CN102143744B - 7,8-二羟基黄酮及其衍生物在制备治疗抑郁的药物中的用途 - Google Patents

7,8-二羟基黄酮及其衍生物在制备治疗抑郁的药物中的用途 Download PDF

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Abstract

提供了涉及TrkB受体活化的新的化合物和方法。该方法包括体内或体外施用治疗有效量的7，8‑二羟基黄酮或其衍生物。特别地，提供了用于治疗包括神经系统病症、神经精神病症和代谢病症(例如，肥胖症)的病症的方法和化合物。例如，提供了治疗受治疗者中的抑郁、焦虑或肥胖或减少受治疗者中的抑郁、焦虑或肥胖的风险的第一方法，其包括选择患有抑郁、焦虑或肥胖或处于发展抑郁、焦虑或肥胖的风险中的受治疗者，并向受治疗者施用治疗有效量的7，8‑二羟基黄酮或其衍生物。还提供了促进受治疗者的神经保护的进一步的方法，其包括选择需要神经保护的受治疗者，并向受治疗者施用治疗有效量的7，8‑二羟基黄酮或其衍生物。

Description

7,8-二羟基黄酮及其衍生物在制备治疗抑郁的药物中的用途
本发明在来自美国国立卫生研究院的基金第R01-NS045627号下的政府资助作出。政府具有本发明中的一些权益。
本申请要求2008年7月25日提交的美国临时申请第61/083,658号；2008年8月15日提交的美国临时申请第61/089,260号；和2008年12月1日提交的美国临时申请第61/118,910号的权益。前面申请的全部公开内容据此通过引用并入。
本发明涉及与TrkB受体的活化相关的新的化合物和方法。
背景
每年神经系统病症和神经精神病症如抑郁、焦虑、肌萎缩侧索硬化和中枢神经损伤等折磨了数百万人，其引起包括以下的许多症状：体重变化、减少的精力、头痛、消化问题、慢性痛、麻痹和在某些情况下死亡。
作为治疗神经系统病症和神经精神病症提出的一类生长因子是神经营养因子，其包括脑源性神经营养因子(BDNF)。据认为BDNF对包括以下的各种神经元群体具有神经营养作用：感觉神经元、运动神经元、黑质的多巴胺能神经元和基底前脑的胆碱能神经元，它们与几种神经系统病症和神经精神病症有关。临床前证据表明BDNF可用作各种神经系统病症和神经精神病症的治疗剂；然而，这样的肽治疗的体内不稳定性限制了其有效性。
神经营养因子也适用代谢性病症。已知酪氨酸激酶受体trkB或其天然配体之一(例如，BDNF或神经营养因子-4(NT4))突变导致啮齿类和人 类严重的饮食过量和肥胖。已经显示trkB配体如BDNF或NT4的施用在几个小鼠肥胖症模型中以剂量依赖性方式抑制食欲和体重。积累的证据表明TrkB信号传导直接调节食欲、代谢和味道偏好。因此TrkB激动剂作为代谢病症的潜在治疗剂出现。
概述
提供了用于治疗包括神经系统病症、神经精神病症(例如，焦虑或抑郁)和代谢病症(例如，肥胖症)的病症的新化合物和方法。该方法包括向受治疗者施用治疗有效量的7，8-二羟基黄酮或其衍生物。例如，提供了关于治疗受治疗者中抑郁、焦虑或肥胖或减少受治疗者中抑郁、焦虑或肥胖的风险的第一方法，其包括选择患有抑郁、焦虑或肥胖或处于发展抑郁、焦虑或肥胖的风险中的受治疗者，并向受治疗者施用治疗有效量的7，8-二羟基黄酮或其衍生物。提供了促进受治疗者中神经保护的进一步的方法，其包括选择需要神经保护的受治疗者，并向受治疗者施用治疗有效量的7，8-二羟基黄酮或其衍生物。
在一个实施方案中，需要神经保护的受治疗者可能患有肌萎缩性侧索硬化。
在另一个实施方案中，需要神经保护的受治疗者可能患有中枢神经系统损伤。中枢神经系统损伤可以是脑损伤。中枢神经系统损伤可以是脊髓损伤。中枢神经系统损伤可以是中风。
在上述方法中，7，8-二羟基黄酮或其衍生物可被口服施用。
在上述方法中，7，8-二羟基黄酮或其衍生物可被注射施用。
还提供了激活神经元上TrkB受体的方法。该方法包括提供具有TrkB受体的神经元，然后使TrkB受体在体外与足以激活TrkB受体的量的7，8-二羟基黄酮或其衍生物接触。神经元可以是例如哺乳动物细胞。
附图说明
还提供了一种组合物，其包含7，8-二羟基黄酮或其衍生物和抗抑郁剂。
还提供了一种组合物，其包含7，8-二羟基黄酮或其衍生物和抗焦虑剂。
还提供了可用于本文描述的方法的化合物。这些化合物具有以下式：
或其药学上可接受的盐或前药。在这一化合物中，X是CH2、NR3、O、或S，其中R3选自氢、取代的或未取代的C1-12烷基、取代的或未取代的C1-12杂烷基、取代的或未取代的C2-12烯基、取代的或未取代的C2-12杂烯基、取代的或未取代的C2-12炔基、或取代的或未取代的C2-12杂炔基；R1是氢、-OH、＝O或-NR4R5，其中R4和R5各自独立地是R3、取代的或未取代的C3-12环烷基、取代的或未取代的C3-12杂环烷基、取代的或未取代的C3-12环烯基、取代的或未取代的C3-12杂环烯基、取代的或未取代的C3-12环炔基或取代的或未取代的C3-12杂环炔基；R2是-OR6或-NR6R7，其中R6和R7各自独立地是R4、-(C＝O)R3或-(C＝O)OR3；和A是间位或对位取代的苯基或取代的或未取代的C5或C6杂芳基，其中R1不是＝O，R2之一不是羟基，或A不是未取代的苯基。
在该化合物中，A可以用氢取代，X可以不是O、-OR4、-NR5R6或卤素。
在该化合物中，-NR6R7可以是-N(CH3)2。
在该化合物中，所述卤素可以是氟或氯。
在该化合物中，R2之一可以是
在该化合物中，A可以是
其中Y1和Y2各自独立地是O、N、S或CH2；且Z是氢、卤素、-OR3或-NR4R5。
在该化合物中，A可以是
其中Y3、Y4和Y5各自独立地是O、N、S或CH2；且Z是氢、卤素、-OR3或-NR4R5。
化合物和方法的一个或多个实施例的细节在所附的附图和下面的描述中列出。依据描述和附图以及权利要求，其它特征、目的和优势将是显然的。
图1A显示了说明用TrkB稳定地转染的细胞系中Trk490和Akt的磷酸化的Western印迹。图1B显示了说明稳定的T48细胞系中细胞凋亡的定量分析结果的条形图。
图2显示了用于鉴定TrkB激动剂的化学筛选的设计。
图3显示了黄酮衍生物的化学结构。
图4显示了说明预防T48细胞凋亡但不预防S56细胞凋亡的黄酮衍生物的条形图。
图5显示了表明T48细胞的50％凋亡的有效浓度(EC50)的滴定曲线。
图6显示了表明由黄酮衍生物保护海马神经元不受谷氨酸-触发的凋亡的条形图。
图7显示了说明7，8-二羟基黄酮防止缺氧缺糖的能力的条形图。
图8显示了显示7，8-二羟基黄酮诱导原代海马神经元中TrkB酪氨酸磷酸化的免疫荧光染色图像。
图9显示了说明7，8-二羟基黄酮诱导原代海马神经元中TrkB磷酸化的 Western印迹。
图10显示了说明K252a阻断7，8-二羟基黄酮对TrkB的拮抗效应的Western印迹。
图11显示说明500nM 7，8-二羟基黄酮治疗对海马神经元中Akt和ERK磷酸化的持续增加的时间量的刺激效应(左图)，以及用增加的7，8-二羟基黄酮浓度处理的细胞中Akt和ERK的磷酸化(右图)的Western印迹。
图12显示说明7，8-二羟基黄酮在腹腔内注射之后诱导小鼠脑中TrkB磷酸化的Western印迹(左图)，和说明TrkA和TrkB受体mRNA的水平保持稳定的RT-PCR分析(右图)。
图13显示了说明7，8-二羟基黄酮诱导小鼠海马中TrkB磷酸化的免疫荧光染色。
图14显示了说明7，8-二羟基黄酮引起TrkB二聚作用的Western印迹。
图15显示了表明7，8-二羟基黄酮诱导TrkB自磷酸化作用的Western印迹。
图16显示了纯化的TrkB胞外域(ECD)或胞内域(ICD)(10μg)与[3H]7，8-二羟基黄酮的体外结合测定的结果，说明[3H]7，8-二羟基黄酮结合TrkB受体的ECD而不结合ICD(上图)，且这些数据的斯卡恰特作图(Scatchard plot)分析表明7，8-二羟基黄酮与TrkB以320nM的结合常数结合(下图)。
图17显示了说明固定化GST-TrkB ECD或ICD与7，8-二羟基黄酮的体外结合测定结果的图。
图18显示了用各种ECD截短物和[3H]7，8-二羟基黄酮的测绘测定(mappingassay)结果。
图19显示了脑切片的TUNEL测定结果，表明7，8-二羟基黄酮减少小鼠脑中KA-诱导的凋亡(左图)，和海马中凋亡的定量分析(右图)。
图20显示了来自给予媒介物(60％DMSO)或7，8-二羟基黄酮的代表性动物的脑的2，3，5-三苯基氯化四唑(TTC)-染色的冠状缝切面，梗死显示为浅色，未染色的区域包括纹状体和上层皮质(左面)，和大脑中动脉闭塞(MCAO)24小时之后梗死体积(右面)。
图21显示了说明7，8-二羟基黄酮预防野生型而不是无TrkB神经元中谷氨酸酯-触发的神经元凋亡的Western印迹。
图22显示了说明不考虑TrkC基因型，7，8-二羟基黄酮减少半胱氨酸-3激活作用的Western印迹。
图23显示了说明7，8-二羟基黄酮选择性激活可由1NMPP1阻断的TrkB F616A的Western印迹。
