CN103054850A - 松属素在制备治疗神经退行性疾病药物中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种松属素(Pinocembrin，PCB，中译名匹诺塞林)在制备预防和治疗神经退行性疾病药物中的用途，属于医药领域。经过广泛的研究，在筛选抗氧化损伤的药物中我们发现松属素具有神经保护作用。具体研究发现松属素对由阿尔茨海默病beta-淀粉样蛋白（Aβ）和1-甲基-4-苯基吡啶（MPP+）诱导的帕金森病模型具有神经保护作用。因此，可将松属素用于制备预防和治疗神经退行性疾病的药物。以松属素为活性成分的药物在临床上将会有显著疗效，从而产生巨大的社会效益和经济效益。
Description
技术领域
本发明涉及一种药物，具体说是松属素在制备治疗神经退行性疾病药物中的用途。
背景技术
神经退行性疾病(Neurodegenerative diseases)是一组以原发性神经元变性为基础的慢性进行性神经系统疾病。该类疾病主要包括阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)、帕金森病(Parkinson’s disease, PD)、Huntington舞蹈病(Huntington’s disease, HD)、不同类型脊髓小脑共济失调(Spinal cerebellar ataxias)、肌萎缩侧索硬化症(Amyotrophic lateral sclerosis,ALS)及脊髓肌萎缩症(Spinalmuscular atrophy)等。导致神经元变性的因素主要包括线粒体功能不良、自由基和氧化应激反应、谷氨酸兴奋毒性和炎症。氧化应激损伤（Oxidative stress,OS）和线粒体功能障碍在神经退行性疾病的发病机制及其神经元死亡中发挥重要作用。因此，针对能抑制氧化应激损伤和线粒体功能障碍的治疗可能成为防治神经退行性疾病的有效途径。随着我国老龄化社会的到来，探索预防和治疗神经退行性疾病的有效措施刻不容缓，且具有重要的医学和社会意义。
松属素(Pinocembrin，中译名匹诺塞林) ，即5，7 -二羟基黄酮，是一种广泛存在于蜂胶内的黄酮类化合物。前人研究表明，松属素具有广泛的药理学活性，包括抗菌、抗病毒、抗氧化、抗炎等方面的作用。近年来松属素具有广泛的神经保护作用引起了广大研究者的注意，松属素可以减少谷氨酸引起的SH-SY5Y的损伤[Eur J Pharmacol 2008; 591: 73-79]和葡萄糖剥夺/再充氧(OGD/R)引起的原代培养的皮层神经元损伤[Brain Res 2008; 1216: 104-115]。松属素减轻大鼠脑缺血性损伤的发生。松属素通过改善血流灌注不足引起的大脑线粒体结构和功能障碍，从而改善大鼠的认知功能[Eur J Pharmacol 2006; 542: 77-83]。另外，松属素也可以减轻大鼠全脑缺血/再灌注损伤[Life Sci; 88: 521-528]以及血脑屏障的损伤[Brain Res; 1391: 93-101]，进而发挥其神经保护作用。
松属素分子结构式
发明内容
本发明的目的在于提供松属素在制备治疗神经退行性疾病药物中的应用。
本发明要解决的另一个技术问题是提供一种防治神经退行性疾病的药物组合物。
本发明技术方案如下：
松属素在制备治疗神经退行性疾病药物中的用途。
一种防治神经退行性疾病的药物或药物组合物，后者有活性成分松属素(匹诺塞林)和药学接受的辅料组成。
所述药学接受的辅料组成为药学上可接受的稀释剂、防腐剂、溶剂、乳化剂、佐剂/或载体。
所述防治神经退行性疾病的药物或药物组合物是注射剂、口服制剂、经肺、鼻剂、经穴位、经肌肉或静脉给药的剂型。
所述口服制剂是胶囊、片剂、丸剂、锭剂、颗粒剂、脂质体。
本发明中的松属素(匹诺塞林) 购自Sigma-Aldrich Inc（Cat No.P5239），纯度达95% (TLC)。
