基-4-甲基-3(2-(4-甲基哌嗪-1-基)-3-氧丙基)-2H-苯并吡喃-2-酮(17B,n=2)

按照反应式3，第一步，以12和13B(n=2)为原料，得棕黄色油状物14B(n=2)，不需要纯化待进行下一步反应。

第二步得15B(n=2)，未经纯化直接进行下一步反应。

第三步得16B(n=2)，产率：19.8%。

¹H NMR(300Hz,DMSO-d₆)δ6.213-6.207(d,1H,J＝1.8Hz),5.980-5.973(d,1H,J＝2.1Hz),2.655-2.600(t,2H,J＝8.1Hz),2.523(s,3H),2.091-2.039(t,2H,J=8.1Hz)；ESI-MS (m/z):265.2;[M+H]⁺(MW=265.24).

第四步得17B(n=2)，为乳白色固体粉末，产率：78.8%，m.p.>250℃分解。

¹H NMR(300Hz,DMSO-d₆)δ10.287(br s,2H),6.238-6.230(d,1H,J＝2.4Hz),6.110-6.103(d,1H,J＝2.1Hz),3.394-3.379(m,4H),2.682-2.630(m,2H),2.453(s,3H),2.397-2.344(m,2H),2.204-2.171(m,4H),2.110(s,3H)；ESI-MS(m/z):347.4;[M+H]⁺(MW=347.39).

实施例13

5-(3-氯丙氧基)-7-羟基-4-甲基-3-（4-甲基哌嗪-1-基）-2H-苯并呋喃-2-酮(41A)

按照反应式7，称取中间体21（0.5mmol），PPh3（1.25mmol）加新蒸的THF 2ml溶解，室温下加入3-氯-1-丙醇（1mmol）和DEAD（1.25mmol），室温搅拌反应。15min后，取反应液进行LC-MS检测，结果显示原料转化完全，停止反应。经硅胶柱层析纯化（流动相：DCM:MeOH=20:1）得白色固体40A，产率：85.3%，m.p.147-149℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ7.81(d,J=8.3Hz,2H),7.50(d,J=8.1Hz,2H),6.64(d,J=2.2Hz,1H),6.57(d,J=2.2Hz,1H),4.02(t,J=5.8Hz,2H),3.79(t,J=6.4Hz,2H),2.96(s,4H),2.59(s,3H),2.43(s,7H),2.24(s,3H),2.19(m,2H).¹³C NMR(151MHz,DMSO-d₆)δ157.45,156.78,152.54,149.90,146.19,145.75,133.02,130.92,130.29,128.42,109.83,102.59,102.22,66.28,55.11,48.76,45.86,41.99,31.14,21.17,17.57.HRMS calcd forC25H30ClN2O6S(M+H⁺)521.1513;found 521.1503.

称取40A(0.3mmol），加THF 4ml溶解，再加入TBAF（1.5mmol），室温搅拌反应，4h后，LC-MS检测，结果显示反应完全，停止反应。减压蒸出大部分THF，经制备性TLC（展开剂：DCM:MeOH=10:1）得淡黄色粉末41A，产率：88.3%，m.p.>270℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.55(s,1H),6.39(d,J=1.7Hz,1H),6.31(d,J=1.7Hz,1H),4.13(t,J=5.7Hz,2H),3.83(t,J=6.5Hz,2H),3.24-2.66(m,8H),2.63(s,2H),2.50(s,3H),2.33-2.19(m,2H).¹³C NMR(151MHz,DMSO-d₆)δ160.33,158.14,157.54,154.22,148.42,129.28,103.10,96.58,95.15,65.62,55.25,48.77,45.92,42.15,31.47,17.27.HRMS calcd for C18H24ClN2O4(M+H⁺)367.1425;found 367.1403.

实施例14

5-乙氧基-7-羟基-4-甲基-3-（4-甲基哌嗪-1-基）-2H-苯并呋喃-2-酮(41B)

按照反应式7，第一步得白色固体40B，产率：90.1%，m.p.212-214℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ7.81(d,J=8.1Hz,2H),7.50(d,J=8.1Hz,2H),6.60(s,1H),6.56(s,1H),3.98(q,J=6.9Hz,2H),2.97(b s,4H),2.60(s,3H),2.50(b s,4H),2.43(s,3H),2.30(s,3H),1.34(t,J=6.9Hz,4H).HRMS calcd for C24H29N2O6S(M+H⁺)473.1746;found 473.1740.

第二步得灰色粉末41B，产率：78.6%，m.p.>218℃。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.43(s,1H),6.30(d,J=1.8Hz,1H),6.24(d,J=1.9Hz,1H),4.02(q,J=6.8Hz,2H),2.60(s,3H),2.20(s,3H),1.37(t,J=6.9Hz,3H).¹³C NMR(151MHz,DMSO-d₆)δ160.35,158.39,157.59,154.19,148.64,129.23,103.07,96.61,94.89,64.42,55.30,48.83,46.01,17.17,14.33.HRMS calcd for C17H23N2O4(M+H⁺)319.1658;found 319.1639.

实施例15

7-羟基-5-异丙氧基-4-甲基-3-（4-甲基哌嗪-1-基）-2H-苯并呋喃-2-酮(41C)

按照反应式7，第一步得白色固体40C，产率：87.2%，m.p.191-193℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ7.80(d,J=8.1Hz,2H),7.49(d,J=8.0Hz,2H),6.60(d,J=1.6Hz,1H),6.52(s,1H),4.66-4.47(m,1H),2.93(s,4H),2.58(s,3H),2.42(s,4H),2.40(s,3H),2.21(s,3H),1.22(s,3H),1.21(s,3H).¹³C NMR(151MHz,DMSO-d₆)δ156.80,156.48,152.72,149.93,146.15,145.53,132.99,130.87,130.30,128.39,110.29,103.16,102.09,71.62,55.19,48.86,46.03,21.17,21.11,17.74.HRMS calcd for C25H 31N2O6S(M+H⁺)487.1903;found487.1888.

第二步得黄色粉末41C，产率：84.4%，m.p.73-75℃。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.34(s,1H),6.34(d,J=0.6Hz,1H),6.23(s,1H),4.64(dt,J=11.9,6.0Hz,1H),2.61(s,3H),2.26(s,3H),1.33(s,2H),1.31(s,2H).¹³C NMR(151MHz,DMSO-d₆)δ160.34,157.58,157.15,154.38,148.85,129.09,103.59,97.36,94.76,70.69,55.14,48.62,45.71,21.55,17.45.HRMS calcd for C18H25N2O4(M+H⁺)333.1814;found 333.1816.

实施例16

5-环戊氧基-7-羟基-4-甲基-3-（4-甲基哌嗪-1-基）-2H-苯并呋喃-2-酮(41D)

按照反应式7，第一步得白色固体40D，产率：68.4%，m.p.214-216℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ7.80(d,J=8.2Hz,2H),7.50(d,J=8.1Hz,2H),6.65(d,J=1.9Hz,1H),6.43(d,J=1.8Hz,1H),4.75(s,1H),3.06(s,4H),2.79(s,4H),2.57(s,3H),2.49(s,7H)2.42(s,3H),1.78-1.77(m,2H),1.66-1.60(m,6H).HRMS calcd forC27H33N2O 6S(M+H⁺)513.2059;found 513.2043.

第二步得黄色粉末41D，产率：70.1%，m.p.>240℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.52(s,1H),6.37(s,1H),6.28(s,1H),4.87(b s,1H),3.15-2.67(b s,8H),2.61(s,3H),2.57(s,3H),1.92(m,2H),1.81(m,2H),1.76-1.59(m,4H).¹³C NMR(151MHz,DMSO-d₆)δ160.51,157.71,157.25,154.43,149.26,128.32,103.19,97.39,94.70,80.03,54.01,47.46,43.83,32.15,23.58,17.34.HRMS calcdforC18H25N2O4(M+H⁺)359.1971;found 359.1969.

实施例17

5-环己氧基-7-羟基-4-甲基-3-（4-甲基哌嗪-1-基）-2H-苯并呋喃-2-酮(41E)

按照反应式7，第一步得白色固体40E，产率：70.5%，m.p.151-153℃。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ7.80(d,J=8.3Hz,2H),7.49(d,J=8.2Hz,2H),6.67(d,J=1.9Hz,1H),6.46(d,J=1.8Hz,1H),4.29(m,1H),3.43-2.75(m,8H),2.61(s,3H),2.54(s,3H),2.50(s,3H),2.42(s,3H),1.83-1.19(m,10H).

第二步得黄色粉末41E，产率：72.8%，m.p.80-82℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.47(s,1H),6.41(d,J=1.7Hz,1H),6.27(d,J=1.7Hz,1H),4.44(s,1H),3.66-2.74(m,8H),2.66(s,6H),1.94(s,2H),1.69(s,2H),1.62-1.19(m,6H).HRMS ca l cdfor C21H29N2O4(M+H⁺)373.2127;found 373.2109.

实施例18

7-羟基-4-甲基-3-（4-甲基哌嗪-1-基）-5-(2-(四氢吡咯-1-基)乙氧基)-2H-苯并呋喃-2-酮(41F)

按照反应式7，第一步得白色固体40F，产率：80.2%，m.p.161-163℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ7.81(d,J=8.2Hz,2H),7.50(d,J=8.1Hz,2H),6.63(d,J=2.1Hz,1H),6.54(d,J=2.1Hz,1H),3.97(t,J=5.8Hz,2H),2.93(s,4H),2.78(t,J=5.7Hz,2H),2.60(s,3H),2.49(m,4H),2.43(s,3H),2.38(s,4H),2.20(s,3H),1.69(m,4H).13C NMR(151MHz,DMSO-d₆)δ157.68,156.80,152.54,149.91,146.13,133.03,130.96,130.29,129.31,128.46,115.17,109.86,102.43,68.51,55.23,53.72,53.62,48.90,46.03,23.19,21.15,17.38.HRMS calcd for C28H36N3O6S(M+H⁺)542.2325;found 542.2302.

