CN102050809A - 拮抗cklf1/ccr4相互作用的3-哌嗪基香豆素衍生物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种如通式(I)所示3-哌嗪基香豆素衍生物及其药用盐，其制备方法、含有所述化合物的药物组合物，以及用于预防或治疗与趋化因子CKLF1活性相关疾病的药物和作为CKLF1与CCR4作用的拮抗剂的应用。

Description

拮抗CKLF1/CCR4相互作用的3-哌嗪基香豆素衍生物

技术领域

本发明涉及一种3-哌嗪基香豆素衍生物，其制备方法、在预防或治疗与趋化因子CKLF1活性相关疾病的药物和作为CKLF1与CCR4作用的拮抗剂的应用，属于医药技术领域。

背景技术

趋化因子(chemokine)是指具有趋化作用的细胞因子，属于小分子的分泌蛋白超家族(约8～10KDa，含70～90个氨基酸)。趋化因子的结构相似，绝大多数趋化因子含有4个保守的半胱氨酸，根据其结构中半胱氨酸残基的数量和空间位置，趋化因子被分为四类，分别为CXC、CC、CX3C和XC四个亚家族，，也被称为α、β、γ和δ。

与其它细胞因子相似，趋化因子通过与相应的受体结合而发挥作用。根据结合配体的不同，趋化因子受体可分为四类：CXC趋化因子受体(CXCR)，CC趋化因子受体(CCR)，CX3C趋化因子受体(CX3CR)及XC趋化因子受体(XCR)。趋化因子受体属于G蛋白偶联受体超家族(GPCRs，G-protein coupledreceptors)，胞内区与G蛋白偶联。G蛋白由αβγ三个亚单位组成，βγ亚单位通常形成紧密的二聚体，共同发挥作用。当外环境中不存在趋化因子等激动剂时，G蛋白的三个亚单位呈聚合状态，α亚单位与GDP结合，当趋化因子与受体结合时，GTP取代GDP，与α亚单位结合，同时形成游离的βγ二聚体，分别活化下游效应物。

趋化因子Chemokine-like factor 1(CKLF1)是一个由我国科学家发现的具有我国自主知识产权的趋化因子，在GenBank中的登录号为AF09689c。该趋化因子属于CC趋化因子家族。CKLF1由99个氨基酸组成，其理论分子量为10.9kD。对其功能的研究发现，CKLF1对于淋巴细胞具有广谱的趋化活性；对于小鼠骨骼肌细胞具有促增值作用；能促进人骨造血祖细胞的增值以及克隆的形成。在哮喘病人中该趋化因子表达明显增加，另外，对小鼠电转CKLF1的表达质粒后可以发现肺部具有明显的哮喘样改变，如炎性细胞浸润支气管平滑肌的增生、纤维化以及粘液细胞的大量增生等类似于哮喘等呼吸系统疾病所致的支气管炎性改变，以上均提示趋化因子CKLF1与体内一些免疫系统疾病如哮喘、特异性皮炎以及风湿性关节炎等具有很高的相关性，是该类疾病的重要致病因子。

研究还发现CKLF1是CCR4的功能性配体之一，CCR4优势分布于Th2细胞表面，提示CKLF1对于Th2细胞向支气管的募集具有一定的作用；因此能够阻断CKLF1与其受体CCR4的结合的小分子化合物可以作为抗炎、抗哮喘潜在的先导化合物。相对于传统的临床常用的抗哮喘药物：皮质激素类、β2受体激动剂、胆碱能受体阻断剂以及茶碱类药物等，阻断CKLF1与CCR4受体结合的小分子化合物阻断剂，具有特异性强、副作用小以及可以口服等特点。

近年来，趋化因子及其受体的研究越来越受到重视，已经证明它们在机体发挥重要的生理和病理效应，在炎症、肿瘤、自身免疫病、变态反应、AIDS等疾病中均有趋化因子及其受体的参与。一些重组趋化因子、趋化因子抗体及其拮抗剂已经进入临床研究，成为新的生物治疗热点。鉴于趋化因子在疾病发病过程中的重要作用，日益成为人们研究的热点，同时也成为药物开发的靶点之一。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，提供一种3-哌嗪基香豆素衍生物及其药用盐。

本发明要解决的另一个技术问题是，提供制备本发明化合物的方法。

本发明要解决的又一个技术问题是，提供一种含有一个或多个含有本发明化合物的药物组合物。

本发明要解决的再一个技术问题是，提供本发明化合物在预防或治疗与趋化因子CKLF1活性相关疾病的药物和作为CKLF1与CCR4作用的拮抗剂的应用。

为本发明要解决的技术问题，采用如下技术方案：

(1)本发明提供了通式(I)所示的3-哌嗪基香豆素衍生物及其药用盐，

其中，R₁、R₂独立的选自氢、羟基、-NH₂、硝基、C_1-6直链或支链烷基、C_1-6直链或支链烯基、C_1-6直链或支链烷氧基、C_1-6直链或支链烯氧基、卤代C_1-6直链或支链烷基、卤代C_1-6直链或支链烷氧基、C_1-6直链或支链烷基取代的胺基、C_1-6直链或支链酰氧基、C_1-6酯基、C_1-6酰氨基、磺酰基、磺酰氨基、脲基或硫脲基、-O-(CH₂)_n-R₅、-O-CO-(CH₂)_n-R₅；

并且R₅选自含有0-3个杂原子的取代或未取代脂环或0-3个杂原子的取代或未取代的芳香环；所述的杂原子选自N，O或S；取代基选自C_1-6直链或支链烷基、C_1-6直链或支链烷氧基、羟基、硝基、羧基、卤素；

优选的R₅是五元或六元脂环或芳香环；

更优选的R₅选自取代或未取代的C_3-6环烷基、取代或未取代的苯基、取代或未取代的噻吩基、取代或未取代的呋喃基、取代或未取代的吡咯基、取代或未取代的咪唑基、取代或未取代的吡喃基、取代或未取代的吡啶基、取代或未取代的吗啉基、取代或未取代的哌啶基、取代或未取代的四氢吡咯基、取代或未取代的萘基；取代基选自C_1-6直链或支链烷基、C_1-6直链或支链烷氧基、羟基、硝基、羧基、卤素；

最优选R₅选自是取代或未取代的环己基、取代或未取代的苯基、取代或未取代的噻吩基、取代或未取代的吗啉基、取代或未取代的哌啶基、取代或未取代的四氢吡咯基；取代基选自C_1-4直链或支链烷基、C_1-4直链或支链烷氧基、羟基、硝基、羧基、卤素；

n选自0-6的整数；优选是0-4；更优选是0-3；最优选是0、1、2；

优选的R₁、R₂独立的选自氢、羟基、-NH₂、C_1-3直链或支链烷基、C_1-3直链或支链酰氧基、C_1-3直链或支链烷基取代的胺基；

最优选的R₁、R₂独立的选自H，OH，CH₃，OCH₃，OCH₂CH₃，OCOCH₃，(CH₃)₂N，OCH(CH₂CH₂)₂CHCH₂CH₃，p-OCH₃C₆H₅CH₂O，OCH₂CH₂C₄H₃S，OCH₂CH₂N(CH₂CH₂)₂O，OCH₂CH₂N(CH₂CH₂)₂CH₂，OCH₂CH₂N(CH₂CH₂)，4，5-OCH₂O，

R₁、R₂还可以与相连的环稠合成五元或六元脂环；

R₃选自氢、C_1-6直链或支链烷基；

更优选的R₃选自氢、C_1-3直链或支链烷基；

最优选的R₃选自氢、甲基、乙基。

R₄选自氢、取代或未取代的C_1-6直链或支链烷基，取代或未取代的C_1-6直链或支链烯基、取代或未取代的苯基；取代基选自苯基、C_1-6直链或支链烷基、C_1-6直链或支链烷氧基、卤代C_1-6直链或支链烷基、卤代C_1-6直链或支链烷氧基、卤素、硝基、羟基。

优选的R₄选自氢、取代或未取代的C_1-3直链或支链烷基，取代或未取代的苯基；取代基选自苯基、C_1-3直链或支链烷基、C_1-3直链或支链烷氧基、卤代C_1-3直链或支链烷基、卤代C_1-3直链或支链烷氧基、卤素。

最优选的R₄选自氢、甲基、乙基、丙基、丁基、苯基、苄基、双苯基取代甲基、

苯基或苄基的苯环上的取代基选自三氟甲基、甲氧基、氟原子、氯原子、亚甲二氧基、

(2)根据本发明，优选的通式(I)所示的化合物包括，但不限定于通式(IA)所示化合物及其药用盐：

其中，R选自氢、C_1-6直链或支链烷基、C_1-6直链或支链烯基、-(CH₂)_n-R₅、-CO-(CH₂)_n-R₅；R₅选自取代或未取代的C_3-6环烷基、取代或未取代的苯基、取代或未取代的噻吩基、取代或未取代的呋喃基、取代或未取代的吡咯基、取代或未取代的咪唑基、取代或未取代的吡喃基、取代或未取代的吡啶基、取代或未取代的吗啉基、取代或未取代的哌啶基、取代或未取代的四氢吡咯基、取代或未取代的萘基；取代基选自C_1-6直链或支链烷基、C_1-6直链或支链烷氧基；

n选自0-6的整数

R₃选自C_1-6直链或支链烷基；

R₄选自氢、C_1-6直链或支链烷基。

(3).根据本发明，优选的通式(IA)所示的化合物包括，但不限定于通式(IAa)所示化合物及其药用盐：

其中，R₁₀选自氢、C_1-6支链或直链的烷基；

R₃选自甲基、乙基、丙基或异丙基；

R₄选自氢、甲基、乙基、丙基或异丙基。

(4).根据本发明，优选的通式(IA)所示的化合物包括，但不限定于通式(IAb)所示化合物及其药用盐：

其中，n选自0、1、2、3；R₁₁选自取代或未取代的C_3-6环烷基、取代或未取代的苯基、取代或未取代的噻吩基、取代或未取代的呋喃基、取代或未取代的吡咯基、取代或未取代的咪唑基、取代或未取代的吡喃基、取代或未取代的吡啶基、取代或未取代的吗啉基、取代或未取代的哌啶基、取代或未取代的四氢吡咯基、取代或未取代的萘基；取代基选自羟基、C_1-3直链或支链烷基、C_1-3直链或支链烷氧基；

R₃选自甲基、乙基、丙基或异丙基；

R₄选自氢、甲基、乙基、丙基或异丙基。

(5).根据本发明，优选的通式(I)所示的化合物包括，但不限定于通式(IB)所示化合物及其药用盐：

其中，R₆、R₈独立的选自羟基、C_1-6直链或支链烷基、C_1-6直链或支链烷氧基；

R₃选自C_1-6直链或支链烷基；

R₄选自氢、取代或未取代的C_1-6直链或支链烷基、取代或未取代的苯基；取代基选自苯基、C_1-6直链或支链烷基、C_1-6直链或支链烷氧基、卤代C_1-6直链或支链烷基、卤代C_1-6直链或支链烷氧基、卤素。

