CN103415301A

CN103415301A - 用于与包括与人造表面接触的医疗操作一起施用的fxii抑制剂

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Publication number: CN103415301A
Application number: CN2012800122440A
Authority: CN
Inventors: S·泽特勒; M·诺尔特; S·舒尔特; G·迪肯内特; I·普拉格斯特
Original assignee: CSL Behring GmbH Deutschland
Current assignee: CSL Behring GmbH Deutschland
Priority date: 2011-03-09
Filing date: 2012-03-09
Publication date: 2013-11-27
Also published as: PL2683397T3; CA2829037C; DK2683397T3; ES2646191T3; WO2012120128A1; AU2012224514A1; CA2829037A1; KR20140011372A; JP6109081B2; US9352016B2; EP2683397A1; KR101954052B1; US20140072600A1; EP2683397B1; US20160279195A1; US9987328B2; AU2016213799A1; JP2014508771A

Abstract

一种用于在对人或动物受试者进行的医疗操作期间和/或之后防止血栓的形成和/或稳定化的FXII/FXIIa抑制剂，所述医疗操作包括将所述人或动物受试者的血液与人造表面接触，其中在所述医疗操作之前和/或期间和/或之后施用所述FXII/FXIIa抑制剂。

Description

用于与包括与人造表面接触的医疗操作一起施用的FXII抑制剂

领域

本申请涉及在医疗操作中FXII/FXIIa抑制剂的应用，所述医疗操作包括将血液与人造表面接触。某些实施方案涉及需要需要心肺旁路术(cardiopulmonary bypass，CPB)泵的外科手术的患者的抗凝血疗法，其中凝血因子FXII/FXIIa抑制剂的创新使用减少或替代了在CPB手术过程中对肝素//比伐卢定施用的需要。在某些实施方案中，将FXII抑制剂涂覆在人造表面上。

背景

血管壁损伤和人造表面会触发血小板的突然粘附和聚集，随后活化血浆凝结系统，形成含血纤蛋白的血栓，其会阻塞损伤部位。这些机制对于限制创伤后失血是至关重要的，但也可能阻塞患病血管，从而导致要害器官(vital organ)的缺血和梗塞或CPB膜的阻塞。

在经典的瀑布模型中，血液凝固通过一系列反应进行，所述反应牵涉通过有限蛋白酶解激活酶原，导致凝血酶的产生，所述凝血酶将血浆血纤蛋白原转化成血纤蛋白并且活化血小板。反过来，胶原粘附或血纤蛋白粘附的血小板通过将凝血前磷脂(主要地磷脂酰丝氨酸)暴露于它们的外表面(这使凝血蛋白酶复合物的装配和活化得到扩增)，以及通过血小板受体与凝结因子之间的直接相互作用来帮助凝血酶的产生放大数个数量级。

存在由脉管系统的外源性(血管壁)或内源性(血液传播)组分触发的两个交会的凝血途径。“外源性”途径由血浆因子VII(FVII)与整合膜蛋白(integral membrane protein)组织因子(TF)(不存在于腔表面但在血管的内皮下层中强表达，并且是可及的或通过组织损伤释放的必需凝血辅因子)的复合物引发。循环微囊泡中表达的TF还可能通过在活化血小板的表面上持续产生凝血酶来促成血栓扩展。

当因子XII(FXII，Hageman因子)与带负电荷的表面在牵涉高分子量激肽原和血浆激肽释放酶的反应中接触时，“内部”或“接触活化途径”被启动。FXII可被内皮下基质的大分子组分例如葡糖氨基聚糖和胶原、硫苷脂、核苷酸和其它可溶性聚阴离子或非生理材料例如玻璃或聚合物激活。效力最强的接触激活剂之一是高岭土，该反应充当主要临床凝固测试、测量“内源性”途径的凝固功能的激活部分促凝血酶原激酶时间(activated partial thromboplastin time，aPTT)的机制基础。在由血小板扩大的反应中，激活的FXII(FXIIa)随后将FXI激活成FXIa，随后FXIa将FIX激活成FIXa。FVIIIa(所述FVIIIa先前已被痕量FXa和/或凝血酶激活)与FIXa的复合物(tenase复合物)随后将FX激活成FXa。尽管其在体外诱导血液凝固的效力很强，但FXII-触发的内部凝血途径的(病理)生理学意义受到FXII以及高分子量激肽原和血浆激肽释放酶的遗传缺乏与严重出血并发症无关的事实质疑。加上观察到缺乏外源性途径组分例如TF和FVII的人和小鼠患有严重出血，得到如下的假说：为了在体内停止出血，可能专有地需要外部级联(Mackman,N.2004.Role of tissue factor in hemostasis,thrombosis,andvascular development.Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.24,1015-1022)。

在病理状态中，凝血级联可被不恰当地活化，这从而导致血管内部稳态作用性塞(hemostatically acting plug)的形成。由此，血管可被阻塞，从而限制对远端器官的供血。此外，所形成的血栓可脱离并且在身体的其它部位中发生栓塞，导致缺血性阻塞。该过程称为血栓栓塞并且与高死亡率相关。

在W020061066878中，提议使用抗FXII/FXIIa抗体或使用FXII/FXIIa的抑制剂来防止血栓的形成和/或稳定化。抗凝血酶（ATIII）、血管紧张素转化酶抑制剂、C1抑制剂、抑肽酶、α-I蛋白酶抑制剂、抗蛋白酶素([(S)-l-羧基-2-苯乙基]-氨甲酰基-L-Arg-L-Val-Arginal)、Z-Pro-Pro-醛-二甲基乙酸酯、DX88(DyaxInc.,300Technology Square,Cambridge,MA02139,USA;WilliamsA和Baird LG.2003.DX-88and HAE:a developmental perspective.Transfus Apheresis Sci.29:255-258中引用的)、亮抑酶肽(leupeptin)、脯氨酰寡肽酶的抑制剂例如Fmoc-Ala-Pyr-CN、玉米胰蛋白酶抑制剂、牛胰胰蛋白酶抑制剂的突变体、大肠杆菌素(ecotin)、黄鳍金枪鱼抗凝血剂蛋白(yellowfin sole anticoagulant protein)、笋瓜（Curcurbita maxima）胰蛋白酶抑制剂-v包括笋瓜同效抑制剂(isoinhibitor)和Hamadarin(如由Isawa H等人2002.A mosquitosalivary protein inhibits activation of the plasma contact systemby binding to factor XI and high molecular weight kininogen.J.Biol.Chem.277:27651-27658公开的)已被推荐为潜在的抑制剂。

最近，Infestin-4被报导为FXIIa的新型抑制剂。Infestin是一类来源于吸血昆虫骚扰锥蝽(Triatoma infestans)(已知引起Chagas病的寄生虫克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)的主要载体)的中肠的丝氨酸蛋白酶抑制剂(Campos ITN等人32Insect Biochem.Mol.Bio.991-997,2002;Campos ITN等人577FEBS Lett.512-516,2004)。该昆虫使用此类抑制剂来阻止摄入的血液的凝固。Infestin基因编码4个结构域，得到可抑制凝血途径中的不同因子的蛋白质。具体地，结构域4编码作为FXIIa的强抑制剂的蛋白质(Infestin-4)。Infestin-4已被施用于小鼠而无出血并发症发生(WO2008/098720)。

因为人造表面可触发接触活化途径，所以在涉及血液与这类人造表面接触的医疗操作中存在相当大的医学风险。因此，与血液接触的假体器械(prosthetic devices)或血液透析器的使用由于内部凝血级联的活化而受到严格限制。假体表面的适当涂覆可在一些情况下避免所述问题，但在其它情况下可削弱其功能。此类假体装置的实例是心脏瓣膜、血管支架和留置导尿管(in-dwelling catheter)。

在其中使用此类装置的情况下，需要施用抗凝剂例如肝素来防止在表面上形成血纤蛋白。

然而，一些患者不耐受肝素，这可引起肝素诱发的血小板减少症(HIT)，从而导致血小板聚集和威胁生命的血栓形成。此外，临床中使用的所有抗凝剂的固有不利方面是严重出血事件的风险增加。因此，存在对新型抗凝剂的强烈需要，所述抗凝剂不伴有此类并发症，并且能够用于受累患者或用作阻止血栓形成而无增加的出血风险的优良治疗方案(Renne T等人2005.Defective thrombus formation in mice lackingfactor XII.J.Exp.Med.202:271-281)。

牵涉大量接触活化的医疗操作是心肺旁路术(cardiopulmonarybypass)(CPB)。目前，因以下两个原因使用心脏手术中的CPB装置：a)在正在进行心脏手术的患者心脏麻痹过程中血液循环的人工维持(泵功能)和b)在正在进行心脏手术的患者的心脏麻痹过程中通过半透膜氧合进行的血液的人工氧合(氧气供给器功能)。

由于通过泵功能进行的人工血流维持，患者的血液流经半透膜(～3m²，人造表面)，所述半透膜允许氧穿过膜和结合红细胞，同时血液本身保持在封闭的人造循环系统中。该人工氧合对于患者是至关重要的，并且在CPB期间需要抗凝策略(H.P.Wendl等人1996;Immunpharmacology;C.Sperling等人;Biomaterials30(2009))。目前使用的CPB装置具有高达3m²人造表面，其导致凝血系统、炎症系统的大量接触活化以及补体系统的活化。为了使这些效应对提及的级联系统的作用减小至最小，使用不同类型的多聚体生物材料(例如2-甲基丙烯氧基乙基磷酸胆碱MCP)(Yu J等人;Int J Artif Organs1994;17:499-504;C.Sperling等人Biomaterial30(2009)4447-4456)。尽管实际上使用不太形成血栓的新型表面材料如极性磷酸胆碱，但仍然有必要通过肝素/比伐卢定对经历CPB的患者进行抗凝，因为血小板介导的反应可立即导致对患者具有致命结果的CPB氧气供给器阻塞。

目前有两种产品被许可用于在CPB期间的抗凝：

a)肝素：

以体重调整的方式(300-400IU/kg体重(BW))给患者施用肝素，随后立即连接CPB装置以防止患者的血液凝固。在将CPB与患者连接之前，其本身也加载肝素。这是允许在整个操作中利用人工氧合进行CPB手术而对患者无立即致命结果的唯一的抗凝策略。在该操作中，通过手术过程中的激活凝固时间(ACT)(正常值100-120秒；在手术过程中300-500秒)监测凝血能力。通过测量ACT，医生可以以半定量的方式指导肝素的给药。肝素结合AT(ATIII)并且建立可使凝血系统失活的快速抑制复合物。低分子量肝素(LMWH)主要抑制凝血酶原酶-复合物(因子X、因子Va、Ca²⁺、磷脂)，而未分级分离的肝素(UFH)还抑制因子II，从而比LMWH反应快。此外，因子IX、XI、XII和激肽释放酶被肝素灭活。