图24显示了说明7，8-二羟基黄酮抑制TrkB F616A突变小鼠中KA-诱导的神经元细胞死亡的Western印迹。
图25是显示用媒介物(20％DMSO/80％盐水或100％盐水)、丙咪嗪、阿米替林或7，8-二羟基黄酮处理的小鼠强迫游泳试验行为的结果的条形图。
图26显示了几个7，8-二羟基黄酮衍生物的化学结构。
图27显示了说明来自图26的化合物的TrkB激活的Western印迹(左图)和说明滴定测定中TrkB激活需要的7，8-二羟基黄酮和4′-二甲基氨基-7，8-二羟基黄酮的浓度的Western印迹(右图)。
图28显示了说明7，8-二羟基黄酮和4′-二甲基氨基-7，8-二羟基黄酮对小鼠脑中TrkB受体的刺激效应的Western印迹。
图29显示了说明4′-二甲基氨基-7，8-二羟基黄酮(A)和7，8-二羟基黄酮(B)在皮质神经元中的抗凋亡活性的条形图。
图30显示了说明4′-二甲基氨基-7，8-二羟基黄酮(左图)和7，8-二羟基黄酮(右图)对抗小鼠中卡英酸(KA)的神经保护效应的Western印迹。
图31显示了进一步说明4′-二甲基氨基-7，8-二羟基黄酮和7，8-二羟基黄酮对抗小鼠中卡英酸(KA)的神经保护效应的Western印迹。
图32显示了表明7，8-二羟基黄酮和4′-二甲基氨基-7，8-二羟基黄酮处理的小鼠增加的神经发生的BrdU免疫荧光染色图像。
图33显示表明图32中显示的神经发生的相对水平的条形图。
图34显示表明7，8-二羟基黄酮和4′-二甲基氨基-7，8-二羟基黄酮处理的小鼠在强迫游泳试验中增加的活动度的条形图。
图35显示来自图34的强迫游泳试验中使用的小鼠的脑溶解产物的Western印迹，表明7，8-二羟基黄酮和4′-二甲基氨基-7，8-二羟基黄酮引起小鼠大脑中TrkB激活但不引起TrkA激活。
图36显示了条形图，表明盐水组中7，8-二羟基黄酮和4′-二甲基氨基-7，8-二羟基黄酮处理的小鼠增加的活动度，但对于用1NMPP1预处理的小鼠无显著区别。
详细描述
本文描述了用于激活TrkB受体的化合物和方法。这些化合物和方法有效治疗与激活TrkB受体关联的病症，包括神经系统病症、神经精神病症和代谢病症。神经系统病症和神经精神病症的实例包括抑郁、焦虑、阿尔兹海默病、CNS损伤以及类似病症。代谢病症的实例包括肥胖症和饮食过量。具体地，本文提供化合物7，8-二羟基黄酮以及其药学上可接受的盐、前药和衍生物。本文还描述了它们用于治疗神经系统病症、神经精神病症和肥胖症的方法。
化合物7，8-二羟基黄酮由化合物I表示：
用于本文描述的方法的7，8-二羟基黄酮衍生物包括由化合物II表示的化合物：
以及其药学上可接受的盐和前药。由化合物II表示的化合物包括，例如，比7，8-二羟基黄酮更易溶解且保留激活TrkB受体的能力的7，8-二羟基黄酮衍生物。在激活TrkB受体方面7，8-二羟基黄酮的各种衍生物的有效性可不同。然而，不期望受理论限制，即使特定衍生物在激活TrkB受体方面具 有比7，8-二羟基黄酮低的有效性，溶解度方面的改进可以提高例如本文描述的方法中使用的衍生物的总的有效性。
在化合物II中，X是CH2、NR3、O或S，其中R3选自：氢、取代的或未取代的C1-12烷基、取代的或未取代的C1-12杂烷基、取代的或未取代的C2-12烯基、取代的或未取代的C2-12杂烯基、取代的或未取代的C2-12炔基，或取代的或未取代的C2-12杂炔基。
同样在化合物II中，R1是氢、-OH、＝O或-NR4R5，其中R4和R5各自独立地是R3、取代的或未取代的C3-12环烷基、取代的或未取代的C3-12杂环烷基、取代的或未取代的C3-12环烯基、取代的或未取代的C3-12杂环烯基、取代的或未取代的C3-12环炔基或取代的或未取代的C3-12杂环炔基。R1的实例包括-NH2、-NHCH3、-N(CH3)2、
另外，在化合物II中，R2是-OR6或-NR6R7，其中R6和R7各自独立地是R3、-(C＝O)R3或-(C＝O)OR3。R2之一是，例如，
此外，在化合物II中，A是间位或对位取代的苯基或取代的或未取代的C5或C6杂芳基。例如，A是
其中Y1和Y2各自独立地是O、N、S或CH2；且Z是氢、卤素、-OR4或-NR5R6。对于进一步的实施例，A是
其中Y3、Y4和Y5各自独立地是O、N、S或CH2；且Z是氢、卤素、-OR4或-NR5R6。A的进一步实例包括：
在化合物II中，R1不是＝O，R2之一不是羟基，或A不是未取代的苯基。
化合物II具体的实例如下：
如本领域技术人员所理解，本文描述的化合物可以多种有机合成领域技术人员已知的方法或其改变形式制备。本文描述的化合物可以从容易获得的原材料制备。最佳反应条件可以随着使用的具体反应物或溶剂变化，但是本领域技术人员可以确定这些条件。
化合物II上的变化包括如为各化合物描述的各种组成部分的添加、去除或移动。类似地，当分子中存在一个或多个手性中心时，分子的手性可以被改变。另外，化合物合成可以包括各种化学基团的保护和脱保护。本领域技术人员可以确定保护和脱保护的使用，以及合适的保护基的选择。 保护基的化学可以参见，例如，Greene等，Protective Groupsin Organic Synthesis(有机合成中的保护基)，第2版，Wiley & Sons，1991，其通过引用全部并入本文。涵盖了对化合物II描述的各种化合物的合成和随后的试验以确定功效。
如本文所用，术语烷基、烯基和炔基包括直链和支链的单价取代基。实例包括甲基、乙基、异丁基、3-丁炔基和类似基团。杂烷基、杂烯基和杂炔基被类似地定义，但其可在骨架中包含O、S或N杂原子或其组合。术语取代的表明主取代基已经将一个或多个另外的组分与其连接，所述组分例如OH、卤素或上面列出的取代基之一。
产生本文描述的化合物的反应可在溶剂中进行，有机合成领域技术人员可选择溶剂。溶剂可以是在进行反应的条件，即，温度和压力下与原材料(反应物)、中间体或产物基本上不反应的。反应可以在一种溶剂或多于一种溶剂的混合物中进行。可以根据本领域已知的任何合适的方法监测产物或中间体形成。例如，产物形成可通过光谱手段或通过色谱法监测，光谱手段如核磁共振光谱(例如，1H或13C)、红外光谱、分光光度法(例如，UV-可见)，或质谱法，色谱法如高效液相色谱法(HPLC)或薄层色谱法。
由化合物II描述的化合物和其药学上可接受的盐和前药的实例可以例如使用方案1中显示的方法制备。
方案1
由化合物II描述的化合物和其药学上可接受的盐和前药的另外的实例可以例如使用方案2中显示的方法制备。
方案2
本文描述的方法包括治疗受治疗者中与激活TrkB受体关联的病症或降低受治疗者中与激活TrkB受体关联的病症的风险，所述病症包括神经系统病症、神经精神病症和代谢病症。神经系统病症和神经精神病症的实例包括抑郁、焦虑、阿尔兹海默病、CNS损伤以及类似病症。代谢病症的实例包括肥胖症和饮食过量。这一方法包括以下步骤：选择患有神经系统病症、神经精神病症或肥胖症或处于发展神经系统病症、神经精神病症或肥胖症的风险的受治疗者，和向受治疗者施用治疗有效量的7，8-二羟基黄酮或其衍生物。7，8-二羟基黄酮或其衍生物可以全身地施用(例如，口服地、肠胃外地(例如，静脉内地)、肌内地、腹膜地、经皮地(例如，通过贴片)、体外地、局部地、通过吸入、皮下地或类似途径)，通过施用进入中枢神经系统(例如，进入脑(大脑内或室内)、脊髓，或进入脑髓液)，或其任何组合。
还提供了促进受治疗者中神经保护的方法。这一方法包括以下步骤：选择需要神经保护的受治疗者，并向受治疗者施用治疗有效量的7，8-二羟基黄酮或其衍生物。需要神经保护的受治疗者可以例如是具有肌萎缩性侧索硬化(ALS)或中枢神经系统损伤的受治疗者。中枢神经系统损伤包括例如脑损伤、脊髓损伤或脑血管事件(例如，中风)。
方法可以进一步包括测试7，8-二羟基黄酮或其衍生物的有效性。测试 有效性可以包括但不限于：成像(例如，磁共振成像(MRI))和功能性测量(例如，存活率或临床症状，如语言模式、逻辑、理解力、记忆力、情绪和定向的分析)。该方法任选地进一步包括调整7，8-二羟基黄酮或其衍生物的剂量或治疗方案。
进一步提供了激活神经元(例如，哺乳动物神经元)上TrkB受体的方法。这一方法包括以下步骤：提供具有TrkB受体的神经元，并使TrkB受体在体外与足以激活TrkB受体的量的7，8-二羟基黄酮或其衍生物接触。还提供了筛选加强TrkB受体激活的剂的方法。筛选方法包括激活描述的神经元上的TrkB受体，并使神经元与筛选的剂接触。增强的效应表明该剂加强7，8-二羟基黄酮或其衍生物的效应。
可以在药物组合物中提供本文描述的化合物或其衍生物。取决于期望的施用模式，药物组合物可以处于固体、半固体或液体剂型的形式，如，例如，片剂、栓剂、丸剂、胶囊、粉剂、液体或悬浮液，优选地处于适合用于准确剂量的单个施用的单位剂量形式。组合物将包括治疗有效量的本文描述的化合物或其衍生物结合药学上可接受的载体，且另外可以包括其他药剂(medicinal agent)、药剂(pharmaceutical agent)、载体或稀释剂。药学上可接受的意指不是生物学或在其它方面不期望的材料，其可以与选择的化合物一起被施用到个体，而不引起不可接受的生物学效应或以有害的方式与包含其中的药物组合物的其它组分相互作用。