(6).根据本发明，优选的通式(IB)所示的化合物包括，但不限定于通式(IBa)所示化合物及其药用盐：

R₃选自甲基、乙基、丙基或异丙基；

R₄选自氢、取代或未取代的C_1-6直链或支链烷基、取代或未取代的苯基、取代或未取代的苄基；取代基选自苯基、C_1-6直链或支链烷基、C_1-6直链或支链烷氧基、卤代C_1-4直链或支链烷基、卤代C_1-4直链或支链烷氧基、卤素。

(7).根据本发明，优选的通式(IBa)所示的化合物包括，但不限定于通式(IBa1)所示化合物及其药用盐：

R₃选自甲基、乙基、丙基或异丙基；

R₄选自氢、取代或未取代的C_1-6直链或支链烷基，取代基选自卤素。

(8).根据本发明，优选的通式(IBa)所示的化合物包括，但不限定于通式(IBa2)所示化合物及其药用盐：

R₃选自甲基、乙基、丙基或异丙基；

R₁₀选自取代基选自C_1-6直链或支链烷基、C_1-6直链或支链烷氧基、卤代C_1-4直链或支链烷基、卤代C_1-4直链或支链烷氧基、卤素。

(9).根据本发明，优选的通式(IBa)所示的化合物包括，但不限定于通式(IBa3)所示化合物及其药用盐

R₃选自甲基、乙基、丙基或异丙基；

R₁₁选自取代基选自C_1-6直链或支链烷基、C_1-6直链或支链烷氧基、卤代C_1-4直链或支链烷基、卤代C_1-4直链或支链烷氧基、卤素。

根据本发明，优选的通式(IB)所示的化合物包括，但不限定于通式(IBb)所示化合物及其药用盐：

其中，R₃选自甲基、乙基、丙基或异丙基；

R₄选自氢、C_1-6直链或支链烷基、C_1-6直链或支链烷氧基；

R₈选自C_1-3直链或支链烷基、C_1-3直链或支链烷氧基、。

根据本发明，优选的通式(IB)所示的化合物包括，但不限定于通式(IBc)所示化合物及其药用盐：

(IBc)

其中，R₃选自C_1-3直链或支链烷基；

R₄选自氢、C_1-3直链或支链烷基、C_1-3直链或支链烷氧基；

R₁₄和R₁₅独立的选自C_1-3直链或支链烷基。

根据本发明，优选的通式(IB)所示的化合物包括，但不限定于通式(IBd)所示化合物及其药用盐：

其中，R₃选自C_1-3直链或支链烷基；

R₄选自氢、C_1-3直链或支链烷基、C_1-3直链或支链烷氧基；

R₁₄和R₁₅独立的选自C_1-3直链或支链烷基。

(10).根据本发明，优选的通式(I)所示的化合物包括，但不限定于通式(IC)所示化合物及其药用盐：

其中，R₃选自C_1-3直链或支链烷基；

R₄选自氢、C_1-6直链或支链烷基、C_1-6直链或支链烷氧基；

R’、R”独立的选自氢，C_1-6直链或支链烷基。

(11).根据本发明，优选的通式(I)所示的化合物包括，但不限定于通式(ID)所示化合物及其药用盐：

其中，n为1～6的整数；

R₃选自C_1-3直链或支链烷基；

R₄选自氢、C_1-6直链或支链烷基、C_1-6直链或支链烷氧基。

在本发明中，C_1-6直链或支链烷基选自甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、新丁基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、1-乙基丁基、2-乙基丁基、戊基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基或己基；

C_1-6直链或支链烷氧基选自甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、新丁氧基、1-甲基丁氧基、2-甲基丁氧基、3-甲基丁氧基、1-乙基丁氧基、2-乙基丁氧基、戊氧基、1-甲基戊氧基、2-甲基戊氧基、3-甲基戊氧基、4-甲基戊氧基；

C_3-6环烷基选自环丙基、环丁基、环戊基、环己基；

卤素选自氟、氯、溴、碘；

含有1～3个杂原子的五元或六元环选自：

在本发明中，烷基是指具有特定碳原子数的直链和支链饱和脂肪烃。包括但是不限于含有1-12个，优选1-6个碳原子的直链或支链的烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基和叔丁基被包括在术语烷基之中

烷氧基是指具有指定碳原子数的烷基-O-基团。

“卤素”或“卤代”是指作为取代基的氟、氯、溴或碘。当卤原子作为取代基的时候，其取代的数目可以是一个、两个或三个。

芳基包括苯基、取代苯基(此处取代苯基包括下述一个、两个或三个基团：C_1-6烷基，C_1-6烷氧基，硝基，氨基或卤素)。

本发明使用的术语“杂环”表示稳定的5-至7-元单环，这些杂环可以是饱和的或不饱和的，并由碳原子和任选自N，O和S的1至4个杂原子组成，其中的氮和硫杂原子可被选择性地氧化，且氮杂原子可被选择性地季铵化，优选6元杂环，例如吡啶、哌啶、吡嗪、哌嗪、吗啉或硫吗啉等

药学可接受盐，是指分子中存在的羧基与钠、钾、锂等碱金属、钙、镁等碱土金属、以及铝等金属或者氨或有机胺形成的碱加成盐、或者分子中的氨基与无机酸或有机酸形成的酸加成盐。在此，无机酸包括硫酸、磷酸、盐酸、氢溴酸、硝酸、亚硫酸、戊酸、甲磺酸、乙磺酸、甲苯磺酸、水杨酸、苯甲酸等，有机酸包括甲酸、乙酸、丙二酸、乳酸、肉桂酸、琥珀酸、草酸、柠檬酸、马来酸、富马酸、苹果酸、扁桃酸、酒石酸、磺酸等。本发明中对于药学可接受盐不加限制。

最优选的化合物包括但不限定于：

本发明还提供了本发明化合物的制备方法：

1.采用N-取代的哌嗪基酰基乙酸乙酯(II)与R₁和/或R₂取代的苯酚反应得到通式(I)所示化合物：

其中，反应催化剂选自三氟化硼乙醚，反应溶剂选自无水甲醇；反应温度优选为回流温度，优选采用HPLC-MS检测反应进程；反应完毕后分离纯化方法优选石油醚和/或二氯甲烷洗涤、硅胶柱层析分化；硅胶柱层析分化时的洗脱液优选为二氯甲烷和甲醇体积比为20～30∶1。

式II的制备方法优选为：用R₃取代的乙酰乙酸乙酯与N位上R₄取代的哌嗪反应，

其中，反应中优选使用无水碳酸钾吸收反应中产生的氯化氢，反应溶剂优选为无水乙腈，反应温度优选为40～60℃。

2.采用N-取代的哌嗪基酰基乙酸乙酯(II)与1，3苯二酚反应生成式III，再将式III的7位羟基反应生成取代的烷氧基得到如通式(IA)所示化合物：

其中，由式II与1，3苯二酚反应生成式III的反应中：反应催化剂选自三氟化硼乙醚，反应溶剂选自无水甲醇；优选利用mitsunobu反应将式III的7位羟基衍生得到式IA，mitsunobu反应的溶剂优选四氢呋喃(THF)，催化剂优选三苯基磷(PPh₃)和偶氮二碳酸二乙酯(DEAD)，反应温度优选为室温，优选采用硅胶柱层析法纯化反应产物。

3.采用哌嗪基酰基乙酸乙酯(式II-1)与1，3，5苯三酚反应生成式III-1，再将III-1的哌嗪基的N位连上取代基团得到如通式(IBa)所示化合物：

其中，式II-1的制备方法同式II，式III-1的制备方法同式III；

由式III-1的哌嗪基上的N位烷基化制备式IBa的反应中：

(1)通过式III-1与卤代烷发生烷基化反应生成取代胺，催化剂优选二异丙基乙基氨，溶剂优选四氢呋喃(THF)；

(2)通过式III-1与醛发生加成-消除反应、再经还原得到取代胺，催化剂优选为三乙酰氧基硼氢化钠。

4.采用N-取代的哌嗪基酰基乙酸乙酯(式II)与1，3，5苯三酚反应生成式III-2，式III-2上的6位、8位羟基发生酯化反应生成如通式(IBc)所示化合物：

其中，式III-2的制备方法同式III；

由式III-2制备通式IBc化合物的反应中，优选式III-2与羧酸或羧酸苷反应，溶剂优选四氢呋喃(THF)。

本领域技术人员可对上述步骤进行变动以提高收率，可根据本领域的基本知识确定合成的路线，如选择反应物，溶剂和温度。这样的改动或变动均在本发明的范围内。还可以通过使用各种常规保护基以避免副反应的发生从而提高收率。这些常规的保护方法可参见例如T.Greene，Protecting Groups inOrganic Synthesis(the Fourth Edition，John Wiley & Sons，Inc.)

本发明还涉及一种含有有效剂量的含有本发明所述的任一化合物和药学上可接受的载体的药物组合物。

本发明提供含有治疗量/有效量的本发明化合物的药物，和一种或多种药学上可接受载体和/或赋形剂的药物组合物。载体包括如盐水，缓冲盐水，葡萄糖，水，甘油，乙醇和它们的混合物，下文更详细地论述。如果需要，该组合物还可以包含较小量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。该组合物可以是液体溶液，悬浮液，乳剂，片剂，丸剂，胶囊，持续释放制剂或粉末。该组合物可以用传统的粘合剂和载体如三羧酸甘油酯配制成栓剂。口服制剂可以包括标准载体如药物品级的甘露糖醇，乳糖，淀粉，硬脂酸镁，糖精钠，纤维素和碳酸镁，等等。视需要制剂而定，配制可以涉及混合，制粒和压缩或溶解成分。在另一个途径中，该组合物可以配制成纳米颗粒。

使用的药物载体可以为，固体或者液体。

载体或赋形剂可以包括本领域已知的时间延迟材料，如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯，还可包括蜡，乙基纤维素，羟丙基甲基纤维素，异丁烯酸甲酯等等。当制剂用于口服时，公认PHOSALPG-50(phospholipid与1，2-丙二醇浓缩，A.Nattermann & Cie.GmbH)中的0.01％吐温80用于其他化合物的可接受的口服制剂的配制，可以适应于本发明各种化合物的配制。

