JP6109081B2 - 人工表面との接触を含む医学的手技に伴う投与のためのｆｘｉｉ阻害剤 - Google Patents

Description

分野
本出願は、血液を人工表面と接触させることを含む医学的手技におけるＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤の使用に関する。特定の実施態様は、心肺バイパス（ＣＰＢ）ポンプを要求する医学的手技を必要とする患者の抗凝固療法に関し、ここで凝固因子ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤の新規な使用は、ＣＰＢ手技の間のヘパリン／ビバリルジンの必要性を減少させるがそれらに取って代わる。特定の実施態様において、ＦＸＩＩ阻害剤は人工表面上にコーティングされる。

背景
血管壁損傷及び人工表面は、血小板の突然の粘着及び凝集を引き起こし、続いて血漿凝固系の活性化及びフィブリン含有血栓の形成が起こり、これが損傷部位を閉塞する。これらの機構は外傷後の血液損失を抑えるために不可欠であるが、これらはまた罹患血管を閉塞し得、重要臓器の虚血及び梗塞、ＣＰＢ膜の閉塞をもたらす。

古典的な滝現象モデルでは、血液凝固は、血漿フィブリノゲンをフィブリンに転換し、そして血小板を活性化するトロンビンの生成に至る制限されたタンパク質分解によるチモーゲンの活性化を含む一連の反応により進行する。今度はコラーゲン−又はフィブリン−接着血小板が、凝固促進（ｐｒｏｃｏａｇｕｌａｎｔ）リン脂質（主にホスファチジルセリン）をそれらの外面に露出させ、これが凝固プロテアーゼ複合体の集合及び活性化を伝播し、そして血小板受容体と凝固因子との間の直接的相互作用により桁違いにトロンビン生成を促進する。

凝固についての２つの合流する経路が存在し、これは血管系の外因性（血管壁）又は内在性（血液由来）の構成要素により引き起こされる。「外因性」経路は、血漿因子ＶＩＩ（ＦＶＩＩ）と膜内在性タンパク質組織因子（ＴＦ）との複合体により開始され、この膜内在性タンパク質組織因子は、管腔表面上には存在しないが血管の内皮下層において強く発現され、そして組織損傷によりアクセス可能であるか又は放出される必須の凝固補助因子である。循環する微小胞において発現されたＴＦは、活性化血小板の表面上でのトロンビン生成を維持することにより血栓増殖にも寄与し得る。

「内在性」又は「接触活性化経路」は、高分子量キニノーゲン及び血漿カリクレインを含む反応において第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ、ハーゲマン因子）が負に荷電した表面と接触する場合に開始される。ＦＸＩＩは、内皮下基質の高分子構成物質、例えばグリコサミノグリカン及びコラーゲン、スルファチド、ヌクレオチド及び他の可溶性ポリアニオン又は非生理的物質、例えばガラス若しくはポリマーにより活性化され得る。最も強力な接触活性化因子の一つはカオリンであり、そしてこの反応は、主要な臨床的凝固検査、「内在性」経路の凝固機能を測定する活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）の機構的基礎として役立つ。血小板により伝播される反応において、次いで活性化ＦＸＩＩ（ＦＸＩＩａ）はＦＸＩをＦＸＩａへと活性化し、そして続いてＦＸＩａがＦＩＸをＦＩＸａへと活性化する。ＦＶＩＩＩａ（このＦＶＩＩＩａは以前に微量のＦＸａ及び／又はトロンビンにより活性化されている）及びＦＩＸａの複合体（テナーぜ複合体）は、続いてＦＸをＦＸａへと活性化する。インビトロで血液凝固を誘導するその高い能力にも関わらず、ＦＸＩＩ誘発固有凝固経路の（病理的）生理学的重要性は、ＦＸＩＩの遺伝的欠失さらには高分子量キニノーゲン及び血漿カリクレインの遺伝的欠失が重症の出血合併症と関連がないという事実により疑問が持たれる。ＴＦ及びＦＶＩＩのような外因性経路の構成物質を欠いたヒト及びマウスが重症の出血を患うという知見と一緒に、このことはインビボでの出血の停止には、もっぱら外因性カスケードのみが必要とされ得るという現在の仮説に至った（非特許文献１）。

病理的状態において、凝固カスケードは不適切に活性化され得、次いでこれが血管内において止血的に作用する栓の形成を生じる。それにより血管は閉塞し得、そして遠位の器官への血液供給は制限される。さらに、形成された血栓は剥離して身体の他の部分を閉塞し得、そこで虚血性閉塞に至る。この過程は血栓塞栓症として知られ、そして高い死亡率を伴う。

特許文献１において、ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａに対する抗体の使用又はＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤の使用は、血栓の形成及び／又は安定化を防止すると提案されている。見込みのある阻害剤として、抗トロンビン（ＡＴ ＩＩＩ）、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、Ｃ１阻害剤、アプロチニン、アルファ−１プロテアーゼ阻害剤、アンチパイン（［（Ｓ）−１カルボキシ−２−フェニルエチル］−カルバモイル−Ｌ−Ａｒｇ−Ｌ−Ｖａｌ−アルギナール（Ａｒｇｉｎａｌ））、Ｚ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏアルデヒド−ジメチルアセテート、ＤＸ８８（Ｄｙａｘ Ｉｎｃ．，３００ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｓｑｕａｒｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ ０２１３９，ＵＳＡ；非特許文献２において引用される）、ロイペプチン、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−Ｐｙｒ−ＣＮのようなプロリルオリゴペプチダーゼの阻害剤、トウモロコシ−トリプシン阻害剤（ＣＴＩ）、ウシ膵臓トリプシン阻害剤の変異体、エコチン、ＹＡＰ（コガネガレイ（ｙｅｌｌｏｗｆｉｎ ｓｏｌｅ）抗凝固性タンパク質）、西洋カボチャ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｍａｘｉｍａ）トリプシン阻害剤−ｖ、西洋カボチャイソ阻害因子、及びＨａｍａｄａｒｉｎ（非特許文献３により開示されるとおり）が提案されている。

近年、インフェスチン−４はＦＸＩＩａの新規な阻害剤であると報告された。インフェスチンは、シャーガス病を引き起こすことが知られている寄生生物クルーズトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）の主要なベクターである吸血昆虫のサシガメ（Ｔｒｉａｔｏｍａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）の中腸由来のセリンプロテアーゼ阻害剤のクラスである（非特許文献４；非特許文献５）。この昆虫はこれらの阻害剤を、摂取した血液の凝固を防ぐために使用する。インフェスチン遺伝子は、凝固経路において異なる因子を阻害し得るタンパク質を生じる４つのドメインをコードする。特に、ドメイン４は、ＦＸＩＩａの強力な阻害剤であるタンパク質（インフェスチン−４）をコードする。インフェスチン−４は出血の合併症なくマウスに投与されてきた（特許文献２）。

人工表面は接触活性化経路を誘発し得るので、血液をこのような人工表面と接触させることを含む医学的手技には相当な医学的危険性が含まれる。従って、血液と接触するプロテーゼ装置又は血液透析器の使用は、内在性凝固化スケートの活性化のために厳しく制限される。プロテーゼ表面の適切なコーティングは、いくつかの場合にはこの問題を回避し得るが、他の場合はその機能に支障を来し得る。このようなプロテーゼ装置の例は、心臓弁、血管ステント及び留置（ｉｎ−ｄｗｅｌｌｉｎｇ）カテーテルである。

このような装置が使用される場合、表面上でのフィブリン形成を防止するためにヘパリンのような抗凝固剤を投与することが必要である。

しかし、一部の患者はヘパリンに不耐性であり、血小板凝集及び生命を脅かす血栓症を生じるヘパリン誘導血小板減少（ＨＩＴ）を引き起こし得る。さらに、診療所において使用される全ての抗凝固剤の固有の欠点は、重篤な出血事象の増加した危険性である。従って、このような合併症を伴わず、かつ罹患した患者において使用され得、又は増加した出血の危険性を伴わずに血栓症を予防する優れた治療概念として使用され得る新しい型の抗凝固剤に対する強い必要性が存在する（非特許文献６）。

大量の接触活性化を含む医学的手技は心肺バイパス（ＣＰＢ）である。現在、心臓手術におけるＣＰＢ装置は２つの理由のために使用される：ａ）心臓手術を受けている患者の心停止法の間の血液循環の人工的な維持（ポンプ機能）、及びｂ）心臓手術を受けている患者の心停止法の間の半透性膜酸素供給による血液の人工的酸素供給（酸素供給器機能）。

ポンプ機能を介した人工的血流維持に起因して、患者の血液は半透性膜（約３ｍ²、人工表面）に送られ、これは血液自体が閉鎖人工循環系中にある間、酸素が膜を通過し、そして赤血球に結合することを可能にする。この人工的酸素供給は患者の生命維持に必要であり、そしてＣＰＢの間の抗凝固方策を必要とする（非特許文献７）。現在使用されているＣＰＢ装置は、凝固系、炎症系の大量接触活性化、さらには補体系の活性化をもたらす３ｍ²までの人工表面を有する。上述のカスケード系に対するこれらの効果を最小にするために、異なる種類のポリマー生体材料が使用される（例えば、２−メチルアクリルオキシエチルホスホリルコリン ＭＣＰ）（非特許文献８；非特許文献９）。低いトロンボゲン形成性の極性ホスホリルコリンのような新規な表面材料が使用されるという事実にも関わらず、血小板媒介反応は、患者の命を脅かす結果を伴うＣＰＢ酸素供給器の閉塞を即座にもたらすので、ヘパリン／ビバリルジンによりＣＰＢを受けている患者を抗凝固剤処置する必要性がなお残る。

現在、ＣＰＢ中の抗凝固剤処置について認可された２つの製品がある：
ａ）ヘパリン：
ヘパリンは、患者の血液の凝固を防ぐために、ＣＰＢ装置に接続するすぐ前に患者に体重調整様式で（３００〜４００ＩＵ／体重（ＢＷ）ｋｇ）投与される。ＣＰＢ自体も患者に接続される前にヘパリンをロードされる。これは、患者の命を即時に脅かすことなく手技全体の間人工酸素供給を行いながらＣＰＢ手術を可能にする唯一の抗凝固剤処置方策である。この手技の間、凝固能は、手術の間活性化凝固時間（ＡＣＴ）によりモニタリングされる（通常値１００〜１２０秒；手術の間は３００〜５００秒）。ＡＣＴを測定することにより、医師は半定量的様式でヘパリンの投薬を指導することができる。ヘパリンはＡＴ（ＡＴＩＩＩ）に結合し、そして凝固系を不活化する即効（ｆａｓｔ）阻害複合体を形成する。低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）は主にプロトロンビナーゼ−複合体（第Ｘ因子、第Ｖａ因子、Ｃａ²⁺、リン脂質）を阻害するが、未分画ヘパリン（ＵＦＨ）は第ＩＩ因子も阻害し、従ってＬＭＷＨより早く反応する。さらに、第ＩＸ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子及びカリクレインは、ヘパリンにより不活化される。

ＣＰＢの後、潜在的な出血事象は患者について致命的な結果を有するかもしれないので、ヘパリンの効果はプロタミン（１ｍｇ／１００ ＩＵヘパリン）により拮抗される必要がある。

この標準的治療の主要な制限は：
ｉ） 患者の血液中のヘパリンの量がＡＣＴと相関せず（非特許文献１０）、従って患者が低−又は高凝血異常（ｈｙｐｏ− ｏｒ ｈｙｐｅｒｃｏａｇｕｌｏｐａｔｈｉｃ）状態のいずれかになる危険性が残る。
ｉｉ） ヘパリンは血小板減少症（ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｐｅｎｉａ）を誘導し得る（血小板の直接的活性化によりヘパリンにより引き起こされるＨＩＴ、又はヘパリン及び血小板因子４蓄積並びに複合体に対する抗体の継続的発生により引き起こされるＨＩＴ ２）。
ｉｉｉ） ＣＰＢ後のヘパリン拮抗と集中治療室（ＩＣＵ）での患者の抗凝固治療の開始との間の時間窓は、依然として出血又は血栓性事象の危険因子である。
ｉｖ） ヘパリン自体の効果に対する解毒薬としてのプロタミンは、血栓性事象、重篤なアレルギー反応及び血圧の致死的な低下についての危険性を増加させる。過少量投与（ｕｎｄｅｒ ｄｏｓｉｎｇ）の場合のプロタミンのこの先の第二の投与は、患者に対して致死的結果を有し得る。

ｂ） ビバリルジン：
ビバリルジン（ヒルジンから誘導される）は、ヘパリンによる抗凝固剤処置の代替として既知のＨＩＴを有する患者における使用について登録されている。この代替療法の制限は：
ｉ） 出血の場合の臨床登録された解毒薬が現在ところ無いこと。
ｉｉ） 結果としての術後の危険性を伴うＣＰＢの間の血液製剤の大量消費（非特許文献１１）