在CPB后，肝素的作用需要通过鱼精蛋白(1mg/100IU肝素)来拮抗，因为潜在出血事件对于患者可能是致命的。

该护理标准的主要限制是：

i)患者血液中肝素的量与ACT无关(Gruenwald等人2010;theJournal of Extra Corporeal Technology)，从而患者仍然存在处于低凝(hypo-coagulopathic)或高凝(hypercoagulopathic)状态的风险。

ii)肝素可诱导血小板减少症(通过凝血细胞的直接活化由肝素引起的HIT1，或通过肝素和血小板因子4积累以及抗复合物抗体的连续产生引起的HIT2)。

iii)CPB后肝素拮抗与患者在重症监护室(ICU)的抗凝疗法的开始之间的时间窗仍然存在出血或血栓形成事件的风险。

iv)作为肝素作用的解毒药的鱼精蛋白本身增加了血栓形成事件、严重过敏反应和血压致命下降的风险。此外，对于鱼精蛋白的第二次施用，在不足量给药的情况下可能对患者具有致命结果。

b)比伐卢定:

比伐卢定(衍生自水蛭素)已被注册用于具有已知HIT的患者，作为通过肝素进行抗凝的另一选择。该另类疗法的限制是：

i)当前在出血的情况下不能获得临床注册的解药。

ii)在CPB期间更高的血液制品消耗，这导致术后风险(C.Dyke等人;surgery for acquired cardiovascular disease2005)。

在本申请中令人惊讶地发现，FXII/FXIIa的抑制剂的使用可阻止凝血，而在CPB操作期间和之后出血的风险在操作包括将患者的血液与人造表面接触的医疗操作中并未增加，在某些实施方案，该接触在体外进行。因此，除了FXII/FXIIa抑制剂以外只需要施用减少量的其它抗凝剂。在一个实施方案中，除FXII/FXIIa抑制剂外，其它抗凝剂的添加可完全避免。这导致更安全的医疗操作，因为可避免当前疗法中固有的高出血风险以及因逆转抗凝而导致的并发症。

某些实施方案的概述

本申请提供了XII/FXIIa的抑制剂用于在对人或动物受试者进行的医疗操作期间和/或之后防止血栓的形成和/或稳定化，所述医疗操作包括将所述人或动物受试者的血液与人造表面接触，其中在所述医疗操作之前和/或期间和/或之后施用所述FXII/FXIIa抑制剂。在某些实施方案中，所述受试者的血液与人造表面之间的接触在受体者的身体之外进行。在本发明的一个实施方案中，将人造表面暴露于人或动物受试者的至少80%、90%或100%血液。在另一个实施方案中，将80%、90%或100%体积的人或动物受试者血液与人造表面接触少于30分钟，少于15分钟，少于10分钟，或少于5分钟。在另一个实施方案中，人造表面用作人或动物体外的血液容器，这样的血液在量上可以为至少50mL、100mL、200mL、300mL、400mL、500mL或更多。在一个实施方案中，暴露于患者血液的人造表面为至少0.2m²。在一些实施方案中，人造表面面积为至少0.1m²或至少0.5m²。在另一个实施方案中，人造表面不包括拉钩、针、解剖刀和仅与受试者血液的部分接触的其它手术器械。

另一个实施方案包括FXII/FXIIa抑制剂用于在对人或动物受试者进行的医疗操作期间和/或之后防止血栓的形成和/或稳定化，所述医疗操作包括将所述人或动物受试者的血液与人造表面接触，其中在所述医疗操作之前和/或期间和/或之后施用所述FXII/FXIIa抑制剂，并且此外其中

(i)将人造表面暴露于至少80%的受试者血液体积并且人造表面为至少0.2m²，或

(ii)人造表面是用于在受试者的体外收集血液的容器，或

(iii)人造表面是支架、瓣膜、管腔内导管或用于血液的内部辅助泵吸的系统。

另一个实施方案涉及FXII/FXIIa抑制剂用于在对人或动物受试者进行的医疗操作期间和/或之后防止血栓的形成和/或稳定化，所述医疗操作包括将所述人或动物受试者的血液与人造表面接触，其中在所述医疗操作之前、期间和/或之后施用所述FXII/FXIIa抑制剂，并且其中所述人或动物受试者不具有增加的出血风险，或其中所述人或动物受试者相较于与肝素或其衍生物和/或水蛭素或其衍生物的施用相关的出血风险相比具有降低的出血风险。优选出血风险未增加。

另一个实施方案涉及FXII/FXIIa抑制剂用于在对人或动物受试者进行的医疗操作期间和/或之后防止血栓的形成和/或稳定化，所述医疗操作包括将所述人或动物受试者的血液与人造表面接触，其中在所述医疗操作之前、期间和/或之后施用所述FXII/FXIIa抑制剂，并且其中所述人或动物受试者不具有增加的出血风险以及其中在所述人或动物受试者中，i)根据Duke的耳或指尖出血时间不超过10分钟或ii)根据Ivy的方法的出血时间不超过10分钟或iii)根据Marx的方法的出血时间不超过4分钟。

在某些实施方案中，所述医疗操作是

i)需要心肺旁路术的任何操作，或

ii)通过体外膜式氧合(extracorporeal membrane oxygenation)进行的血液氧合和泵吸，或

iii)血液的辅助泵吸(内部或外部)，或

iv)血液的透析，或

v)血液的体外滤过，或

vi)血液在任何容器中的收集，以待以后用于动物或人受试者，或

vii)静脉或动脉管腔内导管的使用，或

viii)用于诊断或介入性心脏插入导管术(interventionalcardiac catherisation)的设备的使用，或

ix)血管内装置的使用，或

x)人工心脏瓣膜的使用，或

xi)人工移植物的使用。

在另一个实施方案中，提供了医疗器械，其中所述医疗器械涂覆了FXII/FXIIa抑制剂。所述医疗器械可以是心肺旁路术机器、用于血液氧合的体外膜式氧合系统、用于血液辅助泵吸的装置、血液透析装置、用于血液体外滤过的装置、用于收集血液的容器、管腔内导管、支架、人工心脏瓣和/或用于这类装置中任一种的配件，包括管道、套管、离心泵、阀门、端口(port)、分流器(diverter)等。

在一个实施方案中，在医疗操作之前、之后和/或期间施用FXII/FXIIa抑制剂，所述医疗操作包括将血液收集在任何容器中以待以后用于动物或人受试者。在一个实施方案中，在献血过程之前和/或期间给献血者施用FXII/FXIIa抑制剂。在另一个实施方案中，将FXII/FXIIa抑制剂与血液在收集容器中混合。在另一个实施方案中，将FXII/FXIIa抑制剂置于收集容器中，随后收集血液，以及可将其涂覆在容器的内表面。在另一个实施方案中，在给人或动物接受者施用血液之前、期间和/或之后，给血液接受者施用FXII/FXIIa抑制剂。

在其它实施方案中，将FXII/FXIIa抑制剂与肝素或其衍生物和/或水蛭素或其衍生物一起施用，其中与当未施用FXII/FXIIa抑制剂时通常在所述医疗操作之前和/或期间施用的肝素或其衍生物和/或水蛭素或其衍生物的量相比，在医疗操作之前和/或期间和/或之后，除了FXII/FXIIa抑制剂之外，还添加减少量的肝素或其衍生物和/或水蛭素或其衍生物。“与......一起施用”意指同时(在单个制剂中或两个单独的制剂中)施用，或在1分钟、5、10、15,30或45分钟或1小时、2、3、4、5或6小时内施用，或对于相同的医疗操作以不同的次数施用。任一试剂可被首先施用。

肝素衍生物由从肝素衍生的一组产物(通过一个或多个化学修饰产生的)组成。例如，硫酸肝素是其中葡糖胺残基中的所有伯羟基和二糖单位中的大部分仲羟基已被O-硫酸酯取代的衍生物；羧基还原的肝素是其中肝素的糖醛酸残基的羧基已被还原成醇的衍生物；高碘酸氧化的肝素是其中肝素的所有未硫酸化的糖醛酸残基被高碘酸氧化的衍生物。其它肝素衍生物包括例如脱-O-硫酸肝素、2-O-脱硫肝素、完全N-乙酰化的肝素、完全N-硫酸化的肝素、脱-N-硫酸肝素、脱-N-乙酰化肝素。水蛭素衍生物还可包含化学修饰，其是对水蛭素肽的修饰，或衍生物可以是水蛭素肽的合成类似物，和/或可包含连接至例如载体分子的水蛭素肽，其可用于例如增加水蛭素的半衰期。水蛭素衍生物的实例包括来匹卢定和地西卢定。水蛭素衍生物的特征在于它们结合凝血酶的活性催化部位。

在一个实施方案中，与FXII/FXIIa抑制剂一起施用的肝素或其衍生物和/或水蛭素或其衍生物以减少的量施用，从而无FXII/FXIIa抑制剂时的ACT短于500秒。

在另一个实施方案中，在不施用肝素或其衍生物和/或不施用水蛭素或其衍生物的医疗操作中施用FXII/FXIIa抑制剂。

在一个实施方案中，人或动物受试者在医疗操作后具有降低的促血栓风险或无促血栓风险。在另一个实施方案中，人或动物受试者在肝素或其衍生物的术后拮抗后具有降低的促血栓风险或无所述风险，和/或水蛭素或其衍生物的术后拮抗通过使用FXII/FXIIa抑制剂得到防止或减弱。

在另一个实施方案中，肝素或其衍生物的术后拮抗和/或水蛭素或其衍生物的术后拮抗之后的促血栓风险通过在医疗操作之前、期间和/或之后施用FXII/FXIIa抑制剂来防止或降低，其中与未施用FXII/FXIIa抑制剂时通常在所述医疗操作之后施用的所述拮抗剂的量相比，在进行医疗操作后还添加减少量的肝素拮抗剂和/或水蛭素拮抗剂，或不添加肝素拮抗剂和/或水蛭素拮抗剂。