给予本发明化合物时可以使用各式各样的药物形式。以纯粹的化合物或与常规的药用载体混合后给药。可以使用的固体载体可以包括一种或多种物质，该物质也可以作为调味剂、润滑剂、增溶剂、悬浮剂、填充剂、滑舌剂、压缩助剂、粘合剂或片剂一崩解剂或胶囊化材料。它们是以常规方式，例如以类似于配制已知的抗高血压剂、利尿剂方式进行配制的。含有本发明的活性化合物的口服制剂可以包括任何常用的口服剂型，例如片剂、胶囊、面颊剂型、锭剂、糖锭和口服液体、悬浮液或溶液。在粉末中与细分散的活性组分的混合物。在片剂中载体是细分散的固体，它是将活性组分与具有必要的压缩性能的载体以合适的比例混合并压紧成所要的形状和尺寸。所述的粉末和片剂优选包含至多99％的活性成分。

胶囊可以包含活性化合物与惰性填充剂和/或稀释剂例如药学上可以接受的淀粉(例如玉米、马铃薯或木薯淀粉)、糖、人工甜味剂、粉末状纤维素如结晶和微晶纤维素、面粉、明胶等。有用的片剂制剂可以通过常规的压缩、湿造粒或干造粒方法并且利用药学上可接受的稀释剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、表面改性剂(包括表面活性剂)，悬浮剂或稳定剂进行制备，这些剂型包括但是不限于硬脂酸镁、硬脂酸、十二烷基硫酸钠、滑石、糖、乳糖、糊精、淀粉、明胶、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、数甲基纤维素钠、数甲基纤维素钙、聚乙烯咄咯烷酮、藻酸、金合欢胶、黄原胶、柠稼酸钠、复合硅酸盐、碳酸钙、甘氛酸、蔗糖、山梨糖醇、磷酸二钙、硫酸钙、乳酸、高岭土、甘寡糖醇、氛化钠、低熔点的腊和离子交换树脂。优选的表面改性剂包括非离子和阴离子表面改性剂。表面改性剂的代表性。

实例包括但是不限于泊洛沙姆、苯扎氛按、硬脂酸钙、十六～十八醇混合物、cetomacrogol乳化蜡、脱水山梨醇醋、胶体二氧化硅、磷酸醋、十二烷基硫酸钠、硅铝酸镁和三乙醇胺。口服配方可以使用标准的缓释剂或时间释放配方，以便改变活性化合物的吸收。口服配方还由水或果汁中的给药活性成份组成，其中含有适当的增溶剂和必要的乳化剂。

液体载体可以被用于制备溶液、悬浮液、乳液、糖浆和配剂，本发明的活性成份能够溶解或悬浮于药学上可接受的液体载体中，载体例如为水、有机溶剂、药学上可接受的油脂或脂肪的混合物。液体载体可以含有其它合适的药用添加剂，例如增溶剂、乳化剂、缓冲剂、防腐剂、调味剂、悬浮剂、增稠剂、着色剂、粘度调解剂、稳定剂或渗透调解剂。对于口服和非肠道给药的液体载体的实例包括水(特别是含有上述添加剂如纤维素衍生物，尤其是致甲基纤维素钠的溶液)、醇类(包括单羟基醇和多羟基醇，例如二元醇)及其衍生物，以及油脂(例如精炼的可可油和花生油)。对于非肠道给药，载体也可以是油性的醋，例如橄榄油乙酯。无菌液体载体用于无菌液体形式的非肠道给药组合物。用于加压的组合物的液体载体可以是卤化的烃或其它药学上可接受的推进剂。液体的药物组合物(无菌溶液或悬浮液)能够用于例如肌肉内、腹膜内或皮下注射。无菌溶液也可以通过静脉给药。用于口服给药的组合物可以是液体或固体形式。药物组合物是单位剂量形式，例如片剂、胶囊、粉剂、溶液、悬浮液、乳液、颗粒剂或栓剂。在上述形式中，组合物在含有适当量活性成份的单位剂量中可以是再一分开的形式；单位剂量形式可以是包装的组合物，例如包装的粉末、小瓶、含有液体的预填充的针剂或香囊。单位剂量形式例如可以是胶囊或片剂本身，或可以是适当数量的这种包装形式的组合物。所述剂量形式可以含有0.1～100mg或优选2～50mg的本发明化合物，更优选单位剂量形式含有5～25mg的本发明化合物。本发明化合物的口服给药的剂量范围是0.01～100mg/kg，或优选剂量范围为0.1～10mg/kg，所述组合物可以一天给药1～6次，更通常是每天1～4次。

当给药用于治疗或抑制特定疾病或病症时，应该理解有效剂量可以根据使用的特定化合物、给药方式、疾病的状态和严重程度、治疗条件以及与被治疗个体有关的各种物理因素而变化。在治疗应用中，以足以治疗或至少部分改善疾病和其并发症的数量，将本发明化合物提供给已经患病的患者。该合适的数量被定义为“治疗有效量”.在特殊情况下治疗所使用的剂量必须客观地由治病的医生确定，涉及的变化包括患者的特殊状态、体重、年龄以及反应行为。有效给药本发明化合物的口服剂量为约0.1mg/天～1000mg/天，优选为约10mg/天～约600mg/天，更优选开始剂量为约5mg/天，每天剂量逐渐增加到约150mg/天，将所需剂量水平提供给人类.所述剂量可以一次给药或分两次或多次给药。规定的日剂量可以随给药的方式变化。所述剂量能够以任何可用于将活性化合物导入接受者的血液中的方式给药，该方式包括口服、通过植入物、非肠道(包括静脉、腹膜内、关节内和皮下注射)、直肠、鼻内、表皮、眼内(眼滴剂)、阴道和经皮给药。在某些情况下使用化合物直接以气雾剂形式通过空气给药或许是理想的，用于通过鼻或支气管吸入给药时，本发明化合物可以被配制成含水或部分含水的溶液。

本发明化合物可以以非肠道方式给药或以腹腔内方式给药，所述游离碱或其药学上可接受的盐的形式的溶液或悬浮液能够在水中进行配制，并且适当混合以表面活性剂，例如羟丙基纤维素。可以在甘油、液体聚乙二醇及其在油中的混合物中配制分散剂体，在通常的储存和使用条件下，所述制剂含有防腐剂以便抑制微生物的生长。

适合于注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散液，以及用于即时配制注射溶液或分散液的无菌粉末。在所有情况下，所述形式必须是无菌的，并且必须是可流动的，达到了便于注射的程度，而且必须在生产和储存条件下是稳定的，并且针对微生物例如细菌和霉菌的污染作用必须是防腐的。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇或液体聚乙二醇)及其适当的混合物和植物油的溶剂或分散介质。

本发明化合物能够通过使用透皮贴透皮给药，为此公开的目的，透皮给药应该被理解为包括通过身体表面的所有给药，以及透过包括上皮和粘膜组织的身体的内膜进行给药，这种给药方式可以使用本发明化合物或药学上可接受的盐，以洗剂、乳膏、泡沫、补片、悬浮液、溶液和栓剂(直肠和阴道)的形式进行。透皮给药可以通过使用含有活性化合物及对活性化合物惰性的载体的贴完成，它对皮肤是没有毒性的，并且可以通过皮肤系统吸收进入血流来传递药物。载体可以是任何形式，例如乳膏和软膏、糊剂、凝胶和包藏剂。乳膏和软膏可以是黏性液体，或者是水包油或油包水类型的半固体乳液。含有分散在矿物油或亲水矿物油(其中含有活性成份)中的可吸收粉末的糊剂也是可用的。各种包藏剂用于将活性成份释放到血流中，例如履盖含有活性成份(有或没有载体)的储液囊的半透膜或含有活性成份的基质。其它包藏剂是文献公知的。

本发明化合物可以采用常规的检剂直肠或阴道给药，检剂配方可以从传统材料制备，包括椰子油，添加或不添加蜡以改进检剂的熔点，和甘油。也可以使用水溶性检剂，例如各种分子量的聚乙二醇。

本发明包括式A的化合物的前药，本文使用的“前药”是指在体内通过代谢方式(例如水解)可以转化为式A的化合物，各种形式的前药是本领域公知的。

本发明中我们采用配体受体竞争亲和实验方法筛选模型。配体受体竞争亲和实验方法是筛选竞争性拮抗剂的经典方法。实验中我们采用FITC标记的CKLF1的C端27肽(FITC-Acp-ALIYRKLLFNPSGPY QKKPVHEKKEVL，分子量：3699.41，以下简称FITC-C27)作为配体，成功构建了CCR4高表达细胞系，以FITC-C27/CCR4为靶点的高通量筛选方法。

将生长状态良好高表达CCR4的HEK293细胞每孔100ul接种于96孔板(浓度6×10⁴个/ml)，培养48h后加入FITC-C27和待筛选化合物(浓度1×10^-5，1×10^-6，1×10^-7，1×10^-8，1×10^-9，1×10^-10，1×10^-11)共育50min，孵育结束后用PBS洗板洗去未结合的FITC-C27，在荧光酶标仪上读取荧光值(Eex＝490nm，Eem＝530nm)。只以FITC-C27处理的HEK293-CCR4细胞为CKLF1对照组(F_{CKLF1 control})，用以下公式计算化合物对结合的抑制率，并计算IC₅₀。

本发明所述化合物竞争性具有拮抗趋化因子CKLF1与其受体CCR4结合的活性，因而可以用治疗与CKLF1有关的炎症和疾病，例如哮喘、过敏性疾病、遗传性皮炎等。

本发明进一步提供本发明的化合物用作活性物质预防和治疗与CKLF1有关的症状和疾病，如哮喘、过敏性疾病、遗传性皮炎等。

本发明进一步提供治疗哺乳动物，包括人类的以下疾病的方法：哮喘、过敏性疾病、遗传性皮炎等。所述方法包括对感染的哺乳动物使用本发明的有效量的化合物或药物组合物给药。

附图说明

图1为化合物A15对CKLF1诱导的HEK293-CCR4细胞钙瞬变的抑制作用；

图2为化合物A15对C27引起的HEK293-CCR4细胞趋化运动的抑制作用；

图3为化合物A15对角叉菜胶所致的急性胸膜炎模型肺组织HE染色结果；

A：空白组、B：模型组、C：地塞米松组、D：A15(12.5mg/kg)、

E：A15(25mg/kg)、F：A15(50mg/kg)；

图4为化合物A15对CKLF1高表达所致实验动物哮喘模型肺组织病理切片结果；

图5为化合物A15对CKLF1高表达所致实验动物哮喘模型肺组织p-IκB表达的影响(#P＜0.05，Vs空白组；*P＜0.05，**P＜0.01 Vs模型组)；

图6为化合物A15对CKLF1高表达所致实验动物哮喘模型肺组织IκB表达的影响：A为对于肺组织胞浆蛋白IκB的影响，B为对于肺组织胞核蛋白IκB的影响(#P＜0.05，Vs空白组；*P＜0.05，**P＜0.01 Vs模型组)。