Ｗ０２００６１０６６８７８ ＷＯ２００８／０９８７２０

Ｍａｃｋｍａｎ，Ｎ．２００４．Ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ，ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ，ａｎｄ ｖａｓｃｕｌａｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．２４，１０１ ５−１ ０２２ Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ａ ａｎｄ Ｂａｉｒｄ ＬＧ．２００３．ＤＸ−８８ ａｎｄ ＨＡＥ：ａ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ．Ｔｒａｎｓｆｕｓ Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ Ｓｃｉ．２９：２５５−２５８ ｌｓａｗａ Ｈ ｅｔ ａｌ．２００２．Ａ ｍｏｓｑｕｉｔｏ ｓａｌｉｖａｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｌａｓｍａ ｃｏｎｔａｃｔ ｓｙｓｔｅｍ ｂｙ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｆａｃｔｏｒ ＸＩ ａｎｄ ｈｉｇｈ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｋｉｎｉｎｏｇｅｎ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２７６５１−２７６５８ Ｃａｍｐｏｓ ＩＴＮ ｅｔ ａｌ．３２ Ｉｎｓｅｃｔ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．９９１−９９７，２００２ Ｃａｍｐｏｓ ＩＴＮ ｅｔ ａｌ．５７７ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５１２−５１６，２００４ Ｒｅｎｎｅ Ｔ ｅｔ ａｌ．２００５．Ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｔｈｒｏｍｂｕｓ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｍｉｃｅ ｌａｃｋｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ＸＩＩ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０２：２７１−２８１ Ｈ．Ｐ．Ｗｅｎｄｌ ａｔ ａｌ １９９６； Ｉｍｍｕｎｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ； Ｃ．Ｓｐｅｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．； Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ３０ （２００９） Ｙｕ Ｊ ｅｔ ａｌ．； Ｉｎｔ Ｊ Ａｒｔｉｆ Ｏｒｇａｎｓ １９９４； １７：４９９−５０４ Ｃ．Ｓｐｅｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ ３０ （２００９） ４４４７−４４５６ Ｇｒｕｅｎｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．２０１０； ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｔｒａ Ｃｏｒｐｏｒｅａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃ．Ｄｙｋｅ ｅｔ ａｌ．； ｓｕｒｇｅｒｙ ｆｏｒ ａｃｑｕｉｒｅｄ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅ ２００５

本出願において、驚くべきことに、ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａの阻害剤の使用が凝固を防止し、一方でＣＰＢ手技の間及びＣＰＢ手技の後の出血の危険性は医学的手技において増強されないということを見出し、この手技は、患者の血液を人工表面と接触させることを含み、これは特定の実施態様では体外である。従って、ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤に加えて減少した量の他の抗凝固剤を投与するだけでよい。一実施態様において、ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤に加えて他の抗凝固剤を添加することは完全に回避され得る。これは、現在の治療法に固有の出血の増加した危険性、さらには抗凝固剤処置を逆転させることによる合併症が回避されるので、より安全な医学的手技をもたらす。

特定の実施態様の要旨
本出願は、ヒト又は動物対象に対して行われる医学的手技の間かつ／又は該医学的手技の後の、血栓の形成及び／又は安定化の予防における使用のための、ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤を提供し、該医学的手技は、該ヒト又は動物対象の血液を人工表面と接触させることを含み、ここで該ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤は、該医学的手技の前、かつ／又は該医学的手技の間、かつ／又は該医学的手技の後に投与される。特定の実施態様において、上記対象の血液と人工表面との接触は対象の体外で起こる。本発明の一実施態様において、人工表面は、ヒト又は動物対象の血液の少なくとも８０％、９０％、又は１００％に曝露される。別の実施態様において、ヒト又は動物対象の血液の８０％、９０％、又は１００％の体積が、３０分未満、１５分未満、１０分未満、又は５分未満に人工表面に接触する。別の実施態様において、人工表面はヒト又は動物体外で血液のための容器として作用し、このような血液は少なくとも５０ｍＬ、１００ｍＬ、２００ｍＬ、３００ｍＬ、４００ｍＬ、５００ｍＬ又はそれ以上の量であり得る。一実施態様において、患者の血液に暴露される人工表面は少なくとも０．２ｍ²である。実施態様において、人工表面面積は少なくとも０．１ｍ²、又は少なくとも０．５ｍ²である。別の実施態様において、人工表面は、レトラクタ、針、小刀、及び対象の血液のわずかと接触するのみの他の慣用の手術器具を除く。

別の実施態様は、ヒト又は動物対象に対して行われる医学的手技の間かつ／又は該医学的手技の後の、血栓の形成及び／又は安定化の予防における使用のための、ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤を含み、該医学的手技は、該ヒト又は動物対象の血液を人工表面と接触させることを含み、ここで該ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤は、該医学的手技の前、かつ／又は該医学的手技の間、かつ／又は該医学的手技の後に投与され、そしてさらにここで、
（ｉ） 人工表面は、対象の血液体積の少なくとも８０％に曝露され、かつ人工表面は少なくとも０．２ｍ²であるか、又は
（ｉｉ） 人工表面は、対象の体外での採血のための容器であるか、又は
（ｉｉｉ）人工表面は、ステント、弁、管内カテーテル、若しくは血液の内部補助ポンピングのためのシステムである。

別の実施態様は、ヒト又は動物対象に対して行われる医学的手技の間かつ／又は該医学的手技の後の、血栓の形成及び／又は安定化の予防における使用のための、ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤に言及し、該医学的手技は、該ヒト又は動物対象の血液を人工表面と接触させることを含み、ここで該ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤は、該医学的手技の前、該医学的手技の間、かつ／又は該医学的手技の後に投与され、そしてここで該ヒト若しくは動物対象は増加した出血の危険性を有していないか、又はここで該ヒト若しくは動物対象は、ヘパリン若しくはその誘導体及び／若しくはヒルジン若しくはその誘導体の投与に伴う出血の危険性と比較して減少した出血の危険性を有する。好ましくは、出血の危険性は増加しない。

別の実施態様は、ヒト又は動物対象に対して行われる医学的手技の間かつ／又は該医学的手技の後の、血栓の形成及び／又は安定化の予防における使用のための、ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤に言及し、該医学的手技は、該ヒト又は動物対象の血液を人工表面と接触させることを含み、ここで該ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤は、該医学的手技の前、該医学的手技の間、かつ／又は該医学的手技の後に投与され、そしてここで該ヒト又は動物対象は増加した出血の危険性を有しておらず、そしてここで該ヒト又は動物対象において、ｉ）Ｄｕｋｅに従う耳若しくは指先の出血時間は１０分より長くなく、又はｉｉ）Ｉｖｙの方法に従う出血時間は１０分より長くなく、又はｉｉｉ）Ｍａｒｘの方法に従う出血時間は４分より長くない。

特定の実施態様において、医学的手技は、
ｉ） 心肺バイパスを必要とするいずれかの手技、又は
ｉｉ） 体外膜型酸素供給を介する血液の酸素供給及びポンピング、又は
ｉｉｉ） 血液の補助ポンピング（内部又は外部）、又は
ｉｖ） 血液透析、又は
ｖ） 血液の体外ろ過、又は
ｖｉ） 動物若しくはヒト対象における後の使用のためのいずれかの保存場所における採血、又は
ｖｉｉ） 静脈若しくは動脈の管内カテーテルの使用、又は
ｖｉｉｉ） 診断的若しくは介入的心臓カテーテル法のための装置の使用、又は
ｉｘ） 脈管内装置の使用、又は
ｘ） 人工心臓弁の使用、又は
ｘｉ） 人口移植片の使用
である。

別の実施態様において、ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤でコーテイングされている医療機器が提供される。医療機器は、心肺バイパス機器、血液の酸素供給のための体外膜型酸素供給システム、血液の補助ポンピングのための装置、血液透析装置、血液の体外ろ過のための装置、採血における使用のための保存場所、管内カテーテル、ステント、人工心臓弁、並びに／又は管状部材、カニューレ、遠心ポンプ、弁、ポート、及び／若しくはダイバータなどを含むこれらの装置のいずれか１つのための付属品であり得る。

一実施態様において、ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤は、動物若しくはヒト対象における後の使用のためのいずれかの保存場所における採血を含む医学的手技の前、該医学的手技の後、かつ／又は該医学的手技の間に投与される。一実施態様において、ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤は、供血プロセスの前、かつ／若しくは供血プロセスの間に血液ドナーに投与される。別の実施態様において、ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤は収集保管場所において血液と混合される。さらに別の実施態様において、ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤は、採血前に収集保管場所中に位置し、そして保管場所の内部表面上にコーティングされ得る。別の実施態様において、ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤は、血液がヒト又は動物レシピエントに投与される前、間かつ／又は後に血液レシピエントに投与される。

他の実施態様において、ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤は、ヘパリン若しくはその誘導体及び／又はヒルジン若しくはその誘導体と共に投与され、ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤が投与されない場合に前記医学的手技の前、かつ／又は該医学的手技の間に通常投与されるヘパリン若しくはその誘導体及び／又はヒルジン若しくはその誘導体の量と比較して減少した量のヘパリン若しくはその誘導体及び／又はヒルジン若しくはその誘導体が、ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤に加えて、医学的手技の前、かつ／又は医学的手技の間かつ／又は医学的手技の後に添加される。「と共に投与される」により、同時に投与される（単一の製剤又は２つの分離した製剤のいずれかで）か、又は１分、５分、１０分、１５分、３０分若しくは４５分以内、又は１時間、２、３、４、５、若しくは６時間以内に投与されるか、又は異なる時点で投与されるが同じ医学的手技のために投与されることを意味する。いずれの薬剤が最初に投与されてもよい。

ヘパリン誘導体は、１つ又はそれ以上の化学修飾により製造された、ヘパリン由来の一群の生成物からなる。例えば、硫酸化ヘパリンは、グルコサミン残基中の全ての第一級ヒドロキシル及び二糖単位中の第二級ヒドロキシル基の大部分がＯ−サルフェートエステルで置換されている誘導体であり；カルボキシ還元ヘパリンは、ヘパリンのウロン酸残基のカルボキシル基がアルコールに還元されている誘導体であり；過ヨウ素酸塩−酸化ヘパリンは、ヘパリンの全ての非硫酸化ウロン酸残基が過ヨウ素酸により酸化されている誘導体である。他のヘパリン誘導体としては、例えば、脱−Ｏ−硫酸化ヘパリン、２−Ｏ−脱硫酸化ヘパリン、完全Ｎ−アセチル化ヘパリン、完全Ｎ−硫酸化ヘパリン、脱−Ｎ−硫酸化ヘパリン、脱−Ｎ−アセチル化ヘパリンが挙げられる。ヒルジン誘導体もまた化学修飾を含み得、これはヒルジンペプチドに対するものであるか、又は誘導体はヒルジンペプチドの合成類似体であり得、かつ／又は例えば担体分子に連結されたヒルジンペプチドを含み得、これは、例えばヒルジンの半減期を増加させるために使用され得る。ヒルジン誘導体の例としては、レピルジン、及びデシルジンが挙げられる。ヒルジン誘導体は、それらがトロンビンの活性触媒部位に結合するということを特徴とする。

一実施態様において、ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤と共に投与されるヘパリン若しくはその誘導体及び／又はヒルジン若しくはその誘導体は、ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤を用いない場合のＡＣＴが５００秒未満となるように減少した量で投与される。

別の実施態様において、ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤は、ヘパリン若しくはその誘導体の投与及び／又はヒルジン若しくはその誘導体の投与を用いない医学的手技において投与される。

一実施態様において、ヒト又は動物対象は、医学的手技の後に減少した血栓形成促進の危険性を有するか、血栓形成促進の危険性を有していない。別の実施態様において、ヒト又は動物対象は、ヘパリン若しくはその誘導体の術後の拮抗及び／又はヒルジン若しくはその誘導体の術後の拮抗が防止されるかまたは減少した後に、ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤の使用により減少した血栓形成促進の危険性を有するか又は血栓形成促進の危険性を有さない。

別の実施態様において、ヘパリン若しくはその誘導体の術後の拮抗及び／又はヒルジン若しくはその誘導体の術後の拮抗の後の血栓形成促進の危険性は、医学的手技の前、医学的手技の間、かつ／又は医学的手技の後のＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤の投与により予防されるか又は減少され、ここで、ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤が投与されない場合に該医学的手技の後に通常投与される該アンタゴニストの量と比較して、減少した量のヘパリンアンタゴニスト及び／若しくはヒルジンアンタゴニストが医学的手技の後に加えられるか、又はヘパリンアンタゴニスト及び／若しくはヒルジンアンタゴニストは加えられない。

