DK175116B1 - Vævsfaktorprotein-antagonist til farmaceutisk anvendelse, anvendelse af vævsfaktorprotein-antagonister til fremstilling af et lægemiddel til behandling af hyperkoagulativ blödningsforstyrrelse, og terapeutisk doseringsform - Google Patents

Description

i DK 175116 B1

Denne opfindelse angår vævsfaktorprotein-antagonist til farmaceutisk anvendelse. Specielt angår opfindelsen anvendelsen af vævsfaktorprotein-antagonist til fremstilling af et lægemiddel til behandling af et dyr, fortrinsvist et menneske - med en hyperkoagulativ blødningsforstyrrelse samt en terapeutisk doserings- 5 form til indgivelse på et dyr med en blødningsforstyrrelse karakteriseret ved en J hyperkoagulativ tilstand.

OPFINDELSENS BAGGRUND

Blødning er en af de mest alvorlige og væsentlige manifestationer af sygdom.

Den kan ske fra et lokalt sted eller kan være generaliseret. Blødning forbundet 10 med en lokal læsion kan være overlejret på enten en normal eller en defekt hæmostatisk mekanisme. Normal hæmostase omfatter mekanismer, som virker umiddelbart efter en beskadigelse, og sådanne der virker over et længere tidsrum. Primær hæmostase består hovedsageligt af to komponenter Vaso-konstriktion og blodpladepropdannelse. Opretholdelsesmekanismen består af 15 fibrinkoaglet frembragt åf koaguleringssystemet. Blodpladepropdannelse er særlig vigtig ved kapillær hæmostase, medens vasokonstriktion og fibrinkoagel-dannelse er mere vigtig ved hæmostase i større kar. I mikrokredsløbet består hæmostase af vasokonstriktion og blodpladepropdannelse. Blodpladepropdannelse kan opdeles i flere stadier: Vedhæftning af blodplader til subendotheliale 20 overflader blottet ved trauma; blodpladeaktiverings-frigørelsesreaktion; blodpla-deaggregation, som resulterer i sekvestration af yderligere blodplader på stedet og binding af fibrinogen og koaguleringsproteineme til blodpladeoverfladen, hvilket inkluderer thrombindannelse; og fusion, som er koalescensen af fibrin og sammensmeltede blodplader til dannelse af en stabil hæmostatisk prop.

25 Blodkoagulation udøver to funktioner: Produktion af thrombin, som inducerer blodpladeaggregation, og dannelse af fibrin,som gør blodpladeproppen stabil.

Et antal adskilte proenzymer og procofaktorer, som betegnes "koagulationsfaktorer", deltager i koaguleringsprocessen. Processen består af flere stadier og ' ender med fibrindannelse. Fibrinogen omdannes til fibrin ved indvirkning af 30 thrombin. Thrombin dannes ved den proteolytiske spaltning af et proenzym, prothrombin. Denne proteolyse frembringes af aktiveret faktor X (betegnet som faktor Xa), som bindes til overfladen af aktiverede blodplader og i nærvær af Va og calciumion spalter prothrombin.

2 DK 175116 B1

Aktivering af faktor X kan ske ved en af to adskilte reaktionsveje, den ydre og den indre (figur 1). Den indre kaskade består af en række reaktioner, hvorved et proteinforstadium spaltes til dannelse af en aktiv protease. I hvert trin vil den nydannede protease katalysere aktiveringen af proteaseforstadiet i det efterføl-5 gende kaskadetrin. En mangel på ethvert af proteinerne i reaktionsvejen blokerer aktiveringsprocessen i det trin og forhindrer derved koageldannelse og giver typisk anledning til en tendens til blødning. Mangler på faktor VIII eller faktor IX forårsager f.eks. de alvorlige blødningssyndromer hhv. hæmophilia A og B. I den ydre reaktionsvej for blodkoagulering frigøres vævsfaktor, også betegnet 10 som vævsthromboplastin, fra beskadigede celler og aktiverer faktor X i nærvær af faktor VII og calcium. Selv om aktivering af faktor X oprindeligt blev antaget at være den eneste reaktion, som var katalyseret af vævsfaktor og faktor VII, er det nu kendt, at der eksisterer en forstærkningsløkke mellem faktor X, faktor VII og faktor IX (Osterud, B., and S.l. Rapaport, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 15 5260-52-64,1977; Zur, M. et al., Blood 52:198,1978). Hver af serinproteaser- ne i dette skema er i stand til ved proteolyse at omdanne de andre to til den aktiverede form og derved forstærke signalet på dette stadium i koaguleringsprocessen (figur 2). Det antages nu, at den ydre reaktionsvej faktisk kan være den overvejende fysiologiske reaktionsvej for normal blodkoagulation (Haemostasis 20 13: 120-155 1983). Eftersom vævsfaktor ikke normalt findes i blodet, koagulerer systemet ikke kontinuert; udløseren for koagulation vil derfor være frigørelsen af vævsfaktor fra beskadiget væv.

Vævsfaktor er et integralt membranglycoprotein, der som omtalt ovenfor kan udløse blodkoagulation via den ydre reaktionsvej; Bach, R. et al., J. Biol Chem.