本发明的优点在于：本发明经过广泛的研究，在筛选抗氧化损伤的药物中我们发现松属素具有神经保护作用。具体研究发现松属素对由阿尔茨海默病beta-淀粉样蛋白（Aβ）和1-甲基-4-苯基吡啶（MPP+）诱导的帕金森病模型具有神经保护作用。因此，可将松属素用于制备预防和治疗神经退行性疾病的药物。以松属素为活性成分的药物在临床上可能会有显著疗效，从而产生巨大的社会效益和经济效益。
下面结合具体实施方式对本发明做进一步说明，并非对本发明的限定，依照本领域公知的现有技术，本发明的实施方式并不限于此，因此凡依照本公开内容所做的本领域的等同替代，均属本发明的保护范围。
附图说明
图1是松属素(PCB)显著改善由Aβ损伤而导致的SH-SY5Y细胞数量减少的细胞活力柱形图；
图2是松属素(PCB)显著改善Aβ损伤导致的SH-SY5Y细胞内ROS的过度产生不同处理荧光强度柱形图；
图3是松属素(PCB)显著改善Aβ损伤导致的SH-SY5Y凋亡发生的细胞核计数图；
图4是松属素(PCB)上调Bcl-2，下调Bax蛋白表达水平的免疫印迹图；
图5是松属素(PCB)显著抑制Aβ损伤导致的caspase-3的活化的免疫印迹图；
图6是松属素(PCB)显著改善MPP+诱导的SH-SY5Y细胞数量减少的细胞活力柱形图；
图7是松属素(PCB)显著改善MPP+ 损伤诱导的SH-SY5Y凋亡发生的细胞核计数图；
图8是松属素(PCB)显著改善MPP+损伤诱导的SH-SY5Y细胞内ROS的过度产生不同处理荧光强度柱形图。
以上图表中数以均值±标准误表示，*表示与正常对照组相比*P<0.05; **表示与正常对照组相比**P<0.01；#表示与Aβ或MPP+损伤组相比 #P<0.05；##表示与Aβ或MPP+损伤组相比##P<0.01。
具体实施方式
下面结合附图对本发明进一步说明。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。
实施例1：松属素 (Pinocembrin，PCB) 抑制beta-淀粉样蛋白（Aβ）引起的损伤的细胞水平研究。
一．材料
松属素(匹诺塞林) （Cat No.P5239）和MTT (#M5655)购自Sigma-Aldrich Inc; Aβ购自GL Biochem Ltd; H2DCF-DA (#D-399) 购自Invitrogen; DAPI购自Roche Diagnostics GmbH。
二．方法
1. 细胞活力MTT检测
采用MTT法检测松属素(匹诺塞林)对Aβ诱导的SH-SY5Y细胞损伤的作用。实验分组如下：
MTT是一种四甲基偶氮哩盐，在活细胞线粒体玻拍酸脱氢酶的作用下被还原成蓝色甲攒颗粒，其形成量与活细胞数和线粒体玻拍酸脱氢酶的活性呈正相关。SH-SY5Y细胞以1x104个/孔密度接种于96孔板中，100 μ1/孔。于37℃, 5%CO2孵箱中培养过夜。12小时后，吸弃上清液。96孔板中处理好的细胞，每孔加入20 μL (5mg/ml) MTT，37℃孵育4 h，并加入150 μL DMSO，振荡8 min，待紫色结晶充分溶解后, 置酶标仪上测各孔光吸收值(OD)。然后以OD值求细胞存活率。
2. 细胞凋亡检测: Hoechst染色
吸去细胞培养基，用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗细胞2次；4%多聚甲醛室温固定10min，移去固定液，用PBS冲洗细胞2次；将细胞于5mg/L的Hoechst 33258标记液中室温染色10min；吸去标记液，用PBS冲洗2次，晾干后在倒置荧光显微镜下紫外光激发观察形态学变化，并随机拍照。
3. 细胞内活性氧（ROS）测定