一実施態様において、本発明に従って使用されるＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤は、
（ｉ） 野生型インフェスチン−４ポリペプチド配列（配列番号１）、若しくはその変異体［ここで変異体は、
（ａ） 野生型インフェスチン−４配列のＮ末端アミノ酸２〜１３、及び野生型インフェスチン−４との差異を生じる、該Ｎ末端アミノ酸の外側の少なくとも１個かつ５個までのアミノ酸変異；
及び／又は
（ｂ） 野生型インフェスチン−４配列からの６個の保存的システイン残基及び野生型インフェスチン−４配列に対する少なくとも７０％の相同性
を含む］、
（ｉｉ） 野生型インフェスチン−４配列のＮ末端アミノ酸２〜１３を含むように変異されたＳＰＩＮＫ−１（配列番号２）若しくは該変異ＳＰＩＮＫ−１の変異体［ここで、変異体は、
（ａ） 野生型インフェスチン−４配列のＮ末端アミノ酸２〜１３；及び野生型ＳＰＩＮＫ−１配列との差異を生じ、かつ野生型インフェスチン−４配列に対する変異体の相同性を増加させる、該Ｎ末端アミノ酸の外側の少なくとも１個かつ５個までのアミノ酸変異；
及び／又は
（ｂ） 野生型ＳＰＩＮＫ−１配列からの６個の保存的システイン残基及び野生型ＳＰＩＮＫ−１配列に対する少なくとも７０％の相同性
を含む］、
（ｉｉｉ） ＡＴ ＩＩＩ、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、Ｃ１阻害剤、アプロチニン、アルファ−１プロテアーゼ阻害剤、アンチパイン（［（Ｓ）−１カルボキシ−２−フェニルエチル］−カルバモイル−Ｌ−Ａｒｇ−Ｌ−Ｖａｌ−アルギナール）、Ｚ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−アルデヒド−ジメチルアセテート、ＤＸ８８、ロイペプチン、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−Ｐｙｒ−ＣＮのようなプロリルオリゴペプチダーゼの阻害剤、トウモロコシ−トリプシン阻害剤（ＣＴＩ）、ウシ膵臓トリプシン阻害剤の変異体、エコチン、ＹＡＰ（コガネガレイ（ｙｅｌｌｏｗｆｉｎ ｓｏｌｅ）抗凝固性タンパク質）及び西洋カボチャトリプシン阻害剤−Ｖ、西洋カボチャイソ阻害因子、及びＰｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−クロロメチル−ケトン（ＰＣＫ）；
（ｉｖ） 抗ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ抗体［ここで、抗体はＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａに結合し、かつその活性及び／又は活性化を阻害する］
を含む。

一実施態様において、本発明に従って使用されるＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤は、半減期増強ポリペプチドに連結され、ここで半減期増強ペプチドは場合により、アルブミン、アファミン（ａｆａｍｉｎ）、アルファ−フェトプロテイン又はビタミンＤ結合タンパク質、ヒトアルブミン又はその変異体、免疫グロブリン又はその変異体、ＩｇＧのＦｃである。別の実施態様において、上記半減期増強ポリペプチドはリンカーを介してＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤に連結される。

ブタ全血のエクスビボ全血凝固時間（ＷＢＣＴ）は、ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤ｒＨＡ−インフェスチン−４を添加した後劇的に延長され得る。必要な体積のｒＨＡ−インフェスチン−４をシリンジで与えた。次いでブタ全血を加えて総体積５００μＬとし、穏やかに混合した後、予熱したガラスバイアルに入れた。凝固時間を１分毎（水浴中３７℃でのインキュベーション）にガラスバイアルを穏やかに振盪させることにより視覚的に決定した。データを平均＋標準誤差として示す。Ｎ＝各濃度での２〜３頭のブタの全血。 マウス全血のエクスビボＷＢＣＴは、抗ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を添加した後延長され得る。必要な体積の抗ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ ＭＡｂをシリンジで与えた。次いでマウス全血を加えて総体積を５００μＬとし、穏やかに混同した後、予熱したガラスバイアルに入れた。凝固時間を１分毎（水浴中３７℃でのインキュベーション）にガラスバイアルを穏やかに振盪させることにより視覚的に決定した。データを平均＋標準誤差として示す。Ｎ＝各濃度での３匹のマウスの全血。 ブタ全血のエクスビボＷＢＣＴは、ｒＨＡ−インフェスチン−４の単回静脈内（ｉ．ｖ．）投与後に顕著に延長される。投与後の特定の時点において、血液を動物から採取し、そして予熱したガラスバイアルに入れた。１分毎にそれぞれのガラスバイアルを穏やかに振盪させることにより凝固時間を視覚的に決定した（水浴中３７℃でのインキュベーション）。 ブタ血液のａＰＴＴは、ネガティブコントロールと比較して、ｒＨＡ−インフェスチン−４の投与後に顕著に延長された。 ブタ血液のＰＴは、ａＰＴＴの延長と比較して、より高用量のｒＨＡ−インフェスチン−４の投与後にわずかしか延長されなかった。 ブタ皮膚出血時間は、ｒＨＡ−インフェスチン−４を投与した後、通常の範囲内のままであった（約２〜５分）。この効果は実験の終了時まで持続した。 ブタモデルにおける体外循環を、図７に示されるグラフに従って行った。 ｒＨＡ−インフェスチン−４投与後に、ブタ血液のａＰＴＴは、体外循環での実験全体の間、顕著に延長されたままであった。 ブタ血液のＰＴは、体外実験の間ｒＨＡ−インフェスチン−４投与後にわずかな影響しか受けなかった。 ブタ全血のエクスビボＷＢＣＴは、ｒＨＡ−インフェスチン−４の単回ｉ．ｖ．投与後に体外実験全体の間中延長された。特定の時点で血液を動物から採取し、そして予熱したガラスバイアル中に入れた。１分毎（水浴中３７℃でのインキュベーション）にガラスバイアルを穏やかに振盪させることにより凝固時間を視覚的に決定した。 Ｒ．ｐｒｏｌｉｘｕｓ阻害剤のトロンビンとの接触部位及びＳＰＩＮＫ−１のキモトリプシンとの接触部位。＃はＲ．ｐｒｏｌｉｘｕｓ阻害剤とトロンビンとの間の接触部位であるアミノ酸を示し；＋はＳＰＩＮＫ−１とキモトリプシンとの間の接触部位であるアミノ酸を示す。 インフェスチン−４（Ｉ４）とＳＰＩＮＫ−１（ＳＰ）との間のアミノ酸配列類似性。^＊は同一のアミノ酸を示し；｜は類似アミノ酸を示し；太字のアミノ酸は保存的システインであり；インフェスチン−４配列の下線を付したアミノ酸２−１３は保存されている。 インフェスチン−４、ＳＰＩＮＫ１及び３つのＳＰＩＮＫ１変異体（Ｋ１、Ｋ２、及びＫ３）のアミノ酸配列。インフェスチン−４配列に関して＊は同一のアミノ酸を示し；｜は類似したアミノ酸を示す。Ｉ４の下線を付した配列を、ＳＰＩＮＫ−１の１５個のアミノ酸を置き換えてＫ１を生成するために使用した。変異体Ｋ２及びＫ３をＫ１配列に対するさらなる点変異（下線を付したアミノ酸）により生成した。

詳細な説明
ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤は、第ＸＩＩ因子及び活性化第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩａ）のいずれか又は両方の阻害剤を指す。

本出願は、ヒト又は動物対象の血液を人工表面と接触させることを含む該ヒト又は動物対象に対して行われる医学的手技の間、かつ／又は該医学的手技の後に、血栓の形成及び／又は安定化を予防する際の使用のためのＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤を提供し、ここで該ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤は、該医学的手技の前、該医学的手技の間、かつ／又は該医学的手技の後に投与される。

人工表面は、いずれかの非ヒト又は非動物表面であり、これは医学的手技の間に血液と接触され、そして第ＸＩＩ因子の第ＸＩＩａ因子への接触活性化をもたらす。特定の実施態様において、対象の血液と人工表面との間の接触は、対象の体外で起こる。非限定的な例として、このような人工表面は、鋼鉄、いずれかの種類のプラスチック、ガラス、シリコン、ゴムなどであり得る。一実施態様において、人工表面はヒト又は動物対象の血液の少なくとも８０％、９０％、又は１００％に曝露される。別の実施態様において、ヒト又は動物対象の血液の８０％、９０％、又は１００％の体積が、３０分未満、１５分未満、１０分未満、又は５分未満に人工表面と接触する。別の実施態様において、人工表面はヒト又は動物の体外で血液のための容器として作用し、そしてこのような血液は少なくとも５０ｍＬ、１００ｍＬ、２００ｍＬ、３００ｍＬ、４００ｍＬ、５００ｍＬ又はそれ以上の量であり得る。一実施態様において、患者の血液に曝露される人工表面は、少なくとも０．２ｍ2である。一実施態様において、患者の血液の全体積が人工表面に暴露され、これは少なくとも０．２ｍ²である。実施態様において、人工表面面積は少なくとも０．１ｍ2、又は少なくとも０．５ｍ2である。別の実施態様において、人工表面は、レトラクタ、針、小刀、及び対象の血液のわずかと接触するのみの他の慣用の手術器具を除く。

一実施態様において、ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤は医学的手技の前、該医学的手技の間、かつ／又は該医学的手技の後に投与される。別の実施態様において、ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤は医学的手技の間に投与される。別の実施態様において、これはまた医学的手技か開始される前に投与され得る。接触活性化は手術の間に容器内に一体化されている人工表面上で起こり得るので、医学的手技の後に投与することさえ有益であり得る。

別の実施態様は、ヒト又は動物対象の血液を人工表面と接触させることを含む該ヒト又は動物対象に対して行われる医学的手技の間、かつ／又は該医学的手技の後に血栓の形成及び／又は安定化を予防するためのＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤に言及し、ここで血液と人工表面との間の接触は、対象の体外で起こり、ここで該ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤は、該医学的手技の前、該医学的手技の間かつ／又は該医学的手技の後に投与され、そしてここで該ヒト又は動物対象は、増加した出血の危険性を有していない。実施態様において、該対象の血液と人工表面の少なくとも一部との接触は、対象の身体の「外側」で起こり、これは特定の実施態様において、対象の身体から少なくとも１ｃｍ、又は２ｃｍ、又は３ｃｍ、又は４ｃｍ、又は５ｃｍ、又は１０ｃｍ、又は１５ｃｍ、又は２０ｃｍ、又は５０ｃｍ、又はそれ以上離れている。

別の実施態様は、ヒト又は動物対象の血液を人工表面と接触させることを含む該ヒト又は動物対象に対して行われる医学的手技の間、かつ／又は該医学的手技の後の血栓の形成及び／又は安定化の予防のためのＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤に言及し、ここで該ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤は、該医学的手技の前、該医学的手技の間、かつ／又は該医学的手技の後に投与され、そしてここで該ヒト又は動物対象は増加した出血の危険性を有しておらず、そしてここで該ヒト又は動物対象において、ｉ）Ｄｕｋｅに従う耳若しくは指先の出血時間が１０分より長くなく、８分より長くなく、６分より長くなく、若しくは５分より長くないか、又はｉｉ）Ｉｖｙの方法に従う出血時間は１０分より長くなく、８分より長くなく、６分より長くなく、若しくは５分より長くないか、又はｉｉｉ）Ｍａｒｘの方法に従う出血時間は４分より長くなく、３分より長くなく、若しくは２分より長くない。換言すると：ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤の投与に起因する。

Ｄｕｋｅ、Ｉｖｙ又はＭａｒｘに従う出血の危険性の決定は、ヒト又は動物対象における出血の危険性を決定するために使用され得る方法の非限定な例でしかない。動物においては、出血の危険性は皮膚出血時間を決定することによっても評価され得る。例えばブタにおいて、皮膚出血時間（ＳＢＴ）は、Ｓｕｒｇｉｃｕｔｔ^(R)切断装置（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｔｅｃｈｎｉｄｙｎｅ Ｃｏｒｐ．，Ｅｄｉｓｏｎ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ）を使用することにより生成された標準化された長さ５ｍｍ深さ１ｍｍの内耳切開からの失血の停止までの時間として定義され得る。

上述のこの動物試験と比較して、ヒトのための試験方法を以下に記載する。

Ｄｕｋｅ法に従う出血時間は、対象の耳垂の縁で、又は上腕の周りに血圧計カフ（４０ｍｍ Ｈｇ）を用いて指先で行われる。研究者は耳垂の縁又は指先をランセットで穿刺し、そして深さ約３ｍｍの組織損傷を生じさせる。次いで研究者はその損傷を技術的に、又は手動で損なうことなく重力によって組織損傷から血液の滴を落下させる。外傷に触れることなく１５〜３０分毎に滴っている血液をセルロース紙で拭き取る。研究者が目視検査により停止を検出するまでこの手順を繰り返す。この目視で評価された出血試験の正常値は５分までである。しかし、個々の対象によってもいくらかの変動があるので、Ｄｕｋｅに従う正常出血時間は６分まで、又は８分まで、又は１０分までにもなり得る。