具体实施方式

实验部分

试剂与溶剂

反应所用试剂若无特别说明，均购自Acros Organics(Geel，Belgium)，未经过进一步纯化直接使用。10％钯-碳购自陕西开达化工有限公司。甲酸铵购自北京化学试剂公司。反应所用溶剂若无特别说明，均购自北京化工厂，级别是分析纯。干燥THF的处理：分析纯THF用4

分子筛浸泡干燥过夜，加入金属钠和二苯基酮，加热回流，溶剂颜色变为蓝色时收集THF。干燥DCM的处理：分析纯DCM分别用5％Na2CO3、蒸馏水各洗涤两遍，用无水CaCl2干燥过夜。过滤，加入P2O5加热回流重蒸制得。丙酮：分析纯丙酮用新炒无水K₂CO₃浸泡干燥。无水Na₂SO₄，无水K₂CO₃，4分子筛：马弗炉500℃烘烤12h以上。GF254薄层层析硅胶，柱层析硅胶(60-100目，160-200目)，硅胶H均购自青岛海洋化工厂。

仪器

自动HPLC-MS分析仪：

HPLC分析仪为Agilent 1100 HPLC系统。Agilent G1312A泵，AgilentG1314A紫外检测器，Agilent G1313A自动进样器，Agilent G1316A柱温箱和分流阀。洗脱条件同上述Gilson HPLC系统。

质谱仪为ThermoFinnigan LCQ-Advantage质谱仪。洗脱液中的5％分流进入质谱仪。质谱检测采用正离子或者负离子扫描方式。离子源：电喷雾离子源(ESI)。

色谱柱：Kromasil C18分析柱(4.6μm，4.6mm×50mm)，购自DIKMA公司。

洗脱条件：流动相为含有0.05％HCOOH的乙腈和水。线性梯度洗脱5∶95(v∶v)acetonitrile-H2O到95∶5(v∶v)acetonitrile-H2O，时间5minutes，流速是1mL/min。UV检测波长是254nm

高分辨质谱仪：

Agilent LC/MSD TOF系统。色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18(Rapidresolution，3.5μm，2.1 30mm)。流动相：MeOH∶H2O＝75∶25(v∶v)，含有5mmol/L甲酸，等梯度洗脱。时间：5mins，流速：0.40mL/min。质谱检测采用正离子或者负离子扫描方式。离子源：ESI。

核磁共振仪：Varian Mercury，300MHz，400MHz，或500HMz。溶剂为DMSO-d6。

熔点仪：Yanaco微量熔点仪。所测熔点均未校正。熔点用日本Yanaco显微熔点仪测定，温度未经校正。

质谱用Finnigan LCQ-Advantage型质谱仪测定。

实施例1

7-羟基-4-甲基-3-(4-甲基哌嗪-1-基)-2H-苯并吡喃-2-酮(A1，R₁＝H，R₂＝OH，R₃＝CH₃，R₄＝CH₃)

按照反应式1，将2-氯乙酰乙酸乙酯(5mmol)、N-甲基哌嗪I-1(5mmol)、无水碳酸钾(10mmol)溶于无水乙腈，50℃搅拌反应。反应液由乳白色渐变为淡黄色，HPLC-MS跟踪监测，反应完毕，滤除碳酸钾，旋除乙腈，得黄色油状物II-1(R₃＝CH₃，R₄＝CH₃)，不必纯化，直接备做下步反应。

将间苯二酚(5mmol)和II-1(5.5mmol)溶于绝对甲醇，加入2.0ml三氟化硼乙醚溶液，加热回流，反应液渐变为桔红色，并有沉淀生成。HPLC-MS跟踪监测，反应完毕，减压蒸除溶剂，所得固体用石油醚，二氯甲烷淋洗，得淡黄色粉末，收率80.8％，m.p.272-275℃；¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)：δ7.500(d，1H，J＝9.0Hz)，6.730(d，1H，J＝9.0Hz，J＝2.1Hz)，6.598(d，1H，J＝2.4Hz)，2.931(br，4H)，2.191-2.393(m，7H)，2.193(s，3H)；¹³C NMR(100MHz，DMSO-d₆)：δ13.172，42.500，42.574，46.641，49.753，53.445，101.842，112.249，113.148，127.472，128.753，148.834，153.046，158.366，160.451；HRMS Calcd.For C15H19N2O3(M+H⁺)275.1396；found275.1398.

实施例2

7-甲氧基-4-甲基-3-(4-甲基哌嗪-1-基)-2H-苯并吡喃-2-酮(A2，R₁＝H，R₂＝OCH₃，R₃＝CH₃，R₄＝CH₃)

按照反应式2，将实施例1合成的化合物A1(0.10mmol)、无水甲醇(0.10mmol)及三苯基磷(PPh₃)(0.13mmol)溶于无水THF中，0℃下，将偶氮二碳酸二乙酯(DEAD)(0.13mmol)滴入上述溶液中，滴毕，自然升至室温，继续搅拌反应。HPLC-MS跟踪监测，必要时，可补加PPh₃和DEAD。反应完毕，减压蒸除THF，所得残余物经硅胶柱层析纯化，得标题化合物。淡黄色粉末，收率75.3％；m.p.190-192℃；1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ7.642(d，1H，J＝9.0Hz)，6.933-6.940(m，2H)，3.827(s，3H)，2.975(br，4H)，2.490(br，4H)，2.431(s，3H)，2.246(s，3H)；HRMS Calcd.For C16H21N2O3(M+H⁺)289.1552；found 289.1566.

实施例3

7-乙氧基-4-甲基-3-(4-甲基哌嗪-1-基)-2H-苯并吡喃-2-酮(A3，R₁＝H，R₂＝OCH₂CH₃，R₃＝CH₃，R₄＝CH₃)

采用与化合物A2相同的方法，，原料采用无水乙醇(0.10mmol)反应完毕后，所得残余物经硅胶柱层析纯化，得标题化合物，为淡黄色粉末，收率77.2％，m.p.195-197℃；1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ7.627(d，1H，J＝9.0Hz)，6.906-6.031(m，2H)，4.098(q，2H，J＝6.9Hz)，2.983(br，4H).2.490(br，4H)，2.426(s，3H)，2.275(s，3H)，1.333(t，3H，J＝6.9Hz)；HRMS Calcd.For C17H23N2O33(M+H⁺)303.1709；found 303.1723.

实施例4

7-(4-乙基环己基氧基)-4-甲基-3-(4-甲基哌嗪-1-基)-2H-苯并吡喃-2-酮(A4，R₁＝H，R₂＝OCH(CH₂CH₂)₂CHCH₂CH₃，R₃＝CH₃，R₄＝CH₃)

采用与化合物A2相同的方法，原料采用对乙基环己醇(0.1mmol)。反应完毕后，所得残余物经硅胶柱层析纯化，得标题化合物，黄色粉末，收率54.5％，m.p.136-138℃；¹H NMR(300MHz，MeOH)：δ7.558(d，1H，J＝9.0Hz)，6.837(dd，1H，J＝9.0Hz，J＝2.4Hz)，6.749(d，1H，J＝2.4Hz)，4.250(m，1H)，3.069(br，4H)，2.562(br，4H)，2.448(s，3H)，2.296(s，3H)，2.092(m，2H).1.811(m，2H)，0.983-1.425(m，8H)，0.863(t，3H，J＝7.2Hz)；HRMS Calcd.For C23H33N2O3(M+H⁺)385.2491；found 385.2498.

实施例5.

7-(4-甲氧基苄氧基)-4-甲基-3-(4-甲基哌嗪-1-基)-2H-苯并吡喃-2-酮(A5，R₁＝H，R₂＝p-OCH₃C₆H₅CH₂O，R₃＝CH₃，R₄＝CH₃)

采用与化合物A2相同的方法，，原料采用对甲氧基苯乙醇(0.1mmol)反应完毕后，所得残余物经硅胶柱层析纯化，得标题化合物，为淡黄色粉末，收率68.5％，m.p.182-184℃；¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)：δ7.630(d，1H，J＝9.0Hz)，7.385(d，2H，J＝9.0Hz)，6.972-7.003(m，2H)，6.937(d，2H，J＝9.0Hz)，5.108(s，2H)，3.743(s，3H)，2.963(br，4H)，2.490(br，4H)，2.423(s，3H).2.230(s，3H).¹³C NMR(125MHz，DMSO-d₆)：δ12.885，42.817，55.099，59.008，101.687，112.042，112.981，114.180，118.799，127.074，128.159，134.255，148.568，152.867，158.084，160.311，160.589.HRMS Calcd.For C23H27N2O4(M+H⁺)395.1971；found 395.1975.

实施例6

4-甲基-3-(4-甲基哌嗪-1-基)-7-(2-噻吩-2-基)乙氧基)-2H-苯并吡喃-2-酮(A6，R₁＝H，R₂＝OCH₂CH₂C₄H₃S，R₃＝CH₃，R₄＝CH₃)

采用与化合物A2相同的方法，，原料采用噻吩-2-乙醇(0.1mmol)反应完毕后，所得残余物经硅胶柱层析纯化，得标题化合物，类白色粉末，收率75.5％，m.p.268-270℃；¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)：δ7.681(d，1H，J＝9.0Hz)，7.460(d，1H，，J＝4.5Hz)，6.962-6.977(m，4H)，4.289(t，2H，J＝6.0Hz)，3.271(t，2H，J＝6.0Hz)，3.084(br，8H)，2.682(s，3H)，2.457(s，3H).¹³C NMR(125MHz，DMSO-d₆)：δ13.181，21.653，42.910，101.949，112.212，113.181，125.181，126.459，127.290，127.466，128.332，137.826，149.086，153.049，158.339，160.517.HRMS Calcd.For C21H25N2O3S(M+H⁺)385.1586；found 385.1581

实施例7

4-甲基-3-(4-甲基哌嗪-1-基)-7-(2-吗啉基乙氧基)-2H-苯并吡喃-2-酮(A7，R₁＝H，R₂＝OCH₂CH₂N(CH₂CH₂)₂O，R₃＝CH₃，R₄＝CH₃)

采用与化合物A2相同的方法，原料采用2-(4-吗啉)乙醇(0.1mmol)反应完毕后，所得残余物经硅胶柱层析纯化，得标题化合物，为淡黄色粉末，收率75.0％，m.p.96-98℃；¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)：δ7.635(d，1H，J＝9.0Hz)，6.930-6.958(m，2H)，3.729(t，2H，J＝6.9Hz)，4.168(t，2H，J＝6.0Hz)，3.533-3.577(m，4H)，3.008(br，4H)，2.692(t，2H，J＝6.0Hz)，2.584(br，4H)，2.433-2.494(m，7H)，2.337(s，3H)；HRMS Calcd.ForC21H30N3O4(M+H⁺)388.2236；found388.2229.