在一个实施方案中，根据本发明使用的FXII/FXIIa抑制剂包括

(i)野生型Infestin-4多肽序列(SEQ ID NO:1)或其变体，其中变体包括

(a)野生型Infestin-4序列的N末端氨基酸2-13和所述N末端氨基酸之外的至少一个并不超过5个氨基酸突变，所述突变导致与野生型Infestin-4序列的差异;

和/或

(b)来自野生型Infestin-4序列的6个保守半胱氨酸残基，和与野生型Infestin-4序列有至少70%的同源性。

(ii)SPINK-1(SEQ ID NO:2)，其被突变以包括野生型Infestin-4序列N末端氨基酸2-13，或所述突变的SPINK-1的变体，其中变体包含

(a)野生型Infestin-4序列的N末端氨基酸2-13；和所述N末端氨基酸之外的至少一个并且不超过5个氨基酸突变，所述突变导致与野生型SPINK-1序列的差异并且增加变体与野生型Infestin-4序列的同源性；和/或

(b)来自野生型SPINK-1序列的6个保守半胱氨酸残基，和与野生型SPINK-1序列有至少70%的同源性。

(iii)AT III、血管紧张素转换酶抑制剂、C1抑制剂、抑肽酶、α-1蛋白酶抑制剂、抗蛋白酶素([(S)-1羧基-2-苯乙基]-氨甲酰基-L-Arg-L-Val-Arginal)、Z-Pro-Pro-醛-二甲基乙酸酯、DX88、亮抑酶肽、脯氨酰寡肽酶的抑制剂例如Fmoc-Ala-Pyr-CN、玉米-胰蛋白酶抑制剂(CTI)、牛胰胰蛋白酶抑制剂的突变体、大肠杆菌素、YAP(黄鳍金枪鱼抗凝血剂蛋白)和笋瓜（Cucurbita maxima）胰蛋白酶抑制剂-v、笋瓜同效抑制剂和Pro-Phe-Arg-氯甲基-酮(PCK);

(iv)抗-FXII/FXIIa抗体，其中抗体结合FXII/FXIIa并且抑制其活性和/或活化。

在一个实施方案中，根据本发明使用的FXII/FXIIa抑制剂与增加半衰期的多肽连接，其中所述增加半衰期的肽任选地是白蛋白、afamin、甲胎蛋白或维生素D结合蛋白、人白蛋白或其变体、免疫球蛋白或其变体、IgG的Fc。在另一个实施方案中，所述增加半衰期的多肽通过接头与FXII/FXIIa抑制剂相连接。

附图概述

图1:在掺入FXII/FXIIa抑制剂rHA-Infestin-4后，猪全血的离体全血凝固时间(WBCT)能够被显著延长。在注射器中提供需要体积的rHA-Infestin-4。随后将猪全血添加至500μL的总体积，轻轻地混合，随后在预加温的玻璃小瓶中提供。凝固时间通过每分钟轻轻摇动玻璃小瓶(在水浴中于37℃温育)来目测确定。数据表示为平均值+平均值的标准误差。N=每一个浓度下2-3只猪的全血。

图2:在掺入抗-FXII/FXIIa单克隆抗体(MAb)后，鼠全血的离体WBCT能够被延长。在注射器中提供需要体积的抗-FXII/FXIIa MAb。随后将鼠全血添加至500μL的总体积，轻轻地混合，随后在预加温的玻璃小瓶中提供。通过每分钟轻轻摇动玻璃小瓶(在水浴中于37℃温育)来目测确定凝固时间。数据表示为平均值+平均值的标准误差。N=每一个浓度下3只小鼠的全血。

图3:在单次静脉内(i.v.)施用rHA-Infestin-4后，猪全血的离体WBCT被显著延长。在施用后指定的时间点上，从动物采集血液，在预加温的玻璃小瓶中予以提供。通过每分钟轻轻摇动玻璃小瓶(在水浴中于37℃温育)来目测确定凝固时间。

图4:猪血的aPTT在施用rHA-Infestin-4后相较于阴性对照被显著延长。

图5：在施用更高剂量的rHA-Infestin-4后，相较于aPTT的延长，猪血的PT仅被稍微延长。

图6:在施用rHA-Infestin-4后，猪皮肤出血时间保持在正常范围内(～2-5分钟)。该效应持续至实验结束。

图7：按照图7显示的图表进行猪模型中的体外循环。

图8：在rHA-Infestin-4施用后，猪血的aPTT在对体外循环进行的整个实验过程中仍然被显著延长。

图9：在体外实验过程中，在施用rHA-Infestin-4后，猪血的PT仅略受影响。

图10：在单次i.v.施用rHA-Infestin-4后，猪全血的离体WBCT在整个体外实验中被延长。在指定的时间点上，从该动物采集血液，于预加温的玻璃小瓶中予以提供。通过每分钟轻轻摇动玻璃小瓶(在水浴中于37℃温育)来目测确定凝固时间。

图11：R.prolixus抑制剂与凝血酶以及SPINK-1与胰凝乳蛋白酶的接触位点。#指示R.prolixus抑制剂与凝血酶之间的接触位点的氨基酸；+指示SPINK-1与胰凝乳蛋白酶之间的接触位点的氨基酸。

图12：Infestin-4(I4)与SPINK-1(SP)之间的氨基酸序列相似性。*表示相同的氨基酸；|表示类似氨基酸；粗体氨基酸是保守性的半胱氨酸；Infestin-4序列中加以下划线的氨基酸2-13是保守的。

图13：Infestin-4、SPINK1和3个SPINK1变体(K1、K2和K3)的氨基酸序列。*表示相同的氨基酸；|表示相对于Infestin-4序列类似的氨基酸。I4的下划线序列被用于替代SPINK-1的15个氨基酸，产生K1。变体K2和K3通过在K1序列上进行额外的点突变(下划线的氨基酸)来产生。

发明详述

FXII/FXIIa抑制剂是指因子XII和活化的因子XII(FXIIa)之一或两者的抑制剂。

本申请涉及在对人或动物受试者进行的医疗操作期间和/或之后采用FXII/FXIIa抑制剂来防止血栓的形成和/或稳定化，所述医疗操作包括将所述人或动物受试者的血液与人造表面接触，其中在所述医疗操作之前、期间和/或之后施用所述FXII/FXIIa抑制剂。

人造表面是任何非人或非动物表面，其在医疗操作期间与血液接触，导致因子XII向因子XIIa的接触激活。在某些实施方案中，受试者的血液与人造表面之间的接触发生在受试者的身体之外。一个非限定性实例为，这样的人造表面可以是钢、任何类型的塑料、玻璃、硅、橡胶等。在一个实施方案中，将人造表面暴露于人或动物受试者血液的至少80%、90%或100%。在另一个实施方案中，80%、90%或100%体积的人或动物受试者血液接触人造表面少于30分钟，少于15分钟，少于10分钟或少于5分钟。在另一个实施方案中，人造表面用作人或动物身体之外的血液的容器，这样的血液可以以至少50mL、100mL、200mL、300mL、400mL、500mL或更多的量存在。在一个实施方案中，暴露于患者血液的人造表面为至少0.2m²。在一个实施方案中，将整个体积的患者血液暴露于人造表面，所述表面为至少0.2m²。在一些实施方案中，人造表面的面积为至少0.1m²，或至少0.5m²。在另一个实施方案中，人造表面不包括拉钩(retractor)、针、解剖刀和仅与受试者血液的一部分接触的其它手术器械。

在一个实施方案中，在医疗操作之前、期间和/或之后施用FXII/FXIIa抑制剂。在另一个实施方案中，在医疗操作过程中施用FXII/FXIIa抑制剂。在另一个实施方案中，还可在开始医疗操作之前施用FXII/FXIIa抑制剂。其甚至可能在医疗操作后进行施用也是有利的，因为在手术过程中在已被整合在血管内的人工表面上可能发生接触活化。

另一个实施方案涉及FXII/FXIIa抑制剂在对人或动物受试者进行的医疗操作期间和/或之后用于防止血栓的形成和/或稳定化，所述医疗操作包括将所述人或动物受试者的血液与人造表面接触，其中血液与人造表面之间的接触在受试者的身体之外发生，其中在所述医疗操作之前、期间和/或之后施用所述FXII/FXIIa抑制剂，并且其中所述人或动物受试者不具有增加的出血风险。在一些实施方案中，所述受试者的血液与至少一部分人造表面之间的接触在受试者的身体“之外”发生，在某些实施方案中，距离受试者的身体至少1cm、或2cm、或3cm、或4cm、或5cm、或10cm、或15cm、或20cm、或50cm或更多。

另一个实施方案涉及FXII/FXIIa抑制剂在对人或动物受试者进行的医疗操作期间和/或之后用于防止血栓的形成和/或稳定化，所述医疗操作包括将所述人或动物受试者的血液与人造表面接触，其中在所述医疗操作之前、期间和/或之后施用所述FXII/FXIIa抑制剂，并且其中所述人或动物受试者不具有增加的出血风险，以及其中在所述人或动物受试者中，i)根据Duke的耳或指尖出血时间不超过10分钟，不超过8分钟，或不超过6分钟或不超过5分钟，或ii)根据Ivy方法的出血时间不超过10分钟，不超过8分钟，或不超过6分钟或不超过5分钟，或iii)根据Marx方法的出血时间不超过4分钟，不超过3分钟，或不超过2分钟。换句话说：归因于FXII/FXIIa抑制剂的施用。

根据Duke、Ivy或Marx的出血风险的测定仅是可用于测定人或动物受试者中出血风险的各方法的非限定性实例。在动物中，出血风险还可通过测定皮肤出血时间来进行估量。例如在猪中，皮肤出血时间(SBT)可定义为到从由使用切割装置(International TechnidyneCorp.,Edison,New Jersey,USA)产生的标准5mm长1mm深的内耳切口出血停止的时间。

对照上述动物测试，下面描述用于人的测试法。

对受试者的耳垂边缘或指尖(利用测血压布袖袋(blood pressurecuff)缠绕上臂(40mm Hg))测定Duke法的出血时间。研究者利用柳叶刀刺穿耳垂边缘或指尖，诱导～3mm深的组织损伤。随后研究者让血液通过重力滴出组织损伤而不技术性地或人工地损害损伤。每15至30秒用纤维素纸擦去滴落的血液而不触碰伤口。重复该方法直到研究者通过目视检查检测到停止。这一目视估量的出血测试的正常值不超过5分钟。然而，还取决于个体受试者，存在一定的变化，这样根据Duke的正常出血时间还可长达6分钟，或长达8分钟或长达10分钟。