25 256 (16), 8324-8331 (1981). Vævsfaktor består af en proteinkomponent (tidlige re betegnet som vævsfaktor-apoprotein-lll) og et phospholipid; Osterud, B. and Rapaport, S.I., PNAS 74, 5260-5264 (1977). Komplekset er blevet fundet på-membraneme af monocyter og forskellige celler i blodkarvæggen; Osterud, B., Scand. J. Haematol. 32, 337-345 (1984). Vævsfaktor fra forskellige organer og 30 arter er blevet rapporteret at have en relativ molekylmasse på 42 000 - 53 000. Humant vævsthromboplastin er blevet beskrevet som bestående af et vævsfaktorprotein indsat i phospholipid-dobbeltlag i et optimalt forhold mellem vævsfaktorprotein og phospholipid på omkring 1:80; Lyberg, T. and Prydz, H. Nouv.

Rev. Fr. Hematol 25 (5), 291-293 (1983). Rensning af vævsfaktor er blevet rap-35 porteret fra forskellige væv, såsom: human hjerne (Guha, A. et al. PNAS 83, 3 DK 175116 B1 299-302 [1986] og Broze, G.H. et al., J. biol. Chem. 260 [20], 10917-10920 [1985]; oksehjeme (Bach, R. et al., J. Biol. Chem. 256. 8324-8331 [1981]; human placenta (Bom, V.J.J. et al., Thrombosis res. 42: 635-643 [1986]; og An-doh, K. et al., Thrombosis Res. 43: 275-286 [1986]); fårehjerne (Carlsen, E. et 5 al., Thromb. Haemostas. 48 [3], 315-319 [1982]); og -lunge (Glas, P. and

Astrup. T., Am. J. Physiol. 219. 1140-1146 [1970]. Det er blevet vist, at okse- og humant vævsthromboplastin er identiske i størrelse og funktion; se f.eks. Bronze, G.H. et al., J. Biol. Chem. 260 (20). 10917-10920 (1985). Det er bredt accepteret, at mens der er forskelle i struktur af vævsfaktorprotein mellem arter, er 10 der ingen funktionelle forskelle, målt ved in vitro koagulationsprøvninger; Guha et al. ovenfor. Endvidere lignede vævsfaktor isoleret fra forskellige væv hos et dyr, f.eks. hundehjeme, -lunge, -arterier og -vene hinanden i visse henseender, såsom extinktionskoefficient, indhold af nitrogen og phosphor og optimalt phospholipid/lipidforhold, men adskilte sig lidt m.h.t. molekylstørrelse, aminosy-15 reindhold, reaktivitet med antistof og plasmahalveringslevetid; Gonmori, H. and Takeda, Y„ J. Physiol. 229 (3), 618-626 (1975). Alle vævsfaktoreme fra de forskellige hundeorganer viste koaguleringsaktivitet i nærvær af lipid; Ibid. Deter bredt accepteret, at for at udvise biologisk aktivitet må vævsfaktorprotein være forbundet med phospholipider; Pitlick, F.A., and Menerson, Y., Biochemistry 9, 20 5105-5111 (1970) og Bach, R. et al. ovenfor, side 8324. Det er blevet vist, at fjernelsen af phospholipidkomponenten af vævsfaktor, f.eks. ved anvendelse af en phospholipase, resulterer i tab af dens biologiske aktivitet; Nemerson, Y.

J.C.I. 47, 72-80 (1968). Relipidering kan genoprette in vitro vævsfaktor-aktivitet; Pitlick, F.A. and Nemerson, Y. Biochemistry 9, 5105-5113 (1970) og Freyssinet, 25 J.M. et al., Thrombosis and Haemostasis 55,112-118 [1986].

Infusion af vævsfaktor er længe blevet anset for at kompromittere normal hæ-mostase. 11834 fastslog den franske fysiolog de Blainville først, at vævsfaktor medvirkede direkte til blodkoagulation; de Blainville, HI, Gazette Medicale Paris, Series 2, 524 (1834). de Blainville iagttog også, at intravenøs infusion afen 30 hjernevævssuspension forårsagede øjeblikkelig død, som han iagttog var korre-leret med en hyperkoagulativ tilstand, som giver anledning til udstrakt disseminerede blodkoagler fundet ved obduktion. Det er nu vel accepteret, at intravenøs infusion af vævsthromboplastin inducerer intravaskulær koagulation og kan forårsage død hos forskellige dyr (hunde: Lewis, J. and Szeto I.F., J. Lab. Clin.

35 Med. 60, 261-273 (1962); kaniner: Fedder, G. et al., Thromb. Diath. Haemorrh.

4 DK 175116 B1 27, 365-376 (1972); rotter: Giercksky, K.E. et al., Scand. J. Haematol. 17, 305-311 (1976); og får: Carlsen, E. et al., Thromb. Haemostas. 48, 315-319 [1982]).

Foruden intravaskulær koagulation eller en hyperkoagulativ tilstand stammende fra den exogene indgivelse af vævsfaktor, er det blevet foreslået, at den intra-5 vaskulære frigørelse af vævsthromboplastin kan starte disseminieret intravaskulær koagulation (DIC); Prentice, C.R., Clin. Haematol. ΛΑ (2), 423-442 (1985).