实施例8

4-甲基-3-(4-甲基哌嗪-1-基)-7-(2-(哌啶-1-基)乙氧基)-2H-苯并吡喃-2-酮(A8，R₁＝H，R₂＝OCH₂CH₂N(CH₂CH₂)₂CH₂，R₃＝CH₃，R₄＝CH₃)

采用与化合物A2相同的方法，，原料采用4-乙氧基哌啶(0.1mmol)反应完毕后，所得残余物经硅胶柱层析纯化，得标题化合物，为淡黄色粉末，收率75.8％，m.p.231-233℃；¹H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ7.632(d，1H，J＝9.0Hz)，6.953(br，2H)，4.164(br，2H)，2.991(br，2H)，2.718(br，2H)，2.492(br，8H)，2.431(s，3H)，2.289(s，3H)，1.502(br，4H)，1.384(m，2H)；HRMS Calcd.ForC22H32N3O3(M+H⁺)386.2444；found 386.2443.

实施例9

4-甲基-3-(4-甲基哌嗪-1-基)-7-(2-(四氢吡咯-1-基)乙氧基)-2H-苯并吡喃-2-酮(A9，R₁＝H，R₂＝OCH₂CH₂N(CH₂CH₂)，R₃＝CH₃，R₄＝CH₃)

采用与化合物A2相同的方法，，原料采用4-乙氧基四氢吡咯(0.10mmol)。反应完毕后，所得残余物经硅胶柱层析纯化，得标题化合物，为淡黄色粉末，收率55.0％，m.p.146-148℃；¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)：δ7.526(d，1H，J＝9.0Hz)，6.820(m，1H)，6.610(s，1H)，3.603(br，6H)，3.335(br，6H)，2.779(m，4H)，2.523(s，3H)，2.392(s，3H).HRMS Calcd.For C21H30N3O3(M+H⁺)372.2287；found 372.2289.

实施例10

5-羟基-4，7-二甲基-3-(4-甲基哌嗪-1-基)-2H-苯并吡喃-2-酮盐酸盐(A10，R₁＝OH，R₂＝CH₃，R₃＝CH₃，R₄＝CH₃)

按照反应式1，将2-氯乙酰乙酸乙酯(0.10mmol)、N-甲基哌嗪(I-1)(0.10mmol)、无水碳酸钾(0.15mmol)溶于无水乙腈，50℃搅拌反应。反应液由乳白色渐变为淡黄色，HPLC-MS跟踪监测，反应完毕，滤除碳酸钾，旋除乙腈，得黄色油状物(II-1，R₃＝CH₃，R₄＝CH₃)，不必纯化，直接备做下步反应。

将5-甲基间苯二酚(0.10mmol)和II-1(0.10mol)混合溶于绝对甲醇，加入三氟化硼乙醚(0.3mmol)溶液，加热回流，反应液渐变为棕红色，LC-MS跟踪监测，反应完毕，硅胶柱层析纯化，洗脱剂为CH₂Cl₂∶MeOH＝20∶1，得标题化合物，为淡黄色粉末，收率70.5％，m.p.213～215℃；¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)：δ10.490(s，1H)，9.382(s，1H)，6.599(s，1H)，6.584(s，1H)，3.492-3.531(m，2H)，3.402-3.445(m，2H)，3.105-3.207(m，2H)，2.905(br，2H)，2.838(d，3H，J＝4.2Hz)，2.674(s，3H)，2.262(s，3H).¹³C NMR(125MHz，DMSO-d₆)：δ17.118，20.936，45.427，48.452，54.971，106.968，107.296，111.968，130.876，141.373，148.475，152.816，156.382，157.645.HRMSCalcd.For C16H21N2O3(M+H⁺)289.1552；found 289.1553.

实施例11

8-甲基-7-(4-甲基哌嗪-1-基)-6H-[1，3]二氧杂亚甲基[4，5-g]苯并吡喃-6-酮盐酸盐(A11，R₁＝H，R₂＝4，5-OCH₂O，R₃＝CH₃，R₄＝CH₃)

按照反应式1，将芝麻酚(0.10mmol)和II-1(0.10mol)混合溶于绝对甲醇，加入三氟化硼乙醚(0.30mmol)溶液，加热回流，反应液渐变为棕红色，LC-MS跟踪监测，反应完毕，硅胶柱层析纯化，洗脱剂为CH₂Cl₂∶MeOH＝20∶1，得标题化合物，得淡黄色粉末，收率74.5％，m.p.254-256℃；¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)：δ9.369(s，1H)，7.294(s，2H)，7.077(s，2H)，6.154(s，2H)，3.447(br，4H)，3.173(br，2H)，2.944(br，2H)，2.843(s，3H)，2.445(s，3H).¹³C NMR(125MHz，DMSO-d₆)：δ13.746，42.536，46.572，53.369，97.474，102.478，103.584，113.788，129.713，144.764，148.056，148.666，150.047，158.171.HRMS Calcd.For C16H21N2O4(M+H⁺)305.1501；found 305.1508.HRMSCalcd.For C16H19N2O4(M+H⁺)303.1345；found 303.1351

实施例12

5-羟基-7-甲氧基-4-甲基-3-(4-甲基哌嗪-1-基)-2H-苯并吡喃-2-酮盐酸盐(A12，R₁＝OH，R₂＝OCH₃，R₃＝CH₃，R₄＝CH₃)

按照反应式1，将5-甲氧基间苯二酚，(0.10mmol)和II-1(0.10mol)混合溶于绝对甲醇，加入三氟化硼乙醚(0.30mmol)溶液，加热回流，反应液渐变为棕红色，LC-MS跟踪监测，反应完毕，硅胶柱层析纯化，洗脱剂为CH₂Cl₂∶MeOH＝20∶1，得标题化合物，类白色粉末，收率77.0％，m.p.173-175℃；¹HNMR(300MHz，DMSO-d₆)：δ10.510(s，1H)，9.362(s，1H)，6.370(d，1H，J＝2.1Hz)，6.280(d，1H，J＝2.1Hz)，3.821(s，3H)，3.436-3.483(br，4H)，3.132-3.197(br，2H)，2.830(s，3H)，2.606(s，3H).HRMS Calcd.ForC16H21N2O4(M+H⁺)305.1501；found 305.1508.

实施例13

5，7-二甲氧基-4-甲基-3-(4-甲基哌嗪-1-基)-2H-苯并吡喃-2-酮盐酸盐(A13，R₁＝OCH₃，R₂＝OCH₃，R₃＝CH₃，R₄＝CH₃)

按照反应式1，将3，5-二甲氧基苯酚(0.1mmol)和II-1(0.15mol)混合溶于绝对甲醇，加入三氟化硼乙醚(0.3mmol)溶液，加热回流，反应液渐变为棕红色，LC-MS跟踪监测，反应完毕，硅胶柱层析纯化，洗脱剂为CH2Cl2∶MeOH＝20∶1，得标题化合物，得白色粉末，收率81.0％，m.p.230-232℃，为白色粉末，收率81.0％，m.p.230-232℃；¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)：δ9.380(s，1H)，6.549(d，1H，J＝2.4Hz)，6.510(d，1H，J＝2.4Hz)，3.859(s，3H)，3.83O(s，3H)，3.397-3.485(m，4H)，3.178(br，2H)，2.892(br，2H)，2.839(s，3H)，2.620(s，3H).¹³C NMR(125MHz，DMSO-d₆)：δ17.214，42.582，46.538，53.379，55.847，56.276，93.228，95.873，104.148，128.642，154.295，157.690，159.161，162.160.HRMS Calcd.For C17H23N2O4(M+H⁺)319.1658；found 319.1657.

实施例14

7-(二甲基氨基)-4-甲基-3-(4-甲基哌嗪-1-基)-2H-苯并吡喃-2-酮(A14，R₁＝H，R₂＝(CH₃)₂N，R₃＝CH₃，R₄＝CH₃)

按照反应式1，将3-二甲氨基苯酚(0.10mmol)和II-1(0.10mol)混合溶于绝对甲醇，加入三氟化硼乙醚(0.30mmol)溶液，加热回流，反应液渐变为棕红色，LC-MS跟踪监测，反应完毕，硅胶柱层析纯化，洗脱剂为CH₂Cl₂∶MeOH＝20∶1，得标题化合物，淡黄色粉末，收率65.0％，m.p.163-165℃；¹H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ7.493(d，1H，J＝9.0Hz)，6.722(d，1H，J＝9.0Hz，J＝2.1Hz)，6.503(d，1H，J＝2.1Hz)，2.600-3.332(m，6H)，2.982(s，6H)，2.440(br，2H)，2.388(s，3H)，2.223(s，3H).HRMS Calcd.For C17H24N3O2(M+H⁺)302.1869；found 302.1872.

实施例15

5，7-二羟基-4-甲基-3-(4-甲基哌嗪-1-基)2H-苯并吡喃-2-酮(A15，R₁＝R₂＝OH，R₃＝CH₃，R₄＝CH₃)

按照反应式1，将间苯三酚(0.10mmol)和II-1(0.10mol)混合溶于绝对甲醇，加入三氟化硼乙醚(0.30mmol)溶液，加热回流，反应液渐变为棕红色，

LC-MS跟踪监测，反应完毕，硅胶柱层析纯化，洗脱剂为CH₂Cl₂∶MeOH＝20∶1，得标题化合物，乳白色粉末，收率84.8％，m.p.208-210℃；¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆，ppm)：6.258(d，1H，J＝1.5Hz)，6.115(d，1H，J＝1.5Hz)，2.935-2.955(m，4H)，2.624(s，3H)，2.429(m，4H)，2.235(s，3H)；

实施例16

4-甲基-3-(4-甲基哌嗪-1-基)-2-氧-2H-苯并吡喃-5，7-二羟基二乙酸酯(A16，R₁＝R₂＝OCOCH₃，R₃＝CH₃，R₄＝CH₃)

按照反应式4，将上述所得A15(0.10mmol)溶于无水THF，加入28μ1(0.30mmol)乙酸酐，室温搅拌反应，HPLC-MS跟踪监测，反应完毕，蒸除THF，二氯甲烷溶解残余物，用碳酸氢钠饱和水溶液洗涤三次，无水硫酸镁干燥有机层，过滤，浓缩，得34.2mg标题化合物，为浅褐色粉末，收率91.0％，m.p.225-228℃。¹H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ7.170(d，1H，J＝2.4Hz)，7.030(d，1H，J＝2.4Hz)，2.967(m，4H)，2.502(s，3H)，2.363(m，4H)，2.346(s，3H)，2.280(s，3H)，2.198(s，3H).