根据Ivy法的出血时间通过在前臂内侧的皮肤中进行确定的切割(例如

)来进行测试，同时通过受试者的上臂上的测血压布袖袋(40mm Hg)产生标准化组织压。研究者每30秒擦去通过重力从伤口流出的血液而不触碰伤口。随后记录时间直至出血停止。该目视估量的出血测试的正常值不超过5分钟。然而，还取决于个体受试者，存在一定的变化，这样，根据Ivy的正常出血时间还可长达6分钟，或长达8分钟或长达10分钟。

根据Marx的subaquale出血时间通过使用柳叶刀在受试者的指尖上产生的组织损伤来进行测试。在组织损伤产生后，需要立即将指尖插入37℃的水中。随后，在手指保持在水下的同时，研究者目视检查出血，监测到出血停止而不损害组织损伤时的时间。该目视估量的出血测试的正常值可长达2分钟。然而，还取决于个体受试者，存在一定的变化，这样根据Marx的正常出血时间还可长达3分钟或长达4分钟。

在某些实施方案中，以非限定性实例为例，医疗操作是：

i)使用心肺旁路术(CBP)的任何操作，包括例如冠状动脉旁路移植(CABG)、瓣膜置换术、主动脉置换术以及心脏或血管手术的其它形式；或

ii)通过体外膜式氧合(ECMO)进行的血液的氧合和泵吸，其用于患有急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的患者，或用于婴儿呼吸窘迫综合征(IRDS)，或用于吸入毒性物质的患者，或用于胎粪吸入综合征(meconiumaspiration syndrome，MAS)或肺感染或肺高血压(pulmonalhypertension)或各种原因如例如心脏手术后引起的、因心肌病所致的心力衰竭或用于心脏移植之前；或

iii)血液(内部或外部)的辅助泵吸，包括人工心脏和心室辅助设备；或

iv)血液透析；或

v)血液的体外滤过；或

vi)血液在任何容器中的收集，以待以后用于动物或人受试者；或

vii)预期停留一定时间的静脉或动脉管腔内导管(例如斯-甘二氏导管(Swan-Ganz catheter)、中心静脉导管(central venous catheter)等)的使用；或

viii)导管、鞘、导线或其它设备/装置在诊断或介入性心导管插入术中的使用；或

ix)血管内装置例如支架、大静脉过滤器(vena cava filter)、房间隔缺损(Atrial Septal Defect，ASD)、室间隔缺损(VentricularSeptal Defect，VSD)或永久性动脉导管(Persistent DuctusArteriosus，PDA)阻塞器、线圈的使用；或

x)人工心脏瓣膜包括例如主动脉瓣、二尖瓣、三尖瓣、肺动脉瓣的使用，由此心脏瓣膜可以是机械瓣膜或人造生物瓣膜、组织工程瓣膜或支架安装瓣膜(stent mounted valve)；或

xi)人工血管移植物包括例如Gore-tex主动脉移植物、肺移植物和改进的巴诺克一陶西格(BT)分流器(modifiedBlalock-Taussig(BT)shunt)的使用。

一般而言，一些医疗情形下会发生血液与人体内部和外部的人造表面接触的状况，这种接触随后可因这些表面上的凝固活化而导致血块形成。

外部接触(人体之外)可概括为包括体外循环以便从身体取出血液和马上返回身体(旁路术,ECMO,血液滤过,透析,血液的收集等)的操作。

在所有使用血管内装置(永久性置入的装置(心脏瓣膜支架等)和仅临时使用的装置(导管、导线等))的操作中均涉及与外来物质的内部接触(人体之内)。

在另一个实施方案中，提供了医疗器械，其中用FXII/FXIIa抑制剂涂覆医疗器械。所述医疗器械可以是心肺旁路仪(cardiopulmonarybypass machine)、用于血液氧合的体外膜式氧合系统、用于血液的辅助泵吸的装置、血液透析装置、用于血液的体外滤过的装置、用于血液收集的容器、管腔内导管、支架、人工心脏瓣膜和/或这类装置的任一种的配件（包括管道、套管、离心泵、阀门、端口、分流器等）。另一个实施方案包括通过利用浸渍、喷雾以及涂覆技术领域内的其它常规方法用FXII/FXIIa抑制剂涂覆此类器械来制备它们的方法。

在一些实施方案中，将FXII/FXIIa抑制剂涂覆至人造表面，其中FXII/FXIIa抑制剂以这样的方式存在于表面上，以便其可供用于结合FXII/FXIIa，即FXII/FXIIa抑制剂的生物活性得到保持。在一些实施方案中，将FXII/FXIIa抑制剂共价地附着至人造表面。在其它实施方案中，将FXII/FXIIa抑制剂非共价地附着至表面。在某些实施方案中，用FXII/FXIIa抑制剂浸渍人造表面。人造表面可以是药物洗脱表面，其中FXII/FXIIa抑制剂从所述表面缓慢释放。可将FXII/FXIIa抑制剂包埋在表面中，其中当血液接触人造表面时，FXII/FXIIa抑制剂缓慢地溶解。在一个实施方案中，对表面进行衍生化以便FXII/FXIIa抑制剂粘附至表面。在某些实施方案中，涂覆在表面上的FXII/FXIIa抑制剂的浓度可与给受试者全身性施用的量相似。可在制造之前和/或期间测定FXII/FXIIa抑制剂溶液的浓度和/或人造表面上可供利用的FXII/FXIIa抑制剂的终浓度。在一些实施方案中，通过涂覆在器械的人造表面上来施用FXII/FXIIa抑制剂。

在其它实施方案中，将FXII/FXIIa抑制剂与肝素或其衍生物和/或水蛭素或其衍生物一起施用，其中与当不施用FXII/FXIIa抑制剂时在所述医疗操作之前和/或期间通常施用的肝素或其衍生物和/或水蛭素或其衍生物的量相比较而言，在医疗操作之前和/或期间和/或之后除了FXII/FXIIa抑制剂以外还添加的肝素或其衍生物和/或水蛭素或其衍生物的量降低。

上述医疗操作中的标准疗法是施用肝素或其衍生物和/或水蛭素或其衍生物。施用这类药物以防止因接触活化(其中血液接触人造表面)发生而引起的凝血。为了防止凝血，这类药物的给药是使得激活凝固时间(ACT)为300-500秒。在少于300秒的ACT值下，进行上述医疗操作可导致高血栓形成风险。

发现FXII/FXIIa抑制剂的施用能够使得利用减少量的肝素或其衍生物和/或水蛭素或其衍生物进行上述医疗操作，这样的量在不施用FXII/FXIIa抑制剂的情况下本身可导致ACT值少于500秒。

一些实施方案包括利用进一步减少量的肝素或其衍生物和/或水蛭素或其衍生物进行上述医疗操作，以便在不施用FXII/FXIIa抑制剂而只施用肝素或其衍生物和/或水蛭素或其衍生物本身时，ACT值将低于400秒、低于300秒、低于250秒、低于200秒、低于150秒、低于100秒、低于50秒。这种减少量的肝素可包括1至400IU/kg体重(BW)、50至300IU/kg BW、100至200IU/kg BW和200至300IU/kg BW)。减少量的肝素可包括低于400IU/kg体重(BW)的量、低于300IU/kg体重(BW)的量、低于200IU/kg体重(BW)的量、低于100IU/kg体重(BW)的量、低于50IU/kg体重(BW)的量或低于10IU/kg体重(BW)的量。

在一个实施方案中，在上述医疗操作中施用FXII/FXIIa抑制剂而不施用肝素或其衍生物和/或不施用水蛭素或其衍生物。

在上述除施用FXII/FXIIa抑制剂外不施用肝素或其衍生物和/或不施用水蛭素或其衍生物的医疗操作中治疗的患者，其受到保护而免受因凝血级联的接触活化而引起的凝血，同时不存在作为当前标准疗法一个缺点的增加的出血风险。这对于患者和医生是极其重要的，因为在所提及的医疗操作后凝血状态不能通过一般凝血测试(例如aPTT、PT)得以充分反映，从而不能被充分监测和治疗。患者本身可显示高凝血病(hypercoagulopathy)或低凝血病(hypocoagulopathy)的体征。在一些国家，患者在手术后严重出血的情形下会仅仅出于可能的医疗法律原因而在医疗操作后不能以及时的方式进行抗凝，虽然凝血的风险与患者个人的风险相关。

由于在进行医疗操作以及将人或动物受试者的血液不再暴露于人造表面后与肝素或其衍生物的施用相关的该增加的出血风险的原因，必须尽可能早地拮抗肝素或其衍生物的作用，以尽可能早地降低这种增加的出血风险。为了拮抗肝素或其衍生物的作用，通常给予鱼精蛋白；然而，拮抗存在其自身的风险，如下文中所描述的。在使用水蛭素或其衍生物而非肝素或其衍生物或将二者组合使用的情况下，由于出血风险也增加，因此拮抗水蛭素或其衍生物的作用也是有益的，虽然临床上有用的拮抗剂仍未被批准，从而剩余未被拮抗的水蛭素或其衍生物存在风险。一旦有水蛭素或其衍生物的此类拮抗剂可供利用，可预见拮抗剂的使用可具有与肝素拮抗剂使用时相当的促血栓风险。

与鱼精蛋白的施用相关的风险是由鱼精蛋白分子引起的即时严重过敏反应、严重低血压的风险和因肝素作用的突然停止(这可引起过度凝血酶产生)而引起凝血的风险。

因此，在另一个实施方案中，肝素或其衍生物的术后拮抗和/或水蛭素或其衍生物的术后拮抗之后的促血栓风险通过使用FXII/FXIIa抑制剂来防止或降低。

在另一个实施方案中，通过在医疗操作之前、期间和/或之后施用FXII/FXIIa抑制剂来防止或降低肝素或其衍生物的术后拮抗和/或水蛭素或其衍生物的术后拮抗之后的促血栓风险，其中与当不施用FXII/FXIIa抑制剂时在所述医疗操作后通常施用的所述拮抗剂的量相比较而言，在医疗操作后施用减少量的肝素拮抗剂和/或水蛭素拮抗剂或不添加所述拮抗剂。