DIC kan opstå ved forskellige tilstande, såsom shock, septieæmia, hjertestop, udbredt trauma, bid afgiftslanger, akut leversygdom, større kirurgiske indgreb, forbrændinger, septisk abort, hedeslag, dissemineret malignans, panereatisk og 10 ovarielt carcinoma, promyelocytisk leukæmia, myocardial infarkt, neoplasmer, systemisk lupus erythematosus, nyresygdom og eclampsia. Den nuværende behandling af DIC inkluderer transfusion af blod og frisk frosset plasma, infusion af heparin, og fjernelse af dannede thrombi. De ovenstående kliniske syndromer antyder, at endogen frigørelse af vævsfaktor kan resultere i alvorlige klini-15 ske komplikationer; Andoh, K. et al., Thromb. Res. 43, 275-286 (1986). Der er gjort forsøg på at overvinde den thrombotiske virkning af vævsthromboplastin ved anvendelse af enzymet thromboplastinase; Gollub, S. et al., Thromb. Diath. Haemorh. 7, 470-479 (1962). Thromboplastinase er en phospholipase og ville antageligvis spalte phospholipidportionen af vævsfaktor; Ibid.

20 Medfødte koagulationslidelser involverer karakteristisk et enkelt koagulationsprotein. Hæmophilia er en blødersygdom, som skyldes arvet mangel på en koagulationsfaktor, f.eks. den prokoagulerende aktivitet af faktor VIII. Grundlaget for terapi af blødningsepisoder er transfusion af materiale indeholdende det manglende koagulationsprotein, f.eks. infusion af faktor-VIII-prokoagulerende 25 aktivitet, som midlertidligt korrigerer den specifikke mangel ved hæmophilia A.

Von Willebrand's sygdom er en anden bløderlidelse, som er karakteriseret ved en forlænget blødningstid i forbindelse med en abnormalitet eller mangel i von Willebrand proteinet. Behandlingen sker ved infusion af normalt plasma eller af et præparat rigt på von Willebrandt protein. Medfødte mangler på hver af de 30 andre koagulationsfaktorer forekommer og kan være forbundet med en hæmo-ragisk tendens. De nuværende terapier for manglerne er: Faktor IX mangel behandles under anvendelse af koncentrater indeholdende faktor IX; der gives in- 5 DK 175116 B1 fusioner af plasma for en faktor XI mangel; og der gives plasmainfusion for en faktor XIII mangel.

Erhvervede koagulationslidelser opstår hos individer uden tidligere blødningshistorie som resultat af en sygdomsproces. Inhibitorer for blodkoagulationsfakto-5 rer kan forekomme hos multitransfuserede individer. Erhvervede koagulationsfaktormangler med ukendt ætiologi giver også anledning til hæmostatiske problemer. DIC beskriver en dybtgående nedbrydning af hæmostasemekanismen.

Et formål for denne opfindelse er at angive et antikoaguleringsterapeutikum, d.v.s. en antagonist for vævsfaktorprotein, til at neutralisere de thrombotiske 10 virkninger af endogen frigørelse af vævsthromboplastin, som kan resultere i en hyperkoagulativ tilstand. Især ville en sådan antikoagulant, d.v.s. en antagonist for vævsfaktorprotein, neutralisere de hyperkoagulerende virkninger af endogent frigjort vævsthromboplastin ved at inaktivere vævsfaktorprotein. En sådan vævsfaktorprotein-antagonist kan være et antistof eller et andet protein, som 15 specifikt inaktiverer proteinkomponenten.

SAMMENFATNING AF OPFINDELSEN

Vævsfaktorprotein er proteinportionen af vævsfaktor, som mangler det normalt forekommende phospholipid, der tidligere blev betegnet som vævsfaktor-apoprotein-lll og tidligere blev antaget at være inaktivt. Vævsfaktorprotein blev 20 for første gang fundet at korrigere blødningsdiatesen, d.v.s. en tendens til blødning, forbundet med faktor VIII mangel in vivo. Endvidere ville infusion af vævsfaktorprotein forventes at være ineffektiv i lyset af de artikler, der beskriver vævsfaktor som havende et absolut krav om phospholipid. Den iagttagne effektivitet og mangel på toxicitet er i modsætning til de resultater, man ville have 25 forventet ud fra arbejderne af de Blainville og efterfølgende forskere i løbet af de sidste 152 år.

Denne opfindelse er rettet mod en antikoagulant til neutralisering af de koagulerende virkninger af endogent frigjort vævsthromboplastin ved en aktivering af vævsfaktorprotein.

30 I overensstemmelse hermed angår opfindelsen vævsfaktorprotein-antagonist til farmaceutisk anvendelse.

6 DK 175116 B1

Specielt omfatter opfindelsen anvendelsen af en vævsfaktorprotein-antagonist til fremstilling af et lægemiddel til behandling af et dyr, fortrinsvist et mennske med en hyperkoagulativ blødningsforstyrrelse.

Endvidere omfatter opfindelsen en terapeutisk doseringsform til indgivelse på et 5 dyr, fortrinsvist et mennske med en blødningsforstyrrelse karakteriseret ved en hyperkoagulativ tilstand, hvilken doseringsform er særegen ved at den omfatter en vævsfaktorprotein-antagonist og et farmaceutisk acceptabelt medium.

Opfindelsen omfatter ligeledes anvendelse af vævsfaktorprotein-antagonist til fremstilling af et lægemiddel til behandling af et dyr, fortrinsvist et menneske 10 med dissimineret vasculær koagulation (DIC).

I en særlig udføreslesform af opfindelsen er vævsfaktorprotein-antagonisten et antistof.