如本文所用，术语载体包括任何赋形剂、稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂、脂质、稳定剂或本领域熟知的用于药物制剂的其它材料。组合物中使用的载体的选择将取决于组合物的期望的施用途径。药学上可接受的载体和包含这些材料的制剂的制备描述在例如，Remington′s Pharmaceutical Sciences(雷明顿药物科学)，第21版，编著，University of the Sciences in Philadelphia，Lippincott，Williams & Wilkins，Philadelphia Pa.，2005。生理上可接受的载体的实例包括缓冲液，如磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液和含其它有机酸的缓冲液；包括抗坏血酸的抗氧化剂；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸 或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖醇如甘露醇或山梨醇；盐-形成抗衡离子如钠；和/或非离子表面活性剂如TWEEN (ICI，Inc.；Bridgewater，New Jersey)、聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTM(BASF；Florham Park，NJ)。
适合肠胃外注射的包含本文描述的化合物或其衍生物的组合物可包括生理上可接受的无菌水溶液或非水溶液、分散体、悬浮液或乳液，和用于重构成无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。合适的水和非水载体、稀释剂、溶剂或媒介物的实例包括水、乙醇、多元醇(丙二醇、聚乙二醇、甘油等)、其合适的混合物、植物油(如橄榄油)和可注射的有机酯如油酸乙酯。例如，通过使用包衣如卵磷脂，在分散液的情况下通过维持需要的粒度和通过使用表面活性剂，保持适当的流动性。
这些组合物也可以包含佐剂，如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂促进微生物活动的预防，抗菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸和类似物。也可以包括等渗剂，例如糖、氯化钠和类似物。通过使用延迟吸收的剂，例如，单硬脂酸铝和明胶，可以实现可注射药物形式的延长的吸收。
用于本文描述的化合物或其衍生物的口服施用的固体剂型包括胶囊、片剂、丸剂、粉剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，本文描述的化合物或其衍生物与以下物质混合：至少一种惰性的常用赋形剂(或载体)如柠檬酸钠或磷酸二钙或(a)填充剂或膨胀剂，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸，(b)粘合剂，例如，羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶，(c)润湿剂，例如，甘油，(d)崩解剂，例如琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、海藻酸、某些复合硅酸盐和碳酸钠，(e)溶液阻滞剂，例如，石蜡，(f)吸收促进剂，例如，季铵化合物，(g)湿润剂，例如，鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯，(h)吸附剂，例如，高岭土和膨润土，和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠或其混合。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，剂量形式也可以包括缓冲剂。
相似类型的固体组合物也可以被用作软-和硬-填充明胶胶囊中的填充 剂，明胶胶囊使用如乳糖或乳糖(milk sugar)以及高分子量聚乙二醇和类似物的赋形剂。
固体剂型如片剂、锭剂、胶囊、丸剂和颗粒剂可以被制备为具有包衣和壳，如肠溶衣和本领域已知的其它包衣。它们可以包含遮光剂且也可以具有这样的组合物：它们以延迟方式在肠道的特定部分释放活性化合物。可以使用的包埋组合物的实例是聚合物和蜡类。活性化合物也可以，如果合适的话与上面提到的赋形剂的一种或多种一起处于微囊形式。
用于本文描述的化合物或其衍生物的口服施用的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。除了活性化合物，液体剂量形式可以包括本领域中普遍使用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例如，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺，油，特别是棉子油、花生油、玉米胚芽油、橄榄油、蓖麻油、芝麻油、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和去水山梨醇的脂肪酸酯，或这些物质的混合物，和类似物。
除这些惰性稀释剂之外，组合物还可以包括另外的剂，如湿润剂、乳化剂、悬浮剂、增甜剂、调味剂或芳香剂。
除了活性化合物，悬浮液还可以包括另外的剂，例如，乙氧基异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂和黄蓍胶，或这些物质的混合物，以及类似物。
用于直肠施用的本文描述的化合物或其衍生物的组合物优选地是栓剂，栓剂可以通过将化合物与合适的无刺激的赋形剂或载体如可可脂、聚乙二醇或栓剂蜡混合来制备，栓剂在常温下是固体但在体温下是液体并因此在直肠或阴道腔内融化并释放活性组分。
用于本文描述的化合物或其衍生物的局部施用的剂型包括软膏、粉剂、喷雾剂和吸入剂。将本文描述的化合物或其衍生物在无菌条件下与生理上可接受的载体和可能需要的任何防腐剂、缓冲剂或推进剂混合。眼用制剂、软膏、粉剂和溶液也包括在组合物的范围之内。
如本文所用，术语药学上可接受的盐指本文描述的化合物或其衍生物 的盐以及如果可能的本文描述的化合物的两性离子形式，所述盐属于合理的药物评价的范围，适合用于与受治疗者的组织接触而无异常毒性、刺激、过敏反应和类似物，与合理的益处/风险比相称，且对于它们期望的用途是有效的。术语盐指本文描述的化合物的相对无毒的无机酸加成盐和有机酸加成盐。这些盐可以在化合物的分离和纯化过程中在原处制备，或通过单独地使游离碱形式的纯化的化合物与合适的有机酸或无机酸反应并分离因此形成的盐来制备。代表性的盐包括氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、硝酸盐、乙酸盐、草酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、硼酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、延胡索酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘二甲酸甲磺酸盐(naphthylate mesylate)、葡庚糖酸盐、乳糖醛酸盐、甲磺酸盐和月桂基磺酸盐以及类似物。这些可以包括基于碱金属和碱土金属如钠、锂、钾、钙、镁和类似物的阳离子，以及无毒的铵、季铵和胺阳离子，包括但不限于铵、四甲铵、四乙铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺和类似物(参见S.M.Barge等，J.Pharm.Sci.(1977)66，1，其通过引用至少将关于本文教导的组合物全部并入本文)。
上面描述的化合物或其衍生物用于治疗与激活TrkB受体关联的病症，以及用于促进人(例如包括儿童群体和老人群体)和动物(例如兽医应用)中的神经保护，与激活TrkB受体关联的病症包括神经系统病症、神经精神病症和代谢病症(例如，肥胖症)。需要神经保护的受治疗者是处于神经系统病症或神经精神病症的风险中的受治疗者或患有神经系统病症或神经精神病症的受治疗者。神经学和神经精神病症例如：抑郁、焦虑、肌萎缩性侧索硬化、阿尔兹海默病、亨延顿病、Rett综合征、癫痫、帕金森病、痴呆、糖尿病性神经病、外周神经病和中枢神经系统损伤。中枢神经系统损伤包括例如，脊髓损伤、中风、缺氧、局部缺血和脑损伤。如本文所用，术语促进、治疗(treating)和治疗(treatment)包括预防；延迟发病；减少、消除或延迟发病后一种或多种体征或症状的加重；和预防复发。