第二步得淡黄色粉末41F，产率：90.5%，m.p.207-209℃。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.43(s,1H),6.36(d,J=1.5Hz,1H),6.27(d,J=1.6Hz,1H),4.10(t,J=5.6Hz,2H),2.90(t,J=5.3Hz,3H),2.64(s,3H),2.57(s,4H),2.26(s,3H),1.71(s,4H).HRMS calcd for C21H 30N3O4(M+H⁺)388.2236;found 388.2218.

实施例19

5-(2-(二甲氨基)乙氧基)-7-羟基-4-甲基-3-（4-甲基哌嗪-1-基）-2H-苯并呋喃-2-酮(41G)

按照反应式7，第一步得白色固体40G，产率：83.3%，m.p.163-165℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ7.79(d,J=8.0,3H),7.48(d,J=7.9,3H),6.60(s,1H),6.53(s,1H),3.92(t,J=5.3,2H),2.92(s,4H),2.59(t,J=5.3,2H),2.59(s,3H),2.40(s,3H),2.37(s,4H),2.18(s,3H),2.17(s,6H).HRMS calcd for C26H34N3O6S(M+H⁺)516.2168;found 516.2157.

第二步得黄色粉末41G，产率：89.3%，m.p.>225℃。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.81(s,1H),6.44(d,J=1.6Hz,1H),6.35(d,J=1.4Hz,1H),4.05(t,J=5.5Hz,2H),2.67(t,J=5.8Hz,2H),2.64(s,3H),2.22(s,3H).HRMS calcdfor C19H28N3O4(M+H⁺)362.2080;found 362.2060.

实施例20

5-(环丙甲氧基)-7-羟基-4-甲基-3-（4-甲基哌嗪-1-基）-2H-苯并呋喃-2-酮(41H)

按照反应式7，第一步得白色固体40H，产率：92.1%，m.p.185-187℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ7.81(d,J=8.3Hz,2H),7.50(d,J=8.1Hz,3H),6.61(d,J=2.2Hz,1H),6.53(d,J=2.2Hz,1H),3.78(d,J=7.2Hz,3H),3.06(b s,4H),2.78(b s,4H),2.66(s,3H),2.47(s,3H),2.43(s,3H),1.22-1.12(m,1H),0.64-0.54(m,2H),0.33(m,2H).¹³C NMR(151MHz,DMSO-d₆)δ157.84,156.90,152.59,150.07,146.13,132.46,130.98,130.29,128.42,109.75,102.52,102.22,74.04,54.31,47.83,44.53,21.13,17.56,9.57,3.08.HRMS calcd for C26H 31N2O6S(M+H⁺)499.1903;found 499.1886.

第二步得淡黄色粉末41H，产率：88.8%，m.p.>238℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.50(s,1H),6.32(d,J=1.8Hz,1H),6.29(d,J=2.0Hz,1H),3.87(d,J=7.0Hz,2H),2.94(s,8H),2.69(s,3H),2.59(s,3H),1.37-1.19(m,1H),0.67-0.53(m,2H),0.37(m,2H).¹³C NMR(151MHz,DMSO-d₆)δ160.65,158.54,157.75,154.23,149.43,128.38,103.00,96.85,94.93,73.27,54.00,47.39,43.82,17.37,9.85,3.04.HRMScalcd for C19H25N2O4(M+H⁺)345.1814;found345.1797.

实施例21

5-丁氧基-7-羟基-4-甲基-3-（4-甲基哌嗪-1-基）-2H-苯并呋喃-2-酮(41I)

按照反应式7，第一步得白色固体40I，产率：89.3%，m.p.150-152℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ7.81(d,J=8.3Hz,2H),7.50(d,J=8.1Hz,3H),6.61(d,J=2.2Hz,1H),6.52(d,J=2.2Hz,1H),3.88(t,J=6.3Hz,2H),2.94(s,4H),2.59(s,3H),2.43(s,7H),2.22(s,3H),1.77-1.63(m,2H),1.42(t t,J=7.4,6.3Hz,2H),0.92(t,J=7.4Hz,3H).HRMS calcd for C26H 33N2O6S(M+H⁺)501.2059;found501.2044.

第二步得白色粉末41I，产率：84.7%，m.p.>220℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.41(s,1H),6.33(s,1H),6.26(s,1H),3.98(s,2H),2.62(s,3H),2.37(s,3H),1.75(s,2H),1.46(dd,J=14.1,7.2Hz,2H),0.94(t,J=6.9Hz,3H).HRMS calcd for C19H27N2O4(M+H⁺)347.1971;found 347.1965.

实施例22

7-羟基-4-甲基-3-（4-甲基哌嗪-1-基）-5-（2-（噻吩-2-基）乙氧基）-2H-苯并呋喃-2-酮(41J)

按照反应式7，第一步得淡黄色固体40J，产率：77.2%，m.p.188-190℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ7.80(d,J=7.9Hz,2H),7.48(d,J=7.8Hz,2H),7.38(d,J=4.6Hz,1H),6.98(d,J=4.5Hz,Hz,3H),2.92(s,4H),2.50(s,3H),2.39(s,7H),2.20(s,3H).¹³C NMR(151MHz,DMSO-d₆)δ157.40,156.73,152.57,149.89,146.17,145.91,140.14,133.01,130.89,130.28,128.45,126.97,125.77,124.37,109.83,102.61,102.46,70.06,55.16,48.83,45.98,28.65,21.13,17.36.HRMScalcd for C28H 31N2O6S2(M+H⁺)555.1624;found 555.1611.

第二步得淡黄色粉末41J，产率：67.4%，m.p.103-105℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.45(s,1H),7.37(dd,J=4.3,1.8Hz,1H),6.99(d,J=4.2Hz,2H),6.38(d,J=1.8Hz,1H),6.28(d,J=1.9Hz,1H),4.28(t,J=5.9Hz,2H),3.34(t,J=5.9Hz,2H),2.51(S,6H).

实施例23

7-羟基-4-甲基-3-（4-甲基哌嗪-1-基）-5-（2-（哌啶-1-基）乙氧基）-2H-苯并呋喃-2-酮(41K)

按照反应式7，第一步得淡黄色固体40K，产率：78.2%，m.p.146-148℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ7.81(d,J=8.2Hz,2H),7.49(d,J=8.1Hz,2H),6.62(d,J=2.1Hz,1H),6.55(d,J=2.1Hz,1H),3.96(t,J=5.5Hz,2H),2.94(s,4H),2.63(t,J=5.5Hz,2H),2.62(s,3H),2.43(s,3H),2.38(m,8H),2.22(s,3H),1.55-1.43(m,4H),1.38(m,2H).HRMS calcd for C29H38N3O6S(M+H⁺)556.2481;found556.2468.

第二步得黄色粉末41K，产率：85.2%，m.p.110-112℃。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.49(s,1H),6.35(d,J=1.1Hz,1H),6.27(d,J=1.1Hz,1H),4.08(t,J=4.6Hz,2H),2.76(t,J=4.6Hz,2H),2.62(s,3H),2.33(s,3H),1.50(m,4H),1.44-1.27(m,2H).¹³C NMR(151MHz,DMSO-d₆)δ160.51,158.29,157.62,154.19,149.02,128.89,103.10,96.88,95.07,66.28,56.78,54.80,54.06,48.28,45.17,25.26,23.57,17.21.HRMS calcd for C22H32N3O4(M+H⁺)402.2393;found 402.2380.

实施例24

7-羟基-4-甲基-3-（4-甲基哌嗪-1-基）-5-（2-吗啉乙氧基）-2H-苯并呋喃-2-酮(41L)

按照反应式7，第一步得淡黄色固体40L，产率：88.5%，m.p.161-163℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ7.81(d,J=7.7Hz,2H),7.50(d,J=7.7Hz,2H),6.61(s,1H),6.58(s,1H),4.00(s,2H),3.57(bs,4H),2.95(bs,4H),2.68(s,2H),2.63(s,3H),2.43(s,3H),2.43(b s,4H),2.43(bs,4H)2.22(s,3H).HRMS calcd for C28H35N3O7S(M+H⁺)558.2274;found 558.2249.

第二步得黄色粉末41L，产率：86.6%，m.p.>215℃。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.64(s,1H),6.38(s,1H),6.29(s,1H),4.06(t,J=4.4Hz,2H),3.55(s,4H),2.71(t,J=4.4Hz,2H),2.63(s,3H),2.46(s,3H),2.44(s,4H).HRMScalcd for C21H30N3O5(M+H⁺)404.2185;found 404.2164.

实施例25

7-羟基-4-甲基-3-（4-甲基哌嗪-1-基）-5-（辛氧基）-2H-苯并呋喃-2-酮(41M)

按照反应式7，第一步得白色固体40M，产率：87.6%，m.p.122-124℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ7.82(d,J=8.3Hz,2H),7.50(d,J=8.1Hz,2H),6.64(d,J=2.1Hz,1H),6.55(d,J=2.0Hz,1H),3.89(t,J=6.1Hz,2H),3.3-2.7(m,8H),2.61(s,3H),2.43(s,3H),1.79-1.65(m,2H),1.47-1.35(m,2H),1.35-1.19(m,8H),0.87(t,J=6.0Hz,3H).

