CN103444541A - 一种八角莲愈伤组织或悬浮细胞的快速繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种八角莲愈伤组织或悬浮细胞的快速繁殖方法，包括无菌芽的获得，愈伤组织诱导及继代培养、悬浮细胞培养、愈伤组织或悬浮细胞中产生含量较高的鬼臼毒素类化合物。本发明方法利用纳米氧化钛对八角莲愈伤组织或悬浮细胞的培养和鬼臼毒素进行有目的调控，可以在短期内获得大量的制药原料，并能有效降低生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及植物组织培养的快繁方法，尤其涉及外源添加物质对八角莲愈伤组织或悬浮细胞的调控方法，属于植物技术领域。
背景技术
八角莲Dysosma versipellis （Hance） M. Cheng是小科植物，多年生草本植物，根状茎入药，具清热解毒，化痰散结、祛痰消肿之功能。用于治疗痈肿疗疮、凉痈、咽喉肿痛、跌打损伤、毒蛇咬伤等，药用价值较高。近年的研究表明其活性成分鬼臼毒素对治疗食道癌、子宫癌有特效，而且花和叶较美丽，可供观赏；由于人们多年过度采挖及自然繁殖成活率低等因素，八角莲野外资源锐减，濒于灭绝，难以满足医药领域的需要，目前已被列为国家珍稀濒危三级保护植物。近年来，国内外学者对八角莲属及其近缘属植物的解剖学、系统学、药理学和植物化学等方面，已有一系列的研究报道，为进一步深入研究打下了很好的基础。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种八角莲愈伤组织或悬浮细胞的快速繁殖方法，由该方法所制备得到的八角莲愈伤组织或者悬浮细胞中有较高含量的鬼臼毒素，可以规模化的为药厂提供制药的原料。
本发明所要解决的技术问题是通过以下方案来实现的：
一种八角莲愈伤组织或悬浮细胞的快速繁殖方法，包括无菌芽的获得，愈伤组织诱导及继代培养、悬浮细胞培养、愈伤组织或悬浮细胞中产生含量较高的鬼臼毒素类化合物等步骤，其主要步骤如下：将八角莲叶片用毛刷洗去表面污垢，用洗衣粉侵泡三分钟，流水冲洗30min，超净工作台上氯化汞消毒处理12min，流水冲洗30min，无菌水冲洗4-5次，然后用无菌的滤纸吸去叶片表面的水分。消毒过后的八角莲叶片接种到愈伤组织诱导培养基DKW+IAA0.6mg/L+2ip2mg/L中进行愈伤组织诱导，继代培养4-5代后获得嫩绿松散的愈伤组织。诱导出来的八角莲愈伤组织接种到MS液体培养基+ KT0.5mg/L+2，4-D1mg/L中振荡培养，继代培养3代，得到八角莲液体悬浮培养细胞。所得到的液体悬浮培养的细胞接种在下述液体培养基中进行振荡培养： MS液体培养基+KT0.5mg/L+2，4-D1mg/L+纳米氧化钛5mg/L，培养30天后，收集悬浮细胞；或将步骤（2）诱导出的八角莲愈伤组织继代培养在下述固体培养基上培养：MS固体培养基+ KT0.5mg/L+2，4-D1mg/L+纳米氧化钛1-5mg/L，培养30天后，收集八角莲愈伤组织。提取检测其鬼臼毒素的含量。
采用本发明制备八角莲鬼臼毒素含量高的愈伤组织或悬浮细胞，周期短，细胞增量大，能耗少，八角莲愈伤组织诱导率94%，鬼臼毒素的含量达0.209%，利于大生产操作。
下面将结合具体实施方式对本发明作进一步阐述，但本发明要求保护的范围并不局限于下列实施方式。
实施例1
将八角莲叶片用毛刷洗去表面污垢，用洗衣粉侵泡三分钟，流水冲洗30min，超净工作台上氯化汞消毒处理12min，流水冲洗30min，无菌水冲洗4-5次，然后用无菌的滤纸吸去叶片表面的水分，消毒过后的八角莲叶片接种到愈伤组织诱导培养基DKW+IAA0.3mg/L+2ip1mg/L中进行愈伤组织诱导，继代培养4-5代后获得嫩绿松散的愈伤组织，诱导出来的八角莲愈伤组织接种到MS液体培养基+ KT0.5mg/L+2，4-D1mg/L中振荡培养，继代培养3代，得到八角莲液体悬浮培养细胞。所得到的液体悬浮培养的细胞接种在下述液体培养基中进行振荡培养：MS液体培养基+KT0.5mg/L+2，4-D1mg/L+纳米氧化钛1mg/L，培养30天后，收集悬浮细胞；或将步骤（2）诱导出的八角莲愈伤组织继代培养在下述固体培养基上培养：MS固体培养基+ KT0.5mg/L+2，4-D1mg/L+纳米氧化钛1mg/L，培养30天后，收集八角莲愈伤组织，提取检测其鬼臼毒素的含量。八角莲愈伤组织诱导率 85%，鬼臼毒素的含量达0.132%。