本文描述的方法和化合物用于预防性治疗和治疗性治疗。对于预防性使用，在发病前(例如，在明显的神经学或神经精神病症的体征之前)， 在早期发病(例如，在神经系统病症的起始体征和症状之后)或确定的神经系统病症期间，向受治疗者施用治疗有效量的本文描述的化合物或其衍生物。病症例如神经学或神经精神病症的症状的表现之前几天至数年，可以发生预防性施用。可以例如，在诊断患有遗传性神经系统病症如亨延顿病的受治疗者中或在有中风和缺氧风险的手术之前使用预防性施用。治疗性治疗包括在诊断病症例如神经系统病症、神经精神病症或代谢病症(例如，肥胖症)之后向受治疗者施用治疗有效量的本文描述的化合物或其衍生物。
可以使用治疗有效量的本文描述的化合物或其衍生物持续对治疗病症有效的一段时间，进行本文描述的化合物或其衍生物的施用。有效量的本文描述的化合物或其衍生物可以由本领域普通技术人员确定并包括每天约0.5至mg/kg体重至约200mg/kg体重的活性化合物的用于动物的示例性剂量，其可以单剂量被施用或以个体分开剂量如每天1至4次的形式施用。可选地，剂量可以是每天约0.5mg/kg至约150mg/kg体重的活性化合物，每天约0.5mg/kg至100mg/kg体重的活性化合物，每天约0.5mg/kg至约75mg/kg体重的活性化合物，约0.5mg/kg至约50mg/kg体重活性化合物每天，每天约0.5mg/kg至约25mg/kg体重的活性化合物，每天约1mg/kg至约20mg/kg体重的活性化合物，每天约1mg/kg至约10mg/kg体重的活性化合物，每天约20mg/kg体重的活性化合物，每天约10mg/kg体重的活性化合物，或每天约5mg/kg体重的活性化合物。本领域的技术人员将理解：用于任何具体的受治疗者的具体的剂量水平和剂量频率可以变化，且将取决于多种因素，包括使用的具体化合物的活性，那种化合物的代谢稳定性和作用时长，受治疗者的物种、年龄、体重、健康状况、性别和饮食，施用模式和时间，排泄速率，药物组合和具体病况的严重性。
在这些方法中，治疗的病症例如，抑郁、焦虑、中枢神经损伤、代谢病症(例如，肥胖症)或其它病症可以用一种或多种另外的剂进一步治疗。可以任何次序施用所述一种或多种另外的剂和本文描述的化合物或其衍生物，次序包括同时施用，以及达几天相隔的时间间隔次序。该方法还可包括一种和多种另外的剂和/或本文描述的化合物或其衍生物的单次以上 的施用。一种或多种另外的剂和本文描述的化合物或其衍生物的施用可以是通过相同或不同途径，且为同时地或顺序地。当用一种或多种另外的剂治疗时，可以将7，8-二羟基黄酮或其衍生物与所述一种或多种另外的剂组合成药物组合物。例如，7，8-二羟基黄酮或其衍生物可以与抗抑郁剂例如丙咪嗪、氟西汀、帕罗西汀和/或舍曲林组合成药物组合物。作为进一步的实例，7，8-二羟基黄酮或其衍生物可以与抗焦虑剂例如地西泮、阿普唑仑、氯硝西泮和/或羟嗪组合成药物组合物。
下面的实施例意欲进一步说明本文描述的方法和化合物的某些方面，并非意欲限制权利要求的范围。
实施例
一般方法
细胞、试剂和小鼠
在加湿的孵育器中，在37℃与5％CO2气氛下将人成神经细胞瘤SH-SY5Y和人胚肾HEK293细胞系培养在具有10％胎牛血清(FBS)和100单位青霉素-链霉素的DMEM中。通过融合N18TG2成神经瘤细胞与来自出生后21天的隔区的鼠类(株系C57BL/6)神经元产生小鼠隔区神经元x成神经细胞瘤杂交SN56细胞。将SN56细胞保持在37℃与5％CO2气氛下含1mM丙酮酸盐和10％FBS的DMEM培养基中。将用大鼠TrkB稳定转染的T48和T62细胞培养在含300μg/mlG418的相同的培养基中。
神经生长因子(NGF)和脑源性神经营养因子(BDNF)来自Roche；Basel，Switzerland。磷酸-Akt-473和-308、Akt和核纤层蛋白A/C抗体和抗-TrkA来自CellSignaling；Danvers，MA。抗-磷酸-Erk1/2、抗-磷酸-TrkA Y490和抗-磷酸-Akt 473抗体来自Upstate Biotechnology，Inc.；Billerica，MA。抗-TrkB抗体来自Biovision；MountainView，CA。抗-p-TrkB 817来自Epitomics，Inc.(Burlingame，CA)。之前描述了抗-p-TrkAY794和抗-p-TrkB Y816抗体(Arevalo等，Mol.Cell.Biol.20：5908-16，2000；Rajagopal等，J.Neurosci.，24：6650-8，2004，其将至少关于这些抗体方面全部并入本文)。包 含2000个生物学活性化合物的化合物库来自The Spectrum Collection(MicroSource DiscoverySystem，Inc.；Gaylordsville，CT 06755)。7，8-二羟基黄酮购自TCI America(Portland，Oregon)。实施例中未表明具有其它来源的所有化学品购自Sigma。
根据Emory Medical School指导在无病原体的环境中培育TrkBF616A小鼠(Chen X等， 46(1)：13-21，2005)和野生型C57BL/6小鼠。
原代大鼠皮质神经元培养
如下制备原代培养的大鼠皮质神经元。将幼年E17大鼠(pups)断头并将皮质切除，剁碎并通过移液分离悬浮在5％胎牛血清(FCS)，5％马血清(HS)DMEM中。然后将细胞悬浮液在250x g离心5分钟。再重复这一操作。将细胞接种到聚乙烯亚胺涂布的10cm2皿和包括涂布的盖玻片的12孔板中，并在37℃在5％CO2/95％空气中孵育。3小时之后，将培养基改变为含B-27添加物(Invitrogen；Carlsbad，CA)的Neurobasal中并孵育4天。为了维持，每4天将培养基的一半更换为新的Neurobasal/B27。1周之后，皿培养的神经元准备使用。
免疫荧光染色
将原代海马神经元接种到12孔板中聚L赖氨酸涂覆的盖玻片上。在体外7天后，将神经元用100ng/ml BDNF或多种黄酮化合物(1μM)处理30分钟，然后用PBS洗涤。在室温将细胞用3％甲醛固定在PBS中持续10分钟。然后将细胞透化，并通过PBS中0.4％Triton X-100和2％FBS在室温阻断，持续15分钟，用PBS洗涤三次，并用抗-MAP2(1∶200)和抗-磷酸-TrkB抗体(1∶500)处理。用FITC-或若丹明结合的第二抗体染色之后，将盖玻片放置在载玻片上。由OLYMPUS IX71荧光显微镜(Olympus；Center Valley，PA)取得荧光图像。
免疫组织化学染色
将脑组织固定在4％多聚甲醛中过夜，随后由石蜡包埋。切5μm切片。为了免疫组织化学染色，将脑切片在二甲苯中脱蜡并在等级醇(graded alcohols)中再水合。内生过氧化物酶活性由3％过氧化氢阻断5分钟且将 所有载玻片在10mM柠檬酸钠缓冲液(pH 6.0)中煮沸10分钟。使用特异性抗体和Zymed HistostainPlus AEC试剂盒(Invitrogen；Carlsbad，CA)检测磷酸化TrkA、TrkA、磷酸化Trk B和Trk B。然后将载玻片用苏木精复染色。
4′-二甲基氨基-7，8-二羟基黄酮的竞争测定
将纯化的TrkB ECD蛋白用4′-DMA-7，8-DHF(见图26的结构1)、7，8-二羟基-2(嘧啶-5-基)-4H-色-4-酮(见图26的结构4)和2-(4-氟-苯基)-7，8-二羟基喹啉-4(1H)-酮(见图26的结构2)在4℃在1ml结合缓冲液(50mM Na-K磷酸盐、pH 7.1，200mM NaCl和2nM 3H-7，8-DHF(68000cpm))中孵育10min。孵育之后，将反应混合物装载到滤纸上。将混合物用3×5ml洗涤缓洗涤(100mM Tris，pH 7.1)洗涤。将干燥的滤纸放入小瓶中并接受液体闪烁计数器分析。计算竞争常数的值。
卡英酸/TrkB激动剂药物施用
将鼠龄60天的雄性C57BL/6小鼠口腔注射单剂量的4′-DMA-7，8-DHF或7，8-DHF(每只1mg/kg)。腹膜内注射KA(20mg/kg)。为了癫痫活动的发作，连续监测动物2小时。在TrkB激动剂治疗之后第0、4和8小时，将动物处死并通过用p-TrkB-Y817、活性半胱天冬酶-3和全部TrkB抗体的免疫印迹分析脑溶解产物。
TrkB激动剂抑制TrkB F616A小鼠中KA诱导的神经元细胞死亡
在药理学试剂处理前一天喂饲TrkB F616A敲入小鼠(2-3月鼠龄)饮用水中的1NMPP1(25μM)。第二天，在卡英酸(20mg/kg)前4小时，将小鼠口腔注射7，8-DHF或4′-DMA-7，8-DHF(5mg/kg)。将对照小鼠单独用盐水、1NMPP1、卡英酸注射，或在卡英酸之前4小时施用7，8-DHF或4′-DMA-7，8-DHF。在4天内，将小鼠处死并将脑均质化并超离心。将上清液(40μg)分别进行SDS-PAGE和使用指定抗体的免疫印迹分析。
强迫游泳试验
将成年雄性小鼠(2-3月鼠龄)随机提交至无预游泳的强迫游泳试验。口腔注射盐水、4′-DMA-7，8-DHF和7，8-DHF(5mg/kg)持续21天。使得 小鼠适应试验室持续2天。在24℃将小鼠放置在直径16cm，半填充清澈的水的透明的玻璃圆柱体中(14cm的水深不允许小鼠到达圆柱体的底部；每只小鼠之后换水)持续共6min，由对基因型和治疗盲性的研究者在最后4min记录不动性。