Ｉｖｙ法に従う出血時間は、標準化された組織圧力を対象の上腕上の血圧計カフ（４０ｍｍ Ｈｇ）により生じさせながら、前腕の内側の皮膚における規定された切開（例えばＳｕｒｇｉｃｕｔｔ^(R)）で行われる。研究者は、外傷に触れることなく３０秒ごとに重力によって外傷から流れる血液を拭き取る。次いで、出血が止まるまで時間をかける。この目視評価された出血試験の正常値は５分までである。しかし、個々の対象によってもいくらかの変動があるので、Ｉｖｙに従う正常出血時間は、６分まで、又は８分まで、又は１０分までにもなり得る。

Ｍａｒｘに従う半水性（ｓｕｂａｑｕａｌｅ）出血時間は、ランセットを使用することにより対象の指先に作製された組織損傷で行われる。組織損傷が作製された後、指先を直ぐに３７℃の水中に挿入することが必要である。次いで、指を水中に入れたまま、研究者は出血を目視で調べ、そして組織損傷を損なうことなく出血が止まるまでの時間をモニタリングする。この目視で評価した出血試験の正常値は２分までである。しかし、個々の対象によってもいくらかの変動があるので、Ｍａｒｘに従う正常出血時間は、３分まで又は４分までにもなり得る。

特定の実施態様において、医学的手技は、非限定的な例として：
ｉ） 心肺バイパス（ＣＢＰ）を使用するいずれかの手技、例えば冠動脈バイパスグラフト（ＣＡＢＧ）、弁置換、大動脈置換、及び心臓若しくは血管手術の他の形態を含む；又は
ｉｉ） 体外膜型酸素供給（ＥＣＭＯ）を介した血液の酸素供給及びポンピング、これは急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）の患者、若しくは乳児呼吸促迫症候群（ＩＲＤＳ）のため、若しくは毒性物質を吸入した患者のため、若しくは羊水吸収症候群（ＭＡＳ）、若しくは肺感染症、若しくは肺（ｐｕｌｍｏｎａｌ）高血圧、若しくは心臓手術後、心筋症の結果として若しくは心臓移植の前の様々な理由の心不全のために使用される；又は
ｉｉｉ） 人工心臓及び心室補助装置を含む血液の補助ポンピング（内部又は外部）；又は
ｉｖ） 血液の透析；又は
ｖ） 血液の体外ろ過；又は
ｖｉ） 動物若しくはヒト対象における後の使用のためのいずれかの保存場所における採血、又は
ｖｉｉ） 一定時間留まることが予想される静脈若しくは動脈の管内カテーテル（例えば、Ｓｗａｎ−Ｇａｎｚカテーテル、中心静脈カテーテルなど）の使用、又は
ｖｉｉｉ） 診断的若しくは介入的心臓カテーテル法のための、カテーテル、外鞘、ガイドワイヤー若しくは他の装置／機器（単数又は複数）の使用、又は
ｉｘ） 脈管内装置（単数又は複数）、例えばステント（単数又は複数）、大静脈フィルター（単数又は複数）、心房中隔欠損（ＡＳＤ）、心室中隔欠損（ＶＳＤ）若しくは動脈管開存（Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ Ｄｕｃｔｕｓ Ａｒｔｅｒｉｏｓｕｓ）（ＰＤＡ）閉塞物（ｏｃｃｌｕｄｅｒ）（単数又は複数）、コイル（単数又は複数）の使用、又は
ｘ） 例えば、大動脈弁、僧帽弁、三尖弁、肺動脈弁を含む人工心臓弁（単数又は複数）の使用、そしてそれによる心臓弁は機械弁、若しくは生体弁、組織操作弁、若しくはステントに取り付けられた弁であり得る；又は
ｘｉ） 例えば、Ｇｏｒｅ−ｔｅｘ（登録商標）大動脈移植片（単数又は複数）、肺移植片（単数又は複数）、及び改変（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）Ｂｌａｌｏｃｋ−Ｔａｕｓｓｉｇ（ＢＴ）シャント（単数又は複数）を含む人口血管移植片（単数又は複数）の使用
である。

一般に、血液がヒト身体の内側及び外側で人工表面と接触し、次いでこれらの表面上での凝固活性化の結果として凝塊形成を生じ得るいくつかの医学的シナリオがある。

外部接触（ヒト体外）は、血液が身体から取り出されてしばらく後に身体に戻るようにする体外型循環を含む手技（バイパス、ＥＣＭＯ、血液濾過、透析、採血など）として要約され得る。

外来表面に対する内部接触（ヒト身体の内側）は、脈管内装置、永久的に移植されたもの（心臓弁ステントなど）及び一時的に使用されるだけのもの（カテーテル、ガイドワイヤーなど）の両方を使用する全ての手技において生じる。

別の実施態様において、ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤でコーティングされた医療機器が提供される。医療機器は、心肺バイパス機、血液の酸素供給のための体外膜型酸素供給システム、血液の補助ポンピングのための装置、血液透析装置、血液の体外ろ過のための装置、採血における使用のための保存場所、管内カテーテル、ステント、人工心臓弁、並びに／又は管状部材、カニューレ、遠心ポンプ、弁、ポート、ダイバータなどを含むこれらの装置のいずれかのための付属品であり得る。別の実施態様は、浸漬、吹付け、及びコーティングの技術分野で標準的な他の方法により、ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤でそれらをコーティングすることによりこのような装置を製造する方法を含む。

実施態様において、ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤は人工表面上にコーティングされ、ここでＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤は、それがＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａへの結合に利用可能であるように、すなわちＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤の生物学的活性が保存されるように、表面上にある。実施態様において、ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤は人工表面に共有結合で結合される。他の実施態様において、ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤は非共有結合で表面に結合される。特定の実施態様において、人工表面はＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤で含浸される。人工表面は薬物溶出表面であり得、ここでＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤は表面からゆっくりと放出される。ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤は表面に包埋され得、ここでＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤は、血液が人工表面と接触するにつれてゆっくりと溶解する。実施態様において、表面はＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤が表面に接着するように誘導体化される。特定の実施態様において、表面上にコーティングされるＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤の濃度は、対象に全身投与される量と類似したものであり得る。ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤溶液の濃度及び／又は人工表面上で利用可能なＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤の最終濃度は、製造の前及び／又は間に決定され得る。実施態様において、ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤は装置の人工表面上にコーティングされることにより投与される。

他の実施態様において、ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤はヘパリン若しくはその誘導体及び／又はヒルジン若しくはその誘導体と共に投与され、ここでＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤が投与されない場合に上記医学的手技の前、かつ／又は該医学的手技の間に通常投与されるヘパリン若しくはその誘導体及び／又はヒルジン若しくはその誘導体の量と比較して、該医学的手技の前、かつ／又は該医学的手技の間、かつ／又は該医学的手技の後にＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤に加えて加えられるヘパリン若しくはその誘導体及び／又はヒルジン若しくはその誘導体の量は減少している。

上述の医学的手技における標準的な治療は、ヘパリン若しくはその誘導体及び／又はヒルジン若しくはその誘導体の投与である。これらの薬物は、血液が人工表面と接触する場合に起こる接触活性化に起因する凝固を予防するために投与される。凝固の予防を達成するために、これらの薬物は、活性化凝固時間（ＡＣＴ）が３００〜５００秒の間になるように投薬される。３００秒未満のＡＣＴ値で上述の医学的手技を行うことは血栓症の高いリスクを伴う。

ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤の投与は、減少した量のヘパリン若しくはその誘導体及び／又はヒルジン若しくはその誘導体を用いて上述の医学的手技を行うことができるということが見出され、これらはそれ自体で、ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤を投与することなく５００秒未満のＡＣＴ値をもたらす。

実施態様は、ヘパリン若しくはその誘導体及び／又はヒルジン若しくはその誘導体がそれら自体でＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤を投与することなく投与される場合に、ＡＣＴ値が４００秒未満、３００秒未満、２５０秒未満、２００秒未満、１５０秒未満、１００秒未満、５０秒未満となるような、ヘパリン若しくはその誘導体及び／又はヒルジン若しくはその誘導体のさらに減少した量を用いて上述の医学的手技を行うことを含む。このような減少した量のヘパリンには、１〜４００ＩＵ／体重（ＢＷ）ｋｇ、５０〜３００ＩＵ／ｋｇ ＢＷ、１００〜２００ＩＵ／ｋｇ ＢＷ、及び２００〜３００ＩＵ／ｋｇ ＢＷが含まれ得る。減少した量のヘパリンには、４００ＩＵ／体重（ＢＷ）ｋｇ未満の量、３００ＩＵ／体重（ＢＷ）ｋｇ未満の量、２００ＩＵ／体重（ＢＷ）ｋｇ未満の量、１００ＩＵ／体重（ＢＷ）ｋｇ未満の量、５０ＩＵ／体重（ＢＷ）ｋｇ未満の量、又は１０ＩＵ／体重（ＢＷ）ｋｇ未満の量が含まれ得る。

一実施態様において、ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤は、ヘパリン若しくはその誘導体を投与することなく、かつ／又はヒルジン若しくはその誘導体を投与することなく、上記の医学的手技において投与される。

ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤の投与に加えてヘパリン若しくはその誘導体を投与することなく、かつ／又はヒルジン若しくはその誘導体を投与することなく上述の医学的手技において処置される患者は、現在の標準的な治療の欠点である増加した出血の危険性に苦しむことなく、凝固カスケードの接触活性化に起因する凝固に対して保護される。これは、上述の医学的手技の後の凝固状態は一般的な凝固試験（例えばａＰＴＴ、ＰＴ）によって適切に反映されず、従って適切にモニタリング及び処置できないので、これは患者及び医師にとって重大なことである。患者自身は、高凝血異常（ｈｙｐｅｒｃｏａｇｕｌｏｐａｔｈｙ）又は低凝血異常（ｈｙｐｏｃｏａｇｕｌｏｐａｔｈｙ）の徴候を示し得る。従っていくつかの国では、凝固の危険性は個人の患者の危険性に関連するが、術後の深刻な出血の場合において可能性のある医学的法的な理由のためだけに、患者は医学的手技の後に時宜を得たやり方で抗凝固剤処置されない。

医学的手技が行われた後のヘパリン若しくはその誘導体の投与に関連するこの増加した出血の危険性、並びにヒト又は動物対象の血液がもはや人工表面に曝露されないということに起因して、ヘパリン若しくはその誘導体の効果は、増加した出血の危険性を可能な限り早く減少させるために可能な限り早く拮抗されなければならない。ヘパリン若しくはその誘導体の効果を拮抗するために、通常はプロタミンが投与されるが；しかし拮抗は、以下に記載されるようなそれ自身の危険性を示す。ヒルジン若しくはその誘導体がヘパリン若しくはその誘導体の代わりに又はヘパリン若しくはその誘導体と組み合わせて使用される場合、出血の危険性も増加するのでヒルジン若しくはその誘導体の効果を拮抗することも有益だが、臨床的に有用なアンタゴニストはまだ認可されておらず、従って拮抗されていないヒルジン若しくはその誘導体が残っていることが危険性をもたらす。

もしヒルジン若しくはその誘導体のこのようなアンタゴニストが利用可能になるならば、アンタゴニストの使用はヘパリンアンタゴニストの使用の危険性に匹敵する血栓形成促進の危険性を有するだろうということは予測可能である。

プロタミンの投与に伴う危険性は、プロタミン分子により引き起こされる即時の重篤なアレルギー反応、重篤な低血圧の危険性及びヘパリンの効果の突然の停止に起因する凝固の危険性であり、これらは超過したトロンビン生成を引き起こし得る。

従って、別の実施態様において、ヘパリン若しくはその誘導体の術後の拮抗及び／又はヒルジン若しくはその誘導体の術後の拮抗の後の血栓形成促進の危険性が、ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤の使用により防止されるか又は減少される。

別の実施態様において、ヘパリン若しくはその誘導体の術後の拮抗及び／又はヒルジン若しくはその誘導体の術後の拮抗の後の血栓形成促進の危険性は、医学的手技の前、医学的手技の間、かつ／又は医学的手技の後にＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤を投与することにより防止されるか又は減少され、ここでＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤が投与されない場合に該医学的手技の後に通常投与されるヘパリンアンタゴニスト及び／若しくはヒルジンアンタゴニストの量と比較して、減少した量の該アンタゴニストが医学的手技の後に加えられるか、又は該アンタゴニストは加えられない。

より一般的なやり方で、一実施態様において、ヒト又は動物対象は医学的手技の後の減少した血栓形成促進の危険性を有するか、血栓形成促進の危険性を有していない。

上で考察したように、「ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ」は第ＸＩＩ因子及び活性化第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩａ）のいずれか又は両方を指す。従って、「ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤」は、ＦＸＩＩ及びＦＸＩＩａのいずれか又は両方の阻害剤を含む。さらに、抗ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ抗体は、ＦＸＩＩ及びＦＸＩＩａのいずれか又は両方に結合し、そして阻害する抗体を含む。用語「ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤」はまた、半減期延長ポリペプチド（これは一実施態様ではリンカーを含む）に連結された ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａの阻害剤も含むことを意図される。

一実施態様において、ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤は特異的ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤であり、好ましくは特異的ＦＸＩＩａ阻害剤である。