更通常地，在一个实施方案中，所述人或动物受试者在医疗操作后具有降低的促血栓风险或无所述风险。

如上文中所讨论的，“FXII/FXIIa”是指因子XII和活化因子XII(FXIIa)之一或两者。因此，“FXII/FXIIa抑制剂”包括FXII和FXIIa之一或两者的抑制剂。此外，抗-FXII/FXIIa抗体包括结合和抑制FXII和FXIIa之一或两者的抗体。术语“FXII/FXIIa抑制剂”还意欲包括与延长半衰期的多肽连接的FXII/FXIIa抑制剂，在一个实施方案中所述多肽包括接头。

在一个实施方案中，FXII/FXIIa抑制剂是特异性FXII/FXIIa抑制剂，优选特异性FXIIa抑制剂。

特异性FXII/FXIIa抑制剂是指如果以1:1的摩尔比使用时，抑制除FXII和/或FXIIa外的血浆丝氨酸蛋白酶(plasmatic serineproteases)的水平低于或等于25%的抑制剂。换句话说：当将所述抑制剂以相应血浆丝氨酸蛋白酶对所述抑制剂的摩尔比1:1使用时，特异性FXII/FXIIa抑制剂抑制除FXII和/或FXIIa外的血浆丝氨酸蛋白酶低于或等于25%。例如，特异性FXII/FXIIa mAb抑制血浆丝氨酸蛋白酶FXIa仅5%，其中FXIa对所述mAb的摩尔比为1:1，而同一FXII/FXIIa mAb抑制FXIIa至少80%，优选至少90%。

在本发明的一个实施方案中，如果以相应血浆丝氨酸蛋白酶对所述抑制剂的摩尔比1:1使用时，一种其它的血浆丝氨酸蛋白酶被抑制超过50%。

在本发明的另一个实施方案中，如果以相应血浆丝氨酸蛋白酶对所述抑制剂的摩尔比1:1使用时，两种其它的血浆丝氨酸蛋白酶被抑制超过50%。

在另一个实施方案中，FXII/FXIIa抑制剂是人FXII/FXIIa抑制剂，包括人源化单克隆抗体，优选完全人源化的单克隆抗体。

如本文中所用，“同源性”是指相同的或构成保守性置换的氨基酸的百分数。同源性可使用序列比较程序例如GAP(Deveraux等人,1984,Nucleic Acids Research12,387-395，将所述文献通过引用并入本文)来进行测定。这样，可通过将缺口插入比对来比较具有与本文中引用的序列相似或明显不同长度的序列，这样的缺口可以例如通过GAP使用的比较算法来确定。

Infestin-4

在一个实施方案中，本申请提供了包含Infestin结构域4(Infestin-4)的FXII/FXIIa抑制剂。在一个实施方案中，FXII/FXIIa抑制剂包含Infestin-4的变体。在另一个实施方案中，FXII/FXIIa抑制剂包含Infestin结构域4以及任选地Infestin结构域1、2和/或3；这类蛋白质已知为FXII/FXIIa的强效抑制剂(参见WO2008/098720；也参见Campos ITN等人577FEBS Lett.512-516,2004)。提供了Infestin-4的野生型多肽序列(SEQ ID NO:1)。如本文中所用的，术语“变体”是指具有氨基酸突变的多肽，其中“突变”被定义为相对于野生型Infestin-4序列的置换、缺失或添加，其中此类变化不改变多肽抑制FXII/FXIIa的功能性能力。术语“变体”包括野生型或突变的Infestin-4序列的片段。下面提供此类变体的进一步实例。

在一个实施方案中，Infestin-4变体包括野生型Infestin-4序列的N末端氨酸2-13(参见图12中加以下划线的序列)，以及所述N末端氨基酸之外的至少一个和多达5个氨基酸突变，所述突变导致与野生型Infestin-4序列的差异，或6个保守性半胱氨酸残基(参见图12中以粗体标示的氨基酸)并且与野生型Infestin-4序列有至少70%的同源性。基于相关抑制剂长红锥蝽(Rhodnius prolixus)(PDB:1TSO)对凝血酶结合的结构数据的分析和SPINK-1对胰凝乳蛋白酶结合的分析，Infestin-4序列的N末端氨基酸2-13对于对FXII/FXIIa的结合可能是非常重要的，这两种抑制剂共有接触位点集中在N末端区域的共同特征，如图11中显示的。因此，在一个实施方案中，Infestin-4的变体包含野生型Infestin-4序列的保守性N末端区域氨基酸2-13，以及这些保守性N末端氨基酸之外的至少一个和多达5个氨基酸突变，所述突变导致与野生型Infestin-4序列的差异。突变可以是置换、缺失或添加。如本文中所用，术语“在所述N末端氨基酸之外”是指沿着变体的多肽链在除包含序列VRNPCACFRNYV(即来自野生型Infestin-4序列的氨基酸2-13)的氨基酸连续区段外的任何氨基酸。在另一个实施方案中，Infestin-4变体包含6个保守性的半胱氨酸残基并且与野生型Infestin-4序列具有至少70%的同源性。在一个实施方案中，所述6个保守性半胱氨酸残基是野生型Infestin-4序列的位置6、8、16、27、31和48处的氨基酸(参见图12)。在一个实施方案中，变体包含最后的保守性半胱氨酸。在其它实施方案中，半胱氨酸的确切位置和彼此的相对位置可能因Infestin-4变体中的插入或缺失而从位置6、8、16、27、31和48发生改变。然而，在这些实施方案中，Infestin-4变体包含所有6个半胱氨酸并且与野生型Infestin-4序列可能共有70%、75%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同源性。

在一些实施方案中，Infestin-4变体的特征在于其抑制FXII/FXIIa。可以例如通过体外和/或体内鉴定(包括测试FXII/FXIIa酶活性的抑制、延长的凝固时间即激活部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)的直接测定或评估凝固的体内方法)来评估抑制FXII/FXIIa的功能活性。Infestin-4变体的其它实例是下文中描述的SPINK-1突变体。

SPINK-1突变体

一个实施方案涉及用于人的治疗性应用的FXII/FXIIa抑制剂。可使用与Infestin-4具有高度相似性的人蛋白质。例如，与Infestin-4具有最高相似性的人蛋白质是SPINK-1，一种在胰腺中表达的Kazal-型丝氨酸蛋白酶抑制剂(也称为胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂,PSTI)。Kazal-型丝氨酸蛋白酶抑制剂家族是丝氨酸蛋白酶抑制剂的众多家族之一。来自不同物种的许多蛋白质已有描述(Laskowski MKato I,49Ann.Rev.Biochem.593-626,1980)。Infestin-4与SPINK-1之间的氨基酸序列相似性概述于图12中。

基于野生型SPINK-1序列(SEQ ID NO:2)，可产生不同的变体以增加SPINK-1序列与Infestin-4的同源性。短语“增加与Infestin-4的同源性”是指对SPINK-1产生氨基酸突变以使SPINK-1序列更接近Infestin-4序列的方法。

在一个实施方案中，将SPINK-1突变以包含野生型Infestin-4序列的N末端氨基酸2-13；已给出了所述多肽序列并且被称为K1(SEQ IDNO:3)。如上所述，Infestin-4序列的N末端部分被认为对于FXII/FXIIa抑制功能是非常重要的。

因此，在一个实施方案中，突变的SPINK-1的变体还包含野生型Infestin-4序列的N末端氨基酸2-13，以及所述N末端氨基酸之外的至少一个和多达5个氨基酸突变，所述突变导致与野生型SPINK-1序列的差异并且增加变体与野生型Infestin-4序列的同源性。在另一个实施方案中，突变的SPINK-1的变体包含6个保守的半胱氨酸残基并且与野生型SPINK-1序列具有至少70%的同源性。突变可以是置换、缺失或添加。如上文中定义的，术语“在所述N末端氨酸之外”是指沿着变体多肽链除由序列VRNPCACFRNYV(即来自野生型Infestin-4序列的氨基酸2-13)组成的氨基酸连续区段外的任何氨基酸。术语“变体”包括所述突变的SPINK-1序列的片段。在一个实施方案中，所述6个保守的半胱氨酸残基可以是野生型SPINK-1序列的位置9、16、24、35、38和56处的氨基酸(参见图12)。在一个实施方案中，变体包含最后的保守半胱氨酸。在另一个实施方案中，半胱氨酸的确切位置和彼此的相对位置可因SPINK-1变体中的插入或缺失而从野生型SPINK-1序列的位置9、16、24、35、38和56发生改变。然而，在这些实施方案中，SPINK-1变体包含所有6个半胱氨酸。在一些实施方案中，SPINK-1变体的特征也在于其抑制FXII/FXIIa。

已给出了这样的SPINK-1变体的实例，被命名为K2和K3(分别地SEQ ID NO:4和5)。在SPINK-1变体K2和K3中，在N末端之外产生进一步氨基酸置换以增加与Infestin-4的同源性，其中变体的特征也在于它们抑制FXII/FXIIa活性。参见WO2008/098720。图13显示这类变体的氨基酸序列以及相对SPINK-1野生型序列的改变程度。在SPINK-1变体K3的情况下，产生5个氨基酸置换以增加与Infestin-4的同源性。因此在一些实施方案中，SPINK-1变体与野生型SPINK-1序列可能具有70%、75%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同源性。

其它FXII/FXIIa抑制剂

在一个实施方案中，给接受医疗操作的患者施用FXII/FXIIa的其它抑制剂。在W02006/066878中，推荐使用抗FXII/FXIIa抗体或FXII/FXIIa抑制剂。具体地，FXII/FXIIa的抑制剂包括抗凝血酶III(AT III)、血管紧张素转换酶抑制剂、C1抑制剂,抑肽酶、α-1蛋白酶抑制剂、抗蛋白酶素([(S)-l-羧基-2-苯乙基]-氨甲酰基-L-Arg-L-Val-Arginal)、Z-Pro-Pro-醛-二甲基乙酸酯、DX88(DyaxInc.,300Technology Square,Cambridge,MA02139,USA;WilliamsA和Baird LG.2003.DX-88and HAE:a developmental perspective.Transfus Apheresis Sci.29:255-258中引用的)、亮抑酶肽、脯氨酰寡肽酶的抑制剂例如Fmoc-Ala-Pyr-CN、玉米胰蛋白酶抑制剂(CTI)、牛胰胰蛋白酶抑制剂的突变体、大肠杆菌素、黄鳍金枪鱼抗凝血剂蛋白(YAP)、笋瓜胰蛋白酶抑制剂-v包括笋瓜同效抑制剂和Hamadarin(如由Isawa H等人J.Biol.Chem.277:27651-27658公开的)和Pro-Phe-Arg-氯甲基-酮(PCK)。