TrkB激动剂治疗的海马中神经发生分析
将成年雄性小鼠(2-3月龄)口腔注射盐水、4′-DMA-7，8-DHF和7，8-DHF(5mg/kg)，持续21天。然后腹膜内注射BrdU(50mg/kg)。2小时中，用4％多聚甲醛灌注小鼠。在甲醛固定的石蜡包埋的切片上进行免疫组织化学染色。切下脑切片，在二甲苯中脱蜡并在等级醇中再水合。将载玻片在10mM柠檬酸(pH 6.0)中煮沸10分钟，之后在室温在2N HCl中孵育10分钟。然后将载玻片用0.2％PBST中的1％BSA透化并阻断。使用抗-BrdU-FITC(Abeam，Inc；Cambridge，MA)在4℃将掺入的BrdU染色持续16小时。在PBS中洗涤三次之后，在室温将细胞用DAPI染色另外10分钟。载玻片装安装0.01％1，4-重氮双环(2，2，2)辛烷的AquaMount(Lerner Laboratories；Pittsburgh，PA)并在荧光显微镜下检测。
统计学分析
所有结果表示为平均值±SD。使用学生t检验分析平均局部缺血激光多普勒血流仪(LDF)和损伤体积。统计显著性标准设置在p＜0.05。
其它仪器
NMR光谱(Bruker AV300K，300MHz(Bruker Optics Inc.；Billerica，MA))、MS光谱(Shimadzu LCMS(Shimadzu Scientific Instruments；Columbia，MD))、HPLC(PE，双泵，SPD检测器，ODS-C 18反相，254nm，CH3CN-H2O-0.1％TFA(PerkinElmer Life And AnalyticalSciences，Inc.；Waltham，MA))
实施例1：鉴定保护TrkB表达细胞免于凋亡的化合物的基于细胞的筛选。
制备并试验报告细胞系.为了鉴定模拟BDNF并激活TrkB的小分子，制备TrkB稳定转染的鼠类细胞系。通过转染具有TrkB表达构建体的表达 可略的TrkB的基底前脑SN56细胞，产生T48和T62细胞系。为了试验TrkB的表达，将细胞用BDNF处理，与TrkA NTR稳定表达的T17细胞系(图1A)相比，这产生Trk-490的强的磷酸化和Akt激活，表明TrkB的表达。为了试验对凋亡的抗性，不处理SN56细胞和T48细胞系或用BDNF处理SN56细胞和T48细胞系，然后接受凋亡测定。简单地说，将细胞用0.75μM十字孢碱处理9小时，且在实验终止前1小时，将细胞用10μM MR(DEVD)2处理。然后将细胞用4％多聚甲醛固定15分钟，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤，并用Hoechst 33342孵育10分钟。将盖玻片用PBS洗涤，放置，并使用荧光显微镜检查细胞，以观察半胱天冬酶裂解后哪些细胞变红。与亲代SN56细胞系相比，用BDNF处理减少T48细胞系中的凋亡(图1B)。
基于细胞的筛选.为了筛选大量的化学品，使用细胞可透过荧光染料，MR(DEVD)2，开发了基于细胞的凋亡测定，荧光染料在凋亡细胞中半胱天冬酶裂解后变红。将SN56和T48细胞以每孔10,000个细胞放置在多个96孔板中并暴露于来自Spectrum CollectionLibrary的DMSO中10μM浓度的2000个生物活性化合物，持续30分钟。暴露于化合物之后，使细胞接受上面描述的开发的荧光凋亡测定(图2中图解显示的方法)。
然后使选择性地保护T48细胞系但不保护SN56细胞系的候选物接受SH-SY5Y细胞的神经突增生测定来二次筛选。进一步验证阳性化合物在原代海马神经元中的TrkB激活，PI-3激酶/Akt和MAP激酶信号传导级联激活。六十六个化合物选择性地保护T48细胞系但不保护SN56细胞系。
实施例2：鉴定黄酮衍生物为存活增强剂。
在起始筛选中，66个阳性化合物中的5个是黄酮衍生物或类似化合物。库也包含许多无活性的黄酮衍生物。9个代表性黄酮化合物的化学结构显示在图3中。为了比较凋亡抑制活性，将黄酮衍生物用SN56和T48细胞预孵育，并随后接受上面描述的荧光凋亡测定。在T48细胞系中，7，8-二羟基黄酮、西阿尼醇、香叶木素、甲萘醌和生松素强力抑制凋亡；然而，表阿夫儿茶精、非瑟酮醇和表儿茶素未能抑制凋亡(图4)。另外，确定7，8-二羟基黄酮、西阿尼醇、生松素和香叶木素的保护50％(EC50)的细胞免于凋亡的有效浓度。这些化合物的EC50分别是35nM、100nM、100nM和500nM(图5)。
为了检测这些化合物能否促进神经元存活，准备海马神经元并将培养物用各种黄酮衍生物预处理30分钟，随后用50μM谷氨酸处理16小时。定量凋亡测定表明：7，8-二羟基黄酮比阳性对照BDNF显示更好的对神经元的保护效应(图6)。西阿尼醇、甲萘醌和生松素展现了与BDNF相当的抗凋亡活性；然而，香叶木素、表阿夫儿茶精和表儿茶素仅稍微地保护神经元免于谷氨酸诱导的细胞死亡且非瑟酮醇显示无效应(图6)。
为了探索7，8-二羟基黄酮能否对缺氧缺糖(OGD)中的海马神经元发挥任何保护效应，在OGD之前将神经元的原代制品用BDNF或各种黄酮衍生物处理30分钟。3小时内，凋亡分析显示7，8-二羟基黄酮展现了化合物中最强的保护效应(图7，左图)且滴定测定显示7，8-二羟基黄酮以剂量依赖性方式保护神经元(图7，右图)。
实施例3：7，8-二羟基黄酮体外触发海马神经元中的TrkB激活。
结合到TrkB的BDNF诱导其自磷酸化且，随后，包括MAPK和PI3/Akt的下游激酶途径的激活。为了探索7，8-二羟基黄酮能否触发TrkB激活，用抗-磷酸-TrkB抗体对海马神经元进行免疫荧光染色。如图8中所示，7，8-二羟基黄酮，但不是任何其它试验的黄酮衍生物，特异地引起与BDNF相似的TrkB酪氨酸磷酸化(右区表明磷酸化)。
为了进一步检测7，8-二羟基黄酮是否可以刺激TrkB介导的下游信号传导级联，进行Western分析。如图9中所示，对照其它黄酮衍生物，7，8-二羟基黄酮再次显示激活TrkB。另外，如图9所示，Akt和Erk都被7，8-二羟基黄酮和香叶木素激活，且Erk被生松素、西阿尼醇、槲皮素和异氧黄酮(Methoxyvone)激活。
为了进一步试验7，8-二羟基黄酮的刺激效应通过TrkB被介导，不处理细胞或用神经营养素受体Trk家族的酪氨酸激酶活性的选择性抑制剂K252a处理细胞。如图10中所示，用K252a处理的细胞显示K252a阻断暴露于7，8-二羟基黄酮的细胞中TrkB酪氨酸磷酸化。
为了探测7，8-二羟基黄酮触发的TrkB激活的时程，将海马神经元用500nM 7，8-二羟基黄酮处理并通过Western分析确定Erk和Akt随时间的磷酸化。如图11(左图)中所示，在第5分钟观察到Erk磷酸化，在第10分钟增加，持续至第30分钟，60分钟减少，并且180分钟消失，而在第10分钟观察到Akt磷酸化，在第30分钟达峰值，在第60分钟减少并在180分钟消失。7，8-二羟基黄酮对Erk和Akt的刺激作用以剂量依赖性方式发生。如图11(右面)中所示，Erk磷酸化在250nM 7，8-二羟基黄酮处理30分钟时被观察到，在500nM 7，8-二羟基黄酮处理30分钟时增加，而Akt激活在100nm 7，8-二羟基黄酮处理30分钟时被观察到，且在250nM和500nM7，8-二羟基黄酮处理30分钟时增加。
实施例4：7，8-二羟基黄酮体内触发海马神经元中的TrkB激活。
为了评估7，8-二羟基黄酮是否可以引发脑中TrkB激活，将小鼠腹膜内注射5mg/kg剂量并在各时间点分析。如图12(左图)中所示，Western分析显示注射之后2小时TrkB但不是TrkA在脑中被选择性磷酸化。此外，如图12(右图)中所示，用7，8-二羟基黄酮处理之后神经营养素受体的蛋白和mRNA水平未被改变。如图13所示，脑免疫荧光染色显示海马中大量的TrkB磷酸化(亮区显示磷酸化)。
实施例5：7，8-二羟基黄酮结合TrkB受体的胞外域。
已知BDNF结合TrkB受体并引发其二聚(Barbacid，J.Neurobiol，25：1386-1403，1994；Klein等，Cell，66：395-403，1991)。为了探索7，8-二羟基黄酮是否触发TrkB受体二聚合，将HEK293细胞用GST-TrkB和HA-TrkB或HA-TrkA共转染。然后将细胞用BDNF或小黄酮化合物(0.5μM)处理30分钟。采集细胞，在PBS中洗涤一次，并在1mL裂解缓冲液(50mM Tris，ph7.4，150mM NaCl、1mM EDTA、0.5％Triton X-100、1.5mM Na3VO4、50mM NaF、10mM焦磷酸钠、10mM β-甘油磷酸钠、1mM苯基甲磺酰氟(PMSF)、5mg/ml抑肽酶、1mg/ml亮肽素、1mg/ml胃酶抑素A)中裂解并以14,000x g在4℃离心10分钟。将上清液转移到新的试管中并用谷光苷肽小珠将转染的TrkB受体从上清液分离，且将共沉淀的蛋白在 SDS-PAGE上拆分。将样品转移到硝酸纤维素膜，且Western分析显示7，8-二羟基黄酮以与BDNF相似的方式引发TrkB二聚，而无活性的黄酮生松素和DMSO不能(图14)。通过对照，不管BDNF或7，8-二羟基黄酮处理，共转染的TrkB受体未能与TrkA受体二聚。