特異的ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤は、１：１のモル比で使用された場合に、ＦＸＩＩ及び／又はＦＸＩＩａ以外の血漿セリンプロテアーゼを、２５％又はそれ以下だけ阻害する阻害剤を指す。換言すると：特異的ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤は、その阻害剤が１：１の各血漿セリンプロテアーゼ対上記阻害剤のモル比で使用される場合に、ＦＸＩＩ及び／又はＦＸＩＩａ以外の血漿セリンプロテアーゼを２５％又はそれ以下だけ阻害する。例えば、特異的ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ ｍＡｂは、血漿セリンプロテアーゼＦＸＩａを５％だけ阻害し、ここでＦＸＩａ対上記ｍＡｂのモル比は１：１であるが、一方で同じＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ ｍＡｂはＦＸＩＩａを少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％阻害する。

本発明の一実施態様において、１つの他の血漿セリンプロテアーゼは、１：１の各血漿セリンプロテアーゼ対上記阻害剤のモル比で使用された場合に５０％より多く阻害される。

本発明の別の実施態様において、２つの他の血漿セリンプロテアーゼは、１：１の各血漿セリンプロテアーゼ対上記阻害剤のモル比で使用された場合に５０％より多く阻害される。

さらに別の実施態様において、ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤はヒトＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤であり、これにはヒト化モノクローナル抗体、好ましくは完全ヒト化モノクローナル抗体が含まれる。

本明細書において使用される「相同性」は、同一であるか又は保存的置換を構成するアミノ酸のパーセンテージ数を指す。相同性は、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒａｕｘ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２，３８７−３９５）（これは参照により本明細書に加入される）のような配列比較プログラムを使用して決定され得る。このようにして、本明細書において挙げられているものと類似か又は実質的に異なる長さの配列が、その整列中にギャップを挿入することにより比較され得、このようなギャップは例えばＧＡＰにより使用される比較アルゴリズムにより決定され得る。

インフェスチン−４
一実施態様において、本出願は、インフェスチンドメイン４、インフェスチン−４を含むＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤を提供する。一実施態様において、ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤はインフェスチン−４の変異体を含む。別の実施態様において、ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤はインフェスチンドメイン４、そして場合によりインフェスチンドメイン１、２及び／又は３を含み；これらのタンパク質はＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａの強力な阻害剤であることが公知である（ＷＯ ２００８／０９８７２０を参照のこと；またＣａｍｐｏｓ ＩＴＮ ｅｔ ａｌ．５７７ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５１２−５１６，２００４も参照のこと）。インフェスチン−４の野生型ポリペプチド配列を提供する（配列番号１）。本明細書において使用される用語「変異体」は、アミノ酸変異を有するポリペプチドを指し、ここで「変異」は、野生型インフェスチン−４配列に対する置換、欠失又は付加として定義され、ここでこのような変化はＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａを阻害するそのポリペプチドの機能的能力を変更しない。用語「変異体」は、野生型又は変異インフェスチン−４配列のフラグメントを含む。このような変異体のさらなる例は以下に提供される。

一実施態様において、インフェスチン−４変異体は、野生型インフェスチン−４配列のＮ末端アミノ酸２〜１３（図１２において下線を付された配列を参照のこと）、及び野生型インフェスチン−４配列からの差異を生じる、Ｎ末端アミノ酸の外側の少なくとも１個でかつ５個までのアミノ酸変異、又は６個の保存的システイン残基（図１２における太字のアミノ酸を参照のこと）並びに野生型インフェスチン−４配列に対する少なくとも７０％の相同性を含む。インフェスチン−４配列のＮ末端アミノ酸２〜１３は、トロンビンに結合する関連する阻害剤ベネズエラサシガメ（Ｒｈｏｄｎｉｕｓ ｐｒｏｌｉｘｕｓ）（ＰＤＢ：１ ＴＳＯ）についての構造的データの分析、及びキモトリプシンに結合するＳＰＩＮＫ−１の分析にもとづいて、これらは両方とも図１１に示されるようにＮ末端領域において接触部位の蓄積という共通の特徴を共有しており、ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａの結合のために重要であり得る。従って一実施態様において、インフェスチン−４の変異体は、野生型インフェスチン−４配列のアミノ酸２〜１３の保存的Ｎ末端領域、及び野生型インフェスチン−４配列からの差異を生じる、これらの保存的Ｎ末端アミノ酸の外側の少なくとも１個かつ５個までのアミノ酸変異を含む。変異は置換でも欠失でも付加でもよい。本明細書において使用される用語「Ｎ末端アミノ酸の外側」は、配列ＶＲＮＰＣＡＣＦＲＮＹＶ、すなわち野生型インフェスチン−４配列からのアミノ酸２〜１３を含むアミノ酸の連続した配列以外の変異体ポリペプチド鎖に沿ったいずれかのアミノ酸を指す。別の実施態様において、インフェスチン−４変異体は、６つの保存的システイン残基を含み、野生型インフェスチン−４配列に対して少なくとも７０％の相同性を有する。一実施態様において、この６つの保存的システイン残基は野生型インフェスチン−４配列の６位、８位、１６位、２７、３１位及び４８位のアミノ酸である（図１２を参照のこと）。一実施態様において、変異体は最後の保存的システインを含む。他の実施態様において、システイン残基の正確な位置、及び互いに対する相対的な位置は、インフェスチン−４変異体における挿入又は欠失に起因して野生型インフェスチン−４配列の６位、８、１６、２７、３１、及び４８位から変化し得る。それにももかかわらず、これらの実施態様では、インフェスチン−４変異体は６個全てのシステインを含み、かつ野生型インフェスチン−４配列に対して７０％、７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の相同性を共有し得る。

実施態様において、インフェスチン−４の変異体はそれがＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａを阻害するという点で特徴付けられる。ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａを阻害する機能的活性は、例えばインビトロ及び／又はインビボの特徴付けにより評価され得、これらとしては、ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ酵素活性の阻害を試験する直接的アッセイ、延長された凝固時間、すなわち、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）、又は凝固を評価するインビボでの方法が挙げられる。インフェスチン−４変異体のさらなる例はＳＰＩＮＫ−１変異体であり、これは以下に記載される。

ＳＰＩＮＫ−１変異体
一実施態様は、ヒトにおける治療上の使用のためのＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤を含む。インフェスチン−４に対して高い類似性を有するヒトタンパク質が使用され得る。例えば、インフェスチン−４に対する最も高い類似性を有するヒトタンパク質は、膵臓で発現されるＫａｚａｌ型セリンプロテアーゼ阻害剤であるＳＰＩＮＫ−１である（膵分泌性トリプシン阻害剤、ＰＳＴＩとしても知られる）。Ｋａｚａｌ型セリンプロテアーゼ阻害剤ファミリーは、セリンプロテアーゼ阻害剤の多数のファミリーのうちの一つである。様々な種由来の多くの蛋白質が記載されている（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ Ｍ ａｎｄ Ｋａｔｏ Ｉ、４９ Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９３−６２６、１９８０）。インフェスチン−４とＳＰＩＮＫ−１との間のアミノ酸配列類似性の概要を図１２に示す。

野生型ＳＰＩＮＫ−１配列（配列番号２）に基づいて、インフェスチン−４に対するＳＰＩＮＫ−１配列の相同性を増加させるために様々な変異体が生成され得る。句「インフェスチン−４に対する増加した相同性」は、ＳＰＩＮＫ−１配列をインフェスチン−４配列に近づけるためにＳＰＩＮＫ−１に対して行われるアミノ酸変異のプロセスを指す。

一実施態様において、ＳＰＩＮＫ−１は野生型インフェスチン−４配列のＮ末端アミノ酸２〜１３を含むように変異され；ポリペプチド配列が生じ、これはＫ１と呼ばれる（配列番号３）。上記のように、インフェスチン−４配列のＮ末端部分はＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害機能のために重要と考えられる。

従って、一実施態様において、変異ＳＰＩＮＫ−１の変異体はまた、野生型インフェスチン−４配列のＮ末端アミノ酸２〜１３、及び野生型ＳＰＩＮＫ−１配列からの差異を生じ、かつ野生型インフェスチン−４配列に対する変異体の相同性を増加させる、上記Ｎ末端アミノ酸の外側の少なくとも１個かつ５個までのアミノ酸変異を含む。別の実施態様において、変異ＳＰＩＮＫ−１の変異体は６つの保存的システイン残基を含み、そして野生型ＳＰＩＮＫ−１配列に対して少なくとも７０％の相同性を有する。変異は置換でも、欠失でも、付加でもよい。上で定義されたように、用語「上記Ｎ末端アミノ酸の外側」は、配列ＶＲＮＰＣＡＣＦＲＮＹＶ、すなわち野生型インフェスチン−４配列からのアミノ酸２〜１３から構成されるアミノ酸の連続した配列以外の変異体のポリペプチド鎖に沿ったいずれかのアミノ酸を指す。用語「変異体」は上記変異ＳＰＩＮＫ−１配列のフラグメントを含む。一実施態様において、６個の保存的システイン残基は野生型ＳＰＩＮＫ−１配列の９位、１６位、２４位、３５位、３８位、及び５６位のアミノ酸であり得る（図１２を参照のこと）。一実施態様において、変異体は最終保存的システインを含む。別の実施態様において、システインの正確な位置、及び互いに対する相対的な位置は、ＳＰＩＮＫ−１変異体における挿入又は欠失に起因して、野生型ＳＰＩＮＫ−１配列の９位、１６位、２４位、３５位、３８位、及び５６位から変化し得る。それにもかかわらず、これらの実施態様において、ＳＰＩＮＫ−１変異体は６個全てのシステインを含む。実施態様において、ＳＰＩＮＫ−１変異体はそれがＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａを阻害するという点でも特徴づけられる。

このようなＳＰＩＮＫ−１変異体の例が生成され、Ｋ２、及びＫ３と名付けられる（それぞれ配列番号４及び５）。ＳＰＩＮＫ−１変異体Ｋ２及びＫ３において、Ｎ末端の外側のさらなるアミノ酸置換が、インフェスチン−４に対する相同性を増加させるために作成され、ここで変異体はそれらがＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ活性を阻害するという点でも特徴づけられる。ＷＯ ２００８／０９８７２０を参照のこと。図１３はこれらの変異体のアミノ酸配列及びＳＰＩＮＫ−１野生型配列に対する変化の程度を示す。ＳＰＩＮＫ−１変異体Ｋ３の場合、５個のアミノ酸置換が、インフェスチン−４に対する相同性を増加させるために作成された。従って、実施態様において、ＳＰＩＮＫ−１変異体は野生型ＳＰＩＮＫ−１配列と７０％、７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の相同性を共有し得る。

他のＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤
一実施態様において、ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａの他の阻害剤が医学的手技を受けている患者に投与される。Ｗ０ ２００６／０６６８７８において、ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａに対する抗体の使用又はＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａの阻害剤の使用が提案される。具体的には、ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａに対する阻害剤としては、抗トロンビンＩＩＩ（ＡＴ ＩＩＩ）、アンギオテンシン変換酵素阻害剤、Ｃ１阻害剤、アプロチニン、アルファ−１プロテアーゼ阻害剤、アンチパイン （［（Ｓ）−１−カルボキシ−２−フェニルエチル−カルバモイル−Ｌ−Ａｒｇ−Ｌ−Ｖａｌ−アルギナール（Ａｒｇｉｎａｌ））、Ｚ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏアルデヒド−ジメチルアセテート、ＤＸ８８（Ｄｙａｘ Ｉｎｃ．、３００ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｓｑｕａｒｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ ０２１３９、ＵＳＡ；Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ａ ａｎｄ Ｂａｉｒｄ ＬＧ、２９ Ｔｒａｎｓｆｕｓ Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ Ｓｃｉ．２５５−２５８、２００３中に引用される）、ロイペプチン、プロリルオリゴペプチダーゼの阻害剤、例えばＦｍｏｃ−Ａｌａ−Ｐｙｒ−ＣＮ、トウモロコシ−トリプシン阻害剤（ＣＴＩ）、ウシ膵臓トリプシン阻害剤の変異体、エコチン、コガネガレイ（ｙｅｌｌｏｗｆｉｎ ｓｏｌｅ）抗凝固タンパク質（ＹＡＰ）、西洋カボチャ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｍａｘｉｍａ）トリプシン阻害剤−Ｖ（西洋カボチャイソ阻害剤（ｉｓｏｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）及びハマダリン（Ｈａｍａｄａｒｉｎ）（Ｉｓａｗａ Ｈ ｅｔ ａｌ．２７７ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６５１−２７６５８、２００２に開示されるとおり）を含む）、及びＰｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−クロロメチル−ケトン（ＰＣＫ）が挙げられる。

ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤は、例えば抗体、又は阻害活性を保持している同じもの又は模倣物のフラグメント、例えば米国特許第６，６１３，８９０号、第４〜８欄に開示されるようなアミロイド前駆体タンパク質のＫｕｎｉｔｚプロテアーゼ阻害剤ドメインの類似体であり得る。他の適切な阻害剤は、Ｉｓａｗａ Ｈ ｅｔ ａｌ．２７７ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６５１−２７６５８、２００２に開示されるハマダリンであり得る。適切なトウモロコシトリプシン阻害剤及びその製造方法は、Ｃｈｅｎ Ｚ ｅｔ ａＩ．６５ Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１３２０−１３２４、１９９９、及びＷｅｎ Ｌ ｅｔ ａｌ．１８ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８１３−８１４、１９９２に開示される。

別の実施態様において、ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤は、ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａに結合し、かつＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ活性化及び／又は活性を阻害する抗ＸＩＩ／ＦＸＩＩａ抗体であり得る。このような抗体は例えばＷＯ ２００６／０６６８７８、及びＲａｖｏｎ ｅｔ ａｌ．、１ Ｂｌｏｏｄ ４１３４−４３、１９９５において記載される。上で考察したように、「抗ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ抗体」は、ＦＸＩＩ及びＦＸＩＩａのいずれか又は両方に結合し、かつ阻害する抗体を含む。抗ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ抗体は以下でさらに詳細に記載される。

半減期増強ポリペプチドに連結されたＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤
本出願の別の局面は、半減期増強ポリペプチド（ＨＬＥＰ）に連結されたＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤を提供する。一実施態様において、ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤は小タンパク質である。従って、他の小タンパク質について公開されているような急速な腎クリアランスが予測され得る（Ｗｅｒｌｅ Ｍ ａｎｄ Ｂｅｒｎｋｏｐ−Ｓｃｈｎｕｒｃｈ Ａ、３０ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ３５１−３６７、２００６）。ポリペプチド性（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｉｃ）化合物の短い血漿半減期に対処するための１つの方法は、それを繰り返し注射するか又は持続注入することである。別のアプローチは、ポリペプチド自体の本質的な血漿半減期を増加させることである。例えば、一実施態様において、ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤は半減期延長タンパク質に連結される。

「半減期増強ポリペプチド」は、患者又は動物においてインビボでのＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤の半減期を増加させる。例えば、アルブミン及び免疫グロブリン並びにそれらのフラグメント又は誘導体は、半減期増強ポリペプチド（ＨＬＥＰ）として記載されている。Ｂａｌｌａｎｃｅ ｅｔ ａｌ．（ＷＯ ２００１／７９２７１）は、ヒト血清アルブミンに融合された場合に、インビボでの増加した機能的半減期及び延長された貯蔵寿命を有すると予測される多数の様々な治療用ポリペプチドの融合ポリペプチドを記載した。

用語「アルブミン」及び「血清アルブミン」は、ヒトアルブミン（ＨＡ）及びその変異体、示される完全成熟形態（配列番号６）、さらには他の種由来のアルブミン及びその変異体を包含する。本明細書で使用される「アルブミン」は、アルブミンポリペプチド若しくはアミノ酸配列、又はアルブミンの１つ若しくはそれ以上の機能的活性（例えば生物学的活性）を有するアルブミン変異体を指す。本明細書で使用されるアルブミンは、ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤の治療的活性を安定化するか又は延長することができる。アルブミンは、いずれかの脊椎動物、特にいずれかの哺乳動物、例えばヒト、サル、ウシ、ヒツジ、又はブタ由来のものであり得る。非哺乳動物アルブミンとしては、限定されないが、ニワトリ及びサケ由来のアルブミンが挙げられる。アルブミン連結ポリペプチドのアルブミン部分は、治療的ポリペプチド部分と異なる動物由来であってもよい。アルブミン融合タンパク質の例についてはＷＯ ２００８／０９８７２０を参照のこと。

一実施態様において、アルブミン変異体は、少なくとも１０、２０、４０、若しくは少なくとも７０アミノ酸長であるか、又はＨＡ配列（配列番号６）からの１５、２０、２５、３０、５０若しくはそれ以上の連続したアミノ酸を含み得るか、又はＨＡの特異的ドメインの一部若しくは全てを含み得る。アルブミン変異体は、保存的又は非保存的置換のいずれでも、アミノ酸置換、欠失又は付加を含み得、ここでこのような変化は、半減期増強ポリペプチドの治療的活性をもたらす活性部位又は活性ドメインを実質的に変更しない。これらの変異体は、７０％、７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の相同性を共有し得る。

一実施態様において、アルブミン変異体はフラグメントを含み、そしてアルブミンの少なくとも１つのドメイン全体又はそのドメインのフラグメント、例えばドメイン１（配列番号６のアミノ酸１〜１９４）、２（配列番号６のアミノ酸１９５〜３８７）、３（配列番号６のアミノ酸３８８〜５８５）、１＋２（配列番号６の１〜３８７）、２＋３（配列番号６の１９５−５８５）又は１＋３（配列番号６のアミノ酸１〜１９４＋配列番号６のアミノ酸３８８−５８５）からなるものであり得、またあるいはこれらを含み得る。各ドメインはそれ自体で、Ｌｙｓ１０６〜Ｇｌｕ１１９、Ｇｌｕ２９２〜Ｖａｌ３１５及びＧｌｕ４９２〜Ａｌａ５１１を含む可撓性のサブドメイン間リンカー領域残基と共に、２つの相同サブドメイン、すなわち、１〜１０５、１２０〜１９４、１９５〜２９１、３１６〜３８７、３８８〜４９１及び５１２〜５８５から構成される。

別の実施態様において、構造的又は進化的にアルブミンと関連する他のタンパク質はＨＬＥＰとして使用され得、これらとしては、限定されないが、アルファ−フェトプロテイン（ＷＯ２００５／０２４０４４；Ｂｅａｔｔｉｅ ａｎｄ Ｄｕｇａｉｃｚｙｋ、２０ Ｇｅｎｅ ４１５−４２２、１９８２）、アファミン（ａｆａｍｉｎ）（Ｌｉｃｈｅｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．２６９ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１８１４９−１８１５４、１９９４）、及びビタミンＤ結合タンパク質（Ｃｏｏｋｅ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ、７６ Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２４２０−２４２４、１９８５）が挙げられる。それらの遺伝子は、ヒト、マウス、及びラットにおける同じ染色体領域に位置する構造的及び機能的な類似性を有する多重遺伝子クラスターを代表する。アルブミンファミリーメンバーの構造的類似性は、ＨＬＥＰとしてのそれらの有用性を示唆する。例えば、アルファ−フェトプロテインは、付着された治療用ポリペプチドの半減期をインビボで延長させると主張されている（ＷＯ ２００５／０２４０４４）。治療活性を安定化させるか又は延長させることができるこのようなタンパク質、又はその変異体が使用され得、そしてこれらはいずれかの脊椎動物、特にいずれかの哺乳動物、例えばヒト、サル、ウシ、ヒツジ、若しくはブタ、又はニワトリ若しくはサケを含むがこれらに限定されない非哺乳動物由来であり得る。ＷＯ２００８／０９８７２０を参照のこと。このような変異体は１０若しくはそれ以上のアミノ酸長のものであり得、又はそれぞれのタンパク質配列の約１５、２０、２５、３０、５０若しくはそれ以上の連続したアミノ酸を含み得、又はそれぞれのタンパク質の特異的ドメインの一部若しくは全てを含み得る。アルブミンファミリーメンバー融合タンパク質は天然に存在する多形変異体を含み得る。

別の実施態様において、免疫グロブリン（Ｉｇ）又はその変異体はＨＥＬＰとして使用され得、ここで変異体はフラグメントを含む。一実施態様において、免疫グロブリン定常領域のＦｃドメイン又は部分が使用される。定常領域はＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、又はＩｇＥ免疫グロブリンのものであり得る。治療用ポリペプチド部分は、抗体のヒンジ領域又は切断可能であり得るペプチドリンカーを介してＩｇに接続される。いくつかの特許及び特許出願は、治療用タンパク質のインビボでの半減期を延長するための免疫グロブリン定常領域への治療用タンパク質の融合を記載する（ＵＳ ２００４／００８７７７８、ＷＯ ２００５／００１０２５、ＷＯ ２００５／０６３８０８、ＷＯ ２００３／０７６５６７、ＷＯ ２００５／０００８９２、ＷＯ ２００４／１０１７４０、ＵＳ ６，４０３，０７７）。例えば、サイトカインＩＦＮ−βに融合したＦｃは、増強されたＩＦＮ−β生物学的活性、延長された循環半減期及びより高い溶解度を達成した（ＷＯ２００６／０００４４８）。

従って、別の実施態様は、このような免疫グロブリン配列、例えば、免疫グロブリン及びその変異体のＦｃフラグメントをＨＬＥＰとして使用することである。ＦＸｌｌ／ＦＸＩＩａ阻害剤は、免疫グロブリン定常領域のＦｃドメイン又は少なくとも一部にＨＬＥＰとして融合され得、そして原核生物若しくは真核生物宿主細胞、例えば細菌、酵母、植物、動物（昆虫を含む）若しくはヒトの細胞株において、又はトランスジェニック動物において組み換え分子として産生され得る（ＷＯ ２００８／０９８７２０）。ＳＰＩＮＫ−Ｋ２−Ｆｃ融合タンパク質は例として配列番号７で示される。

リンカー
一実施態様において、介在するペプチドリンカーは、治療用ポリペプチドとＨＬＥＰとの間に導入され得る。一実施態様において、切断可能なリンカーが、特にＨＬＥＰが治療用ポリペプチドの特異的活性に、例えば立体障害により干渉する場合に導入される。特定の実施態様において、リンカーは、内在性、外因性、又は共通の凝固経路の凝固プロテアーゼのような酵素により切断される。内在性経路の凝固プロテアーゼは、接触活性化経路におけるプロテアーゼであり、これらとしては、例えば、ＦＸｌｌａ、ＦＸｌａ、又はＦＩＸａが挙げられる。一実施態様において、リンカーはＦＸｌｌａにより切断される。外因性経路のプロテアーゼとしては、組織因子経路におけるプロテアーゼ、例えばＦＶＩＩａが挙げられる。共通経路のプロテアーゼとしては、フィブリノゲンのフィブリンへの変換に関与するプロテアーゼ、例えば、ＦＸａ、ＦＩＩａ、及びＦＸＩＩＩａが挙げられる。

治療製剤及び投与
ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤またはその変異体は、８０％より高い純度、又は９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％より高い純度を有し得る。一実施態様において、変異体は、他のタンパク質及び核酸のような高分子の混入に関して９９．９％より高い純度であり、かつ感染性及び発熱性の因子を含まない、薬学的に純粋な状態を有し得る。

精製されたＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤を、場合により製剤添加物が添加され得る従来の生理学的に適合性の水性緩衝液中に溶解して、患者においてＳＢＩを処置するための医薬製剤が得られ得る。このような製剤担体及び添加剤、さらには適切な医薬製剤は、当該分野で周知である。例えばＫｉｂｂｅ ｅｔ ａｌ．Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ、（３^rd ｅｄ．、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ）、２０００を参照のこと。医薬組成物は、凍結乾燥又は安定な可溶形態で製剤化され得る。ポリペプチドは当該分野で公知の様々な手順により凍結乾燥され得る。凍結乾燥製剤は、１つ又はそれ以上の薬学的に許容しうる希釈剤、例えば注射用滅菌水又は滅菌生理食塩水を加えることにより使用前に再構成される。

ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤の製剤は、いずれかの薬学的に適切な投与手段により患者に送達される。様々な送達系が公知であり、いずれかの都合の良い経路により組成物を投与するために使用され得る。組成物は例えば非経口で全身投与され得る。本明細書で使用される用語「非経口」として、皮下、静脈内、筋内、動脈内及び気管内の注射、点滴注入、噴霧適用及び注入技術が挙げられる。非経口製剤は、ボーラス形態で若しくは持続注入としてのいずれかで静脈内投与され得、又は公知の手順に従って皮下投与され得る。非経口用途に関して周知の液体担体としては、滅菌水、食塩水、水性デキストロース、糖溶液、エタノール、グリコール、及びオイルが挙げられる。全身用途については、治療用タンパク質は静脈内ライン又は動脈ライン用に製剤化され得る。製剤は注入により又はボーラス注射により連続的に投与され得る。いくつかの製剤は持続放出（ｓｌｏｗ ｒｅｌｅａｓｅ）系を包含する。一実施態様において、製剤はパッチとして投与される。経口投与用の錠剤及びカプセル剤は従来の添加剤、例えば結合剤、フィラー、滑沢剤又は湿潤剤などを含有し得る。経口液体製剤は水性若しくは油性の懸濁剤、液剤、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤などの形態であり得、又は水若しくは使用のための他の適切なビヒクルでの再構成のための乾燥製剤として提供され得る。このような液体製剤は、従来の添加剤、例えば懸濁化剤、乳化剤、非水性ビヒクル及び保存料を含有し得る。

ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤の用量は、多くの因子、例えば適応症、処方、又は投与様式に依存し得、そしてそれぞれの適応症について前臨床試験及び臨床試験において決定され得る。ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤の用量は、医学的手技の前、医学的手技の間、かつ／又は医学的手技の後に患者に投与され得る。一実施態様において、ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤は、医学的手技の前１、２、４、６、１２、２４、４８、７２、若しくは９６時間以内に、かつ／又は医学的手技の後１、２、４、６、１２、２４、４８、７２、若しくは９６時間以内に投与され得る。ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤は、医学的手技の前、医学的手技の間、かつ／又は医学的手技の後に、単回用量で、又は複数回用量で、又は０．２５、０．５、１、２、４、６、１２、２４、若しくは４８時間間隔で繰り返し投与され得る。出血の危険性を増加させないという有利な特性のために、一実施態様において、ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤は手技の間に投与される。医薬組成物は、単独で、又は他の治療剤と併用して投与され得る。これらの薬剤は、同時に処方され（ｃｏ−ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ）得るか、又は同時に若しくは別々に、かつ同じ投与経路か若しくは異なる投与経路のいずれかで投与され得る。ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤の投与スケジュール又は用量はまた、同じ適応症又は異なる適応症で、他の医学的状態又は治療のような因子に依存して、個々の患者によって変動し得る。

別の実施態様は、ポンプヘッド（Ｐｕｍｐ Ｈｅａｄ）症候群の予防又は処置のためのＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤である。

ポンプヘッド症候群は、ＣＡＢＧのようなバイパス手技後の中枢神経機能不全又は認知機能障害又は認知低下である。特に、ＣＡＢＧ又は血液が人工表面と接触する他の医学的手技において使用される人工表面における接触活性化により生成される微小血栓により引き起こされると推測される。現在、ポンプヘッド症候群の公知の治療法はない（Ｎｅｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．、ＮＥＪＭ （２００１） Ｖｏｌ．３４４、Ｎｏ．６、ｐｐ．３９４〜４０２）。

別の実施態様は、体外型医療機器におけるヒト血流の閉塞を予防するための上述のＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤の使用であり、この医療機器は、非限定的な例として、心肺バイパス機器又は血液の透析若しくは血液の体外ろ過のために使用される装置であり得る。「閉塞」により、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％の血流の減少、又は血流の完全な停止を意味する。

１．検査所見
検査評価の間に、組み換えアルブミン融合インフェスチン−４（ｒＨＡ−インフェスチン−４；ＷＯ２００８／０９８７２０に記載されるとおり）をシリンジで供給し、続いてブタの全血を加えた。その後、この溶液をガラスバイアルに入れて、そのガラスバイアルを１分毎（水浴中で３７℃にてインキュベーション）に穏やかに振盪させることにより凝固時間を視覚的に決定した。驚くべきことに、ガラス表面を介した大量の接触活性化にもかかわらず、血液は３時間まで凝固の徴候を示さなかった（一方でコントロールサンプルは約３分後に凝固した、図１）。さらに、この未凝固血液の活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）のその後の評価は、顕著に延長された値を示した。これらの所見はさらなるエクスビボでの研究を促進した。これらの研究において、ｒＨＡ−インフェスチン−４が用量依存的に全血凝固時間（ＷＢＣＴ）を延長するということを実証することができた（図１）。例としてマウス全血を使用して同等のプロフィールを得ることができた。

さらなる実験において、特異的抗ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ抗体を上で説明したものと同じ研究設計で試験した。しかし、この抗体はブタ系と反応しないので、マウスからの全血を使用した。興味深いことに、ＦＸＩＩ活性は試験した用量で完全に阻害されると予測されるが、ＷＢＣＴは最大で約３倍延長された（図２）。これにより、ｒＨＡ−インフェスチン−４のＷＢＣＴに対する顕著な効果はそのＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害力によってだけでは説明できないという結論に至った。他の機構よりはむしろ、おそらくそのより弱いＦＸａ阻害力がこの現象の所見をもたらしたのだろう。

２．前臨床動物研究
２．１．動物及び麻酔に関するデータ
動物：
体重２４〜４０ｋｇの去勢した雄性ブタ（大ヨークシャー（ｌａｒｇｅ ｗｈｉｔｅ）×ジャーマンノーブル（Ｇｅｒｍａｎ ｎｏｂｌｅ））を３〜４月齢で地元の飼育場から入手した（Ｗｉｌｌｉ Ｓｃｈｌｏｓｓｅｒ、Ｓｃｈｗａｌｍｔａｌ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。これらの動物を１８〜２１℃でわらを敷き詰めた家畜小屋において周囲昼夜サイクル下で飼育し、そしてＤｅｕｋａ Ｖ豚用餌を自由に食べさせた（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｔｉｅｒｎａｈｒｕｎｇ Ｃｒｅｍｅｒ ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ．ＫＧ、Ｄuｓｓｅｌｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。水道水を自由に供給した。動物畜産及び研究の手順は独国動物保護法（Ｇｅｒｍａｎ Ａｎｉｍａｌ Ｗｅｌｆａｒｅ ｌａｗ）及び欧州連合規則を順守した。

麻酔：
水へのアクセスは制限せずに終夜絶食させた後、これらの動物を２ｍｇ ｋｇ−１アザペロン（Ｓｔｒｅｓｎｉｌ^(R)、Ｊａｎｓｓｅｎ−Ｃｉｌａｇ ＧｍｂＨ、Ｎｅｕｓｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、１５ｍｇ ｋｇ−１ケタミン（Ｋｅｔａｖｅｔ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＆ Ｕｐｊｏｈｎ、Ｅｒｌａｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）及び０．０２ｍｇ ｋｇ−１硫酸アトロピン（Ａｔｒｏｐｉｎｓｕｌｆａｔｅ、Ｂ．Ｂｒａｕｎ Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ ＡＧ、Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の混合物を使用して筋内前投与で鎮静させ、次いでブタを耳静脈を介して１０ｍｇ ｋｇ−１チオペンタールナトリウムで麻酔した。気管の手術準備の後、動物を挿管し、Ｈｅｙｅｒ Ａｃｃｅｓｓ換気装置により呼吸を支援した。吸入麻酔を１〜２％イソフルラン（Ｉｓｏｆｌｕｒａｎ ＣＰ^(R)、ＣＰ Ｐｈａｒｍａ ＧｍｂＨ、Ｂｕｒｇｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて維持した。血液サンプル収集のために１．４×２．１ｍｍカテーテルを頸動脈中まで進め、そして連続的血圧測定のために０．５×０．９ｍｍカテーテルを大腿動脈中に進めた。基底流体要件を満たすためにリンゲル液を４ｍＬ ｋｇ−１ ｈ−１で、及び試験液を外頚静脈に留置した１．４×２．１ｍｍカテーテルを介して注入した。体温を直腸検温によりモニタリングした。

２．２．ブタにおける薬物動態研究
上述の初期検査所見に続いて、単回静脈内（ｉ．ｖ．）ｒＨＡ−インフェスチン−４適用の動態をブタにおいて評価した。我々は、エクスビボＷＢＣＴがｒＨＡ−インフェスチン−４の単回ｉ．ｖ．投与後に顕著に延長され、そして循環からのｒＨＡ−インフェスチン−４の排出の間に再び減少することを見出した（図３）。さらに、ブタにおけるｒＨＡ−インフェスチン−４のｉ．ｖ．投与はａＰＴＴの劇的な延長をもたらし、さらに、高用量では、わずかに延長されたプロトロンビン時間（ＰＴ）をもたらした（図４及び５）。これらの結果は、ｒＨＡ−インフェスチン−４が主に内在性凝固経路（ａＰＴＴ）に影響を及ぼすこと、さらには、高用量において、外因性凝固経路（ＰＴ）にわずかに影響を及ぼすことを示した。さらに、トロンボエラストグラフィにおいて凝固時間の延長を検出することができた。

興味深いことに、ＷＢＣＴ及びａＰＴＴは顕著に延長されたが、皮膚出血時間（すなわち、生理学的止血）は影響されなかった（図６）。

２．３．ブタにおける心肺バイパス手術：
心肺バイパス（ＣＰＢ）手技の間の ｒＨＡ−インフェスチン−４の抗凝固効果を評価し証明するために、前臨床ＣＰＢ試験をブタモデルにおいて行った。最初にＣＰＢをｒＨＡ−インフェスチン−４（５０ｍｇ／体重（ＢＷ）ｋｇに相当）と共に装着し、そしてＣＰＢ装置の酸素供給器膜の凝固及び継続的な閉塞を予防するためにＣＰＢ装置に接続する前に２００ｍｇ／ｋｇ ＢＷの用量のｒＨＡ−インフェスチン−４で動物自体を処置した。ヘパリン、又はビバリルジン（Ａ．Ｋｏｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｃａｒｄｉｏ ２００４； ９３：３５６−３５９）のような他の物質は抗凝固物質として使用しなかった。

２．３．１．ＣＰＢ研究設計：
研究設計についての要約については図７を参照のこと。
麻酔導入（２．１）後に、胸骨切開を振動鋸（ｏｓｃｉｌｌａｔｉｎｇ ｓａｗ）を用いて行い、そして心臓を露出させた。心膜を長手方向に開き、そして縫合により胸壁に固定した。巾着（ｐｕｒｓｅ−ｓｔｒｉｎｇ）縫合を右心房及び心尖部に配置した。２００ｍｇ／ｋｇ ＢＷ ｒＨＡ−インフェスチン−４のｉ．ｖ．注入投与を行った。約１０分後、直径５．２ｍｍの動脈カテーテル及び３２ Ｆｒ静脈カテーテルを右心房及び左心室に配置し、そして止血帯で固定した。両方のカテーテルを成人低体重（ｓｍａｌｌ ａｄｕｌｔ）中空糸酸素供給器にハードシェル静脈血リザーバ（Ｄ９０５ ＥＯＳ、Ｓｏｒｉｎ ＳｐＡ、Ｍｉｌａｎ、Ｉｔａｌｙ）を用いて接続した。体外回路を５００ｍＬ等張食塩水、１０００ｍＬ ６％ヒドロキシエチルデンプン２００／０．５（Ｉｎｆｕｋｏｌｌ、Ｓｃｈｗａｒｚ Ｐｈａｒｍａ ＡＧ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、２ｍＬ ｋｇ−１ １５％マンニトール（Ｏｓｍｏｆｕｎｄｉｎ^(R)、Ｂ．Ｂｒａｕｎ）及び５０ｍｇ／ｋｇ ＢＷ ｒＨＡ−インフェスチン−４からなる溶液で準備した。静脈及び動脈ラインを連続して開き、そして静脈血を重力により静脈血リザーバーに流入させた。ポンプは血液を酸素供給器中に運搬した。酸素化された血液を標的温度まで平衡化させ、そして左心室に動脈ラインを介して戻した。低体温を２５℃に２時間維持し、続いて適温（３７℃）に１時間再加温した。

ＣＰＢの終わりに、酸素供給器中に残っている血液を動物に戻した。抗凝固剤処置をＣＰＢ手技の後に逆転させなかった。

検査アッセイのための血液サンプルを、（１）ベースライン、（２）ｒＨＡ−インフェスチン−４の注入後であるがＣＰＢの開始前、（３）ＣＰＢの開始直後、及び（４）その後５分毎に実験の終了まで収集した。皮膚出血時間（ＳＢＴ）（Ｓｕｒｇｉｃｕｔｔ^(R)切断装置（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｔｅｃｈｎｉｄｙｎｅ Ｃｏｒｐ．、Ｅｄｉｓｏｎ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳＡ）を使用することにより生成された標準化された長さ５ｍｍ深さ１ｍｍの内耳切開からの失血の停止までの時間として定義される）も調べた。

２．３．２．ＣＰＢの間の検査所見：
ＣＰＢの間、ａＰＴＴ値はベースライン値と比較して全研究期間中顕著に延長された（図８）が、一方でＰＴ値は研究期間中少し増加しただけであった（図９）。さらに、エクスビボＷＢＣＴも研究期間中顕著に増加した（図１０）。

２．３．３．ＣＰＢの間の臨床所見：
血液と人工表面との直接接触は、凝固の活性化（内在性経路）さらには酸素供給器膜の継続的閉塞を伴う血小板の直接的活性化を即座にもたらすということは医学の分野で一般的に知られている。従って、ＣＰＢの間のヘパリンの使用は現在では究極の医療基準である。

家畜（ブタ）実験において、３００ＩＵ／ＫＧ ＢＷヘパリンの使用は、ＳＢＴの延長、さらには傷の端からの出血により反映されるような出血についての高い危険性を有する。

ヘパリンでのこれらの所見と対照的に、出血の危険性についての大域的試験としてのＳＢＴは、ｒＨＡ−インフェスチン−４をＣＰＢにおいて使用した場合に変化しないままであり、そしてさらに、増加した出血について傷の端を調べた場合に止血は損なわれていなかった。しかし、最も重要な所見は、ＣＰＢの酸素供給器が試験の間に凝固せず、かつ完全に機能的なままであったことであった。