实施例17

3-(4-乙基哌嗪-1-基)-5，7-二羟基-4-甲基-2氢-苯并吡喃-2-酮(A17，R₁＝R₂＝OH，R₃＝CH₃，R₄＝CH₂CH₃)

按照反应式1，将2-乙酰乙酸乙酯(0.10mmol)溶于无水乙腈，再加入无水K₂CO₃(0.15mmol)及N-乙基哌嗪(I-3，0.10mmol)，50℃下反应。反应液逐渐变为淡黄色粘稠液，3h后，反应完毕，减压蒸除乙腈，加入20ml水，搅拌30min，CH₂Cl₂(20ml×3)萃取，合并萃取液，无水Na₂SO₄干燥5h。过滤，除去Na₂SO₄，滤液减压蒸除溶剂，得黄色油状物(II-3)。HPLC纯度＞95％，不必纯化，可直接用于下一步反应。

将所得黄色油状物II-3和间苯三酚(0.10mmol)溶于绝对甲醇，加入三氟化硼乙醚溶液(0.30mmol)，加热回流，反应液渐变为棕红色，并有沉淀生成。HPLC-MS跟踪监测，反应完毕，减压蒸除溶剂，所得固体用石油醚，二氯甲烷淋洗，得淡黄色粉末，收率85.4％，m.p.210～212℃ ¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)：δ10.535(s，1H)，10.288(s，1H)，9.542(s，1H)，6.317(d，1H，J＝2.4Hz)，6.135(d，1H，J＝2.4Hz)，3.428～3.539(br，4H)，3.058～3.149(br，4H)，2.850(br，2H)，2.637(s，3H)，1.229(t，3H，J＝7.5Hz)；HRMS Calcd.ForC16H21N2O4(M+H⁺)305.1501；found 305.1505.

实施例18

5，7-二羟基-4-甲基-3-(4-(3-(三氟甲基)苯基)哌嗪-1-基)-2H-苯并吡喃-2-酮(A18，R₁＝R₂＝OH，R₃＝CH₃，R₄＝3-CF₃C₆H₄)

按照反应式1，将2-乙酰乙酸乙酯(0.10mmol)溶于无水乙腈，再加入无水K₂CO₃(0.15mmol)及N-3-三氟甲基苯基哌嗪(I-4，R₄＝3-CF₃C₆H₄)，50℃下反应。反应液逐渐变为淡黄色粘稠液，3h后，反应完毕，减压蒸除乙腈，加入20ml水，搅拌30min，CH₂Cl₂(20ml×3)萃取，合并萃取液，无水Na₂SO₄干燥5h。过滤，除去Na₂SO₄，滤液减压蒸除溶剂，得黄色油状物II-4。HPLC纯度＞95％，不必纯化，可直接用于下一步反应。

采用与化合物A17相同的方法，，原料采用0.10mmol间苯三酚和II-4(0.10mmol)，得标题化合物，黄色粉末，收率52.5％，m.p.235～238℃ ¹HNMR(300MHz，DMSO-d₆)：δ10.426(s，1H)，10.190(s，1H)，7.418，t，1H，J＝7.8Hz)，7.245(d，1H，J＝7.8Hz)，7.188(s，1H)，7.065(d，1H，J＝7.8Hz)，6.260(d，1H，J＝2.4Hz)，6.128(d，1H，J＝2.4Hz)，2.879-4.231(br，8H)，2.666(s，3H)；HRMS Calcd.For C₂₁H₂₀F₃N₂O₄(M+H⁺)421.1375；found 421.1378.

实施例19

5，7-二羟基-3-(4-(2-甲氧基苯基)哌嗪-1-基)-4-甲基-2H-苯并吡喃-2-酮(A19，R₁＝R₂＝OH，R₃＝CH₃，R₄＝2-OCH₃C₆H₄)

按照反应式1，将2-乙酰乙酸乙酯(0.10mmol)溶于无水乙腈，再加入无水K₂CO₃(0.15mmol)及N-2-甲氧基苯基哌嗪(I-5，R₄＝2-OCH3C6H3)，50℃下反应。反应液逐渐变为淡黄色粘稠液，3h后，反应完毕，减压蒸除乙腈，加入20ml水，搅拌30min，CH₂Cl₂(20ml×3)萃取，合并萃取液，无水Na₂SO₄干燥5h。过滤，除去Na₂SO₄，滤液减压蒸除溶剂，得黄色油状物II-5。HPLC纯度＞95％，不必纯化，可直接用于下一步反应。

采用与化合物A17相同的方法，，原料采用间苯三酚(0.10mmol)和II-5(0.10mmol)，得类白色粉末，收率50.8％，m.p.218～221℃ 1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ10.409(s，1H)，10.176(s，1H)，7.102(t，1H，J＝8.1Hz)，6.538(d，1H，J＝8.1Hz)，6.468(m，1H)，6.358(d，1H，J＝8.1Hz，J＝2.1Hz)，6.261(d，1H，J＝2.4Hz)，6.130(d，1H，J＝2.1Hz)，3.708(s，3H)，2.768～3.465(br，8H)，2.660(s，3H)；HRMS Calcd.For C₂₁H₂₃N₂O₅(M+H⁺)383.1607；found 383.1600.

实旋例20

3-(4-(4-氟苯基)哌嗪-1-基)-5，7-二羟基-4-甲基-2H-苯并吡喃-2-酮(A20，R₁＝R₂＝OH，R₃＝CH₃，R₄＝p-FC₆H₄)

按照反应式1，将2-乙酰乙酸乙酯(0.10mmol)溶于无水乙腈，再加入无水K₂CO₃(0.15mmol)及N-对氟苯基哌嗪(I-6，R₄＝p-FC₆H₃)，50℃下反应。反应液逐渐变为淡黄色粘稠液，3h后，反应完毕，减压蒸除乙腈，加入20ml水，搅拌30min，CH₂Cl₂(20ml×3)萃取，合并萃取液，无水Na₂SO₄干燥5h。过滤，除去Na₂SO₄，滤液减压蒸除溶剂，得黄色油状物II-6。HPLC纯度＞95％，不必纯化，可直接用于下一步反应。

采用与化合物A17相同的方法，，将间苯三酚(0.10mmol)和II-6(0.10mmol)溶于绝对甲醇，加入2.0ml三氟化硼乙醚溶液，加热回流，反应液渐变为桔红色，并有沉淀生成。HPLC-MS跟踪监测，反应完毕，减压蒸除溶剂，所得固体用石油醚，二氯甲烷淋洗，得类白色粉末，收率58.0％，m.p.189～193℃ 1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ¹HNMR(300MHz，DMSO-d6)：δ10.416(s，1H)，10.202(s，1H)，7.012(m，4H)，6.256(d，1H，J＝1.5Hz)，6.130(d，1H，J＝1.5Hz)，2.870～3.438(br，8H)，2.653(s，3H)；HRMS Calcd.For C₂₀H₂₀FN₂O₄(M+H⁺)371.1407；found 371.1405.

实施例21

3-(4-(2，3-二甲基苯基)哌嗪-1-基)-5，7-二羟基-4-甲基-2H-苯并吡喃-2-酮(A21，R₁＝R₂＝OH，R₃＝CH₃，R₄＝2，3-diCH₃C₆H₃)

按照反应式1，将2-乙酰乙酸乙酯(0.10mmol)溶于无水乙腈，再加入无水K₂CO₃(0.15mmol)及N-2，3-二甲基苯基哌嗪(I-7，R₄＝2，3-diCH₃C₆H₃)，50℃下反应。反应液逐渐变为淡黄色粘稠液，3h后，反应完毕，减压蒸除乙腈，加入20ml水，搅拌30min，CH₂Cl₂(20ml×3)萃取，合并萃取液，无水Na₂SO₄干燥5h。过滤，除去Na₂SO₄，滤液减压蒸除溶剂，得黄色油状物II-7。HPLC纯度＞95％，不必纯化，可直接用于下一步反应。

采用与化合物A17相同的方法，，原料采用630mg间苯三酚(0.10mmol)和II-7(0.10mmol)，得黄色粉末，收率49.0％，m.p.236-239℃；1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ10.409(s，1H)，10.178(s，1H)，7.033(t，1H，J＝7.5Hz，J＝8.1Hz)，6.931(t，1H，J＝8.1Hz)，6.872(t，1H，J＝7.5Hz)6.264(d，1H，J＝2.4Hz)，6.139(d，1H，J＝2.4Hz)，3.373(br，4H)；2.851(br，4H)，2.671(s，3H)，2.199(s，3H)，2.178(s，3H)；HRMS Calcd.For C₂₂H₂₅N₂O₄(M+H⁺)381.1814；found 381.1812.

实施例22

3-(4-(双(4-氟苯基)甲基)哌嗪-1-基)-5，7-二羟基-4-甲基-2H-苯并吡喃-2-酮(A22，R₁＝R₂＝OH，R₃＝CH₃，R₄＝(p-FC₆H₅)₂CH)

按照反应式1，将2-乙酰乙酸乙酯(0.10mmol)溶于无水乙腈，再加入无水K₂CO₃(0.15mmol)及N-双(4-氟苯基)甲基哌嗪(I-8，R₄＝(p-FC₆H₅)₂CH)，50℃下反应。反应液逐渐变为淡黄色粘稠液，3h后，反应完毕，减压蒸除乙腈，加入20ml水，搅拌30min，CH₂Cl₂(20ml×3)萃取，合并萃取液，无水Na₂SO₄干燥5h。过滤，除去Na₂SO₄，滤液减压蒸除溶剂，得黄色油状物II-8。HPLC纯度＞95％，不必纯化，可直接用于下一步反应。

采用与化合物A17相同的方法，，原料采用630mg间苯三酚(0.10mmol)和II-8(0.10mmol)，得到标题化合物，为黄色粉末，收率51.0％，m.p.283～286℃ ¹H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ10.365(s，1H)，10.147(s，1H)，7.468(d，2H，J＝5.7Hz)，7.438(d，2H，J＝5.7Hz)，7.122(m，4H)，6.230(d，1H，J＝2.4Hz)，6.103(d，1H，J＝2.4Hz)，4.395(s，1H)，2.579(s，3H)，2.409～3.315(br，8H)；HRMS Calcd.For C₂₇H₂₅F₂N₂O₄(M+H⁺)479.1782；found 479.1787.