第二步得淡黄色粉末41M，产率：66.3%，m.p.85-87℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.48(s,1H),6.35(s,1H),6.28(s,1H),3.99(t,J=5.7Hz,2H),3.5-2.5(m,8H),2.63(s,3H),2.50(s,3H),1.83-1.71(m,2H),1.44(m,2H),1.39-1.13(m,8H),0.86(m,3H).

实施例26

叔丁基（2-（（7-羟基-4-甲基-3-（4-甲基哌嗪-1-基）-2-氧代-2H-苯并吡喃-5-基）氧基）乙基）氨基甲酸酯(41N)

按照反应式7，第一步得淡黄色固体40N，产率：74.4%，m.p.74-76℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ7.81(d,J=8.2Hz,2H),7.49(d,J=8.1Hz,2H),7.04(t,J=5.2Hz,1H),6.60(d,J=1.8Hz,1H),6.57(d,J=1.8Hz,1H),3.91(t,J=4.6Hz,2H),3.34(dt,J=5.1,4.6Hz,2H),2.94(s,4H),2.58(s,3H),2.43(s,3H),2.40(s,4H),2.22(s,3H),1.39(s,9H).13C NMR(151MHz,DMSO-d₆)δ157.58,156.83,155.53,152.48,149.89,146.16,132.90,130.95,130.27,128.38,109.95,102.36,102.25,77.78,68.18,55.19,48.90,46.00,38.97,28.14,21.15,17.67.HRMS calcd for C29H38N3O8S(M+H⁺)588.2380;found588.2359.

第二步得淡黄色粉末41N，产率：62.2%，m.p.114-116℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.45(s,1H),7.02(s,1H),6.31(s,1H),6.27(s,1H),3.99(s,2H),3.39(s,2H),2.60(s,3H),2.20(s,3H),1.39(s,9H).¹³C NMR(151MHz,DMSO-d₆)δ160.31,158.24,157.61,155.56,154.18,148.83,129.22,103.25,96.57,95.04,77.72,67.43,55.39,48.96,46.13,28.16,17.40.HRMS calcd for C22H32N3O6(M+H⁺)434.2291;found 434.2286.

实施例27

叔丁基（2-（（7-羟基-4-甲基-3-（4-甲基哌嗪-1-基）-2-氧代-2H-苯并吡喃-5-基）氧基）丙基）氨基甲酸酯(41O)

按照反应式7，第一步得淡黄色固体40O，产率：88.4%，m.p.154-156℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ7.68(d,J=8.3Hz,2H),7.37(d,J=8.2Hz,2H),6.79(t,J=5.2Hz,1H),6.45(s,1H),6.43(s,1H),3.79(t,J=5.8Hz,2H),2.97(dd,J=12.4,6.3Hz,3H),2.82(s,4H),2.48(s,3H),2.30(s,3H),2.26(s,4H),2.08(s,3H),1.78-1.65(m,2H),1.24(s,9H).¹³C NMR(151MHz,DMSO-d₆)δ157.83,156.78,155.58,152.52,149.95,146.15,132.91,130.99,130.29,128.36,109.76,102.16,102.10,77.50,67.15,55.19,48.86,46.00,36.90,28.74,28.18,21.15,17.59.

第二步得淡黄色粉末41O，产率：58.9%，m.p.164-166℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.56(s,1H),6.36(s,1H),6.30(s,1H),4.00(s,2H),3.14(s,2H),2.68(s,3H),2.64(s,3H),1.90(s,2H),1.37(s,9H).HRMS calcd for C23H34N3O6(M+H⁺)448.2448;found448.2445.

实施例28

5-((2,4-二甲苯基)氧基)-7-羟基-4-甲基-3-（4-甲基哌嗪-1-基）-2H-苯并吡喃-2-酮(41P)

按照反应式7，第一步得白色固体40P，产率：89.1%，m.p.162-164℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ7.78(d,J=7.8Hz,2H),7.49(d,J=7.7Hz,2H),7.04(s,2H),7.00(s,1H),6.71(s,1H),6.62(s,1H),4.97(s,2H),2.92(s,4H),2.53(s,3H),2.43(s,3H),2.36(s,4H),2.29(s,6H),2.18(s,3H).HRMS calcd for C31H35N2O6S(M+H⁺)563.2216;found 563.2199.

第二步得淡黄色粉末41P，产率：80.5%，m.p.155-157℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.53(s,1H),7.09(s,2H),6.99(s,1H),6.46(d,J=2.1Hz,1H),6.31(d,J=2.1Hz,1H),5.06(s,2H),2.89(s,8H),2.58(s,3H),2.53(s,3H),2.29(s,6H).¹³CNMR(151MHz,DMSO-d₆)δ160.53,158.22,157.66,154.26,137.49,135.99,129.42,128.56,125.62,103.13,97.32,95.22,70.68,54.13,47.53,44.15,20.89,17.49.HRMS calcd for C24H29N2O4(M+H⁺)409.2127;found409.2122.

实施例29

叔丁基（2-（（7-羟基-4-甲基-3-（4-甲基哌嗪-1-基）-2-氧代-2H-苯并吡喃-5-基）氧基）哌啶-1-甲酸酯(41Q)

按照反应式7，第一步得淡黄色固体40Q，产率：86.2%，m.p.133-135℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ7.79(d,J=8.3Hz,2H),7.50(d,J=8.2Hz,3H),6.68(d,J=2.1Hz,1H),6.55(d,J=2.0Hz,1H),4.55(s,1H),3.66-3.52(m,2H),3.24-3.12(m,2H),3.07(s,4H),2.80(s,4H),2.60(s,3H),2.49(s,3H),2.43(s,3H),1.75-1.73(m,2H),1.49-1.44(m,2H),1.41(s,9H).¹³C NMR(151MHz,DMSO-d₆)δ156.87,156.00,153.77,152.83,150.04,146.09,132.33,130.88,130.32,128.46,110.16,103.20,102.58,78.84,73.71,54.01,47.50,43.87,29.61,28.02,21.12,18.00.HRMS calcd for C32H42N3O8S(M+H⁺)628.2693;found 628.2669.

第二步得淡黄色粉末41Q，产率：77.0%，m.p.107-109℃。

¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ6.47(d,J=1.8,1H),6.31(d,J=2.0,1H),4.64-2.61(m,1H),3.65-3.54(m,2H),3.26(m,2H),3.18-2.65(m,8H),2.62(s,3H),2.59(s,3H),1.99-1.90(m,2H),1.61-1.58(m,2H),1.39(s,9H).HRMS calcd for C25H36N3O6(M+H⁺)474.2604;found 474.2597.

实施例30

7-羟基-4-甲基-3-（4-甲基哌嗪-1-基）-5-(2-(吡啶-2-基)乙氧基)-2H-苯并吡喃-2-酮(41R)

按照反应式7，第一步得淡黄色固体40R，产率：90.2%，m.p.178-180℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ8.53(s,1H),7.82(d,J=7.7Hz,2H),7.75(t,J=7.2Hz,1H),7.49(d,J=7.6Hz,2H),7.33(d,J=7.6Hz,1H),7.29-7.20(m,1H),6.61(s,2H),4.34(d,J=5.1Hz,2H),3.20(d,J=5.1Hz,2H),2.94(b s,4H),2.50(b s,4H),2.41(s,3H),2.30(s,6H).HRMS calcd for C29H32N3O6S(M+H⁺)550.2012;found550.1991.

第二步得白色粉末41R，产率：85.7%，m.p.90-92℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.39(s,1H),8.52(d,J=3.3Hz,1H),7.75(t,J=7.2Hz,1H),7.38(d,J=7.5Hz,1H),7.30-7.15(m,1H),6.40(s,1H),6.25(s,1H),4.44(t,J=5.3Hz,2H),3.26(t,J=5.1Hz,2H),2.32(s,3H),2.19(s,3H).¹³C NMR(151MHz,DMSO-d₆)δ160.32,158.27,158.13,157.49,154.19,149.07,148.56,136.49,129.20,123.45,121.67,103.02,96.56,95.00,67.82,55.32,48.82,46.08,36.69,16.91.HRMS calcd for C24H29N2O4(M+H⁺)409.2127;found409.2122.

实施例31

7-羟基-4-甲基-3-（4-甲基哌嗪-1-基）-5-((1-甲基哌啶-4-基)氧基)-2H-苯并吡喃-2-酮(41S)

按照反应式7，第一步得淡黄色固体40S，产率：77.1%，m.p.125-127℃.HRMS calcdfor C28H36N3O6S(M+H⁺)542.2325;found 542.2317.

第二步得淡黄色粉末41S，产率：44.6%，m.p.127-129℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.34(s,1H),6.35(s,1H),6.22(s,1H),4.43(s,1H),2.63(s,3H),2.55(m,2H),2.24(m,2H),2.19(s,3H),2.17(s,3H),1.97-1.94(m,2H),1.79-1.65(m,2H).¹³C NMR(151MHz,DMSO-d₆)δ160.28,157.52,156.86,154.42,148.58,129.25,103.53,97.22,94.84,72.94,55.35,52.14,48.89,46.12,45.81,30.11,17.76.HRMS calcdfor C21H30N3O4(M+H⁺)388.2236;found 388.2226.

实施例32

7-羟基-4-甲基-3-（4-甲基哌嗪-1-基）-5-(吡啶-2-基甲氧基)-2H-苯并吡喃-2-酮(41T)

按照反应式7，第一步得淡黄色固体40T，产率：84.4%，m.p.164-166℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ8.60(d,J=4.3Hz,1H),7.86(t,J=7.7Hz,1H),7.77(d,J=8.1Hz,2H),7.53(d,J=7.8Hz,1H),7.47(d,J=8.0Hz,2H),7.43-7.36(m,1H),6.72(d,J=1.5Hz,1H),6.67(d,J=1.5Hz,1H),5.16(s,2H),3.00(s,4H),2.59(s,7H),2.43(s,3H),2.33(s,3H).HRMS calcd for C28H30N3O6S(M+H⁺)536.1855;found 536.1837.

