CN104094840A

CN104094840A - 花曲柳悬浮培养体系的建立方法

Info

Publication number: CN104094840A
Application number: CN201310111904.7A
Authority: CN
Inventors: 詹亚光; 刘孚婧; 齐凤慧; 尹静; 曾凡锁; 范桂枝
Original assignee: Northeast Forestry University
Current assignee: Northeast Forestry University
Priority date: 2013-04-02
Filing date: 2013-04-02
Publication date: 2014-10-15

Abstract

本发明属于细胞工程技术领域。具体涉及一种花曲柳(Fraxinus rhynchophylla Hance.)愈伤组织团块悬浮培养体系的建立方法。本发明以优良花曲柳茎段和叶片作为原始材料，在添加了激素NAA和TDZ的WPM固体培养基上诱导出愈伤组织，将愈伤组织接种到添加了激素NAA和TDZ的WPM液体培养基中，光照振荡培养。经过多代定向诱导驯化，建立了生长量稳定，增殖迅速，团块均匀的愈伤组织团块悬浮系。本发明具有方法简单易行，操作性强，增殖系数可观，能够促进花曲柳的快速繁殖的特点。

Description

花曲柳悬浮培养体系的建立方法

技术领域

一种利用基本培养基和附加激素建立花曲柳悬浮培养体系的方法，本发明隶属植物细胞工程的技术领域。

背景技术

花曲柳(Fraxinus rhynchophylla Hance.)属于木犀科梣属落叶大乔木，又称大叶白蜡、苦枥白蜡树。干燥树皮、枝皮为我国的传统中药材“秦皮”的四种入药皮料之一，具有清热燥湿、明目和止咳平喘的作用。近年来的分析化学研究表明，其树皮中含有多种香豆素类成分，如秦皮甲素(Esculin)，秦皮乙素(Esculetin)，秦皮苷(Fraxin)，秦皮素(Fraxetol)等。花曲柳干燥枝皮、干皮具有清热燥湿，明目，收涩的功效。现代药理学研究表明，其皮兼有抗菌、消炎、利尿、止咳平喘、镇静、祛痰等作用。近年来，有学者研究发现，香豆素类成分具有抗肿瘤、抗HIV以及免疫调节的重要作用。这使得香豆素类物质的价值越来越多地得以体现。目前常用药用香豆素类化合物主要来自于木犀科白蜡属植物，在入药的秦皮来源中，花曲柳树皮的香豆素总量含量最多。这使得白蜡属树木资源遭到了破坏，而树木的再生周期较长，树皮再生慢，且易受病虫害侵害，环剥将造成树木死亡，长此以往，白蜡属树木资源会趋于枯竭，违背了科学发展观的可持续发展思想。利用植物细胞工程手段，培养大量悬浮细胞并分离其次生代谢产物，提高花曲柳悬浮培养体系中香豆素类物质的含量，且不受季节限制，这将对花曲柳香豆素类药用成分生产和临床应用及花曲柳物种的保护起到积极的推动作用。

以花曲柳悬浮培养愈伤组织团块进行细胞工程、基因工程等研究有明显优势，原因之一是愈伤组织团块取材少，生长速度快，组织形成稳定结构，次生代谢产物产量高，受其他细胞和微环境影响不大，遗传学上也比较稳定；其次是愈伤组织团块继代周期短，增殖速度快，通过再分化手段对再生植株进行选择培养，也可以缩短育种年限，对保护物种有重要意义。目前，花曲柳愈伤组织培养研究外植体材料来源主要为休眠芽萌发茎段、无菌种子萌发的茎段。愈伤组织诱导植株再生及悬浮培养体系的建立尚未见报道。

发明内容

本发明目的是建立一种花曲柳悬浮培养体系的方法，该法简单易行，操作性强，增殖系数可观，能够促进花曲柳的快速繁殖。

为达到上述目的，本发明采用以下技术措施：

步骤一，以花曲柳的茎段和叶片作为外植体，首先用75%酒精浸泡25-30s，然后用饱和Ca(ClO)₂水溶液处理8～12min，最后用无菌水冲洗4-6次；

步骤二，将消毒好的茎段(或叶片)在培养皿中用无菌刀切割成0.5-1cm(或cm²)左右的小段(或块)，接种于固体WPM基本培养基附加NAA(a-naphthalene acetic acid)1.2-1.8mg/L、TDZ(thidiazuron)0.05-0.1mg/L、蔗糖20g/L、琼脂5.3g/L、pH6.0～6.5。