代用（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ）検査所見（ａＰＴＴ、ＰＴ）、臨床的ＣＰＢ及びＳＢＴ結果の組み合わせは、驚くべきことに、人工表面を必要とする手技の間血液を完全に未凝固のままにしながら、安定した血塊を形成する全体的な能力の危険に患者をさらすことのない、新規な抗凝固薬の満たされていない医学的必要性をｒＨＡ−インフェスチン−４が満たすということを示す。

３．結論
ｒＨＡ−インフェスチン−４は、外因性経路（ＰＴ評価）がｒＨＡ−インフェスチン−４の一定の程度／用量まで影響を受けないままで、内在性凝固経路（これはａＰＴＴに反映される）に主に影響を及ぼすことによりＣＢＰ酸素供給器の凝固を予防することができる。これらの結果は驚くべきことであり、かつ出血の増加した危険性を伴うヘパリン／ビバリルジンによる外因性及び内在性凝固系の阻害の必要性がないので、ＣＰＢの間の抗凝固療法における新規な方策を提供する。この先、ＣＰＢ手技の間及び後の微小血栓症及び塞栓形成のプロセスについての残った危険性は、一定のレベルまで減少されるかもしれない。このＣＰＢ手技における新規な処置は、ｒＨＡ−インフェスチン−４のようなＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤が将来の臨床用途においてヘパリン／ビバリルジンにとって代わり得るか又は少なくとも減少させて、有意に改善された治療機会をもたらすということを初めて示す。

４．さらなる検査
４．１．ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤を、ウサギ全血がエクスビボで心肺バイパス（ＣＰＢ）回路に送られる新規な研究設定において試験する。ここでは、血液は常に回路を通って循環しており（そしてウサギには戻されない）、ここで抗凝固剤処置されない場合、凝固系の大量の（接触）活性化に遭遇する。このモデルを、ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤又はＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤及びヘパリンの組み合わせのＣＰＢ回路の閉塞を予防する有効性を試験するために使用する。

読み出しは特に：酸素供給器前圧及び酸素供給器後圧（Ｐｒｅ− ａｎｄ ｐｏｓｔ−ｏｘｙｇｅｎａｔｏｒ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）、血小板数及び寸法を含む完全血球数、酸素供給器及びフィルターの開通性、凝固系、補体系及びキニン−カリクレイン系の機能のさらなる読み出しである。

我々は、ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤がこのエクスビボ設定においてＣＰＢの閉塞／凝固を予防することができ、そしてさらに補体系及びキニン−カリクレイン系の活性化を減少させることができると推測する。

４．２．別の組の研究では、ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤（ｒＨＡ−インフェスチン−４及びＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ ＭＡｂ）のヒトエクスビボ全血凝固（健常ドナー由来）に対する効果を調べる。ここでは、様々な濃度のＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤を添加した後、ＷＢＣＴを上記のように（すなわち、ブタ／マウス全血について）測定する。さらに、ＷＢＣＴをＡＣＴ（活性化凝固時間）装置を使用して測定することができる。上述の他の種における所見と一致して、我々はエクスビボでの全血凝固時間の用量依存性阻害を観測すると推測される。未分画ヘパリンの標準的用量と比較して上で列挙したパラメーター（ＷＢＣＴ）における等価な有効性を達成するために必要とされるＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤の用量が決定されるだろう。さらに、ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤と低用量ヘパリン（又は他の抗血栓薬）との組み合わせも試験する。

４．３．さらに、ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤、さらにはＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤とヘパリン（又は他の抗血栓薬）との組み合わせの効果を、標準的ＣＰＢ系、標準的ＥＣＭＯ系、又は別の臨床的に関連するエクスビボ回路から構成されるエクスビボ回路系（薬物を既に系中に供給しておきながら、薬物を投与していない健常ドナーからのヒト全血を系中に送る）において試験する。ここでは、血液は回路中を常に循環しており（そしてドナー中に戻らない）、ここで凝固系の大量の（接触）活性化に遭遇する。読み出しは、特に：酸素供給気前圧及び酸素供給器後圧、血小板数及び寸法を含む完全血球数、酸素供給器及びフィルターの開通性、凝固系、補体系及びキニン−カリクレイン系の機能のさらなる読み出しである。ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤又はＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤と低用量ヘパリン（又は他の抗血栓薬）との組み合わせもまた回路の凝固を予防することができると推測される。さらに、ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤は、このエクスビボ回路内で補体系及びキニン−カリクレイン系の活性化を減少させることができると推測される。未分画ヘパリンの標準的な用量と比較して、上で列挙されたパラメーター及び読み出しにおいて等価な有効性を達成するために必要とされるＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤の用量が決定されるだろう。

凝固系の接触活性化の前、間かつ／又は後の患者の処置に対するこの新規なアプローチは、特定の手技の前、間かつ／又は後の血栓症の保護を提供しながら、患者は同時に出血事象の危険性にさらされない。

Claims (18)

1. ヒト又は動物対象に対して行われる医学的手技の間かつ／又は該医学的手技の後の、血栓の形成及び／又は安定化を防止するための医薬組成物であって、該医薬組成物は、予め定めた用量のＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤と薬学的に許容しうる担体を含んでなり、該医学的手技は、該ヒト又は動物対象の血液を人工表面と接触させることからなり、ここで該ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤は、該医学的手技の前、かつ／又は該医学的手技の間、かつ／又は該医学的手技の後に投与され、そしてさらにここで、
   （ｉ） 人工表面は、対象の血液体積の少なくとも８０％に曝露され、かつ人工表面は少なくとも０．２ｍ²であるか、又は
   （ｉｉ） 人工表面は、対象の体外での採血のための容器であるか、又は
   （ｉｉｉ）人工表面は、ステント、弁、管内カテーテル、若しくは血液の内部補助ポンピングのためのシステムであり、
   前記ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤は、
   （Ａ） 野生型インフェスチン−４ポリペプチド配列（配列番号１）、若しくはその変異体［ここで変異体は、
   （ａ） 野生型インフェスチン−４配列のＮ末端アミノ酸２〜１３、及び野生型インフェスチン−４との差異を生じる、該Ｎ末端アミノ酸の外側の少なくとも１個かつ５個までのアミノ酸変異；
   及び／又は
   （ｂ） 野生型インフェスチン−４配列からの６個の保存的システイン残基及び野生型インフェスチン−４配列に対する少なくとも７０％の相同性を含む］、又は
   （Ｂ） 抗ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ抗体［ここで、抗体はＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａに結合し、かつその活性及び／又は活性化を阻害する］を含む、
   ことを特徴とする医薬組成物。
2. 前記ヒト又は動物対象が、増大した出血の危険性を有さず、出血の危険性は、
   ａ） Ｄｕｋｅに従う耳若しくは指先の出血時間により［ここで該耳又は指先の出血時間は１０分より長くない］、又は
   ｂ） Ｉｖｙの方法に従って［ここで出血時間は１０分より長くない］、又は
   ｃ） Ｍａｒｘの方法に従って［ここで出血時間は４分より長くない］、
   決定される、請求項１に記載の医薬組成物。
3. 医学的手技が、
   ｉ） 心肺バイパスを必要とするいずれかの手技、又は
   ｉｉ） 体外膜型酸素供給を介する血液の酸素供給及びポンピング、又は
   ｉｉｉ） 血液の補助ポンピング（内部又は外部）、又は
   ｉｖ） 血液透析、又は
   ｖ） 血液の体外ろ過、又は
   ｖｉ） 動物若しくはヒト対象における後の使用のためのいずれかの保存場所における採血、又は
   ｖｉｉ） 静脈若しくは動脈の管内カテーテルの使用、又は
   ｖｉｉｉ） 診断的若しくは介入的心臓カテーテル法のための装置の使用、又は
   ｉｘ） 脈管内装置の使用、又は
   ｘ） 人工心臓弁の使用、又は
   ｘｉ） 人口移植片の使用
   である、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
4. ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤が、心肺バイパスを必要とする医学的手技の前、該医学的手技の後、かつ／又は該医学的手技の間に投与される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
5. ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤が、動物若しくはヒト対象における後の使用のためのいずれかの保存場所における採血を含む医学的手技の前、該医学的手技の後、かつ／又は該医学的手技の間に投与される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
6. ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤が：
   ｉ） 供血プロセスの前、かつ／若しくは供血プロセスの間に血液ドナーに投与されるか、又は
   ｉｉ） 採取保存場所において血液と混合されるか、又は
   ｉｉｉ） ヒト若しくは動物レシピエントに血液を投与する前、投与する間、かつ／若しくは投与した後に、血液レシピエントに投与される、
   請求項５に記載の医薬組成物。
7. ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤が、人工表面上にコーティングされることにより投与される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
8. ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤が投与されない場合に前記医学的手技の前、かつ／又は該医学的手技の間に通常投与されるヘパリン若しくはその誘導体及び／又はヒルジン若しくはその誘導体の量と比較して減少した量のヘパリン若しくはその誘導体及び／又はヒルジン若しくはその誘導体が、ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤に加えて、医学的手技の前、かつ／又は医学的手技の間かつ／又は医学的手技の後に加えられる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
9. ヘパリン若しくはその誘導体及び／又はヒルジン若しくはその誘導体が、ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤に加えて使用されない、請求項１〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
10. 前記ヒト又は動物対象が、医学的手技の後に、減少した血栓形成促進の危険性を有するか又は血栓形成促進の危険性を有していない、請求項１〜９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
11. ヘパリン若しくはその誘導体の術後の拮抗及び／又はヒルジン若しくはその誘導体の術後の拮抗の後に、前記ヒト又は動物対象が、減少した血栓形成促進の危険性を有するか又は血栓形成促進の危険性を有さず、そして場合によりここで血栓形成促進の危険性は、プロタミンの投与により引き起こされる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
12. ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤が投与されない場合の前記医学的手技の後で通常投与されるヘパリンアンタゴニスト及び／若しくはヒルジンアンタゴニストの量と比較して、前記ヒト又は動物対象に、該医学的手技の後で、減少した量のヘパリンアンタゴニスト及び／若しくはヒルジンアンタゴニストを有するか、又はヘパリンアンタゴニスト及び／若しくはヒルジンアンタゴニストが加えられない、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
13. ポンプヘッド症候群の予防又は処置のための、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
14. ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤が半減期増強ポリペプチドに連結されており、ここで半減期増強ペプチドは、任意にアルブミン、アファミン、アルファ−フェトプロテイン又はビタミンＤ結合タンパク質、ヒトアルブミン又はその変異体、免疫グロブリン又はその変異体、ＩｇＧのＦｃである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
15. 半減期増強ポリペプチドがリンカーを介してＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤に連結されている、請求項１４に記載の医薬組成物。
16. リンカーが：
    （ｉ） 切断可能であるもの；
    （ｉｉ） 内在性、外因性、又は共通の凝固経路の凝固プロテアーゼにより切断可能であるもの；及び
    （ｉｉｉ） ＦＸｌｌａにより切断可能であるもの
    のうちの少なくとも１つである、請求項１５に記載の医薬組成物。
17. 体外医療機器におけるヒトの血流の閉塞を防止するための、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の医薬組成物であって、ここで医療機器は、場合により心肺バイパス装置、又は血液の透析若しくは血液の体外ろ過のために使用される装置である、上記医薬組成物。
18. ヒト又は動物対象に対して行われる医学的手技の間かつ／又は該医学的手技の後の、血栓の形成及び／又は安定化を防止するための医薬組成物を製造するためのＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤の使用であって、該医薬組成物は、薬学的に許容しうる担体とＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤を含んでなり、該医学的手技は、該ヒト又は動物対象の血液を人工表面と接触させることからなり、ここで該ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤は、該医学的手技の前、かつ／又は該医学的手技の間、かつ／又は該医学的手技の後に投与され、そしてさらにここで、
    （ｉ） 人工表面は、対象の血液体積の少なくとも８０％に曝露され、かつ人工表面は少なくとも０．２ｍ²であるか、又は
    （ｉｉ） 人工表面は、対象の体外での採血のための容器であるか、又は
    （ｉｉｉ）人工表面は、ステント、弁、管内カテーテル、若しくは血液の内部補助ポンピングのためのシステムであり、
    前記ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤は、
    （Ａ） 野生型インフェスチン−４ポリペプチド配列（配列番号１）、若しくはその変
    異体［ここで変異体は、
    （ａ） 野生型インフェスチン−４配列のＮ末端アミノ酸２〜１３、及び野生型インフェスチン−４との差異を生じる、該Ｎ末端アミノ酸の外側の少なくとも１個かつ５個までのアミノ酸変異；
    及び／又は
    （ｂ） 野生型インフェスチン−４配列からの６個の保存的システイン残基及び野生型インフェスチン−４配列に対する少なくとも７０％の相同性
    を含む］、又は
    （Ｂ） 抗ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ抗体［ここで、抗体はＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａに結合し、かつその活性及び／又は活性化を阻害する］を含む、
    ことを特徴とする上記使用。

Images