实施例23

5，7-二羟基-4-甲基-3-(哌嗪-1-基)-2H-苯并吡喃-2-酮(A23，R₁＝R₂＝OH，R₃＝CH₃，R₄＝H)

按照反应式3，将0.10mol无水哌嗪(I-2，R₄＝H)、0.10mol烘过的碳酸钾溶于无水乙腈，室温剧烈搅拌下，缓慢滴加0.10mol 2-氯乙酰乙酸乙酯的无水乙腈溶液，反应液由乳白色渐变为淡黄色，HPLC-MS跟踪监测，反应完毕，滤除碳酸钾，旋除乙腈，所得残余物加水，搅拌30min，乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，无水Na₂SO₄干燥5h。过滤，除去Na₂SO₄，滤液减压蒸除溶剂，得II-2(R₃＝CH₃，R₄＝H)，棕红色油状物，不必纯化，直接用于下一步反应。

将间苯三酚(0.10mol)和II-2(0.10mol)混合溶于绝对甲醇，加入0.30mol三氟化硼乙醚溶液，加热回流，反应液渐变为棕红色，HPLC-MS跟踪监测，反应完毕，硅胶柱层析纯化，洗脱剂为PE∶AcOEt∶MeOH，得12.34g标题化合物，为类白色粉末，收率70.0％，m.p.110～112℃。¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)：δ6.233(d，1H，J＝2.1Hz)，6.092(d，1H，J＝2.1Hz)，3.156(br，4H)，2.799(br，5H)，2.624(s，3H)；HRMS Calcd.For C14H17N2O4(M+H⁺)277.1188；found277.1183.

实施例24

3-(4-苄基哌嗪-1-基)-5，7-二羟基-4-甲基-2H-苯并吡喃-2-酮(A24，R₁＝R₂＝OH，R₃＝CH₃，R₄＝C₆H₅CH₂)

对实施例23合成的化合物A23进一步衍生，将A23(0.1mmol)溶于无水THF，再加少量DMF助溶，加入20μL(0.12mmol)二异丙基乙基氨及13.8μL(0.12mmol)氯苄，60℃搅拌反应，，HPLC-MS监测，反应完毕，蒸除THF、DMF，硅胶柱层析纯化，洗脱剂PE∶AcOEt＝1∶2得标题化合物，为浅褐色固体，收率42.0％，m.p.212-214℃.¹H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ10.377(s，1H)，10.151(s，1H，)，7.312～7.326(m，4H)，7.236～7.250，6.241(d，1H，J＝2.4Hz)，6.106(d，1H，J＝2,4Hz)，3.497(s，2H)，2.608～3.322(m，4H)，2.608(s，3H)；2.000～2.478(m，4H)；¹³CNMR(125MHz，DMSO-d6)：δ159.994，157.818，154.457，149.453，138.297，128.805，128.517，128.129，126.852，102.267，99.236，94.033，62.330，53.328，49.015，16.856.HRMS Calcd.For C₂₁H₂₂N₂O₄(M+H⁺)367.1658；found 367.1658.

实施例25

3-(4-((6-氯苯并[d][1，3]亚甲二氧基-5-基)甲基)哌嗪-1-基)-5，7-二羟基-4-甲基-2H-苯并吡喃-2-酮(A25，R₁＝R₂＝OH，R₃＝CH₃，R₄＝6-chloropiperonylchloride)

对实施例23合成的化合物A23进一步衍生，将27.6mg(0.1mmol)A23溶于无水THF，再加少量DMF助溶，加入20μL(0.12mmol)二异丙基乙基氨及24.5mg(0.12mmol)6-氯胡椒氯，60℃搅拌反应，，HPLC-MS监测，反应完毕，蒸除THF、DMF，硅胶柱层析纯化，洗脱剂PE∶AcOET＝1∶2得11.53mg标题化合物，为白色固体，收率45.8％，m.p.275-278℃。¹HNMR(300MHz，DMSO-d6)：δ10.647(s，1H，)，10.365(s，1H，)，7.041(s，2H)，6,428(d，1H，J＝2.1Hz)，6.138(d，1H，J＝2.1Hz)，6.055(s，2H)，3.612(br，2H)，2.716～3.254(m，4H)，2.610(s，3H)，2.260～2.502(m，4H)；HRMS Calcd.For C₂₂H₂₂ClN₂O₆(M+H⁺)445.1166；found 445.1168.

实施例26

3-(4-(2-乙基丁基)哌嗪-1-基)-5，7-二羟基-4甲基-2H-苯并吡喃-2-酮(A43，R₁＝R₂＝OH，R₃＝CH₃，R₄＝(CH₃)₂CHCH₂)

将A23(0.10mmol)和37ml 2-乙基丁醛(0.30mmol)溶于甲醇，再加少量DMF助溶，加入18.85mg(0.30mmol)氰基硼氢化钠及几滴冰醋酸，室温搅拌反应，，HPLC-MS跟踪监测，反应完毕，减压蒸除甲醇，加水，乙酸乙酯萃取三次，合并有机层，碳酸氢钠洗涤有机层三次，浓缩，所得残余物经硅胶柱层析纯化，洗脱剂CH₂Cl₂∶CH₃OH＝30∶1，得白色固体，收率28.5％，m.p.296-299℃；¹H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ5.927(s，1H)，5.710(s，1H)，2.650～3.685(br，8H)，2.650(s，3H)，2.120(d，2H，J＝4.6Hz)，1.428(m，1H)，1.281(m，4H)，0.853(t，6H，J＝7.2Hz).HRMS Calcd.For C20H29N2O4(M+H+)361.2127；found361.2124.

药理实验

实验例1香豆素衍生物对CKLF1的抑制活性

采用FITC标记的CKLF1 C端27肽(FITC-C27)，分子量为3699.41，核苷酸序列为FITC-Acp-ALIYRKLLFNPSGPYQKKPVHEKKEVL，以及体外稳定表达的HEK293-CCR4细胞系建立筛选模型。

将生长状态良好高表达CCR4的HEK293细胞每孔100ul接种于96孔板(浓度6×10⁴个/ml)，培养48小时后加入FITC-C27和待筛选化合物(浓度1×10^-5，1×10^-6，1×10^-7，1×10^-8，1×10^-9，1×10^-10，1×10^-11)共育50分钟，孵育结束后用PBS溶液洗板，洗去未结合的FITC-C27，在荧光酶标仪上读取荧光值(Eex＝490nm，Eem＝530nm)。只以FITC-C27处理的HEK293-CCR4细胞为CKLF1对照组(F_{CKLF1 control})，用以下公式计算化合物对结合的抑制率，并计算IC₅₀。

考察以上实施例的竞争性抑制CCR4与CKLF1结合的量效关系，并计算得到化合物的IC₅₀，结果见表1。

表1.实施例竞争性抑制C27与CCR4结合的结果

实验例2 A15化合物对CKLF1引起HEK293-CCR4细胞发生钙内流影响实验研究

实验过程：HEK293稳定转染空质粒细胞和HEK293-CCR4细胞以1×10⁴个/ml接种于Confocal小皿，37℃培养48h，在培养结束前1h更换无血清培养基并加入A15(1×10^-5M)和FLUO3/AM(10μM)在37℃避光孵育，孵育结束后用PBS洗去未进入胞内的荧光染料，在Confocal显微镜下检测观察(E_ex＝488，E_em＝530)。检测时加入CKLF1-C27片段(0.08mM)在激光共聚焦显微镜每隔5sec检测拍照，监测十分钟，记录相对荧光值的变化。图像采用Leical Confoal分析软件计算相对荧光值的变化。

实验结果：

FITC标记的CKLF1 C端27肽(FITC-C27)可引起HEK293-CCR4细胞发生快速的钙内流，使荧光值迅速而持久的升高，但预先用A15(1×10^-5M)与细胞共孵育，可明显抑制FITC-C27所致钙瞬时升高，且化合物A15单独处理对HEK293-CCR4细胞钙瞬变无影响，提示化合物A15能拮抗CKLF1与CCR4的结合(如图1所示)。

实验例3：化合物A15对FITC-C27引起的HEK293-CCR4细胞趋化运动影响

实验研究

实验过程：：HEK293-CCR4细胞以1×10⁷个/ml接种于24孔Transwell小室的上层(100ul/孔)，同时在上层加入A15(1×10^-5M)与HEK293-CCR4细胞在37℃共同孵育1h。孵育结束后在Transwell的下层小室加入100nM的CKLF1-C27片段，在二氧化碳培养箱中继续培养50min，取下聚碳纤维膜轻轻擦去上层的细胞，将膜用甲醇固定，用1％的结晶紫染色10-15min后用水漂洗，在光镜下随机选择5个视野(200×)计数穿过细胞的平均值并计算穿过指数(CI)，当CI＞2时有意义。

实验结果：FCKLF1-C27可引起HEK293-CCR4细胞发生趋化运动，但预先用不同浓度的化合物A15与细胞共同孵育，可明显抑制CKLF1-C27所致的HEK293-CCR4细胞发生的钙瞬变(如图2所示)。

实验例4化合物A15对于急性胸膜炎模型药效学初步研究

趋化因子在炎症过程中的作用是使炎症细胞向炎症部位的募集，因此对于化合物A15化合物的体内药效学研究采用大鼠急性胸膜炎模型。

选取健康雄性Wistar大鼠，模型组胸腔注射质量百分比浓度为1％的角叉菜胶(0.2ml/只)，给药组：提前3天皮下给予实施例A15(剂量分别为12.5mg/kg、25mg/kg、50mg/kg)以少量的吐温-80助溶，在最后一次给药后1小时胸腔注射角叉菜胶；阳性药地塞米松组(剂量5mg/kg，i.p.共2次)，最后一次给药后1小时胸腔注射1％的角叉菜胶。

各组给予角叉菜胶4小时后，处死动物并打开胸腔，计量胸腔积液体积(表2)、并分别检测渗出液中白细胞数量(表3)、总蛋白含量(表4)以及与炎症相关生化指标PGE2(表5)、MDA(表6)、SOD(表7)、GSH-PX(表8)、NO(表9)和iNOS(表10)，同时进行病理检查(图3)。

表2.A15对角叉菜胶所致的急性胸膜炎大鼠胸腔积液渗出体积的影响(X±S，n＝6)

表3.A15对角叉菜胶所致的急性胸膜炎大鼠胸腔积液总蛋白含量的影响(X±S，n＝6)

表4.A15对角叉菜胶所致的急性胸膜炎大鼠胸腔积液白细胞总数的影响(X±S，n＝6)

表5.A15对对角叉菜胶所致的急性胸膜炎大鼠胸腔积液PGE2含量的影响(X±S，n＝6)

表6.实施例II-2对角叉菜胶所致的急性胸膜炎大鼠MDA含量的影响(X±S，n＝6)

表7.实施例A15对角叉菜胶所致的急性胸膜炎大鼠SOD活性的影响(X±S，n＝6)

表8.A15对角叉菜胶所致的急性胸膜炎大鼠GSH-PX活性的影响(X±S，n＝6)

表9.A15对角叉菜胶所致的急性胸膜炎大鼠NO含量的影响(X±S，n＝6)