KORT BESKRIVELSE AF TEGNINGERNE

Figur 1. Diagram, som viser aktivering af blodkoagulation via den indre reakti-15 onsvej.

Figur 2. Diagram, som viser forstærkning af koagulationssignalet via den ydre reaktionsvej.

Figur 3. Cuticula-blødningstider (CBT) i dyr, der modtager vævsfaktorprotein.

Pile angiver dosis af vævsfaktorprotein i enh./kg. Præ henfører til CBT før no-20 gen injektion.

DETAUERET BESKRIVELSE

I denne beskrivelse med krav henfører "vævsfaktorprotein" til et protein, som er istand til at korrigere forskellige blødningsforstyrrelser, især dem, der er forbundet med mangler vedrørende koagulationsfaktorer. Vævsfaktorprotein er for-25 skellig fra vævsfaktor eller vævsthromboplastin ved, at det mangler den naturligt forekommende lipidportion af molekylet. Infusion af vævsfaktorprotein, som defineret her, resulterer ikke i dissemineret intravaskulær koagulation. Vævsfaktorproteins evne til at korrigere forskellige blødningsforstyrrelser bestmmes let under anvendelse af forskellige in vivo blødningsmodeller, f.eks. start af koagu- 7 DK 175116 B1 lation hos hæmofile hunde under anvendelse af cuticula-blødningstids-bestemmelse (Giles, A.R. et al., Blood 60: 727-730 [1982]).

Betegnelsen "vævsfaktorprotein-antagonister" som anvendt i denne beskrivelse med krav henfører til stoffer, som kan fungere på to måder. For det første vil 5 vævsfaktorprotein-antagonister bindes til vævsfaktorprotein med tilstrækkelig affinitet og specificitet til at neutralisere vævsfaktorprotein, således at det ikke kan bindes til faktor VII eller Vlla eller frembringe proteolyse af faktor IX eller X, når den er i kompleks med faktor VII eller VIla. Alternativt vil vævsfaktorprotein-antagonister inaktivere vævsfaktorprotein eller vævsfaktor/faktor VIla komplek-10 set ved spaltning, f.eks. en specifik protease. Antagonister er nyttige, enten alene eller sammen, til terapi af forskellige koagulationsforstyrrelser, som viser sig ved ændrede plasmafibrinogenniveauer som beskrevet i denne beskrivelse, f.eks. DIC, som forekommer under alvorlige infektioner og septicæmier efter kirurgi eller trauma i stedet for eller i kombination med andre antikoagulanter, så-15 som heparin.

Et eksempel på en antagonist, som vil neutralisere vævsfaktorprotein, er et neutraliserende antistof overfor vævsfaktorprotein. Vævsfaktorprotein-neutralise-rende antistoffer frembringes let i dyr, såsom kaniner eller mus, ved immunisering med vævsfaktorprotéin i "Freund's adjuvant" efterfulgt af forstærkningsin-20 jektioner efter behov. Immuniserede mus er særlig anvendelige til at tilvejebringe kilder for B-celler til fremstilling af hybridomer, som igen dyrkes til dannelse af store mængder af billige monoklonale anti-vævsfaktorprotein-antistoffer. Sådanne monoklonale vævsfaktorprotein-antistoffer er blevet fremstillet af Carson S.D. et al., Blood 66(1), 152-156(1985).

25 Vævsfaktor frigøres fra beskadigede celler og aktiverer faktor IX og X i nærvær af faktor VII eller Vlla og calcium (se figur 2). Aktiveringen af faktor X ad den yd- j

re koagulationsvej har et absolut krav om vævsfaktor; Silverberg, S.A., et al., J. I

Biol. Chem. 252. 8481-8488 (1977). Indtil den foreliggende opfindelse blev det antaget, at lipidkomponenten af vævsfaktor var nødvendig for optimal vævsfak-30 tor-aktivitet ved faktor Vll’s eller Vila's katalyse af faktor X eller faktor IX. Denne opfindelse omfatter behandling af forskellige akutte og kroniske blødningsforstyrrelser ved omgåelse af disse mangler via indgivelsen af vævsfaktorproetein.

Nærmere bestemt kan opfindelsen anvendes på de blødningsforstyrrelser, som 8 DK 175116 B1 opstår hos dyr, fortrinsvist mennesker der mangler forskellige koagulationsfaktorer.

Vævsthromboplastin eller vævsfaktor består af en glycoproteinkomponent (tidligere betegnet som vævsfaktor-apoprotein-lll), som er blevet renset til tilsynela-5 dende homogenitet (Bjorklid, E. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 55, 969-976 [1973]), og en phospholipid-fraktion. Talrige rapporter har beskrevet rensningen af vævsfaktor fra mange typer af væv, såsom hjerne, lunge og placenta. Får, ko, kanin, hund, og menneske har været kilde til vævsfaktor. Det første trin i den kemiske rensning har været at dissociere vævsfaktor fra dens 10 native lipid under anvendelse af f.eks. extraktion med organiske opløsningsmidler. Eksempler på sådanne organiske opløsningsmidler inkluderer pyridin, hep-tan/butanol-blanding og ethanol. Vævsfaktorprotein er blevet renset ved kemiske midler. Eksempler på sådanne kemiske midler er: behandling med deter-genser, såsom dioxycholat eller "Triton®X-100"; gelfiltrering og præparativ po-15 lyacrylamidgel-elektrophorese i nærvær af natriumdodecylsulfat; concanavalin A bundet til en ’'Sepharose"®-søjle; og affinitetssøjler under anvendelse af antistoffer overfor vævsfaktorproteinet eller selektiv adsorption til faktor VII. Inkluderet i omfanget af vævsfaktorprotein er vævsfaktorprotein fra rekombinante eller syntetiske kilder. Inkluderet er også dimere af vævsfaktorprotein og vævsfak-20 torprotein-varianter med aminosyreudskiftninger og/eller -deletioner og/eller -tilføjelser, organiske og uorganiske salte og kovalent modificerede derivater af vævsfaktorprotein. Vævsfaktorprotein produceret ved hjælp af rekombinante midler kan inkludere en naturligt forekommende pro-form såvel som en præpro-form af vævsfaktorprotein.