步骤三，光照培养，温度23～26℃，每天光照16h，培养30d；

步骤四，将诱导出的愈伤组织用无菌刀切成0.5-1cm²，接种到含有约50mL液体培养基的100mL的三角瓶中，每瓶接种愈伤组织30-50块，置于转速为110-140r/min的摇床上，温度23-26℃，每天光照16h，培养7-14d继代一次。培养基使用1/2WPM基本培养基附加NAA(a-naphthalene acetic acid)0.7-1.4mg/L、TDZ(thidiazuron)0.03-0.07mg/L、蔗糖20g/L、pH6.0～6.5。

本发明的优点是：利用花曲柳茎段诱导形成的愈伤组织，诱导率达到100%，进一步建立愈伤组织团块悬浮培养体系，每14天增殖3-5倍，愈伤组织紧密，干物质含量高，有利于次生代谢产物的积累，本发明建立的悬浮体系可用于生物反应器培养和扩大生产。

本发明方法简单易行，操作性强，增殖系数可观，能够促进花曲柳的快速繁殖。。

附图说明：悬浮培养7d的花曲柳愈伤组织。

附图说明

图1花曲柳悬浮细胞侧面观察图

图2花曲柳悬浮细胞底部观察图

具体实施方式：

一种水曲柳悬浮培养体系的建立方法，其具体步骤如下：

步骤一，以花曲柳茎段和叶片作为外植体，用75%酒精浸泡25s或28s或30s，用饱和Ca(ClO)₂水溶液处理8min或10min或12min，用无菌水冲洗4次或5次或6次；

步骤二，将消毒好的茎段和叶片在培养皿中用无菌刀切割成0.5-1cm(cm²)左右的小段(块)，接种在固体启动培养基上，WPM培养基附加NAA(a-naphthalene aceticacid)1.2-1.8mg/L、TDZ(thidiazuron)0.05-0.1mg/L、蔗糖20g/L、琼脂5.3g/L、pH6.0～6.5；

步骤三，待愈伤组织长到1cm～2cm³，转到继代培养基WPM培养基附加NAA1.0mg/L、TDZ(thidiazuron)0.1mg/L、蔗糖20g/L、琼脂5.3g/L、pH6.0～6.5；每天光照16h，温度23℃～26℃，培养30d；

步骤四，将愈伤组织用无菌刀切成0.5～1cm(或cm²)左右的小段(或块)，接种到含有50mL液体培养基的100mL的三角瓶中，每瓶接种愈伤组织3g,，置于转速为110-140r/min的摇床上，温度23℃～26℃，每天光照16h，培养7-14d继代一次。悬浮培养基为1/2WPM基本培养基附加NAA0.7-1.4mg/L、TDZ0.03-0.07mg/L、蔗糖20g/L、pH6.0-6.5。

步骤五，继代培养3-5次后，即可获得稳定悬浮培养系，每代增殖3-5倍。

Claims

1.一种花曲柳(Fraxinus rhynchophylla Hance.)愈伤组织团块悬浮体系建立的方法，其特征在于它包括如下步骤：

（1）外植体制备

材料消毒：在超净工作台上将取下的花曲柳茎段和叶片在75%酒精浸泡25-30s，无菌水冲洗2次，每次5分钟，置入饱和Ca(ClO)₂水溶液处理8-12min，用无菌水冲洗4-6次，每次5分钟，无菌滤纸上吸干；

（2）愈伤组织诱导

将（1）处理好的花曲柳茎段(或叶片)切割成0.5-1cm(或cm²)左右的小段(或块)，接入诱导愈伤组织培养基中诱导愈伤组织；

（3）悬浮培养体系建立

将（2）获得的愈伤组织切割成0.5-1cm³，接种到适合悬浮细胞生长的液体培养基中，置于转速为110-140r/min的摇床上，温度23-26℃，每天光照16h，培养7-14d继代一次。

2.按照权利要求1所述的一种花曲柳愈伤组织团块悬浮体系建立的方法，其特征在于，步骤（1）中所述的花曲柳外植体为花曲柳休眠芽萌发的茎段和叶片。

3.按照权利要求1所述的一种花曲柳愈伤组织团块悬浮体系建立的方法，其特征在于，步骤（2）中所述的愈伤组织诱导培养基为在1升WPM培养基中加入下述的原料及配比制成：

。

4.按照权利要求1所述的一种花曲柳愈伤组织团块悬浮体系建立的方法，其特征在于，步骤（3）中所述的悬浮细胞液体培养基为在1升1/2WPM基本培养基中加入下述原料及配比制成：

蔗糖 20-30g

萘乙酸(a-naphthalene acetic acid) 0.7-1.4mg/L

N-苯基-N-1,2,3-噻二唑（thidiazuron） 0.03-0.07mg/L 。