表10.A15对角叉菜胶所致的急性胸膜炎大鼠iNOS活性的影响(X±S，n＝6)

结果表明，实施例A15可显著减少角叉菜胶所致的胸腔积液的渗出、胸腔积液中总蛋白及PGE2的含量(p＜0.05)，但对白细胞总数的作用不显著，提示实施例A15对于角叉菜胶所致的急性胸膜炎模型具有保护作用，这种作用可能与抑制PGE2等炎症介质的生成有关。

实验例5.化合物A15对CKLF1高表达致动物哮喘模型作用的研究

趋化因子CKLF1参与体内一些重要的呼吸系统疾病的发生。实验研究发现当采用电转外源性真核表达质粒于小鼠时，可以引起肺部发生明显的炎性改变，具体表现为：支气管周围炎症细胞的大量浸润，支气管上皮细胞的脱落，胶原的沉积，支气管平滑肌细胞的增生和纤维化等。CKLF1所导致的实验动物肺部的病理改变与慢性持续性哮喘、SARS(Severe acute respiratory syndrome)等呼吸系统病理改变相似。这些充分的说明了CKLF1在这些呼吸系统疾病发病过程中的重要作用，同时也为我们进行药效学研究，提供了相应的实验动物模型。选择CKLF1高表达致动物哮喘模型，观察实施例A15对于该模型的保护作用。

选择健康雄性Balb/c小鼠，将质粒pCDB-CKLF1以及pCDB空质粒溶于生理盐水，终浓度为1μg/μl，将小鼠用水合氯醛麻醉后，剪去后肢腹股沟处的毛，用75％的酒精进行局部消毒，轻轻剪破皮肤进行肌肉深部注射，剂量100μg/只，注射结束后用BTX电转仪进行质粒导入，电转条件：100V、40ms、1Hz、8pulse。电击导入后对实验动物进行伤口消毒包扎处理并继续进行饲养。空白组在相同条件下电转导入等量的空质粒pCDB。将电击转化后的各组实验动物饲养3周后，实施例A15组开始给药(剂量分别为20mg/kg、120mg/kg)，而DEX组在第四周开始给药。在第五周开始处死动物，对BALF进行白细胞计数并分类(表11)，观察肺组织病理改变(图4)，同时取各组动物的肺组织分离胞浆胞核蛋白，检查化合物A15对于NFκB信号通路中p-IκB表达的影响，对肺组织胞浆蛋白IκB、肺组织胞核蛋白IκB的影响。

表11.A15对CKLF1高表达所致实验动物哮喘模型BLAF中WBC的影响(X±S，n＝10)

表12.A15对CKLF1高表达所致实验动物哮喘模型BLAF中EOS的影响(X±S，n＝10)

结果表明，化合物A15对于CKLF1高表达致实验动物哮喘模型BLAF中异常升高的WBC以及嗜酸性粒细胞具有降低作用，同时对于肺组织病理改变具有一定的改善作用。

Claims (21)

1.一种由下述通式(I)所示的3-哌嗪基香豆素衍生物及其药用盐，

其中，R₁、R₂独立的选自氢、羟基、-NH₂、硝基、C_1-6直链或支链烷基、C_1-6直链或支链烯基、C_1-6直链或支链烷氧基、C_1-6直链或支链烯氧基、卤代C_1-6直链或支链烷基、卤代C_1-6直链或支链烷氧基、C_1-6直链或支链烷基取代的胺基、C_1-6直链或支链酰氧基、C_1-6酯基、C_1-6酰氨基、磺酰基、磺酰氨基、脲基或硫脲基、-O-(CH₂)_n-R₅、-O-CO-(CH₂)_n-R₅；

并且R₅选自含有0-3个杂原子的取代或未取代脂环或0-3个杂原子的取代或未取代的芳香环，所述的杂原子选自N，O或S；取代基选自C_1-6直链或支链烷基、C_1-6直链或支链烷氧基、羟基、硝基、羧基、卤素；

n选自的整数；

R₁、R₂还可以相连，与环稠形成环；

R₃选自氢、C_1-6直链或支链烷基；

R₄选自氢、取代或未取代的C_1-6直链或支链烷基，取代或未取代的C_1-6直链或支链烯基、取代或未取代的苯基；取代基选自苯基、C_1-6直链或支链烷基、C_1-6直链或支链烷氧基、卤代C_1-6直链或支链烷基、卤代C_1-6直链或支链烷氧基、卤素、硝基、羟基。

2.根据权利要求1所示的化合物，其特征在于，所述的化合物是通式(IA)所示化合物及其药用盐：

其中，R选自氢、C_1-6直链或支链烷基、C_1-6直链或支链烯基、-(CH₂)_n-R₅、-CO-(CH₂)_n-R₅；R₅选自取代或未取代的C_3-6环烷基、取代或未取代的苯基、取代或未取代的噻吩基、取代或未取代的呋喃基、取代或未取代的吡咯基、取代或未取代的咪唑基、取代或未取代的吡喃基、取代或未取代的吡啶基、取代或未取代的吗啉基、取代或未取代的哌啶基、取代或未取代的四氢吡咯基、取代或未取代的萘基；取代基选自C_1-6直链或支链烷基、C_1-6直链或支链烷氧基；

n选自0-6的整数

R₃选自C_1-6直链或支链烷基；

R₄选自氢、C_1-6直链或支链烷基。

3.根据权利要求2所示的化合物，其特征在于，所述的化合物是通式(IAa)所示化合物及其药用盐：

其中，R₁₀选自氢、C_1-6支链或直链的烷基；

R₃选自甲基、乙基、丙基或异丙基；

R₄选自氢、甲基、乙基、丙基或异丙基。

4.根据权利要求2所示的化合物，其特征在于，所述的化合物是通式(IAb)所示化合物及其药用盐：

其中，n选自0、1、2、3；R₁₁选自取代或未取代的C_3-6环烷基、取代或未取代的苯基、取代或未取代的噻吩基、取代或未取代的呋喃基、取代或未取代的吡咯基、取代或未取代的咪唑基、取代或未取代的吡喃基、取代或未取代的吡啶基、取代或未取代的吗啉基、取代或未取代的哌啶基、取代或未取代的四氢吡咯基、取代或未取代的萘基；取代基选自羟基、C_1-3直链或支链烷基、C_1-3直链或支链烷氧基；

R₃选自甲基、乙基、丙基或异丙基；

R₄选自氢、甲基、乙基、丙基或异丙基。

5.根据权利要求1所示的化合物，其特征在于，所述的化合物是通式(IB)所示化合物及其药用盐：

其中，R₆、R₈独立的选自羟基、C_1-6直链或支链烷基、C_1-6直链或支链烷氧基；

R₃选自C_1-6直链或支链烷基；

R₄选自氢、取代或未取代的C_1-6直链或支链烷基、取代或未取代的苯基；取代基选自苯基、C_1-6直链或支链烷基、C_1-6直链或支链烷氧基、卤代C_1-6直链或支链烷基、卤代C_1-6直链或支链烷氧基、卤素。

6.根据权利要求5所示的化合物，其特征在于，所述的化合物是通式(IBa)所示化合物及其药用盐：

R₃选自甲基、乙基、丙基或异丙基；

R₄选自氢、取代或未取代的C_1-6直链或支链烷基、取代或未取代的苯基、取代或未取代的苄基；取代基选自苯基、C_1-6直链或支链烷基、C_1-6直链或支链烷氧基、卤代C_1-4直链或支链烷基、卤代C_1-4直链或支链烷氧基、卤素。

7.根据权利要求6所示的化合物，其特征在于，所述的化合物是通式(IBa1)所示化合物及其药用盐：

R₃选自甲基、乙基、丙基或异丙基；

R₄选自氢、取代或未取代的C_1-6直链或支链烷基，取代基选自卤素。

8.根据权利要求6所示的化合物，其特征在于，所述的化合物是通式(IBa2)所示化合物及其药用盐：

R₃选自甲基、乙基、丙基或异丙基；

R₁₀选自取代基选自C_1-6直链或支链烷基、C_1-6直链或支链烷氧基、卤代C_1-4直链或支链烷基、卤代C_1-4直链或支链烷氧基、卤素。

9.根据权利要求6所示的化合物，其特征在于，所述的化合物是通式(IBa3)所示化合物及其药用盐：

R₃选自甲基、乙基、丙基或异丙基；

R₁₁选自取代基选自C_1-6直链或支链烷基、C_1-6直链或支链烷氧基、卤代C_1-4直链或支链烷基、卤代C_1-4直链或支链烷氧基、卤素。

10.根据权利要求1所示的化合物，其特征在于，其特征在于，所述的化合物是通式(IC)所示化合物及其药用盐：

其中，R₃选自C_1-3直链或支链烷基；

R₄选自氢、C_1-6直链或支链烷基、C_1-6直链或支链烷氧基；

R’、R”独立的选自氢，C_1-6直链或支链烷基。

11.根据权利要求1所示的化合物，其特征在于，其特征在于，所述的化合物是通式(ID)所示化合物及其药用盐：

其中，n为1～6的整数；

R₃选自C_1-3直链或支链烷基；

R₄选自氢、C_1-6直链或支链烷基、C_1-6直链或支链烷氧基。

12.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物选自：

13.一种药物组合物，含有有效剂量的如权利要求1～12中任一项所述的化合物和药学上可接受的载体的。

14.根据权利要求13的药物组合物，其特征在于所述的药物组合物选自片剂、胶囊、丸剂、注射剂、缓释制剂、控释制剂或微粒给药系统。

15.如权利要求1～12中任一项所述的化合物用于预防和/或治疗与趋化因子CKLF1活性相关疾病的药物的应用。

16.如权利要求1～13中任一项所述的化合物作为CKLF1与CCR4作用的拮抗剂的应用。

17.根据权利要求16所述的应用，其特征在于，所述的疾病选自哮喘、过敏性疾病、遗传性皮炎。

18.权利要求1～12中任一项中所述化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

采用N-取代的哌嗪基酰基乙酸乙酯(II)与R₁和/或R₂取代的苯酚反应得到通式(I)所示化合物：

其中，R₁、R₂、R₃、R₄的定义同权利要求1-12中任一项相同。

19.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，反应的催化剂选自三氟化硼乙醚。

20.权利要求2所述化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

采用N-取代的哌嗪基酰基乙酸乙酯(II)与1，3苯二酚反应生成式III，再将式III的7位羟基生成取代的烷氧基得到如通式(IA)所示化合物：

其中，R、R₃、R₄的定义同权利要求2。

21.权利要求6所述化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

采用哌嗪基酰基乙酸乙酯(II-1)与1，3，5苯三酚反应生成式III-1，再将III-1的哌嗪基的N位连上取代基团得到如通式(IBa)所示化合物：

其中，R₃、R₄定义同权利要求6。

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