第二步得白色粉末41T，产率：80.2%，m.p.166-168℃。

¹³C NMR(151MHz,DMSO-d₆)δ160.48,157.64,155.69,154.26,149.21,137.04,123.17,122.17,103.26,97.45,95.46,71.57,54.30,47.70,45.14,17.55.HRMS calcd forC21H24N3O4(M+H⁺)382.1767;found382.1756.

实施例33

7-羟基-4-甲基-3-（4-甲基哌嗪-1-基）-5-(（四氢呋喃-3-基）氧基)-2H-苯并吡喃-2-酮(41U)

按照反应式7，第一步得淡黄色固体40U，产率：88.2%，m.p.175-177℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ7.78(d,J=8.0Hz,2H),7.48(d,J=7.9Hz,3H),6.65(s,1H),6.47(s,1H),4.99(s,2H),3.85-3.60(m,4H),2.93(s,4H),2.55(s,3H),2.39(s,7H),2.22(s,3H),2.09(m,2H),1.85(s,1H).HRMS calcd for C26H31N2O7S(M+H⁺)515.1852;found515.1827.

第二步得淡黄色粉末41U，产率：76.6%，m.p.163-165℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.57(s,1H),6.36(d,J=1.9Hz,1H),6.32(d,J=2.0Hz,1H),5.11(s,2H),3.98-3.78(m,4H),3.34(s,4H),2.85(s,4H),2.63(s,3H),2.52(s,3H),2.26(dt,J=14.1,8.2Hz,2H),2.08(dd,J=12.5,6.0Hz,1H).HRMS calcd forC19H25N2O5(M+H⁺)361.1763;found 361.1750.

实施例34

7-羟基-4-甲基-3-（4-甲基哌嗪-1-基）-5-(噻唑-2-基甲氧基)-2H-苯并吡喃-2-酮(41V)

按照反应式7，第一步得淡黄色固体40V，产率：90.1%，m.p.190-192℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.18(s,1H),8.03(s,1H),7.82(d,J=8.2Hz,2H),7.51(d,J=8.0Hz,2H),6.92(s,1H),6.66(s,1H),5.43(s,2H),3.07(b s,4H),2.87(b s,4H),2.51(s,3H),2.44(s,3H).¹³C NMR(151MHz,DMSO-d₆)δ156.83,156.74,155.95,152.57,150.02,146.22,143.59,132.52,132.37,130.96,130.35,128.33,110.00,103.23,102.84,63.29,53.97,47.48,43.89,21.18,17.79.HRMScalcd for C26H28N3O6S2(M+H⁺)542.1420;found 542.1394.

第二步得黄色粉末41V，产率：88.0%，m.p.>230℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.71(s,1H),9.22(s,1H),8.11(s,1H),6.61(d,J=1.7Hz,1H),6.41(d,J=1.8Hz,1H),5.50(s,2H),3.38(s,2H),2.89(s,8H),2.59(s,3H),2.56(s,3H).HRMS calcd forC19H22N3O4S(M+H⁺)388.1331;found 388.1318.

实施例35

5-(2-氨基乙氧基)-7-羟基-4-甲基-3-（4-甲基哌嗪-1-基）-2H-苯并吡喃-2-酮(44A)

按照反应式8，称取中间体21（0.5mmol），PPh3（1.25mmol）加新蒸的THF 2ml溶解，室温下入叔丁（2-羟乙基）氨基甲酸酯（1mmol）和DEAD（1.25mmol），室温搅拌反应。20min后，取反应液进行LC-MS检测，结果显示原料转化完全，停止反应。经硅胶柱层析纯化（流动相：DCM:MeOH=20:1）得白色固体42A，产率：81.2%，m.p.74-76℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ7.81(d,J=8.2Hz,2H),7.49(d,J=8.1Hz,2H),7.04(t,J=5.2Hz,1H),6.60(d,J=1.8Hz,1H),6.57(d,J=1.8Hz,1H),3.91(t,J=4.6Hz,2H),3.34(dt,J=5.1,4.6Hz,2H),2.94(s,4H),2.58(s,3H),2.43(s,3H),2.40(s,4H),2.22(s,3H),1.39(s,9H).HRMS calcd for C29H38N3O8S(M+H⁺)588.2380;found 588.2359.

称取42A(0.3mmol），加DCM5ml溶解，再加入TFA（1ml），40℃搅拌反应，1h后，LC-MS检测，结果显示反应完全，停止加热，室温搅拌下慢慢滴加饱和碳酸氢钠水溶液，直至不在有气泡产生，有机层浓缩后，经硅胶柱层析纯化（DCM:MeOH=20:1）得淡黄色粉末43A，产率：79.1%。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ7.81(d,J=8.3,2H),7.50(d,J=8.1,2H),6.59(d,J=2.2,1H),6.56(d,J=2.1,1H),3.86(t,J=5.4,2H),2.94(s,4H),2.89(t,J=5.4,2H),2.62(s,3H),2.43(s,3H),2.39(s,4H),2.20(s,3H).HRMS calcd for C24H30N3O6S(M+H⁺)488.1855;found 488.1833.

称取43A（0.2mmol）用5ml THF溶解，加入TBAF(0.8mmol)后，搅拌4h，LC-MS检测反应完全后，停止反应。经C18柱层析纯化后得淡黄色固体粉末44A，产率：52.2%，m.p.148-150℃。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.79(s,1H),8.20(s,2H),6.43(d,J=2.0Hz,1H),6.35(d,J=2.1Hz,1H),4.24(t,J=4.8Hz,2H),3.43(s,6H),3.32(t,J=4.8Hz,3H),3.17(s,2H),2.85(s,3H),2.66(s,3H).HRMS calcd for C17H24N 3O4(M+H⁺)334.1767;found334.1785.

实施例36

5-（3-氨基丙氧基）-7-羟基-4-甲基-3-（4-甲基哌嗪-1-基）-2H-苯并吡喃-2-酮(44B)

按照反应式8，第一步得42B，产率：78.3%，m.p.154-156℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ7.68(d,J=8.3Hz,2H),7.37(d,J=8.2Hz,2H),6.79(t,J=5.2Hz,1H),6.45(s,1H),6.43(s,1H),3.79(t,J=5.8Hz,2H),2.99-2.94(m,2H),2.82(s,4H),2.48(s,3H),2.30(s,3H),2.26(s,4H),2.08(s,3H),1.78-1.65(m,2H),1.24(s,9H).

第二步得淡黄色粉末43B。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ7.81(d,J=7.5,2H),7.50(d,J=7.5,3H),6.58(s,1H),6.56(s,1H),3.96(t,J=5.6,2H),2.94(s,4H),2.69(t,J=5.6,2H),2.59(s,3H),2.43(s,3H),2.37(s,4H),2.20(s,3H),1.84-1.73(m,2H).

第三步得黄色粉末44B，产率：44.8%，m.p.>245℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ6.33(s,1H),6.26(s,1H),4.06(t,J=5.5Hz,2H),2.88(t,J=6.9Hz,2H),2.60(s,3H),2.19(s,3H),2.03-1.88(m,2H).HRMS calcd forC18H26N3O4(M+H⁺)348.1923;found348.1911.

实施例37

N-(2-((7-羟基-4-甲基-3-（4-甲基哌嗪-1-基）-2-氧代-2H-苯并吡喃-5-基)氧基)乙基)甲磺酰胺(46A)

按照反应式8，称取43A（0.2mmol）用DCM 2ml溶解，室温搅拌下加入TEA(0.6mmol),甲磺酰氯（0.4mmol）后，继续室温搅拌2h,LC-MS检测反应完全后，停止反应，经硅胶柱层析纯化后（DCM:MeOH=20:1）得淡黄色固体45A，产率：88.8%，m.p.100-102℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ7.82(d,J=8.1Hz,2H),7.50(d,J=8.0Hz,2H),7.32(t,J=5.7Hz,1H),6.63(s,1H),6.62(s,1H),4.00(t,J=5.0Hz,2H),3.36(dd,J=10.3,5.0Hz,3H),3.03(bs,4H),2.95(s,3H),2.69(bs,4H),2.64(s,3H),2.43(s,3H),2.41(s,3H).¹³C NMR(151MHz,DMSO-d₆)δ157.52,156.86,152.57,150.03,146.24,141.67,132.56,130.93,130.32,128.39,109.88,102.52,102.40,68.64,54.51,48.07,44.83,41.45,21.18,17.72.HRMS calcdfor C25H32N3O8S2(M+H⁺)561.1631;found 561.1610.

称取45A固体（0.1mmol）用THF 2ml溶解，加入TBAF（0.4mmol）后室温搅拌4h，反应完全后，经制备性TLC（展开剂：DCM:MeOH=10:1）得淡黄色粉末46A，产率：，m.p.189-191℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.53(s,1H),7.29(t,J=5.5Hz,1H),6.36(s,1H),6.31(s,1H),4.08(t,J=5.0Hz,2H),3.46-3.36(m,2H),2.95(s,3H),2.67(s,3H),2.61(s,3H).HRMS calcd forC18H26N3O6S(M+H⁺)412.1542;found 412.1533.