FXII/FXIIa抑制剂可以是例如抗体或抗体片段或保持抑制性活性的模拟物，例如美国专利No.6,613,890中第4至8栏中公开的淀粉样蛋白前体蛋白的Kunitz蛋白酶抑制剂结构域的类似物。其它适当的抑制剂可以是Isawa H等人277J.Biol.Chem.27651-27658,2002中公开的Hamadarin。适当的玉米胰蛋白酶抑制剂及其产生方法公开于Chen Z等人，65Applied and Environmental Microbiology,1320-1324,1999和Wen L等人，18Plant Mol.Biol.813-814,1992中。

在另一个实施方案中，FXII/FXIIa抑制剂可以是结合FXII/FXIIa并且抑制FXII/FXIIa激活和/或活性的抗-FXII/FXIIa抗体。这样的抗体已在例如WO2006/066878和Ravon等人,1Blood4134-43,1995中进行了描述。如上所论述的，“抗-FXII/FXIIa抗体”包括结合并且抑制FXII和FXIIa之一或两者的抗体。下面更详细地描述抗-FXII/FXIIa抗体。

连接至增加半衰期的多肽的FXII/FXIIa抑制剂

本申请的另一个方面提供了连接至增加半衰期的多肽(HLEP)的FXII/FXIIa抑制剂。在一个实施方案中，FXII/FXIIa抑制剂是小的蛋白质。因此，预计其会象针对其它小蛋白质所公布的那样被快速肾清除(Werle M和Bernkop-Schnurch A,30Amino Acids351-367,2006)。解决多肽化合物血浆半衰期较短的一个方法是反复地注射其或通过连续输注进行注射。另一个方法是增加多肽本身的固有血浆半衰期。例如，在一个实施方案中，将FXII/FXIIa抑制剂连接延长半衰期的蛋白质。

“增加半衰期的多肽”增加FXII/FXIIa抑制剂在患者或动物中的体内半衰期。例如，白蛋白和免疫球蛋白以及其片段或衍生物已被描述为增加半衰期的多肽(HLEP)。Ballance等人(WO2001/79271)描述了许多不同治疗性多肽的融合多肽，所述治疗性多肽当与人血清白蛋白融合时，预测具有增加的体内功能半衰期和延长的贮存期限。

术语“白蛋白”和“血清白蛋白”包括人白蛋白(HA)及其变体（给出了其完全成熟形式(SEQ ID NO:6)）以及来自其它物种的白蛋白及其变体。如本文中所用，“白蛋白”是指白蛋白多肽或氨基酸序列或具有白蛋白的一个或多个功能活性(例如生物活性)的白蛋白变体。如本文中所用，白蛋白能够稳定或延长FXII/FXIIa抑制剂的治疗活性。白蛋白可来源于任何脊椎动物，尤其是任何哺乳动物例如人、猴、牛、绵羊或猪。非哺乳动物白蛋白包括但不限于来自母鸡和鲑鱼的白蛋白。白蛋白连接的多肽的白蛋白部分可来自与治疗性多肽部分不同的动物。关于白蛋白融合蛋白的实例，参见WO2008/098720。

在一个实施方案中，白蛋白变体在长度上为至少10、20、40或至少70个氨基酸，或可包括来自HA序列(SEQ ID NO6)的15、20、25、30、50或更多个连续氨酸，或可包括HA的特定结构域的部分或全部。白蛋白变体可包括氨基酸置换、缺失或添加，包括保守或非保守置换，其中此类改变不会显著地改变赋予所述增加半衰期的多肽的治疗活性的活性部位或活性结构域。这类变体可以共有70%、75%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同源性。

在一个实施方案中，白蛋白变体包括片段，并且可由白蛋白的至少一个完整结构域或所述结构域的片段组成或可选择地包含所述结构域或片段，所述结构域可以是例如结构域1(SEQ ID NO6的氨基酸1-194)、2(SEQ ID NO6的氨基酸195-387)、3(SEQ ID NO6的氨基酸388-585)、1+2(SEQ ID NO6的1-387)、2+3(SEQ ID NO6的195-585)或1+3(SEQ ID NO6的氨基酸1-194+SEQ ID NO6的氨基酸388-585)。每一个结构域本身由两个同源的亚结构域即1-105、120-194、195-291、316-387、388-491和512-585组成，具有包含残基Lys106至Glu119、Glu292至Val315和Glu492至Ala511的柔性亚结构域间接头区域。

在另一个实施方案中，在结构或进化上与白蛋白相关的其它蛋白质可用作HLEP，包括但不限于甲胎蛋白(WO2005/024044;Beattie和Dugaiczyk,20Gene415-422,1982)、afamin(Lichenstein等人269J.Biol.Chem.18149-18154,1994)和维生素D结合蛋白(Cooke和David,76J.Clin.Invest.2420-2424,1985)。它们的基因代表具有结构和功能相似性的一个多基因簇，在人、小鼠和大鼠中作图到同一染色体区域。白蛋白家族成员的结构相似性显示它们可用作为HLEP。例如，已声称甲胎蛋白会延长所连接的治疗性多肽的体内半衰期(WO2005/024044)。可使用能够稳定或延长治疗活性的此类蛋白质或其变体，并且其可衍生自任何脊椎动物，尤其是任何哺乳动物，例如人、猴、牛、绵羊或猪，或非哺乳动物包括但不限于鸡或鲑鱼。参见WO2008/098720。此类变体在长度上可具有10个或更多个氨基酸，或可包括各自蛋白质序列的约15、20、25、30、50或更多个连续氨基酸，或可包括各自蛋白质的特定结构域的部分或全部。白蛋白家族成员融合蛋白可包括天然存在的多态性变体。

在另一个实施方案中，免疫球蛋白(Ig)或其变体可用作HLEP，其中变体包括片段。在一个实施方案中，使用免疫球蛋白恒定区的Fc结构域或部分。恒定区可以是IgM、IgG、IgD、IgA或IgE免疫球蛋白的恒定区。治疗性多肽部分通过抗体的铰链区或肽接头连接至Ig，其中所述肽接头可以是能切割的。几项专利和专利申请描述了治疗性蛋白质与免疫球蛋白恒定区的融合以延长治疗性蛋白质的体内半衰期(US2004/0087778、WO2005/001025、WO2005/063808、WO2003/076567、WO2005/000892、WO2004/101740、US6,403,077)。例如，细胞因子IFN-β与Fc融合获得了增强的IFN-β生物活性，延长的循环半衰期和更大的溶解度(WO2006/000448)。

因此，另一个实施方案是使用此类免疫球蛋白序列（例如免疫球蛋白的Fc片段及其变体）作为HLEP。可将FXII/FXIIa抑制剂与免疫球蛋白恒定区的Fc结构域或至少部分(作为HLEP)融合，并且可将其在原核或真核宿主细胞例如细菌、酵母、植物、动物(包括昆虫)或人细胞系中或在转基因动物(WO2008/098720)中作为重组分子产生。SPINK-K2-Fc融合蛋白示例性地示于SEQ ID NO:7中。

接头

在一个实施方案中，可在治疗性多肽与HLEP之间引入间插肽接头。在一个实施方案中，引入可切割的接头，特别地如果HLEP通过例如位阻干扰治疗性多肽的特异性活性时。在某些实施方案中，接头通过酶例如内源性、外源性或共同的凝血途径的凝血蛋白酶切割。内源性途径的凝血蛋白酶是接触活化途径中的蛋白酶，包括例如FXIIa、FXIa或FIXa。在一个实施方案中，接头由FXIIa切割。外源性途径的蛋白酶包括组织因子途径中的蛋白酶例如FVIIa。共同途径的蛋白酶包括参与血纤蛋白原向血纤蛋白转化的蛋白酶，例如FXa、FIIa和FXIIIa。

治疗性制剂和施用

FXII/FXIIa抑制剂或其变体可具有高于80%或高于95%、96%、97%、98%或99%纯度的纯度。在一个实施方案中，变体可具有相对于污染性大分子例如其它蛋白质和核酸而言大于99.9%纯度的药物纯状态，以及不含感染因子和热源。

可将纯化的FXII/FXIIa抑制剂溶解在常规生理相容性含水缓冲液中，任选地可向其中添加药物赋形剂以提供用于治疗患者的SBI的药物制剂。此类药物载体和赋形剂以及适当的药物配方在本领域是公知的。参见例如Kibbe等人Handbook of Pharmaceutical Excipients,(第3版,Pharmaceutical Press),2000。可以以冷冻干燥或稳定的可溶形式配制药物组合物。可利用本领域已知的多种方法冷冻干燥多肽。冻干的制剂可在使用前通过添加一种或多种药学上可接受的稀释剂例如注射用无菌水或无菌生理盐水溶液来进行重建。

可利用任何药学上适当的施用工具将FXII/FXIIa抑制剂的制剂递送至患者。各种递送系统是已知的并且可用于通过任何方便的途径施用组合物。组合物可全身性例如通过胃肠外途径施用。如本文中所用，“胃肠外”包括皮下、静脉内、肌内、动脉内和气管内注射、滴注、喷雾施用和输注技术。胃肠外制剂可按照已知的方法，通过静脉内途径以单次快速推射(bolus)的形式或以持续输注(constant infusion)的形式施用或通过皮下途径施用。对于胃肠外使用公知的脂质载体包括无菌水、盐水、含水葡萄糖、糖溶液、乙醇、二醇类和油。对于全身性使用，可配制治疗性蛋白质以用于静脉内管线(intravenous line)或动脉管线(intravenous line)使用。可通过输注连续地或通过单次快速推注施用制剂。一些制剂包含缓释系统。在一个实施方案中，以贴剂方式施用制剂。用于口服施用的片剂和胶囊可包含常规赋形剂例如粘合剂、填料、润滑剂或湿润剂等。口服液体制剂可以以含水或油性悬浮液、溶液、乳剂、糖浆剂、酏剂等形式存在，或可以以无水产品(使用时利用水或其它适当的载体重建)形式提供。适当的液体制剂可包含常规添加剂例如悬浮剂、乳化剂、非水性载体和防腐剂。