2',7'-二氯荧光黄双乙酸酯（H2DCF-DA）为新一代ROS捕获剂，可以迅速通过细胞膜进入细胞，在洗白内酯酶作用下脱去二酯，生成不发光的2, 7-二氢二氯荧光黄(DCFH)，当细胞内存在H2O2、O2-、OH-等ROS时，即被氧化成发荧光的2',7'-二氯双荧光素(2',7'-dichlorofluorescein diacetate，DCF) ，通过流式细胞仪或荧光酶标仪测定细胞内DCF的荧光强度，即可对单个细胞为基础的细胞内ROS 进行原位实时检测。从而根据荧光强度直接反应细胞内自由基的变化程度。用荧光探针H2DCF-DA染色法检测细胞内ROS。H2DCF-DA溶于二甲基亚砜(DMSO)中，-20℃避光保存。染色前用培养基稀释为工作液浓度。即处理好的细胞加载荧光探针H2DCF-DA ，37℃孵育15 min。PBS洗三次细胞，用荧光酶标仪检测。
4. Western Blot免疫印迹
配制10%的Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺胶；胶放入电泳槽加满Tris-甘氨酸电泳缓冲液，样品孔中加入样品，电压积层胶8伏/厘米（40-60伏），分离胶18伏/厘米（100伏），当溴酚蓝到达胶底部时停止；取出胶板，取出分离胶，把胶放入转移缓冲液中平衡10分钟；裁取相当胶大小的硝酸纤维素膜，放入转移缓冲液平衡10分钟。转膜，电压100伏，持续1小时；封闭，放入含5%脱脂奶粉的三羟甲基氨基甲烷缓冲盐(TBS)中平衡2小时；在膜上滴加一抗（1:4000），室温，翻转摇床上作用2小时，然后移至4oC冰箱中过夜；TBST漂洗三次，每次15分钟；在膜上滴加抗兔辣根过氧化物酶-IgG二抗（1:5000），室温，翻转摇床上作用1小时；TBST(三羟甲基氨基甲烷缓冲盐吐温)漂洗三次，每次15分钟；ECL荧光显影液加膜上反应，暗室内膜正面朝下盖于X线胶片上，分别曝光，胶片显影，定影。
三．结果
1.松属素(PCB) 抑制Aβ诱导的SH-SY5Y 细胞损伤（见说明书附图1）。
PCB预处理1.5h后，25 μM Aβ处理细胞24h，细胞活力检测显示Aβ明显降低细胞活力(**P<0.01)，PCB (10和20 μM)预处理组，可以明显抑制Aβ诱导的细胞毒性(##P<0.01)。
2.松属素(PCB)抑制Aβ诱导的细内ROS的产生(图2)。
Aβ诱导的神经元损伤和死亡的机制中有氧化应激机制的参与。用荧光探针2',7'-二氯荧光素二乙酸酯(H2DCF-DA)来检测细胞内活性氧簇ROS的聚集。H2DCF-DA进入细胞后使细胞内的过氧化物、氢过氧化物等氧化分解为Dichlorofluorescein (DCF)而产生荧光，其荧光强度与活性氧的浓度呈线性关系。与对照组相比，25 μM Aβ处理的SH-SY5Y 细胞组，其荧光强度明显增高(**P<0.01)，而PCB预处理可以剂量依赖性降低Aβ引起的细胞内ROS的产生 ( ##P<0.01 )。结果表明，PCB可以抑制Aβ处理的诱导的细胞内ROS的产生。
3.松属素(PCB)阻止Aβ诱导的细胞凋亡的发生。
Aβ处理细胞后，Hoechst 33258 染色来分析细胞核形态的改变。 如图3A-D所示, 图3A是对照组，SH-SY5Y 细胞的细胞核呈现规则的和卵圆形的形状，而Aβ处理24 h后，细胞核显示出核固缩和碎裂的细胞明显增加(**P<0.01)，如图3B。与Aβ单独处理组相比，10 μM PCB预处理可以明显降低凋亡细胞发生的比例(##P<0.01)，如图3C。
4.松属素(PCB)上调Bcl-2/Bax 的表达水平比例(图4)。
凋亡的效应严格受凋亡负调控蛋白（Bcl-2）和凋亡正调控蛋白（Bax）的调控。因此，我们接下来分析PCB对Aβ引起的Bcl-2/Bax表达改变的影响。如图4所示, Aβ引起Bax蛋白的表达升高和Bcl-2蛋白的表达降低，即Aβ引起导致Bcl-2/Bax蛋白的比例的降低(**P<0.01)。而PCB 预处理可以剂量依赖性抑制Aβ引起的Bcl-2/Bax蛋白的比例的降低。结果表明，PCB 可以抑制Aβ的诱导的Bcl-2/Bax的降低(##P<0.01)。总之，结果表明PCB 可以抑制Aβ引起的细胞凋亡。