实施例38

N-(2-((7-羟基-4-甲基-3-（4-甲基哌嗪-1-基）-2-氧代-2H-苯并吡喃-5-基)氧基)乙基)-4-甲基苯磺酰胺(46B)

按照反应式8，以43A（0.2mmol）为原料，第一步得淡黄色固体45B，产率：80.3%，m.p.107-109℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ7.88(t,J=5.4Hz,1H),7.82(d,J=8.3Hz,2H),7.66(d,J=8.1Hz,2H),7.49(d,J=8.1Hz,2H),7.32(d,J=8.0Hz,2H),6.61(t,J=2.5Hz,1H),6.54(d,J=2.1Hz,1H),3.95(t,J=4.8Hz,2H),3.22-3.11(m,2H),3.06(s,4H),2.79(s,4H),2.54(s,3H),2.48(s,3H),2.42(s,3H),2.35(s,3H).HRMS cal cd for C 31H 36N3O8S2(M+H⁺)642.1944;found 642.1919.

第二步得白色固体46B，产率：，m.p.>250℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.59(s,1H),7.87(t,J=5.6Hz,1H),7.70(d,J=8.1Hz,2H),7.38(d,J=8.0Hz,2H),6.31(s,1H),6.30(s,1H),4.01(t,J=4.6Hz,2H),1546-3.18(m,2H),2.77(s,3H),2.62(s,3H),2.38(s,3H).¹³C NMR(151MHz,DMSO-d₆)δ160.72,158.11,157.75,154.22,144.46,142.62,137.38,129.59,127.96,126.43,102.98,96.69,95.23,67.25,53.40,46.74,42.74,41.91,20.93,17.53.HRMS calcd for C24H 30N3O6S(M+H⁺)488.1855;found 488.1845.

实施例39

IMMLG5645水杨酸盐

称取IMMLG5645（152mg,0.5mmol）溶于4ml甲醇中，加入水杨酸（69mg,0.5mmol）后，室温搅拌反应。析出固体后，过滤，得白色固体粉末，产率：85.2%，m.p.223-225℃。

¹H NMR(300Hz,DMSO-d₆)δ10.724(s,1H),7.714-7.682(dd,1H,J1＝7.8Hz,J2＝1.8Hz),7.240-7.183(td,1H,J1＝7.8Hz,J2＝1.8Hz),6.700-6.638(m,1H),6.400-6.394(d,1H,J＝1.8Hz),6.305-6.298(d,1H,J＝2.1Hz),3.827(s,3H),3.45-2.8(br s,8H),2.725(s,3H),2.614(s,3H).

实施例40

IMMLG5645对甲苯磺酸盐

操作同实施例56，得白色固体粉末，产率：87.1%，m.p.250-252℃。

¹H NMR(300Hz,DMSO-d₆)δ10.521(s,1H),9.399(s,1H),7.494-7.466(d,2H,J＝8.4Hz),7.124-7.098(d,2H,J＝7.8Hz),6.391-6.384(d,1H,J＝2.1Hz),6.301-6.294(d,1H,J＝2.1Hz),3.831(s,3H),3.58-3.3(m,4H),3.3-3.0(m,2H),2.9-2.75(m,2H),2.845(s,3H),2.615(s,3H),2.286(s,3H).

实施例41

IMMLG5645马来酸盐

操作同实施例56，得白色固体粉末，产率：78.5%，m.p.223-225℃。

¹H NMR(300Hz,DMSO-d₆)δ10.521(s,1H),9.41(s,1H),6.386-6.380(d,1H,J＝1.8Hz),6.297-6.291(d,1H,J＝1.8Hz),6.023(s,2H),3.832(s,3H),3.6-3.0(m,8H),2.826(s,3H),2.617(s,3H).

实施例42

IMMLG5645草酸盐

操作同实施例56，得白色固体粉末，产率：90.1%，m.p.147-149℃融化，继续升温变为白色固体，228℃开始颜色变深。

¹H NMR(300Hz,DMSO-d₆)δ6.394-6.388(d,1H,J＝1.8Hz),6.305-6.300(d,1H,J＝1.5Hz),3.828(s,3H),3.6-2.8(m,8H),2.746(s,3H),2.614(s,3H).

实施例43

IMMLG5645丙二酸盐

操作同实施例56，得白色固体粉末，产率：95.1%，m.p.189-191℃。

¹H NMR(300Hz,DMSO-d₆)δ6.377-6.371(d,1H,J＝1.8Hz),6.290-6.284(d,1H,J＝1.8Hz),3.826(s,3H),3.4-2.8(m,8H),2.854(s,2H),2.652(s,3H),2.609(s,3H).

实施例44

IMMLG5645盐酸盐

操作同实施例56，得白色固体粉末，产率：95.5%，m.p.248℃开始颜色变深，260℃呈褐色。

¹H NMR(300Hz,DMSO-d₆)δ10.623(s,1H),10.249(s,1H),6.409-6.402(d,1H,J＝2.1Hz),6.329-6.322(d,1H,J＝1.8Hz),3.827(s,3H),3.6-3.48(m,2H),3.44-3.34(m,2H),3.24-3.08(m,2H),2.9-2.78(m,2H),2.804(s,3H),2.611(s,3H).

实施例45

IMMLG5645酒石酸盐

操作同实施例56，得白色固体粉末，产率：83.7%，m.p.125-127℃。

¹H NMR(300Hz,DMSO-d₆)δ6.373-6.366(d,1H,J＝2.1Hz),6.286-6.279(d,1H,J＝2.1Hz),4.108(s,2H),3.820(s,3H),3.0-2.5(br s,8H),2.600(s,3H),2.453(s,3H).

实施例46

IMMLG5645柠檬酸盐

操作同实施例56，得白色固体粉末，产率：81.6%，m.p.178-180℃。¹H NMR(300Hz,DMSO-d₆)δ:10.915-10.529(s,5H),6.376-6.369(d,1H,J＝2.1Hz),6.289-6.283(d,1H,J=1.8Hz),3.826(s,3H),3.4-2.7(brs,8H),2.635(s,3H),2.608(s,3H),2.591(s,2H),2.552(s,2H).

药理实验

实验例1

IMMLG系列化合物对体外神经细胞损伤的影响

取铺满单层的PC12细胞（模拟神经元细胞），弃去原培养液，加入5%FBS、5%马血清的DMEM完全培养液，用吸管轻轻吹打使细胞分散完全，以5×10⁴个/ml密度，每孔100μl接种于预先用多聚赖氨酸（0.1mg/ml)）处理过的96培养板中，培养24h即可用于实验。实验分为空白组、模型组和加药组。空白组给予完全培养基，鱼藤酮造模组是加入终浓度为4μM鱼藤酮的完全培养基作用细胞48h（模拟PD模型），氧糖剥夺（OGD）组是采用低糖完全培养基及加入终浓度为5mM的连二亚硫酸钠作用细胞24h（模拟脑缺血模型），Aβ_25-35造模组是加入终浓度为20μM Aβ_25-35的完全培养基作用细胞24h（模拟AD模型），去血清组为加入无血清DMEM培养基作用细胞24h。加药组则在造模的同时加入10μM受试化合物。细胞增殖实验是除空白组外，加药组加入终浓度为10μM受试化合物的完全培养基作用24h。然后加入10μl5mg/mlMTT,4h后去上清，加入150μl DMSO，以570nm吸光度值表示存活细胞数。

结果见表1，鱼藤酮、氧糖剥夺、Aβ_25-35可明显减少PC12细胞存活率，而化合物实施例10、实施例14、实施例15、实施例52对其中2种或3种损伤模型显示明显保护作用。因此，将上述化合物进行复筛，实验结果见表2。结果表明在筛选的17个化合物中，有10个对其中3种或4种损伤模型显示明显保护作用，

结果见表3，鱼藤酮、氧糖剥夺、Aβ25-35、去血清可明显减少PC12细胞存活率，而化合物实施例14、实施例15、实施例17、实施例20、实施例30、实施例33、实施例34对四种损伤模型显示明显保护作用。且除实施例79、实施例84、实施例95、实施例98在10-5M浓度下对细胞存活无明显影响，其他化合物均具有显著促PC12细胞增殖的作用。

以IMMLG5645神经保护活性最强。而且，IMMLG5645不同盐：水杨酸盐、对甲苯磺酸盐、马来酸盐、草酸盐、丙二酸盐、盐酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐，对上述四种损伤PC12细胞也均显示明显保护作用。因此，选择IMMLG 5645进行进一步活性研究。

表1IMMLG系列化合物对PC12细胞损伤的影响（means±SD,n=3）。

^###P＜0.001vs.空白组，^*P＜0.05，^**P＜0.01，^***P＜0.001 vs.模型组。

表2IMMLG系列化合物对PC12细胞损伤的影响（means±SD,n=3）

^###P＜0.001 vs.空白组，^*P＜0.05，^**P＜0.01，^***P＜0.001 vs.模型组。

表IMMLG系列化合物对PC12细胞增殖和损伤的影响

##p<0.01 vs空白对照组,*p<0.05,**p<0.01 vs模型对照组

实验例2

实验例化合物IMMLG5645对氧糖剥夺诱导神经细胞损伤保护作用的量效关系研究

PC12细胞培养及接种于96孔板同上操作。实验分为六个组：(1)正常对照组(Control)；(2)氧糖剥夺模型组(OGD)；（3）NGF组；（4）IMMLG5645低剂量组（0.1μM）；（5）IMMLG5645中剂量组(1μM)；（6）IMMLG5645高剂量组(10μM)。氧糖剥夺模型通过将细胞培养液换成含终浓度为5mMNa₂S₂O₄无糖DMEM培养基来复制。除空白组外其余组的培养液换为造模培养基，同时各组加入0.1、1、10μM的IMMLG5645共孵育24h。采用倒置显微镜观察细胞形态；采用MTT法测定细胞活力；采用LDH测定试剂盒测定培养基中LDH。形态学观察结果表明正常细胞贴壁良好，细胞突起可见，胞体轮廓清晰、饱满；氧糖剥夺后细胞贴壁差、细胞变圆，可见大量细胞碎片，1μM和10μM的IMMLG5645能显著改善细胞形态（如图1所示）。MTT法结果表明IMMLG5645在0.1-10μM浓度范围内，可剂量依赖性抑制氧糖剥夺所致的细胞活力下降（如图2所示）。LDH测定结果表明1、10μM的IMMLG5645能明显减少氧糖剥夺所致的LDH释放。以上实验证实化合物IMMLG5645对氧糖剥夺诱导的神经细胞损伤具有良好保护作用，且呈剂量依赖关系。