25 Til anvendelse i forbindelse med denne opfindelse kan vævsfaktorprotein- antagonister sammensættes i et injicerbart præparat. Parenterale sammensætninger er egnede til brug i forbindelse med opfindelsen, fortrinsvis til intravenøs indgivelse. Disse sammensætninger indeholder terapeutisk effektive mængder af vævsfaktorprotein-antagdnist, er enten sterile flydende opløsninger, flydende 30 suspensioner eller lyophiliserede versioner og indeholder eventuelt stabilisatorer og excipienter. Typisk rekonstitueres lyophiliserede præparater med egnede fortyndingsmidler, f.eks. sterilt vand til injektion, steril saltopløsning o.l. hvor den biologiske aktivitet er tilstrækkelig til at inducere hæmostatisk koagulation, iagttaget ved en kanininfusionsundersøgelse.

9 DK 175116 B1 Vævsfaktorprotein-antagonister kan indgives ved injektion intravaskulært i en tilstrækkelig dosering til at korrigere en blødningsforstyrrelse, f.eks. DIC. Dosen vil afhænge af forskellige terapeutiske variable, som kendes af den almindeligt uddannede fagmand.

5 Vævsfaktorprotein-antagonisten ifølge opfindelsen sammensættes og indgives fortrinsvis som en steril opløsning, selv om det er inden for opfindelsens omfang at anvende lyophiliserede vævsfaktorpræparater. Sterile opløsninger fremstilles ved sterilfiltrering af vævsfaktorprotein-antagonisten eller ved andre metoder, som kendes inden for faget. Opløsningerne bliver derpå lyophiliseret eller fyldt i 10 farmaceutiske doseringsbeholdere. Opløsningens pH-værdi bør være i området 3,0-9,5, fortrinsvis 5,0-7,5. Vævsfaktorprotein-antagonisten bør være i en opløsning med en egnet farmaceutisk acceptabel puffer, såsom phosphat, tris(hydroxymethyl)aminomethan-HCI, citrat el. lign. Pufferkoncentrationer bør være i området 1-100 mM. Opløsningen af vævsfaktorprotein kan også inde-15 holde et salt, såsom natriumchlorid eller kaliumchlorid, i en koncentration på 50-750 mM. Præparaterne ifølge opfindelsen inkluderer eventuelt en effektiv mængde af et stabiliserende middel efter behov, såsom et albumin, et globulin, en gelatine, mono- eller polysaccharid, aminosyre eller sukker. En stabiliserende mængde detergens, såsom ikke-ioniske detergenser (PRG eller blok-20 copolymere),natriumdeoxycholat, "Triton®X-100? eller natriumdodecylsulfat (SDS), kan tilsættes.

Vævsfaktorprotein -antagonist anbringes fortrinsvis i en beholder med en steril adgangsport f.eks. en pose eller ampul til intravenøs opløsning med en prop, som kan gennembores af en hypodermisk injektionsnål.

25 Opfindelsen belyses nærmere ved de efterfølgende eksempler.

EKSEMPEL 1

Almene materialer og metoder

Modne oksehjerner blev skaffet fra Pel-Freeze, Rogers, AR, USA og opbevaret ved -20 0C. 'Triton®X-100" og α-D-methylglucosid var fra Calbiochem, San 30 Diego, CA, USA. Concanavalin-A-"Sepharose"®-harpiks (betegnet som Con A "Sepharose" i tabel 1) var fra Pharmacia, og "Ultrogel AcA 44" fra LKB, 10 DK 175116 B1

Gaithersburg, MD, USA. Alle kemikalier og reagenser til præparativ og analytisk natrium dodecylsulfat-polyacrylamidgel-elektrophorese (SDS-PAGE) blev skaffet fra Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, USA. Factor IXa/Factor X-reagens og 2222/12581 blev skaffet fra Helena Laboratories (Kabi Coatest kit, Helena 5 Laboratories, Beaumont, CA, USA. Catalogue No. 5293). YM 10 ultrafiltreringsmembraner var fra Amicon. Factor VII var renset fra okseplasma (Broze, G. and Majerus, P.,J. Biol. Chem. 255 (4): 1242-1247 [1980J) Factor VIII-deficient og normalt sammenhældt citrateret plasma var fra George King Bio-medicals, Overland Park, KS, USA. Råt phosphotidylcholin (lecithingranuler fra 10 sojabønne) blev skaffet fra Sigma, St. Louis, MO, USA. Alle andre kemikalier var af reagenskvalitet eller bedre.