5.松属素(PCB)显著抑制Aβ损伤导致的caspase-3的活化 (图 5)。
细胞凋亡蛋白半胱天冬酶-3 (Caspase-3) 在因各种刺激引起的凋亡发生的启动中发挥重要作用。Caspase-3激活导致DNA断裂、核染色质固缩和细胞凋亡的发生。因此，我们用活化Caspase-3特异的抗体进行免疫印迹检测，观察Caspase-3的激活情况。如图5A所示, Aβ处理24 h后，剪切活化的caspase-3 的量显著增加(*P<0.05)，PCB预处理可以剂量依赖性降低Aβ引起的caspase-3 的激活(#P<0.05)，这就进一步印证了PCB具有抗Aβ引起凋亡的活性。
实施例2：松属素(匹诺塞林) (Pinocembrin，PCB) 抑制MPP+引起的损伤
一．材料
松属素(匹诺塞林) （Cat No.P5239）购自Sigma-Aldrich Inc；
噻唑蓝(MTT ) 和1-甲基-4-苯基吡啶（MPP+）购自Sigma-Aldrich Inc
二．方法
1.细胞活力MTT检测
采用MTT法检测松属素(匹诺塞林)对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞损伤的作用。具体方法见实施例1中方法。
Pinocembrin (PCB)抑制Aβ损伤的实验分5组，如下：
2. 细胞凋亡检测: Hoechst染色测定方法同实施例1种的方法
3.细胞内活性氧（ROS）测定方法同实施例1种的方法
三．结果
1.松属素(PCB)抑制MPP+诱导的SH-SY5Y 细胞损伤（见说明书附图6）。
细胞活力检测显示，与对照组相比，MPP+明显降低细胞活力（P<0.01），PCB (1-20 μM)预处理2h后，1mM MPP+处理细胞24h，MTT法检测细胞活力。 图6所示, 与单独MPP+处理组相比较，PCB (10和20 μM)预处理组可以明显抑制MPP+诱导的细胞毒性（#P<0.05，##P<0.01）。
2.松属素(PCB)抑制MPP+诱导的SH-SY5Y 细胞凋亡（见说明书附图7）。
对照组SH-SY5Y 细胞的细胞核呈现规则的和卵圆形的形状，MPP+处理24 h后，细胞核显示出核固缩和碎裂的细胞明显增加(**P<0.01)。与MPP+单独处理组相比，PCB 20 μM 预处理可以明显降低凋亡细胞发生的比例(##P<0.01)。
3.松属素(PCB)抑制MPP+诱导的细内ROS的产生（见说明书附图8）。
与对照组相比，MPP+处理的SH-SY5Y 细胞组，其荧光强度明显增高( **P<0.01)，而PCB预处理可以剂量依赖性降低MPP+引起的细胞内ROS的产生 ( ##P<0.01 )。结果表明，PCB可以抑制MPP+诱导的SH-SY5Y 细胞内ROS的产生。
Claims (5)
1.松属素在制备预防和治疗神经退行性疾病药物中的用途。
2.一种防治神经退行性疾病的药物或药物组合物，其特征在于：由活性成分松属素和药学接受的辅料组成。
3.根据权利要求2所述的一种防治神经退行性疾病的药物或药物组合物，其特征在于：所述药学上可接受的辅料为药学上可接受的稀释剂、防腐剂、溶剂、乳化剂、佐剂/或载体。
4.根据权利要求2所述的一种防治神经退行性疾病的药物或药物组合物，其特征在于：所述药物或药物组合物为注射剂、口服制剂、经肺、鼻剂、经穴位、经肌肉、静脉给药或其他给药剂型。
5.根据权利要求4所述的一种防治神经退行性疾病的药物或药物组合物，其特征在于：所述口服制剂为胶囊、片剂、丸剂、锭剂、颗粒剂、脂质体。
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