实验例3

实验例化合物IMMLG 5645对氧糖剥夺所致神经细胞凋亡的影响

采用流式细胞术和DNA ladder两种方法检测细胞凋亡。PC12细胞接种于6孔板，细胞融合后加IMMLG5645和氧糖剥夺模型制备方法同上。24h后将细胞用0.25%胰蛋白酶消化后，用PBS漂洗，调节密度为10⁹cells/L，按Annexin V-FITC/PI试剂盒说明书操作，然后在流式细胞仪上检测。每组3个样本，计数10000个细胞，检测结果使用Win MDI 2.8软件分析计算早期凋亡及晚期凋亡细胞的百分比。实验结果如图4所示，表明PC12细胞氧糖剥夺24h后，早期凋亡是细胞损伤的主要形式，化合物IMMLG5645在0.1-10μM浓度范围内对OGD所致PC12细胞凋亡呈现剂量依赖性抑制作用，其中10μM的保护作用最佳（结果见图4）。

PC12细胞处理同上，收集细胞，提取DNA。DNA片段通过80V电压，浓度为1％含溴化乙锭的琼脂糖胶电泳分开，电泳结果在紫外灯下观察。实验结果显示，PC12细胞经OGD诱导后出现特异性的细胞凋亡的生化特征，即DNA发生片段化，经1％琼脂糖凝胶电泳的电泳谱呈典型的“梯状带”(ladder pattern)；而化合物IMMLG5645各处理组特征梯状带减少，尤其是10μM组减少最为显著，表明IMMLG5645可以抑制细胞DNA片段化的发生，对氧糖剥夺所致细胞凋亡具有明显抑制作用（结果见图5）。

实验例4

实验例化合物IMMLG5645对氧糖剥夺所致神经细胞凋亡抑制作用机制的研究

细胞内活性氧的检测：IMMLG5645及氧糖剥夺处理PC12细胞操作同上，将细胞用PBS缓冲液洗一次，加入DCF-DA(终浓度为10μM)，孵育30min，去上清，用PBS漂洗两次后在荧光显微镜下观察并照相，激发波长488nm。如图6所示，正常PC12细胞中绿色荧光较弱，表明活性氧含量较少，而经氧糖剥夺损伤后细胞中绿色荧光强度显著增加，而IMMLG5645能降低荧光强度，且呈剂量依赖关系。

线粒体膜电位(△ψ)测定：IMMLG5645及氧糖剥夺处理PC12细胞操作同上，细胞用PBS漂洗一次，加入10μM的JC-137℃负载15min（JC-1是一种特异性的阳离子荧光染料，在线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体的基质中，形成聚合物，可以产生红色荧光；在线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1为单体，可以产生绿色荧光。采用490nm激发，单体发射光为527nm，聚集体发射光为590nm），PBS洗两次后于荧光显微镜下观察拍照。实验结果如图7所示，正常PC12细胞呈均匀的强红色、弱绿色荧光，经氧糖剥夺处理后细胞中红色荧光强度明显减弱，绿色荧光增强，表明细胞线粒体膜电位下降，而IMMLG5645处理后能剂量依赖性增加红色荧光强度，表明该化合物能抑制线粒体膜电位的下降。

ATP含量测定：IMMLG5645及氧糖剥夺处理PC12细胞操作同上，收集细胞，加入200μl裂解液，放置1min于4℃12000g离心5min，取上清100μl与100μlATP检测工作液混匀，于化学发光仪读取荧光数值。同时采用BCA法对细胞裂解液上清进行蛋白含量测定。ATP提供能量在荧光素酶催化作用下使荧光素产生荧光，当荧光素酶和荧光素都过量时，在一定浓度范围内荧光的产生和ATP的浓度成正比。实验结果如图8所示，PC12细胞经氧糖剥夺处理后其荧光产生量与空白组比较明显降低，表明其细胞内ATP含量下降，而IMMLG5645处理后能逆转ATP含量下降，随着浓度的升高ATP含量逐渐增加。

Western blotting方法检测凋亡信号蛋白Bcl-2、Bax、Cyt C及Caspase-3表达：PC12细胞经氧糖剥夺和IMMLG5645处理后，收集细胞，加入细胞裂解液，4℃裂解30min，12000×g离心15分钟，上清液中加入4×loading buffer,混匀，煮沸变性。采用Westernblotting方法检测Bc1-2、Bax、Cyt C及Caspase-3的变化。实验结果如图9所示，氧糖剥夺后Bcl-2及Bax表达发生明显变化，Bc l-2表达显著降低，而Bax表达显著升高，Bcl-2和Bax的比值与空白组比较显著降低，而IMMLG5645处理后能增加Bcl-2和Bax的比值，并且与浓度成正相关。Cyt C从线粒体内膜释放至胞浆，可激活下游凋亡蛋白引起细胞死亡。实验结果显示，氧糖剥夺后胞浆Cyt C含量与空白组比较显著增加，表明造模后细胞线粒体受到损伤，而IMMLG5645可显著降低胞浆Cyt C含量，以10μM浓度作用显著（结果见图10）。Caspase-3是细胞凋亡执行蛋白，procaspase-3是其前体，无酶活性。正常细胞中仅检测到无酶活性的procaspase-3，未检测到有酶活性的Caspase-3（如图10所示），但细胞经氧糖剥夺处理后Caspase-3含量显著升高，同时procaspase-3含量下降，IMMLG5645可显著减少Caspase-3含量，抑制细胞进入凋亡执行程序，提示IMMLG5645可通过调节Bcl-2/Bax比值，抑制Cyt C转位，进而抑制Caspase-3激活，最终抑制神经元凋亡。

羟自由基清除能力测定：采用ESR方法测量DMPO捕捉Fenton反应中的

OH产生DMPO-OH来评价样品清除羟自由基的能力。具体如下：配制0.02%的H₂O₂溶液、0.1%的FeSO4溶液、1%DMPO溶液、不同浓度IMMLG5645、依达拉奉水溶液。取40μl 0.02%的H₂O₂溶液，加入10μl双蒸水或待测样品及10μl的DMPO溶液，振荡均匀，加入40μl FeSO₄溶液，使总体积为200μl，快速振荡后，吸入样品管，混合后60s室温下采用ESR测量DMPO-OH信号。另外也采用南京建成科技有限公司的羟自由检测试剂盒，采用比色法测定IMMLG5645对羟自由基的清除能力。图11为用DMPO捕捉.OH得到DMPO-OH的ESR图谱，图12为试剂盒检测结果，实验结果表明IMMLG 5645清除.OH的IC50是1.4mM，依达拉奉为4.2mM。

DPPH清除能力测定：自由基包括氧自由基和氮自由基，而DPPH是一种很稳定的氮中心的自由基，其在515nm附近有最大吸收，而当其与提供电子的自由基清除剂作用时，生成无色产物，使溶液的紫色变浅。因此采用比色法检测了IMMLG5645对DPPH的清除作用。具体操作为：取0.05mg/ml DPPH甲醇溶液1ml与100μl不同浓度IMMLG5645或依达拉奉极混合，1min后于515nm测定OD值。实验结果图13所示，化合物IMMLG5645与依达拉奉的清除DPPH量效曲线，经过回归计算前者IC50为3.5mM，而后者是0.26mM，表明IMMLG5645清除DPPH的作用弱于依达拉奉。

超氧阴离子清除实验：依照试剂盒操作方法，若CH03具有超氧阴离子清除作用，则可使试剂盒中对照管吸光度降低。本实验采用CH03在水中可溶的最大浓度作为原浓度，并与维生素C作比较。如图5所示，VtaminC对超氧阴离子具有浓度依赖性抑制，但在相同浓度时CH03的抑制作用不明显。即使CH03在10mmol/L大的剂量时，对超氧阴离子的抑制作用仍然很弱或没有。

因此，有上述实验可见，IMMLG5645可通过清除羟自由基、减少氧糖剥夺所致胞内ROS生成增加、增加ATP、保护线粒体（调节Bcl-2/Bax比例、抑制膜电位降低以及Cyt C转位）、抑制Caspase-3激活，最终抑制神经元凋亡。

实验例5

实验例化合物IMMLG5645对LPS所致小胶质细胞激活的影响

IMMLG5645对LPS刺激小胶质细胞后细胞生长及形态的影响：将小胶质细胞株BV-2接种至多聚赖氨酸包被的96孔培养板培养。贴壁24h后，更换培养基，对照组加入DMEM培养基，模型组及给药组细胞中加入含LPS（100ng/ml）的DMEM培养基，各给药组在造模同时加入0.1、1、10μM的IMMLG 5645。24h后，采用MTT法测定存活细胞数，显微镜观察细胞形态。结果表明，IMMLG5645在0.1-10μM剂量范围内对BV-2细胞生长无明显影响（结果见图15）。显微镜观察结果表明，较空白组比较，100ng/mL LPS的模型组细胞胀大变圆，细胞平趴开在底面，呈阿米巴状。1、10μM IMMLG5645组细胞状态明显好转，细胞光度良好，阿米巴状细胞数明显减少（结果见图16），提示IMMLG 5645可以抑制LPS所致BV-2细胞激活。