Acetone-delipidering af oksehjerner

To modne oksehjemer blev optøet ved stuetemperatur og skyllet frie for koaguleret blod med destilleret vand. Vævene blev derpå homogeniseret i iskold ace-15 tone til et volumen på 10 ml acetone pr. gram våd vægt af oksehjeme under anvendelse af en Ultra-Turrex vævshomogenisator. Homogenatet blev extrahe-ret ved 4 °C i 30 minutter og derpå filtreret igennem "Whatman No. 1" filterpapir påen udpumpet kolbe. Vævsopslæmningen blev resuspenderet i det oprindelige volumen iskold acetone, extraheret og filtreret 6 gange. Den endelige filterkage 20 blev tørret under en strøm af nitrogen og opbevaret ved -20 °C.

"Triton®X-100"-solubi lisering af vævsfaktor

Acetonehjernepulver (145 g) blev homogeniseret i 0,05 M Tris/0,1 M NaCI, pH

7,5 (TBS) til et endeligt volumen på 20 ml puffer/g acetonehjernepulver. Homogenatet blev extraheret ved 4 °C i 1 time og derefter centrifugeret ved 10 000 x 25 G i 1 time ved 4 °C. Supematanten blev smidt væk, og pillen rehomogeniseret i 3 liter TBS/0,1 % Triton®X-100". Materialet blev extraheret og centrifugeret som før. Den således opnåede pille blev derpå homogeniseret i 3 liter TBS/2 % 'Triton®X-100M for at solubilisere vævsfaktor. Homogenatet blev extraheret i 16 timer ved 4 °C og derpå centrifugeret som før.

11 DK 175116 B1

Concanavalin A-"Sepharose"®-affinitetskolonne

Supematanten fra 2 % "Triton®X-100"-extraktionen blev gjort 1 mM m.h.t.

CaCb og MgCb og batch-adsorberet med 100 ml concanavalin A-"Sepharose"-harpiks i 16 timer ved 4 °C . Efter adsorptionen blev "Sepharose"-harpiksen 5 hældt i en 3 x 20 cm kolonne og vasket med 500 ml TBS 0,05 % "Triton®X-100” med en strømningshastighed på 2 ml/min. Absorbansen blev kontrolleret ved 280 nm. Da der ikke blev vasket yderligere protein fra kolonnen, blev "Sepharo-sen" elueret isocratisk med en puffer omfattende 100 mg/ml a-D-methylglucosid i TBS/0,05 % "Triton®X-100". Der blev opsamlet 10 ml fraktioner ved en strøm-10 ningshastighed på 2 ml/min. Fraktionerne blev relipideret og prøvet for vævsfaktor-aktivitet. Vævsfaktorprotein blev elueret i omkring 4 kolonne volumener elue-ringsmiddel. Eluatet blev koncentreret i en "Amicon"-koncentreringscelle under anvendelse afen YM 10 ultrafiltreringsmembran.

Gelpermeationschromatografi 15 10 ml koncentreret concanavalin-A-"Sepharose”-eluat blev dialyseret overfor TBS 0,1 % "Triton®X-100", pH 7,4,1 liters volumen med 4 udskiftninger af puffer. Efter dialyse i 8 timer blev materialet sat på en 120 x 1,5 cm kolonne af "AcA 44 Ultrogel" præ-ækvilibreret med TBS 0,1 % ,Triton®X-100". Kolonnen blev udviklet isocratisk med en strømningshastighed på 6 ml/h. Der blev opsam-20 let 1 ml fraktioner. Fraktionerne blev relipideret og prøvet for vævsfaktoraktivitet. Topfraktioner blev hældt sammen til et endeligt volumen på 20 ml. Dette materiale blev opbevaret ved -20 °C før brugen.

Rensning af vævsfaktorprotein Vævsfaktorprotein blev delvis renset fra oksehjerne ved en kombination af ace-25 tone-delipidering, 'Triton®X-100-extraktion, lectinaffinitetschromatografi og gelpermeationschromatografi. Det højrensede vævsfaktorprotein blev oprenset 12 000 gange fra hjernepulver (tabel 1). En følsom chromogenisk prøvning for vævsfaktorprotein blev anvendt til at kontrollere rensningstrinnene. Efter deter-gensextraktion af acetone-hjernepulver kunne vævsfaktorprotein-aktiviteten ikke 30 detekteres ved prøvningen med mindre vævsfaktorprotein blev relipideret. Materialet, som blev infuseret i kaninerne, havde ingen cofaktor-aktivitet før relipi-dering ved hverken 1-trins koaguleringsprøvningen eller den chromogene 2- 12 DK 175116 B1 trinsprøvning beskrevet nedenfor (tabel 2). Dette bekræftede vævsfaktorens velkendte phospholipid-afhængighed; se Nemerson, Y., ovenfor. Human placental vævsfaktor blev isoleret under anvendelse af kendte metoder, se f.eks.

Guha, A. et al. ovenfor. Humant placentalt vævsfaktorprotein blev sammenlig-5 net med okse-vævsfaktorprotein. Som vist i tabel 5, har både human placental vævsfaktor og oksevævsfaktor et lipidkrav til aktivitet ved en in vitro chromogen prøvning. Som omtalt ovenfor, er human placental vævsfaktor og oksevævsfaktor ensartet i struktur. Således ville human placental vævsfaktor forventes at fungere på lignende måde som oksevævsfaktor, hvis den infuseres i kaniner.