实施例2
将八角莲叶片用毛刷洗去表面污垢，用洗衣粉侵泡三分钟，流水冲洗30min，超净工作台上氯化汞消毒处理12min，流水冲洗30min，无菌水冲洗4-5次，然后用无菌的滤纸吸去叶片表面的水分，消毒过后的八角莲叶片接种到愈伤组织诱导培养基DKW+IAA0.6mg/L+2ip2mg/L中进行愈伤组织诱导，继代培养4-5代后获得嫩绿松散的愈伤组织，诱导出来的八角莲愈伤组织接种到MS液体培养基+ KT0.5mg/L+2，4-D1mg/L中振荡培养，继代培养3代，得到八角莲液体悬浮培养细胞，所得到的液体悬浮培养的细胞接种在下述液体培养基中进行振荡培养： MS液体培养基+KT0.5mg/L+2，4-D1mg/L+纳米氧化钛1-5mg/L，培养30天后，收集悬浮细胞；或将步骤（2）诱导出的八角莲愈伤组织继代培养在下述固体培养基上培养：MS固体培养基+ KT0.5mg/L+2，4-D1mg/L+纳米氧化钛3mg/L，培养30天后，收集八角莲愈伤组织，提取检测其鬼臼毒素的含量，八角莲愈伤组织诱导率87%，鬼臼毒素的含量达0.129% 。
实施例3
将八角莲叶片用毛刷洗去表面污垢，用洗衣粉侵泡三分钟，流水冲洗30min，超净工作台上氯化汞消毒处理12min，流水冲洗30min，无菌水冲洗4-5次，然后用无菌的滤纸吸去叶片表面的水分，消毒过后的八角莲叶片接种到愈伤组织诱导培养基DKW+IAA0.3mg/L+2ip2mg/L中进行愈伤组织诱导，继代培养4-5代后获得嫩绿松散的愈伤组织。诱导出来的八角莲愈伤组织接种到MS液体培养基+ KT0.5mg/L+2，4-D1mg/L中振荡培养，继代培养3代，得到八角莲液体悬浮培养细胞，所得到的液体悬浮培养的细胞接种在下述液体培养基中进行振荡培养： MS液体培养基+KT0.5mg/L+2，4-D1mg/L+纳米氧化钛3mg/L，培养30天后，收集悬浮细胞；或将步骤（2）诱导出的八角莲愈伤组织继代培养在下述固体培养基上培养：MS固体培养基+ KT0.5mg/L+2，4-D1mg/L+纳米氧化钛3mg/L，培养30天后，收集八角莲愈伤组织，提取检测其鬼臼毒素的含量。八角莲愈伤组织诱导率 90%，鬼臼毒素的含量达0.145% 。
实施例4
将八角莲叶片用毛刷洗去表面污垢，用洗衣粉侵泡三分钟，流水冲洗30min，超净工作台上氯化汞消毒处理12min，流水冲洗30min，无菌水冲洗4-5次，然后用无菌的滤纸吸去叶片表面的水分，消毒过后的八角莲叶片接种到愈伤组织诱导培养基DKW+IAA0.9mg/L+2ip2mg/L中进行愈伤组织诱导，继代培养4-5代后获得嫩绿松散的愈伤组织。诱导出来的八角莲愈伤组织接种到MS液体培养基+ KT0.5mg/L+2，4-D1mg/L中振荡培养，继代培养3代，得到八角莲液体悬浮培养细胞，所得到的液体悬浮培养的细胞接种在下述液体培养基中进行振荡培养： MS液体培养基+KT0.5mg/L+2，4-D1mg/L+纳米氧化钛5mg/L，培养30天后，收集悬浮细胞；或将步骤（2）诱导出的八角莲愈伤组织继代培养在下述固体培养基上培养：MS固体培养基+ KT0.5mg/L+2，4-D1mg/L+纳米氧化钛5mg/L，培养30天后，收集八角莲愈伤组织，提取检测其鬼臼毒素的含量。八角莲愈伤组织诱导率89%，鬼臼毒素的含量达0.202%。
实施例5