炎性因子NO、TNF-α、IL-1β释放的检测：将小胶质细胞株BV-2接种至多聚赖氨酸包被的6孔培养板培养。参照上述方法加入LPS和IMMLG5645。24h后取培养上清，按照Grie s s法检测NO含量。应用ELISA法测定了细胞培养上清中TNF-α、IL-1β量。结果表明，100ng/mLLPS可显著提高BV-2细胞培养上清中NO、TNF-α、IL-1β的含量（P＜0.01，P＜0.001，P＜0.001），而0.1、1、10μM IMMLG5645可剂量依赖性抑制NO的释放（结果见图17，P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01）；1、10μM IMMLG5645可显著抑制TNF-α释放（结果见图18，P＜0.01，P＜0.01）以及IL-1β的释放（结果见图19，P＜0.01，P＜0.01），表明IMMLG5645具有抗LPS所致小胶质细胞炎症的作用。

化合物IMMLG5645抑制LPS所致小胶质细胞激活机制研究：BV-2细胞给药和LPS刺激同上，24h后收集细胞，加入细胞裂解液冰上裂解30min，4℃，12000rpm离心30min，取上清采用BCA蛋白定量，加入1/3体积的4×loading buffer，混匀，煮沸变性。采用Westernblotting方法检测COX-2、IL-6、iNOS、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK、p38、p-p38的变化；采用碧云天生物技术研究所提供的胞浆胞核提取试剂盒制备胞浆、胞核蛋白，采用Westernblotting方法检测IκB、p-IκB、胞核中NFκB的变化；将pEGFP-p65质粒转染至BV-2细胞中，加入IMMLG5645及LPS刺激，采用共聚焦显微镜观察IMMLG5645对p65核转位的影响；采用DCF-DA荧光探针检测IMMLG5645对LPS刺激BV-2细胞中自由基产生的影响。实验结果如图20所示，IMMLG5645在0.1-1μM浓度范围内可明显抑制炎性蛋白COX-2、iNOS的表达，并且IMMLG5645也可抑制LPS所致BV-2细胞中炎性因子IL-6的表达增加。对MAPK信号通路研究结果表明，LPS明显促进ERK1/2、JNK、p38磷酸化，而IMMLG5645（0.1-1μM）可明显抑制其磷酸化水平，但对其蛋白表达不明显影响（结果见图21）。对NFκB信号通路研究结果表明，LPS刺激BV-2细胞后，胞浆中I κB磷酸化水平明显增加，I κB表达改变不明显，胞核中NF κB表达明显增加，而IMMLG5645在0.1-1μM剂量下可明显抑制I κB磷酸化、胞核中NF κB表达增加（结果见图22），并且共聚焦显微镜观察结果也证实IMMLG5645可明显抑制NFκB的核转位（结果见图23）。由此可见，IMMLG5645可通过抑制LPS所致MAPK（ERK1/2、JNK、p38）及NF κB信号通路的激活，进而抑制炎性蛋白表达、炎性因子释放。

化合物IMMLG5645及LPS作用BV-2细胞的条件培养基对神经细胞存活的影响：BV-2细胞加入IMMLG5645及LPS同上，24h后取细胞上清加入预先种在96孔板或6孔板中的PC12细胞中，24h后采用显微镜观察细胞形态、MTT染色测定细胞存活率、PI/Hoechest染色测定细胞凋亡、Rhodamine 123染色测线粒体膜电位。实验结果表明，单纯LPS刺激条件培养基可明显导致PC12细胞损伤，细胞胞体变圆、出现碎片、细胞数量减少，而IMMLG5645+LPS条件培养基可明显改善细胞形态，细胞突起及数量均明显增加，且呈剂量依赖关系（结果见图24）。MTT法检测结果如图25所示，IMMLG5645在1、10μM剂量下可显著增加PC12细胞存活率。PI/Hoechest染色结果如图26所示，LPS刺激条件培养基组红色（PI着色）明显增加、蓝色（Hoechest着色）明显减少，而IMMLG5645+LPS条件培养基可明显逆转红色着色增加，提示IMMLG5645+LPS组细胞凋亡明显减少。线粒体膜电位测定结果如图27所示，LPS刺激条件培养基组绿色荧光明显减弱，而IMMLG 5645可剂量依赖性增加荧光强度，表明IMMLG5645可抑制线粒体膜电位的降低。

因此，由上述实验可见，IMMLG5645可通过抑制MAPK、NF κB通路的激活，抑制炎症蛋白表达、炎性因子释放，进而保护神经元免受损伤。

实验例6

实验例化合物IMMLG5645对拟血管性痴呆模型小鼠学习记忆功能的影响

模型制备及分组给药：健康雄性昆明小鼠，适应饲养1周。参考文献方法，腹腔注射水合氯醛(350mg/kg)麻醉小鼠，消毒，颈正中切口，分离双侧颈总动脉，套“4”号丝线扣备用。拉紧丝扣，阻断血流15min，并同时在距尾尖1cm处剪断放血约0.3ml，热凝止血。松开丝扣灌注10min后，再次阻断血流15min，第2次再灌后观察30min，然后缝合皮肤。假手术组只分离颈总动脉，套丝扣，但不阻断血流，尾部不放血，观察时间等与模型组相同。次日将模型小鼠随机分为模型组、阳性组（1mg/kg二氢麦角碱,P.O.）、IMMLG5645给药组（10、20、40mg/kg,P.O.），空白组和模型组分别灌胃相同体积蒸馏水，每日灌胃给药一次。行为学评价采用避暗法和Morris水迷宫两种方法。

避暗实验方法及结果：从给药后第6天开始避暗实验。实验时将小鼠放于明室背向暗室入口，并立即启动记录，当小鼠进入暗室遭电击后取出动物，每只训练120s，记录潜伏期作为学习成绩；24h后重复实验并记录300s内小鼠错误次数及潜伏期作为记忆成绩。学习成绩（潜伏期）各组没有明显差异，但记忆成绩结果表明模型小鼠与假手术小鼠相比，错误次数明显增多，潜伏期明显缩短，表明动物出现明显的学习记忆障碍。而IMMLG564510mg/kg、20mg/kg和40mg/kg给药组动物错误次数明显减少（结果见图28），受电击的潜伏期明显延长（结果见图29）。

Morris水迷宫实验方法及结果：从给药第8天开始Morris水迷宫实验，共持续7天，每次实验前1h给药。第8天不放置安全岛让每只小鼠适应60s，第9天将安全岛放置第四象限，动物从第二象限入水，每天训练一次，连续5天。记录动物从下水60s内找到平台的潜伏期及运动轨迹，并让动物在平台停留20s，60s内找不到平台的，主试者将其放于平台并停留20s。第14天，撤去安全岛，小鼠从第二象限入水，记录60s内的运动轨迹。实验结果表明，与模型组小鼠比较，从试验第2天起IMMLG5645给药组小鼠找到平台的潜伏期与模型组相比，明显缩短，且成剂量依赖关系（结果见图30）。实验第6天撤平台后，IMMLG5645各剂量组小鼠在目标象限的停留时间比例显著延长（结果见图31）。

以上实验结果表明，IMMLG5645能明显改善短暂性脑缺血引起的学习记忆障碍。

尼氏染色方法及结果：部分小鼠于行为学检测结束后，麻醉，脑组织灌流、固定，石蜡包埋、切片，采用尼氏染色观察海马神经元的改变。实验结果如图32所示，假手术组小鼠海马锥体细胞层次较多，分布均匀，排列紧密，细胞形态完整，核仁清晰。模型小鼠海马锥体细胞数目明显减少，形态欠规则，细胞皱缩，细胞带分布不均，甚至出现脱失和带中断，部分细胞可见胞体肿大及核裂解和碎裂现象，尤以CA1区损伤严重。IMMLG5645高剂量给药组海马锥体细胞增加，形态规则神经元数目增加。

凋亡相关蛋白的检测：部分小鼠于行为学检测结束后，取海马组织冻存于-70°C冰箱，海马组织（约0.1g）用生理盐水洗涤后加入约500μl预冷的组织裂解液，冰浴中匀浆，冰上裂解30min。破碎后的组织匀浆于4°C12000rpm离心20min，取上清。取少量用以测定蛋白含量，余上清液按比例加入上SDS上样缓冲液并于100°C沸水浴中煮沸5min以充分变性，采用12%的SDS-PAGE胶电泳，加入Bcl-2、Bax抗体，采用ECL显色检测蛋白的改变。实验结果如图33所示，和假手术组比较，缺血后海马促凋亡蛋白Bax表达变化不明显，而抗凋亡蛋白Bcl-2显著减少，从而导致Bax和Bcl-2之间的平衡被打破，这可能是海马神经元凋亡的原因之一。化合物IMMLG5645能剂量依赖性增加抗凋亡蛋白Bc l-2的表达，而对Bax作用不明显，从而引起Bcl-2/Bax比值升高，抑制细胞进入凋亡。

因此，有上述实验结果可见，IMMLG5645对血管性痴呆小鼠模型学习记忆功能缺陷有较好的改善作用，这可与其调节Bc1-2/Bax比例，保护海马神经元免受损伤有关。