为了确定7，8-二羟基黄酮是否促进其它Trk受体的酪氨酸磷酸化，将HEK293细胞用各种Trk受体转染，随后用7，8-二羟基黄酮处理。如图15中所显示，用7，8-二羟基黄酮处理引起TrkB受体而不是TrkA或TrkC受体中的酪氨酸磷酸化。在激酶死亡(KD)-TrkB受体中观察到可忽略的酪氨酸磷酸化。
为了确定7，8-二羟基黄酮是否物理地和直接地结合TrkB受体，用纯化的TrkB胞外域(ECD)和胞内域(ICD)重组蛋白进行体外结合测定。将纯化的TrkB ECD和ICD(各10μg)用不同浓度的3H-7，8-二羟基黄酮在1mL的结合缓冲剂(0.05M Na/K磷酸缓冲液，pH 7.1，200mM NaCl)中在4℃孵育10分钟。孵育之后，将反应混合物装载到滤纸上。将混合物用Tris缓冲液(100mM Tris，pH 7.1)洗涤三次，并将干燥的滤纸放入小瓶中且经受液体闪烁计数器分析。[3H]-7，8-二羟基黄酮的逐渐增量渐进地结合TrkB ECD但不结合ICD。解离常数的值和位点数目获自斯卡恰特图，使用方程r/[L]游离＝n/Kd-r/Kd，其中r是结合配体的浓度与总蛋白浓度的比，且n是结合位点的数目。使用斯卡恰特图的定量分析显示配体与受体的比是1∶1，结合常数Kd是320nM(见图16)。TrkA受体的ECD和ICD都不能结合7，8-二羟基黄酮。
为了进一步探索7，8-二羟基黄酮与TrkB受体的关联，进行体外结合测定。增加体积的GST-TrkB ECD和GST-TrkB ICD被结合到谷胱甘肽小珠至总计250uL，且将250μl(20％DMSO/80％PBS)中的500nM 7，8-二羟基黄酮与小珠在柱中在4℃孵育30分钟。孵育之后，收集洗脱级分并通过UV光谱测定法在410nm波长处分析洗脱的7，8-二羟基黄酮的浓度。如图17中所示，7，8-二羟基黄酮浓度随着GST-TrkB ECD体积增加而降低；然而，当GST-TrkB ICD体积增加时，洗脱的7，8-二羟基黄酮浓度保持恒定。
已知BDNF结合到包含第三亮氨酸富集基序(LRM)的TrkB ECD区 域、第二半胱氨酸聚簇(CC)结构域和免疫球蛋白2(Ig2)结构域(Haniu等，J.Biol.Chem.，272：25296-303，1997)。为了定位7，8-二羟基黄酮结合TrkB ECD的位置，制备ECD的截短突变体并进行体外结合测定。如图18中所示，7，8-二羟基黄酮较强地与ECD和CC-2结构域缔合，较弱地与LRM结构域缔合，且不结合CC-1结构域或ICD。
实施例6：7，8-二羟基黄酮预防卡英酸触发的神经元凋亡并减少中风的大鼠脑的梗死体积。
卡英酸(KA)是AMPA受体的强效激动剂。KA的外周注射引起复发的癫痫和海马中选择的神经元群体随后的退化(Schauwecker和Steward，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94：4103-8，1997)。KA以半胱天冬酶依赖和非依赖性方式诱导神经元细胞死亡(Faherty等，BrainRes.Mol.Brain Res.，70：159-63，1999；Glassford等，Neural.Res.，24：796-800，2002；Liu等，Mol.Cell，29：665-78，2008)。为了探索7，8-二羟基黄酮是否可以阻断由KA发起的神经毒性，将鼠龄60天的C57BL/6小鼠腹膜内注射单剂量的盐水中的20％DMSO、20mg/kg KA(Sigma)或5mg/kg的7，8-二羟基黄酮，随后20mg/kg KA。5天内，将小鼠麻醉，灌注0.1M磷酸盐缓冲盐水中的4％多聚甲醛并除去脑，固定后过夜，且处理用于石蜡包埋。将脑的连续切片切成5μm的厚度并放置在载玻片(Superfrost-plus，Fisher；Pittsburgh，PA)上。如图19(左图)显示，TUNEL染色显示KA引发海马中的凋亡，其通过7，8-二羟基黄酮减少(亮区显示上图的凋亡细胞)。海马中凋亡的定量分析显示7，8-二羟基黄酮减少海马中KA-诱导的凋亡(图19，右图)。
为了进一步确定体内神经保护潜力，在成年雄性大鼠中的暂时性大脑中动脉闭塞(MCAO)中风模型中试验7，8-二羟基黄酮。如先前所描述，右大脑中动脉闭塞诱导局部脑缺血(Sayeed等，Ann.Emerg.Med.，47：381-9，2006)。2小时MCAO之后接着再灌注，在开始再灌注前，动物腹膜内接受媒介物或7，8-二羟基黄酮(5mg/kg)5分钟。研究中包括的所有的动物幸免于缺血损伤并用7，8-二羟基黄酮处理。图20(左图)中显示了媒介物处理的和7，8-二羟基黄酮处理的大鼠中MCAO之后24小时，用2，3，5-三苯基氯化四唑(TTC)染色的代表性脑片。TTC切片的面积和体积测量显 示用7，8-二羟基黄酮处理减少这一暂时性缺血的中风模型中的梗死体积(图20，右图)。数据表示为平均值±SD；*(p＜0.05)＝与MCAO+媒介物(右图)相比的显著差异。
实施例7：7，8二羟基黄酮以TrkB依赖性方式保护神经元免于凋亡。
为了确定7，8-二羟基黄酮是否可以选择性激活TrkB受体并预防神经元细胞死亡，自与相同基因型交配的TrkB+/-小鼠的纯合幼仔(pups)制备皮质神经元。如图21中所示(第1和3行)，7，8-二羟基黄酮特异性激活野生型而非无TrkB神经元中的TrkB受体而非TrkA受体。谷氨酸非选择性地引起野生型和无TrkB神经元中较弱的TrkA磷酸化(图21，第3行)。在野生型而非TrkB-/-神经元中谷氨酸引发的半胱天冬酶-3激活基本上被7，8-二羟基黄酮阻断(图21，第5行)。对照化合物香叶木素和生松素非选择性地抑制两种神经元中半胱天冬酶-3激活(图21，第5行)。
为了进一步评估7，8-二羟基黄酮是否以TrkB依赖性方式阻断神经元凋亡，自与相同基因型交配的TrkC+/-小鼠的纯合幼仔制备皮质神经元。如图22(第1行)中所示，7，8-二羟基黄酮引发野生型和TrkC敲除神经元中的TrkB激活而非TrkA激活。不考虑TrkC基因型，谷氨酸较弱地刺激TrkA和TrkB的微弱的磷酸化(图22，第1和3行)。TrkC-/-神经元中自发半胱天冬酶-3激活被7，8-二羟基黄酮抑制(图22，第5行)。此外，谷氨酸触发的半胱天冬酶-3激活被7，8-二羟基黄酮显著地减少(图22，第5行)。
为了探索7，8-二羟基黄酮的神经保护作用是否依赖于体内TrkB激活，使用TrkBF616A敲入小鼠。已经显示TrkB F616A受体被1NMPP1抑制剂选择性阻断，且导致无TrkB的表型(Chen等，Neuron，46：13-21，2005)。为了进一步评估7，8-二羟基黄酮是否可以模拟BDNF，自TrkB F616A敲入小鼠制备皮质神经元。将皮质神经元用K252a Trk酪氨酸激酶抑制剂(100nM)或1NMPP1抑制剂(100nM)预处理30分钟，随后用0.5μM 7，8-二羟基黄酮处理30分钟。如图23(第1行)中显示，BDNF引发的TrkB磷酸化被1NMPP1而不是K252a选择性阻断。另外观察到7，8-二羟基黄酮被1NMPP1而不是K252a选择性阻断(图23，第1行)。1NMPP1而非K252a阻断BDNF-触发的Akt和Erk1/2激活，而1NMPP1部分地减少Akt激活且未能抑制7，8-二羟基黄酮引起的Erk1/2激活(图23，第3和5行)。
为了确定1NMPP1是否将使得用7，8-二羟基黄酮处理的神经元易受KA-引发的神经元细胞死亡，在药理学试剂处理的前一天用饮用水中的1NMPP1(25mM)喂食TrkF616A敲入小鼠。第二天，KA注射前4小时，将小鼠腹膜内注射KA(25mg/kg)或7，8-二羟基黄酮(5mg/kg)。将对照小鼠单独注射KA或7，8-二羟基黄酮，或在KA之前4小时向小鼠施用7，8-二羟基黄酮。在4天内，将小鼠处死并将脑均质化并超离心。将上清液用于SDS-PAGE和免疫印迹分析。如图24中所示，1NMPP1、7，8-二羟基黄酮单独处理或1NMPP1和7，8-二羟基黄酮组合处理对TrkB F616A小鼠中凋亡无效应。KA引发明显的半胱天冬酶-3激活，且1NMPP1的预处理提高了TrkBF616A中KA引发的凋亡。7，8-二羟基黄酮抑制KA引发的凋亡，而1NMPP1预处理取消了7，8-二羟基黄酮在F616A小鼠中的保护效应。
实施例8：7，8-二羟基黄酮显示了抗抑郁效应。