将八角莲叶片用毛刷洗去表面污垢，用洗衣粉侵泡三分钟，流水冲洗30min，超净工作台上氯化汞消毒处理12min，流水冲洗30min，无菌水冲洗4-5次，然后用无菌的滤纸吸去叶片表面的水分，消毒过后的八角莲叶片接种到愈伤组织诱导培养基DKW+IAA0.6mg/L+2ip2mg/L中进行愈伤组织诱导，继代培养4-5代后获得嫩绿松散的愈伤组织，诱导出来的八角莲愈伤组织接种到MS液体培养基+ KT0.5mg/L+2，4-D1mg/L中振荡培养，继代培养3代，得到八角莲液体悬浮培养细胞。所得到的液体悬浮培养的细胞接种在下述液体培养基中进行振荡培养： MS液体培养基+KT0.5mg/L+2，4-D1mg/L+纳米氧化钛3mg/L，培养30天后，收集悬浮细胞；或将步骤（2）诱导出的八角莲愈伤组织继代培养在下述固体培养基上培养：MS固体培养基+ KT0.5mg/L+2，4-D1mg/L+纳米氧化钛3mg/L，培养30天后，收集八角莲愈伤组织，提取检测其鬼臼毒素的含量。八角莲愈伤组织诱导率 90%，鬼臼毒素的含量达0.197%。
Claims (6)
1.一种八角莲愈伤组织或悬浮细胞的快速繁殖方法，包括无菌芽的获得、愈伤组织诱导及继代培养、悬浮细胞的培养等，其主要步骤如下：
1）、按照常规植物组织培养的消毒方法对芽进行消毒处理，获得无菌的八角莲叶片；
2）、将步骤（1）所获得的八角莲叶片接种到愈伤组织诱导培养基中进行愈伤组织诱导，继代培养4-5代后获得嫩绿松散的愈伤组织；
3）、将步骤（2）所得的八角莲愈伤组织接种到KT和2，4-D的MS培养基中振荡培养，继代培养3代，得到八角莲液体悬浮培养细胞；
4）、将步骤（3）所得到的液体悬浮培养的细胞接种在下述液体培养基中进行振荡培养：
MS液体培养基+KT0.5mg/L+2，4-D1mg/L+纳米氧化钛1-5mg/L，培养30天后，收集悬浮细胞；或将步骤（2）诱导出的八角莲愈伤组织继代培养在下述固体培养基上培养：MS固体培养基+ KT0.5mg/L+2，4-D1mg/L+纳米氧化钛1-5mg/L，培养30天后，收集八角莲愈伤组织。
2.按照权利要求1的快速繁殖方法，其特征在于：步骤（1）中所述无菌的八角莲叶片按下列消毒方法得到：将八角莲叶片用毛刷洗去表面污垢，用洗衣粉侵泡三分钟，流水冲洗30min，超净工作台上氯化汞消毒处理12min，流水冲洗30min，无菌水冲洗4-5次，然后用无菌的滤纸吸去叶片表面的水分。
3.按照权利要求1的快速繁殖方法，其特征在于：步骤（2）中八角莲愈伤组织诱导的诱导配方为：DKW+IAA0.3-0.9mg/L+2ip1-3mg/L。
4.按照权利要求1的快速繁殖方法，其特征在于：步骤中八角莲组织培养的条件为温度25℃，光照强度1000-2000lx，光照时间12-14h/d。
5.按照权利要求1的快速繁殖方法，其特征在于：步骤（3）中八角莲悬浮细胞的培养，培养基配方为MS液体培养基+ KT0.5mg/L+2，4-D1mg/L。
6.按照权利要求1的快速繁殖方法，其特征在于：步骤（3）纳米氧化钛加入培养基的方式是过滤灭菌。
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Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN105010146A (zh) * | 2015-08-14 | 2015-11-04 | 广西壮族自治区药用植物园 | 八角莲的快速繁殖方法 |
| CN111657145A (zh) * | 2020-06-28 | 2020-09-15 | 张家界欣农农业科技有限公司 | 一种快速培育八角莲幼苗的方法 |
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2013
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Application publication date: 20131218 |