10 Prøvning for vævsfaktorprotein 1. Chromogen vævsfaktor-prøvning.

Alle prøver extraheret fra oksehjerne med ikke-ionisk detergens blev relipideret før prøvningen. Som omtalt ovenfor, har vævsfaktor et absolut krav om phospholipid for at udøve aktivitet i in vitro prøvningssystemer (Pitlick and Ne-15 meson, ovenfor). Lecithingranuler blev homogeniseret i "Tris" 0,05 M, 0,1 M NaCI pH 7,4 (TBS) indeholdende 0,25 % natriumdeoxycholat til en koncentration på 1 mg/ml. Denne opløsning (PC/DOC) blev anvendt til at relipidere vævsfaktor som følger. Vævsfaktorprotein blev fortyndet i TBS indeholdende 0,1 % okseserumalbumin (TBSA). 50 μΙ blev anbragt i et 12 x 75 mm polystyrenrea-20 gensglas, og der tilsattes 50 μΙ PC/DOC-opløsning. Derpå tilsattes 350 μΙ TBSA sammen med 25 μ1100 mM CdCI2. Denne relipideringsblanding fik lov at inkubere ved 37 °C i 30 minutter.

Til den chromogene prøvning blev prøver af relipideret vævsfaktorprotein fortyndet i TBSA. 10 μΙ blev anbragt i et reagensglas med 50 μΙ af faktor IXa/faktor 25 X reagenset og 2 μΙ af en opløsning af renset faktor VII, 30 enh./ml. Reagensglassene blev opvarmet til 37 °C, og der tilsattes 100 μΙ 25 mM CaCI2. Prøver blev inkuberet i 5 minutter ved 37 °C før tilsætningen af 50 μΙ chromogent substrat S2222 indeholdende den syntetiske thrombininhibitor 12581. Reaktionen fik lov at foregå i 10 minutter og blev standset ved tilsætning af 100 μΙ 50 % iseddi-30 ke-opløsning. Absorbans blev detekteret ved 405 nm. En standardkurve blev konstrueret under anvendelse af kaninhjerne-thromboplastin (forhandlet kommercielt af Sigma, St. Louis, MO, USA, catalogue No. T0263), idet dette reagens arbitrært blev betegnet som indeholdende 100 vævsfaktorenheder pr. ml.

13 DK 175116 B1

Fortyndinger blev foretaget fra 1:10 til 1:1000. Absorbansen blev afsat langs abscissen på semilog-kurvepapir med fortynding af standarden afsat langs ordinaten.

2. Et-trins prøvning for vævsfaktoraktivitet.

5 100 pi hæmophilt plasma blev tilsat til 10 μΙ relipideret eller lipidfri vævsfaktor eller TBSA som kontrol i et siliconeovertrukket reagensglas for at fortiindre ikke-specifik aktivering via kontaktfasen af koagulation. Reaktanterne blev opvarmet til 37 °C, der tilsattes 100 μΙ 25 mM CaCI2, og der blev taget tid på koageldan-nelsen; Hvatum, Y. and Prydz, H., Thromb. Diath. Haemorrh. 21, 217-222 10 (1969).

EKSEMPEL 2

Effektivitet og mangel på toxicitet af vævsfaktorprotein i en kaninmodel

Arterielle og venøse kanyler blev indsat i ørerne på to 1,8 kg hvide New Zealand kaniner. 0,8 ml arterielt blod blev udtaget fra hvert dyr og antikoaguleret 15 med 0,2 ml 0,13 M trinatriumcitrat. Begge dyr blev derpå infuseret med 600 μΙ protein-A-renset, humant, anti-human-faktor-VIII-antistof, 1700 Bethesda-enh./ml igennem den venøse kanyle. 30 minutter efter infusionen blev de arterielle kanyler skyllet med 1 ml saltopløsning, og 1 ml blod blev udtaget og smidt væk. Derpå blev 0,8 ml blod antikoaguleret til prøvning som beskrevet ovenfor.

20 300 μΙ TBS/0,1 % Triton®X-100" blev derpå infuseret i den første kanin som kontrol, medens den anden kanin modtog 300 μΙ vævsfaktorprotein. Efter relipi-dering vil dette repræsentere en dosis på 233 vævsfaktorenheder pr. kg.

(enh./kg). 60 minutter efter infusionen af antistoffet blev der udtaget blod fra begge kaniner til prøvning, og de arterielle kanyler blev fjernet. Blod blev op-25 samlet, og strømningen og varigheden af blodstrømmen optegnet.

Kanin-faktor VIII krydsreagerede med humane anti-human-faktor-VIIl-antistoffer i in vitro prøvningssystemer. Disse antistoffer blev derpå anvendt til at antikoa-gulere kaniner, hvilket muliggjorde påvisningen af vævsfaktorproteins faktor-Vlll-omgående aktivitet in vivo. 30 minutter efter infusionen af anti-faktor-VIII-30 antistoffer blev der ikke detekteret faktor VIII i plasmaet ved den chromogene faktor-VIII-prøvning (tabel 3). Kontrolkaninen modtog en infusion af puffer (300 14 DK 175116 B1 μΙ) indeholdende 0,1 % "Triton®X-100M 30 minutter før fjernelsen af den arterielle kanyle. Dette resulterede i voldsom blødning, som tog elleve minutter om at ophøre (tabel 3). Dyret, som modtog vævsfaktorprotein (prøvning nr. 2 i tabel 3) blødte kun lidt efter den samme behandling, og denne strømning standsede ef-5 ter 38 sekunder, hvilket påviser, at vævsfaktorprotein omgår faktor-VIII in vivo. Dyrene, som modtog vævsfaktorprotein, havde ingen observerbare thrombi, som det er blevet rapporteret i litteraturen for vævsfaktor og omtalt ovenfor.