已经显示BDNF在调节抗抑郁药的治疗效应中起重要作用(Castren，Curr.Opin.Pharmacol.，4：58-64，2004；Duman，Biol.Psychiatry，56：140-5，2004；Groves，Mol.Psychiatry，12：1079-88，2007；Monteggia等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，101：10827-32，2004；Saarelainen等，J.Steroid Biochem.Mol.Biol，78：231-9，2003)。此外，已经显示将外源BDNF注入海马或脑干中具有抗抑郁样行为效应(Shirayama等，J.Neurosci.，22：3251-61，2002；Siuciak等，Pharmacol.Biochem.Behav.，56：131-7，1997)。为了探索7，8-二羟基黄酮是否具有BDNF样抗抑郁效应，进行强迫游泳试验。将无预游泳的成年雄性小鼠(2-3月龄，n＝8)随机进行6分钟的强迫游泳试验，在最后4分钟内记录不动。将小鼠腹膜内注射盐水、丙咪嗪(20mg/kg)、阿米替林(15mg/kg)或7，8-二羟基黄酮(5mg/kg)持续5天。使小鼠适应试验室2天，且在24℃将小鼠放置在直径16cm半填充清澈的水的透明玻璃圆柱体中。14cm的水深使得小鼠不能到达圆柱体底部，且在每只小鼠之后换水。如图25所示，当用丙咪嗪或阿米替林处理小鼠时，游泳不动减少。另外，7，8-二羟基黄酮也减少了不动。数据被表示为平均值±SEM；*相对媒介物p＜0.05，** 相对媒介物P＜0.01和***相对媒介物P＜0.0001，学生t检验。
实施例9：2-(4-二甲基氨基)苯基)-7，8-二羟基黄酮·HBr的合成
用Varian 300光谱仪(Varian，Inc.；Palo Alto，CA)记录1H和13C NMR谱。NMR化学位移被报告为d值(百万分率，ppm)。在Bruker Equinox 55FTIR分光光度计(Bruker OpticsInc.；Billerica，MA)上记录红外光谱。以cm-1报告IR峰。用Barnstead ElectrothermalMelTemp仪器(Thermo Fisher Scientific Inc.；Waltham，MA)获得熔点。在AppliedBiosystems 4000QTrap光谱仪(Applied Biosystems Inc，；Foster City，CA)上记录ESI-MS谱。没食子苯乙酮3′，4′-二甲醚(1)和4-二甲基氨基苯甲酰氯(2)购自Sigma Aldrich(Sigma-Aldrich Corp.；St.Louis，MO)。所有其它试剂和溶剂购自商业源并通过标准过程纯化。所有反应在干燥N2气氛下在火焰烘干(flame-dried)的玻璃器皿中进行。
使用上面方案1的变化方案，如下合成2-(4-二甲基氨基)苯基)-7，8-二羟基黄酮·HBr：
首先，如下合成6-乙酰基-2，3-二甲氧基苯基4-(二甲基氨基)苯甲酸酯(3)：向没食子苯乙酮3′，4′-二甲醚(1)(5.83g，29.72mmol)在干燥吡啶(25mL)中的溶液经15分钟分三份加入(4-二甲基氨基)苯甲酰氯(2)(8.19g，44.58mmol)。将混合物在室温搅拌2小时。将反应用2M HCl酸化并用乙酸乙酯萃取。将合并的有机物用盐水洗涤，用MgSO4干燥，并在减压下浓 缩。将粗产物通过快速色谱法(10％EtOAc/己烷)纯化以得到8.45g(83％)的白色晶体3：mp 102-106℃ IR(纯)2990，2966，2890，2823，1685，1603，1268，1187cm-1；1H(CDCl3)δ8.10(d，J＝9Hz，2H)，7.68(d，J＝9Hz，1H)，6.87(d，J＝9Hz，1H)，6.72(d，J＝9Hz，2H)，3.93(s，3H)，3.80(s，3H)，3.08(s，6H)，2.49(s，3H)；13C(CDCl3)196.5，165.0，157.4，154.1，145.3，141.7，132.5，125.8，125.6，115.6，111.1，109.2，61.1，56.4，40.3，30.6；ESI-MS m/z 344.11[(M+H)+].
然后如下合成1-(4-(二甲基氨基)苯基)-3-(2-羟基-3，4-二甲氧基苯基)丙烷-1，3-二酮(4)：将包含6-乙酰基-2，3-二甲氧基苯基4-(二甲基氨基)苯甲酸酯3(8.45g，24.6mmol)，无水氢氧化钾粉末(2.08g，36.9mmol)和吡啶(50mL)的溶液在50℃加热2小时。将反应冷却至室温，用2M HCl酸化，用乙酸乙酯萃取，用盐水洗涤，用MgSO4干燥，并在减压下蒸发以得到7.59g(90％)的粗丙二酮4。粗反应混合不经进一步纯化进行下一步。1H(CDCl3)δ7.84(d，J＝9Hz，2H)，7.53(d，J＝9Hz，1H)，6.70(d，J＝9Hz，2H)，6.51(d，J＝9Hz，1H)，4.5(s，2H)，3.93(s，3H)，3.91(s，3H)，3.08(s，6H).
随后如下合成2-(4-(二甲基氨基)苯基)-7，8-二甲氧基-4H-色-4-酮(5)：将1-(4-(二甲基氨基)苯基)-3-(2-羟基-3，4-二甲氧基苯基)丙烷-1，3-二酮(4)(11.5g，33.4mmol)在冰乙酸(100mL)和浓硫酸(1mL)中的溶液回流1小时。然后将反应混合倒入冰中并用乙酸乙酯萃取。将合并的有机物用盐水洗涤，用MgSO4干燥，并在减压下浓缩以得到深色固体。快速柱色谱(30％EtOAc/己烷)产生黄棕色固体6.41g(60％)。IR(纯)2567，2176，2018，1966，1951，1598，1383，1116cm-1；1H(CDCl3)δ7.95(d，J＝9Hz，1H)，7.85(d，J＝9Hz，2H)，7.01(d，J＝9Hz，1H)，6.78(d，J＝9Hz，2H)，6.65(s，1H)，4.04(s，3H)，3.99(s，3H)，3.08(s，6H)；13C(CDCl3)d 178.1，156.5，153.0，127.9，121.0，111.9，109.8，104.0，63.7，57.2，40.3；ESI-MS m/z 326.2[(M+H)+].
然后如下合成4′-二甲基氨基-7，8-二羟基黄酮(6)(也见图26中结构1)：将2-(4-(二甲基氨基)苯基)-7，8-二甲氧基-4H-色-4-酮(5)(0.462g，1.42mmol)在氢溴酸水溶液(48％，10mL)中的溶液回流过夜。冷却之后，将反应混合用水稀释，用饱和NaHCCO3中和，并用1-丁醇萃取。将有机相用水 洗涤，用MgSO4干燥并在减压下蒸发。从50％甲醇/二氯甲烷重结晶得到0.221g(52％)的深红色固体结晶6：mp 242-245℃；IR(纯)3371，3200，2590，2171，1966，1619，1566，1480，1300cm-1；1H NMR(DMSO-d6)δ7.97(d，J＝9Hz，2H)，7.35(d，J＝9Hz，1H)，6.89(d，J＝9Hz，1H)，6.85(d，J＝9Hz，2H)，6.65(s，1H)，4.10(bs，2H)，3.01(s，6H)；13C(DMSO-d6)δ178，164，151，134，129，119，118，116，114，113，108，103，39.5；ESI-MS：计算分子量：297g；实测：m/z 298.1[(M+H)+].
实施例10：另外的化合物
另外，如下制备并表征以下化合物：
2-(4-氟苯基)-7，8-二羟基喹啉-4(1H)-酮·HBr(见图26中结构2)：1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ10.83(br s，1H)，10.09(br s，1H)，7.92(q，J1＝5.1，J2＝8.12H)，7.70(d，J＝8.7，1H)，7.46(t，J＝8.7，2H)，7.30(d，J＝9，1H)，6.87(s，1H)，MS-ESI：计算值271；实测值：272(M+H)+.C15H10FNO3.0.87HBr.2.4H2O的分析；计算值：C，46.81；H，4.10；N，3.64；Br，18.06；实测值：C，46.75；H，3.80；N，3.26；B r，17.46；m.p＞300.
7，8-二羟基-2-苯基喹啉-4(1H)-酮·HBr(见图26中结构3)：1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ10.71(br s，1H)，7.81(d，J＝7.2，2H)，7.65(d，J＝9.3，1H)，7.57-7.66(m，3H)，7.23(d，J＝9.3，1H)，6.81(s，1H)，MS-ESI(负值)：计算值253；实测值：252(M-1).C15H11NO3.0.8HBr.0.96H2O的分析；计算值：C，53.74；H，4.12；N，4.18；Br，18.90；实测值：C，53.45；H，3.96；N，4.43；Br，19.11；m.p.：269.8-274.2℃.
7，8-二羟基-2-(嘧啶-5-基)-4H-色-4-酮HBr(见图26中结构4)：1H NMR(300MHz，CDCl3)δ10.27(brs，1H)，9.65(brs，1H)，9.52(s，2H)，9.32(s，1H)，7.39(d，J＝8.7，1H)，7.10(s，1H)，6.94(d，J＝8.7，1H)；计算值256；实测值：257(M+H)+.C13H8N2O4.0.45H2O.0.3HBr的分析；计算值：C，54.10；H，3.21；N，9.71；Br，8.31；实测值：C：54.30；H，3.39；N，9.41；Br，8.37.m.p.＞300℃.