FXII/FXIIa抑制剂的剂量可取决于许多因素，例如适应症、制剂或施用模式，并且对于各适应症，可在临床前试验和临床试验中进行确定。可在医疗操作之前、期间和/或之后施用FXII/FXIIa抑制剂的剂量。在一个实施方案中，可在医疗操作之前和/或之后1、2、4、6、12、24、48、72或96小时内施用FXII/FXIIa抑制剂。可在医疗操作之前、期间和/或之后，以单次剂量或以多次剂量或以0.25、0.5、1、2、4、6、12、24、或48小时的间隔反复施用FXII/FXIIa抑制剂。由于具有不增加出血风险的有利性质，因此在一个实施方案中，在操作期间施用FXII/FXIIa抑制剂。可单独地或与其它治疗剂组合地施用药物组合物。这些药剂可共配制，或可将其作为单独的制剂同时或分开地、通过相同或不同的施用途径施用。FXII/FXIIa抑制剂的施用方案或剂量还可在具有相同适应症或不同适应症的患者个体间变化，这取决于例如其它治疗状况或疗法等因素。

另一个实施方案是FXII/FXIIa抑制剂用于预防或治疗泵压头综合征(Pump Head syndrome)。

泵压头综合征是中枢神经功能障碍或旁路手术(bypass procedure)如CABG后认知损害或认知功能衰退。除其它以外，推测这是由在CABG或其中血液接触人造表面的其它医疗操作中使用的人造表面上通过接触活化产生的小血栓(micro-thrombi)引起的。目前，不存在已知的用于泵压头综合征的疗法(Newman等人,NEJM(2001)第344卷,No.6,pp.394至402)。

另一个实施方案是使用上述FXII/FXIIa抑制剂防止人血流在离体医疗器械中阻滞，所述医疗器械的非限定性实例可以是心肺旁路装置或用于血液透析或血液的体外滤过的装置。关于“阻滞”，我们意指血流下降至少10%，至少20%，至少30%，至少40%，至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，至少95%，至少99%或血流完全停止。

实施例

1.实验室发现

在实验室评估中，将重组白蛋白融合的Infestin-4(rHA-Infestin-4；如WO2008/098720中所述)提供于注射器中，随后添加猪的全血。随后在玻璃小瓶中提供该溶液，通过每分钟轻轻摇动玻璃小瓶(在水浴中于37℃温育)来目测确定凝固时间。令人惊讶地，尽管通过玻璃表面的大量接触活化，血液未显示任何凝固征兆达3小时(然而对照样品在约3分钟后凝固，图1)。此外，该未凝固的血液的激活部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)的随后评估显示有显著延长的值。这些发现鼓舞了进一步的离体研究。在这些研究中，可证实rHA-Infestin-4剂量依赖性延长全血凝固时间(WBCT)(图1)。当示范性地使用鼠全血时，可获得相当的模式。

在另外的实验中，以如上解释的相同研究设计测试特异性抗-FXII/FXIIa抗体。然而，由于该抗体不与猪系统反应，因此使用小鼠的全血。有趣地，虽然FXII的活性预期在测试的剂量上会被完全抑制，但WBCT最大被延长约3倍(图2)。由此得到如下结论：rHA-Infestin-4对WBCT的显著影响不能仅由其FXII/FXIIa抑制性潜能来解释。与其它机制不同，可能其更弱的FXa抑制性潜能导致这一现象发现。

2.临床前动物研究

2.1.关于动物和麻醉的数据

动物:

从当地育种场(Willi Schlosser,Schwalmtal,Germany)获得3-4月龄的体重24-40kg的去势雄性猪(英国大白猪(large white)×German noble)。在环境昼夜周期(day-night cycles)下将动物于18-21℃圈养在铺有草垫的畜舍中，随意喂饲Deuka V猪食(pigchow)(Deutsche Tiernahrung Cremer GmbH&Co.KG,Düsseldorf,Germany)。随意提供自来水。畜牧业和研究方法遵照German AnimalWelfare law and European Union regulations。

麻醉:

在过夜禁食(但不限制对水的获得)后，使用2mg kg-1阿扎哌隆(

,Janssen-Cilag GmbH,Neuss,Germany)、15mg kg-1氯胺酮(Ketavet,Pharmacia&Upjohn,Erlangen,Germany)和0.02mgkg-1硫酸阿托品(Atropinsulfate,B.Braun Melsungen AG,Melsungen,Germany)的混合物通过肌内术前用药法使动物镇静，随后用10mg kg-1硫喷妥钠经耳静脉麻醉猪。在做好气管的手术准备后，将管子插入动物喉管，通过Heyer Access呼吸机支持呼吸。利用1-2%异氟烷(Isofluran

,CP Pharma GmbH,Burgdorf,Germany)维持吸入麻醉。将1.4×2.1mm导管向前伸入颈动脉以收集血液样品，将0.5×0.9mm导管伸入股动脉以进行连续血压测量。以4mL kg-1h-1施用林格溶液以满足基础流体需要，通过1.4×2.1mm留置导管在外颈静脉灌注测试液。利用直肠温度测量法监测体温。

2.2.猪的药物动力学研究

在上述初步实验室发现后，在猪中评价单次静脉内(i.v.)rHA-Infestin-4施用的动力学。我们发现，在rHA-Infestin-4的单次i.v.施用后离体WBCT显著延长，并且在从循环中消除rHA-Infestin-4的过程中再次减小(图3)。此外，猪中rHA-Infestin-4的i.v.施用导致aPTT的显著延长，并且在高剂量下凝血酶原时间(PT)稍微延长(图4和5)。这些结果表明，rHA-Infestin-4主要影响内源性凝血途径(aPTT)，在更高的剂量下略微影响外源性凝血途径(PT)。此外，可在血栓弹力描记术中检测凝血时间的延长。

有趣地，虽然WBCT和aPTT被显著延长，但皮肤出血时间(即生理性止血)不受影响(图6)。

2.3.猪的心肺旁路手术：

为了评价和证明rHA-Infestin-4在心肺旁路术(CPB)操作中的抗凝作用，在猪模型中进行临床前CPB试验。最初，用rHA-Infestin-4(相当于50mg/kg体重(BW))加载CPB，在连接至CPB装置之前，利用rHA-Infestin-4以200mg/kg BW的剂量处理动物，以防止凝血和CPB装置的氧合器膜的连续阻塞。未将其它物质如肝素或比伐卢定(A.Koster等人Am J Cardio2004;93:356-359)用作抗凝物质。

2.3.1.CPB研究设计：

关于研究设计的概述参见图7。

在麻醉诱导(2.1)后，利用摆锯进行胸骨切开术，暴露心脏。纵向打开心包膜，通过缝线将其固定至胸壁。在右心房和心尖进行荷包缝合。静脉内输注200mg/kg BW rHA-Infestin-4。在约10分钟后，将5.2mm直径的动脉导管和32Fr静脉导管置于右心房和左心室内，利用止血带固定。将两根导管连接至具有硬壳静脉贮血器(D905EOS,Sorin SpA,Milan,Italy)的小型成人中空纤维氧合器。利用由500mL等渗盐水、1000mL6%羟乙基淀粉200/0.5(Infukoll,Schwarz Pharma AG,Mannheim,Germany)、2mL kg-115%甘露醇(

,B.Braun)和50mg/kg BW rHA-Infestin-4组成的溶液引发体外回路。接连地打开静脉和动脉导管线，让静脉血通过重力流入静脉贮血器。泵将血液传输入氧合器。使氧合血平衡至目标温度，然后经动脉导管线返回至左心室。将低温在25℃维持2小时，随后进行1小时复温至正常体温的(37℃)。

在CPB结束后，将剩余在氧合器中的血液输送回动物。抗凝在CPB操作后未被逆转。

在(1)基线，(2)在rHA-Infestin-4输注后但在CPB开始前，(3)在CPB开始后立即，(4)后来每5分钟一次直至实验结束，收集血液样品用于实验室测定。还调查皮肤出血时间(SBT)，其被定义为至从由使用

切割装置(International Technidyne Corp.,Edison,NewJersey,USA)产生的标准5mm长1mm深的内耳切口停止出血的时间。

2.3.2.CPB期间的实验室发现:

在CPB期间，相较于基线值，aPTT值在整个研究期中被显著延长(图8)，然而PT值在研究期中仅轻微增加(图9)。此外，离体WBCT也在研究期中显著增加(图10)。

2.3.3.在CPB期间的临床发现:

在医学领域中普遍已知血液与人造表面的直接接触立即导致凝固的活化(内源性途径)以及血小板的直接活化(通过氧合器膜的连续关闭)。因此在CPB期间使用肝素目前是护理金标准。

使用300IU/KG BW肝素的室内动物(猪)实验具有更高的出血风险，如SBT的延长以及伤口缘的出血所反映的。

与对于肝素的这些发现相反，当将rHA-Infestin-4用于CPB中时，作为出血风险总体测试的SBT保持不变，此外，当就增加的出血观察伤口边缘时，止血未被削弱。然而，最重要的发现是CPB的氧合器在测试期中不凝血，保持完全的功能。

替代性实验室发现(aPTT,PT)、临床CPB与SBT结果的组合令人惊讶地显示rHA-Infestin-4满足了尚未满足的对新型抗凝药物的医学需要，其不削弱患者形成稳定凝块的总体能力，同时血液在需要人造表面的操作中保持完全不凝固。

3.结论

rHA-Infestin-4能够通过主要影响内源性凝血途径来防止CBP氧合器的凝血，这反映在aPTT上，然而对于一定程度/剂量的rHA-Infestin-4，外源性途径(PT评价)仍然不受影响。这些结果令人惊讶，并且为CPB期间的抗凝疗法提供了新型策略，因为不必通过肝素/比伐卢定(具有增加的出血风险)来抑制外源性和内源性凝血系统。此外，在CPB操作期间和之后小血栓形成和栓塞过程的持续风险可能降至一定的水平。CPB操作中的该新型处理首次显示FXII/FXIIa抑制剂如rHA-Infestin-4可在将来的临床应用中替代或至少减少肝素/比伐卢定的使用，从而导致显著改善的治疗机会。

4.其它研究

4.1.在新型研究方案中测试FXII/FXIIa抑制剂，其中使兔的全血离体路经心肺旁路术(CPB)回路。在本文中，血液不断地通过回路进行循环(并且不返回兔中)，其中如果没有抗凝的话，其会遭遇凝血系统的大量(接触)活化。该模型用于测试FXII/FXIIa抑制剂或FXII/FXIIa抑制剂与肝素的组合阻止CPB回路阻塞的效力。