实验例7

实验例化合物IMMLG5645对双侧颈总动脉永久结扎所致慢性脑缺血大鼠的影响

动物手术、分组、给药及Morris水迷宫行为测试：参照Wakita的方法，选择雄性SD大鼠（体重180±20g）。大鼠术前12小时禁食，术前4小时禁水。10%水合氯醛(350mg/kg)腹腔注射麻醉。大鼠仰卧位固定，常规消毒，颈部正中切开皮肤，钝性分离各层组织，暴露并分离双侧颈总动脉(CCA)，双重5-0号丝线结扎，0号丝线逐层缝合，假手术组只进行麻醉和血管分离术，不结扎颈总动脉。术后第26天采用Morris水迷宫筛选符合模型标准大鼠。具体方法同上。连续进行5天学习训练，并计算每只大鼠在五天内找到平台的平均时间，以假手术组大鼠潜伏期的均值作为参考值，计算缺血大鼠的平均潜伏期与参考值之差占该鼠的平均潜伏期时间的比例，作为筛选指标(Screening Criteria，SC)对模型大鼠进行筛选。根据公式筛选指标(SC)＝（平均潜伏期-参考值）/平均潜伏期。当该值>0.2时，认为此大鼠出现认知障碍可用于进行后续实验研究。符合标准的大鼠随机分为模型组、阳性对照组、IMMLG5645低、中和高剂量组。阳性组灌胃给予尼莫地平30mg/kg，IMMLG5645低、中和高剂量组分别给与3mg/kg、10mg/kg和30mg/kg的IMMLG 5645，每日一次，连续25天。然后进行Morris水迷宫行为测试。实验结果如图34所示，在连续5天的定位航行训练中，模型组大鼠到达平台的时间（逃避潜伏期）与假手术组大鼠比较显著延长；IMMLG5645各剂量组与模型组比较到达平台时间均显著减少。在空间探索实验中，模型组大鼠穿越目标区域的次数与假手术组比例显著减少，而IMMLG5645各剂量组大鼠穿越目标区域次数与模型组大鼠比较均显著性增加（结果见图35所示）。

组织匀浆制备及生化指标测定：部分大鼠于行为学检测结束后，麻醉、取海马，分别按1:9体积比置于预冷生理盐水中，剪碎，制成10%匀浆，BCA方法测定蛋白浓度。采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定SOD、GSH-Px、MDA、Catlase（CAT）活性或含量。结果如表3显示，与假手术组相比，慢性脑缺血大鼠海马组织MDA含量及CAT活性显著升高(P＜0.01)、GSH-Px活性显著降低(P＜0.05)。而化合物IMMLG5645中、高剂量组降低CAT活性及MDA含量，IMMLG5645各给药组均显著增加GSH-Px活性。

尼氏染色方法及结果：实验方法同上。实验结果如图36所示，假手术组大鼠海马锥体细胞层次较多，分布均匀，排列紧密，细胞形态完整，核仁清晰。模型大鼠海马锥体细胞数目明显减少，形态欠规则，细胞皱缩，细胞带分布不均，甚至出现脱失和带中断，部分细胞可见胞体肿大及核裂解和碎裂现象，尤以CA1区损伤严重。IMMLG5645高剂量给药组海马锥体细胞增加，病理改变减轻。

凋亡相关蛋白检测：Western blotting检测实验方法同上。免疫组织化学染色检测实验方法为：石蜡切片脱蜡水化，3%H₂O₂室温孵育10min，以消除内源性过氧化物酶的活性，枸橼酸盐缓冲溶液热修复，5%正常山羊血清封闭，室温孵育10min，滴加适当比例稀释的一抗工作液，4℃过夜，滴加适当比例稀释的二抗，37℃孵育30min，加入三抗辣根酶标记链霉卵白素，37℃孵育30min，显色剂显色（DAB），封片。每组样品染色时均同批进行空白对照。在光学显微镜下按单盲法观察全部切片，每张切片随机选取10个高倍视野照相。免疫组化切片采用IPP5.1图像分析系统进行图像分析，所有切片均采用同一放大倍数。每只大鼠选取3张切片，分别显示海马CA1区神经元数目。Western blotting结果表明，模型组和假手术组比较,海马组织促凋亡蛋白Bax表达变化不明显，而抗凋亡蛋白Bc1-2显著减少，从而导致Bax和Bcl-2之间的平衡被打破。化合物IMMLG5645能剂量依赖性增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，而对Bax作用不明显（结果见图37），从而引起Bcl-2与Bax比值升高，抑制细胞进入凋亡。免疫组织化学染色结果表明Bcl-2在正常大鼠海马组织表达丰度较高，慢性低灌注可引起大鼠海马Bcl-2表达显著降低，尤其以CA1区明显减少，不仅阳性细胞数减少，而且单个细胞的表达强度亦减少。IMMLG5645能剂量依赖性增加Bcl-2的表达，灰度扫描统计结果显示低、中和高剂量组与模型组比较均有显著性差异（结果见图38）。

表3IMMLG5645对双侧颈总动脉永久结扎所致慢性脑缺血大鼠海马组织中MDA含量、SOD,GSH-Px，Catalase活性的影响（means±SE，n=6)。

^#P＜0.05,^##P＜0.01 vs.sham;^*P＜0.05,^**P＜0.01 vs.Model

实验例8

实验例化合物IMMLG 5645对大脑中动脉梗塞大鼠脑缺血的保护作用

大脑中动脉阻断（MCAO）模型的制备：参照Longa方法制备MCAO模型，并加以改进。操作步骤如下，大鼠经10%水合氯醛麻醉后，仰卧固定在手术台上。颈部消毒并在正中做一2cm切口，钝性分离皮下软组织、肌肉，暴露分离颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA）。用0号手术线结扎ECA，在CCA分叉前及ICA近颅端置动脉夹，在ECA距离CCA分叉3～4mm处做微切口。松开ICA的动脉夹，插入特制尼龙线（长50mm，直径0.26mm），沿ICA推进至大脑中动脉（MCA）起始部，约18.5±0.5mm，遇阻力而停止，记录缺血时间，用1号手术线固定尼龙线。伤口覆盖生理盐水化的棉球，1小时后将尼龙线抽出而再灌，缝合伤口，再灌注24小时。假手术组不插入尼龙线，其余操作同脑缺血模型组。

分组、给药及评价：分为6组，每组12只，分别为：假手术组、模型组、IMMLG 5645给药组（1.5、3、6mg/kg、舌下静脉注射）、阳性药依达拉奉组（6mg/kg，舌下静脉注射）。实验结束后，通过Longa的“5分法”对神经功能缺损进行评分（0分为无神经缺损症状；1分为对侧前肢不能完全伸直；2分为向对侧旋转；3分为行走向对侧倾倒；4分为不能自发行走，意识丧失）；随后动物断头立即取脑，以TTC染色法检测缺血面积；称重测定脑组织含水量。

神经症状评分结果表明，假手术组的神经症状指数为0，模型组为3.3，表明出现了明显的神经缺陷。而IMMLG56451.5，3，6mg/kg给药组能明显改善术后神经症状，其神经症状指数分别降低为2.8、1.7、2.4，其中以中剂量3mg/kg剂量效果最好，与阳性药依达拉奉组相当（结果见图39）。

脑缺血24h后，经TTC染色后，可观察到假手术组动物大脑呈现均匀的玫瑰红色，表明未出现缺血性坏死，模型组脑组织右侧缺血区出现大面积梗塞性坏死，呈现白色。IMMLG5645给药组可明显减小脑缺血造成的梗塞面积，其中3mg/kg剂量组效果最好（结果见图40）。

含水量测定结果如图41所示，模型组含水量明显增加，表明水肿严重，而IMMLG5645的3、6mg/kg剂量组，脑组织含水量明显减少，提示IMMLG5645可明显减轻脑缺血造成的水肿现象。

实验例9

实验例化合物IMMLG5645对东莨菪碱所致小鼠学习记忆障碍的影响

将105只昆明雄性小鼠随机分为对照组、东莨菪碱模型组、阳性药donepezil组、IMMLG56451mg/kg、4mg/kg、16mg/kg、64mg/kg组，每组15只小鼠。每天灌胃给药，第11-15天进行通道式水迷宫实验：第11、12天为训练实验，第13-15为测试实验，将小鼠置于最远如水点，记录2min内小鼠进入盲端的错误次数和找到安全台阶的潜伏期。东莨菪碱模型组、阳性药组、IMMLG5645给药组于每天水迷宫实验前30min腹腔注射东莨菪碱（3mg/kg）。

实验结果如图42、43所示，在通道式水迷宫实验每3天，与空白对照组相比，模型组小鼠潜伏期均显著延长（P<0.001），错误次数明显增加（P<0.001），而4、16mg/kg IMMLG5645给药组及阳性药多奈哌齐组在第4、5天均明显缩短潜伏期、减少错误次数。

Claims (7)

1.选自如下组群的化合物及其药学上可接受的盐

2.根据权利要求1的化合物及其药学上可接受的盐，其特征在于，所述的其药学上可接受的盐选自化合物和无机酸、有机酸成的盐。

3.根据权利要求2的化合物及其药学上可接受的盐，其特征在于，所述的无机酸选自硫酸、磷酸、盐酸、氢溴酸、硝酸、亚硫酸；所述的有机酸选自甲酸、乙酸、丙二酸、乳酸、肉桂酸、琥珀酸、草酸、柠檬酸、马来酸、富马酸、苹果酸、扁桃酸、酒石酸、戊酸、甲磺酸、乙磺酸、甲苯磺酸、水杨酸、苯甲酸。

4.一种药物组合物，其特征在于，含有作为有效成分的如权利要求1的任一化合物及其药学上可接受的盐。

5.权利要求1的任一化合物及其药学上可接受的盐在制备预防或治疗脑疾病的药物中的应用。

6.根据权利要求5的应用，其特征在于，所述的脑疾病选自神经元损伤、神经炎症相关疾病。

7.根据权利要求6的应用，其特征在于，所述的神经元损伤、神经炎症相关疾病选自帕金森氏症、痴呆、脑缺血、抑郁、脑卒中。