实施例11：4′-二甲基氨基-7，8-二羟基黄酮显示了对TrkB受体的刺激 效应。
为了比较由实施例9和10的合成化合物的TrkB激活(见图26)，制备原代皮质培养物。将皮质神经元用500nM的各种化合物处理30min并收集细胞裂解产物。免疫印迹分析(p-TrkB Y817抗体(1∶20,000-40,000稀释))显示如阳性对照BDNF和7，8-二羟基黄酮(“7，8-DHF”)，4′-二甲基氨基-7，8-二羟基黄酮(“4′-DMA-7，8-DHF”)(参见图26的结构1)和7，8-二羟基-2(嘧啶-5-基)-4H-色-4-酮(见图26的结构4)强烈地引发TrkB激活，而2-(4-氟-苯基)-7，8-二羟基喹啉-4(1H)-酮(见图26的结构2)和7，8-二羟基-2-苯基喹啉-4(1H)-酮(见图26的结构3)不引发相同水平的TrkB激活(图27，左图)。这些数据表明中间C环中的O原子增加了7，8-DHF的激动剂效应。用氢键供体NH代替氢键受体O原子减小其刺激效应。滴定测定表明在低至10nM的浓度4′-DMA-7，8-DHF引发TrkB激活，且随着药物浓度升高TrkB活性逐渐增加(见图27，右图)。对比之下，7，8-DHF以100nM的最小浓度引发TrkB激活(图27，右图)。
为了比较对小鼠脑中TrkB受体的刺激效应，将1mg/kg的这些化合物注射进入C57BL/6J小鼠并在不同的时间点监测TrkB激活(见图28)。4′-DMA-7，8-DHF在1h时引起TrkB激活且TrkB的活性随时间逐渐增强，并在8h时到峰值，且在16h时部分地消失。相反，7，8-DHF在口腔注射之后2h引发TrkB激活，并在4h达峰值，且TrkB活性逐渐消失。即使在16hTrkB活性是可证明的(图28)。如显示，4′-DMA-7，8-DHF比7，8-DHF具有对TrkB更强的(即，约10倍高)激动剂效应，且其激动剂效应也在动物中持续较长。
实施例12：4′-二甲基氨基-7，8-二羟基黄酮具有强的抗凋亡活性。
为了定量比较7，8-DHF和4′-DMA-7，8-DHF的抗凋亡活性，自E16大鼠胚胎细胞制备皮质神经元并用各种指定浓度的4′-DMA-7，8-DHF和7，8-DHF预处理30min，随后50μM谷氨酸预处理16小时。用活性半胱天冬酶-3ELISA将细胞裂解物定量分析。谷氨酸引发的半胱天冬酶-3激活基本上被50nM或更高浓度的两种化合物阻断。然而，在10nM，4′-DMA-7，8-DHF显示了比7，8-DHF更强的抑制效应(图29A&29B)。这 些结果符合4′-DMA-7，8-DHF和7，8-DHF的TrkB受体激活情况。
为了研究这些化合物是否在动物中发挥任何神经保护效应，进行时程测定。将两种化合物口腔注射1mg/kg进入C57BL/6J小鼠，随后腹膜内施用卡英酸(KA)(20mg/kg)持续2h。小鼠脑裂解物的免疫印迹显示KA-诱发的神经元凋亡随时间消逝逐渐减少，其与4′-DMA-7，8-DHF激活TrkB负相关(图30，左图)。但是，KA-诱导的半胱天冬酶-3激活在4h时被7，8-DHF减少，且活性半胱天冬酶在8h时稍微增加。这一动力学谱图紧密匹配7，8-DHF的TrkB激活状态(图30，右图)。
为了探索这些小分子的神经保护效应是否依赖于体内TrkB激活，使用TrkB F616A敲入小鼠。TrkB F616A可以被TrkB F616A抑制剂1NMPP1选择性阻断，产生有效的无TrkB表型(Chen X，等，Neuron 46(1)：13-21，2005)。因为1NMPP1选择性抑制7，8-DHF的TrkB F616A激活，预期1NMPP1在TrkB F616A突变体敲入小鼠中阻断TrkB F616A信号传导将使得神经元易受KA-引发的神经元细胞死亡。KA引起显著的半胱天冬酶-3激活，其被4′-DMA-7，8-DHF和7，8-DHF预处理明显地减少。1NMPP1预处理取消了F616A小鼠中4′-DMA-7，8-DHF和7，8-DHF的神经保护效应(图31，上图)。因此，4′-DMA-7，8-DHF和7，8-DHF的TrkB磷酸化被1NMPP1预处理显著地阻断(图31，第2图)。所以，这些数据显示4′-DMA-7，8-DHF和7，8-DHF选择性激活TrkB受体，并增强小鼠中神经元存活。
实施例13：4′-二甲基氨基-7，8-二羟基黄酮促进神经发生。
为了试验4′-二甲基氨基-7，8-二羟基黄酮增加的TrkB激活是否会提高神经发生，将成年雄性C57BL/6J小鼠每天注射媒介物、7，8-DHF或4′-DMA-7，8-DHF(5mg/kg)持续21天。在处理的末期(第21天)，将动物注射BrdU(50mg/kg，腹膜内)以标记分裂细胞，并将动物在2小时后处死。免疫组织化学(抗BrdU和DAPI)被用于评估祖细胞增殖(图32和33)。观察到与媒介物对照相比，长期(21天)的TrkB激动剂处理显著地增加神经发生。这些结果表明TrkB激动剂促进小鼠海马中的神经发生。
实施例14：4′-二甲基氨基-7，8-二羟基黄酮和7，8-二羟基黄酮以TrkB 依赖性方式显示抗抑郁效应。
为了探索4′-DMA-7，8-DHF和7，8-DHF是否具有任何抗抑郁效应，在经口腔注射长期处理雄性C57BL/6J小鼠(8只小鼠/组)持续21天之后进行强迫游泳试验(6分钟，在最后4分钟内记录不动)。当将小鼠用7，8-DHF(5mg/kg)处理时，游泳不动被显著地减少。有趣地，4′-DMA-7，8-DHF(5mg/kg)也明显地减少了不动(图34)，表明7，8-DHF和4′-DMA-7，8-DHF模仿BDNF并发挥了强力的抗抑郁效应。使用来自强迫游泳试验小鼠的脑裂解物的免疫印迹分析(抗-p-TrkA 794和抗-p-TrkB 817)显示两种化合物都引发小鼠脑中TrkB激活但不引发TrkA激活(图35)。
为了评估7，8-DHF及其衍生物的行为反应是否由TrkB受体介导，使用TrkB F616A敲入小鼠。使转基因小鼠分别经受盐水或1NMPP1(25μM)预处理(在药物注射前一天提供饮用水并在整个实验维持)。提供对照物和/或药物持续五天。在盐水和1NMPP1处理的对照组中未观察到不动时间的显著差异。在盐水组，7，8-DHF和4′-DMA-7，8-DHF大量地减少不动时间；相反，4′-DMA-7，8-DHF和7，8-DHF在1NMPP1处理之后都对不动时间无任何显著效应(图36)，显示TrkB信号传导级联的抑制阻断TrkB激动剂的抗抑郁效应。这些数据表明4′-DMA-7，8-DHF和7，8-DHF模拟BDNF并通过激活TrkB受体在小鼠中用作强效的抗抑郁药。(图34、35和36中提供的数据为平均值±SEM；*相对媒介物p＜0.05，**相对媒介物P＜0.01和***相对媒介物P＜0.0001，学生t试验)。
实施例15：4′-二甲基氨基-7，8-二羟基黄酮和7，8-二羟基黄酮毒性
为了探索4′-二甲基氨基-7，8-二羟基黄酮和7，8-二羟基黄酮是否具有任何不耐受的毒性，分析来自用两种化合物以5mg/kg/天处理3周的小鼠的主要器官。在药物处理的小鼠中未检测到可观察的不良病理变化。另外，全血细胞计数(CBC)分析显示在药物处理的小鼠和对照盐水处理的小鼠之间不存在显著差异。这些数据显示对于小鼠以5mg/kg/天剂量持续3周的长期处理，两种化合物都是无毒性的。
所附权利要求的化合物和方法不限于本文描述的具体的化合物和方法的范围，本文描述的具体的化合物和方法意欲作为权利要求的一些方面 的示例说明且功能上等同的任何化合物和方法属于本公开内容的范围。除了本文显示和描述的那些，化合物和方法的各种改良也意欲属于所附权利要求的范围。此外，当仅详细地描述了某些代表性化合物、方法和这些化合物和方法的方面，即使未详细地叙述，其它化合物和方法以及化合物和方法的各种特征的组合意欲属于所附权利要求的范围。因此本文可明确地提到步骤、元素、组分或组成部分的组合；然而，即使未详细地陈述，本文包括步骤、元素、组分和组成部分的所有其它组合。

Claims (2)

1.7,8-二羟基黄酮用于制备在患有抑郁或处于发展抑郁的风险中的受治疗者中治疗抑郁或降低抑郁的风险的药物的用途。
2.4'-二甲基氨基-7,8-二羟基黄酮或其药学上可接受的盐用于制备在患有抑郁或处于发展抑郁的风险中的受治疗者中治疗抑郁或降低抑郁的风险的药物的用途。
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