读数包括下述：氧合器前压(Pre-oxygenator pressure)和氧合器后压(post-oxygenator pressure)、完全血细胞计数(包括血小板计数和尺寸)、氧合器和滤器的效力(patency)、凝血系统、补体系统和激肽-激肽释放酶系统功能的其它读数。

我们推测FXII/FXIIa抑制剂能够在该离体方案中防止CPB的阻塞/凝固，并且还能够减少补体系统和激肽-激肽释放酶系统的活化。

4.2.在另一组研究中，研究FXII/FXIIa抑制剂(rHA-Infestin-4和FXII/FXIIa MAb)对人离体全血凝固(来自健康供体)的作用。此处，在掺入不同浓度的FXII/FXIIa抑制剂后，如上所述(即对于猪/小鼠全血所述)测量WBCT。此外，可使用ACT(激活凝固时间)装置测量WBCT。我们推测与在上述其它物种中的发现一致，我们会观察到离体全血凝固时间的剂量依赖性抑制。将要测定在上文中列举的参数(WBCT)上实现相较于标准剂量的未分级分离肝素等同的效力所需的FXII/FXIIa抑制剂剂量。此外，还测试FXII/FXIIa抑制剂与低剂量肝素(或其它抗血栓药)的组合。

4.3.此外，在由标准CPB系统、标准ECMO系统或另一个临床上相关的离体回路组成的离体回路系统(使来自健康的不含药物的供体的人全血流经系统，而药物已在所述系统中提供)中测试FXII/FXIIa抑制剂以及FXII/FXIIa抑制剂与肝素(或其它抗血栓形成药)的组合的效果。在本文中，血液在其中其遭遇凝血系统的大量(接触)活化的回路中持续循环(并且不返回至供体)。读数包括：氧合器前压和氧合器后压、完全血细胞计数(包括血小板计数和尺寸)、氧合器和滤器的效力、凝血系统、补体系统和激肽-激肽释放酶系统的功能的其它读数。推测FXII/FXIIa抑制剂或FXII/FXIIa抑制剂与低剂量肝素(或其它抗血栓形成药物)的组合也能够防止回路的凝固。此外，推测FXII/FXIIa抑制剂能够在该离体回路内减少补体系统和激肽-激肽释放酶系统的活化。将要测定在上文中列出的参数和读数上实现相较于标准剂量的未分级分离肝素等同的效力所需的FXII/FXIIa抑制剂的剂量。

在凝血系统的接触活化之前、期间和/或之后治疗患者的该新型方法在某些操作之前、期间和/或之后提供了对血栓形成的保护作用，同时不使患者处于出血事件的风险中。

Claims

1.FXII/FXIIa抑制剂用于在对人或动物受试者进行的医疗操作期间和/或之后防止血栓形成和/或稳定化的用途，所述医疗操作包括将所述人或动物受试者的血液与人造表面接触，其中在所述医疗操作之前和/或过程中和/或之后施用所述FXII/FXIIa抑制剂，并且其中

(i)将所述人造表面暴露于受试者的至少80%血液体积，并且所述人造表面为至少0.2m²；或

(ii)所述人造表面是用于在受试者的机体外收集血液的容器；或

(iii)所述人造表面是支架、瓣膜、管腔内导管或用于血液的内部辅助泵吸的系统。

2.权利要求1的FXII/FXIIa抑制剂的用途，其中所述人或动物受试者具有未增加的出血风险，这种出血风险是通过下述测定的：

a)通过根据Duke的耳或指尖出血时间，并且其中所述耳或指尖出血时间不超过10分钟，或

b)根据lvy的方法，其中所述出血时间不超过10分钟，或

c)根据Marx的方法，并且所述出血时间不超过4分钟。

3.权利要求1和2的FXII/FXIIa抑制剂的用途，其中所述治疗操作是

i)需要心肺旁路术的任何操作，或

ii)通过体外膜式氧合进行的血液的氧合和泵吸，或

iii)血液的辅助泵吸(内部或外部)，或

iv)血液的透析，或

v)血液的体外滤过，或

vii)静脉或动脉管腔内导管的使用，或

viii)用于诊断或介入心脏插入导管术的设备的使用，或

ix)血管内装置的使用，或

x)人工心脏瓣膜的使用，或

xi)人工移植物的使用。

4.权利要求1至3的FXII/FXIIa抑制剂的用途，其中在需要心肺旁路术的医疗操作之前、之后和/或期间施用所述FXII/FXIIa抑制剂。

5.权利要求1至3的FXII/FXIIa抑制剂的用途，其中在医疗操作之前、之后和/或期间施用FXII/FXIIa抑制剂，所述医疗操作包括在任何容器中收集血液以待以后用于动物或人受试者。

6.权利要求5的FXII/FXIIa抑制剂的用途，其中将所述抑制剂:

i)在献血过程之前和/或期间给献血者施用，或

ii)在所述收集容器中与血液混合，或

iii)在给人或动物接受者施用血液之前、期间和/或之后给所述受血者施用。

7.权利要求1至6的FXII/FXIIa抑制剂的用途，其中通过将其涂覆在人造表面上来施用所述FXII/FXIIa抑制剂。

8.权利要求1至7的FXII/FXIIa抑制剂的用途，其中在所述医疗操作之前和/或期间和/或之后，相较于当不施用FXII/FXIIa抑制剂时在所述医疗操作之前和/或期间通常施用的肝素或其衍生物和/或水蛭素或其衍生物的量，除了所述FXII/FXIIa抑制剂以外还添加减少量的肝素或其衍生物和/或水蛭素或其衍生物。

9.权利要求1至8的FXII/FXIIa抑制剂的用途，其中除了FXII/FXIIa抑制剂以外不使用肝素或其衍生物和/或水蛭素或其衍生物。

10.权利要求1至9的FXII/FXIIa抑制剂的用途，其中所述人或动物受试者在所述医疗操作后具有减少的促血栓风险或无促血栓风险。

11.权利要求1至10的FXII/FXIIa抑制剂的用途，其中所述人或动物受试者在肝素或其衍生物的术后拮抗和/或水蛭素或其衍生物的术后拮抗被阻止或减弱后具有减少的促血栓风险或无促血栓风险，并且任选地其中所述促血栓风险是因鱼精蛋白的施用引起。

12.权利要求1至11的FXII/FXIIa抑制剂的用途，其中相较于当不施用FXII/FXIIa抑制剂时在所述医疗操作后通常施用的所述拮抗剂的量而言，在所述医疗操作后向所述人或动物受试者施加减少量的肝素拮抗剂和/或水蛭素拮抗剂或不施加肝素拮抗剂和/或水蛭素拮抗剂。

13.权利要求1至12使用的FXII/FXIIa抑制剂的用途，其用于预防或治疗泵压头综合征。

14.权利要求1至13的FXII/FXIIa抑制剂的用途，其中所述FXII/FXIIa抑制剂包括

(a)所述野生型Infestin-4序列的N末端氨基酸2-13和所述N末端氨基酸之外的至少一个到不超过5个氨基酸突变，所述突变导致与所述野生型Infestin-4序列的差异;

和/或

(b)来自所述野生型Infestin-4序列的6个保守半胱氨酸残基和与所述野生型Infestin-4序列有至少70%的同源性，

(ii)SPINK-1(SEQ ID NO:2)，其被突变而包括所述野生型Infestin-4序列N末端氨基酸2-13，或所述突变的SPINK-1的变体，其中所述变体包含

(a)所述野生型Infestin-4序列的N末端氨基酸2-13；和所述N末端氨基酸之外的至少一个到不超过5个氨基酸突变，所述突变导致与所述野生型SPINK-1序列的差异并且增加所述变体与所述野生型Infestin-4序列的同源性；

和/或

(b)来自野生型SPINK-1序列的6个保守半胱氨酸残基和与野生型SPINK-1序列有至少70%的同源性，

(iii)AT III、血管紧张素转换酶抑制剂、C1抑制剂、抑肽酶、α-1蛋白酶抑制剂、抗蛋白酶素([(S)-1羧基-2-苯乙基]-氨甲酰基-L-Arg-L-Val-Arginal)、Z-Pro-Pro-醛-二甲基乙酸酯、DX88、亮抑酶肽、脯氨酰寡肽酶的抑制剂例如Fmoc-Ala-Pyr-CN、玉米-胰蛋白酶抑制剂(CTI)、牛胰胰蛋白酶抑制剂的突变体、大肠杆菌素、YAP(黄鳍金枪鱼抗凝血剂蛋白)和笋瓜胰蛋白酶抑制剂-V、笋瓜同效抑制剂和Pro-Phe-Arg-氯甲基-酮(PCK)；

(iv)抗-FXII/FXIIa抗体，其中所述抗体结合FXII/FXIIa并且抑制其活性和/或活化。

15.权利要求14的FXII/FXIIa抑制剂的用途，其中所述FXII/FXIIa抑制剂包括SPINK K1、K2或K3(SEQ ID NO:3、4或5)。

16.权利要求1至15的FXII/FXIIa抑制剂的用途，其中将所述FXII/FXIIa抑制剂连接至增加半衰期的多肽上，其中所述增加半衰期的肽任选地是白蛋白、afamin、甲胎蛋白或维生素D结合蛋白、人白蛋白或其变体、免疫球蛋白或其变体、IgG的Fc。

17.权利要求16的FXII/FXIIa抑制剂的用途，其中将所述增加半衰期的多肽通过接头连接至所述FXII/FXIIa抑制剂。

18.权利要求17的FXII/FXIIa抑制剂的用途，其中所述接头是如下的至少一种：

(i)可切割的；

(ii)可被内源性、外源性或共同的凝血途径的凝血蛋白酶切割；和

(iii)可被FXIIa切割。

19.如权利要求1至18中定义的FXII/FXIIa抑制剂的用途，用于防止人血流在离体医疗器械中阻滞，其中所述医疗器械任选地是心肺旁路器械或者用于血液透析或血液体外滤过的器械。

20.一种被FXII/FXIIa抑制剂涂覆的医疗器械，其中所述器械是心肺旁路术机器、用于血液氧合的体外膜式氧合系统、用于血液的辅助泵吸的装置、血液透析装置、用于血液的体外滤过的装置、用于收集血液的容器、管腔内导管、支架、人工心脏瓣和/或用于所述装置的任一种的配件，包括管道、套管、离心泵、阀门、端口和/或分流器。