Toxiciteten af vævsfaktorproteinpræparatet blev prøvet i 6 kaniner, som blev infuseret med 250 enh. vævsfaktorprotein pr. kg. Efter 3 dage blev der ikke iagt-10 taget nogen skadelige virkninger (tabel 4). Det bør bemærkes, at dette er den dosis, der er anvendt i tabel 3, hvorved blødningsdefekten blev korrigeret. To af kaninerne blev derpå infuseret med en anden dosis på 250 enh./kg, én modtog to gange denne dosis, og én kanin modtog 5 gange denne dosis. Disse dyr såvel som de to, der ikke modtog en anden injektion, blev holdt under opsyn i 15 yderligere 2 dage. Alle dyr viste sig normale efter ialt 120 timers iagttagelse, hvilket viser, at materialet tolereres godt og ikke er toxisk. Lignende præparater af humant vævsfaktorprotein vil derfor forventes at tolereres godt, når de infuse-res i patienter (tabel 4), og være i stand til at korrigere blødningsforstyrrelser (tabel 3).

20 EKSEMPEL 3

Effektivitet og mangel på toxicitet af vævsfaktorprotein i en hunde-hæmophiiia-model Vævsfaktorprotein infuseres i hæmophile hunde under anvendelse af proceduren beskrevet af Giles, A.R. et al., Blood 60, 727-730 (1982).

25 Mangel på toxicitet af vævsfaktorprotein blev først bestemt i en normal hund efter bolusinjektion af doser på50 vævsfaktorproein-enh. pr. kg og 250 vævsfak-torprotein-enh. pr. kg. En cuticula-blødningstids-bestemmelse (CBT) blev gennemført (Giles ovenfor) før infusion og 30 min. efter hver injektion. Blod blev udtaget og antikoaguleret til koagulationsprøvninger ved forskellige tidspunkter 30 under forsøget (fig 3). For at påvise faktor-VIII-bypassing aktivitet in vivo af vævsfaktorprotein blev der udført forsøg under anvendelse af hæmophile hunde. Fastende dyr blev anæsthetiseret, og der blev gennemført en CBT før no- 15 DK 175116 B1 gen infusion. Vævsfaktorprotein blev derpåindgivet ved bolusinjektion, og der blev gennemført CBTer ved forskellige tidspunkter op til 90 min efter infusionen. Flere doser af vævsfaktorprotein blev indgivet. Blodprøver blev udtaget under varigheden af hvert forsøg og prøvet for faktor V, prothrombin-tid (PT) og 5 partial-thromboplastin-tid (PTT). CBTer på over 12 min. blev betragtet som stærkt abnorme. De kløer blev kauteriseret for at forhindre overdrevent blodtab.

En anæthestiseret normal hund blev indgivet doser af vævsfaktorprotein repræsenterende 50 og 250 enh./kg vævsfaktorprotein efter relipidering ved den chro-mogene prøvning. CBT'en i dette dyr var omkring 3 min. før nogen infusion 10 (figur 3). Faktor V niveauer var normale 30 min. efter hver infusion (tabel 6). Prothrombintiden (PT) og partial-thromboplastin-tiden (PTT) var uændrede ved forsøgets afslutning, og CBTeme var også indenfor det normale område. Således blev infusionen af vævsfaktorprotein tolereret godt hos normale hunde, og der fandtes intet tegn på dissemineret intravasculær koagulation.

15 En hæmophil hund med et forlænget-CBT-karakteristikum for haemophilia A blev indgivet 50 enh./kg vævsfaktorprotein. CBT'en var normaliseret 30 min efter denne infusion (figur 3). Denne korrektion var ikke forbundet med en ændring i faktor V niveauer, og prothrombin-tiden (PT) var heller ikke forlænget (tabel 6). Prokoagulant-effekten var ikke opretholdt 90 min. efter infusionen, da 20 CBT-effekten igen var abnorm ved dette tidspunkt. Et dosis-respons-forhold blev fastslået ved infusion af 250 enh. vævsfaktorprotein pr. kg. Ved denne dosis var CBT'en for den hæmophile hund normaliseret ved 30 og 90 min (figur 3).

Denne forøgede dosering var imidlertid forbundet med en sænkning i faktor V niveauer og en let forlængelse af prothrombin-tiden (PT) (tabel 6). Som følge 25 heraf blev forsøgene gentaget under anvendelse af en dosis på 100 enh. vævsfaktorprotein pr. kg. for at opnå den maksimale varighed af effektivitet, medens man sikrede, at andre koagulationsfaktorniveauer var upåvirkede. Således modtog en hæmophil hund 100 enh. vævsfaktorprotein pr. kg, og der gennemførtes CBT ved 15, 30 og 45 min. Det er interessant, at CBTen ved 15 min sta-30 dig var abnorm (figur 3), og at stasis ikke blev opnået før 30 min efter infusionen. Dette er en iagttagelse, som stemmer overens med resultater opnået under anvendelse af konventionelle hunde-faktor-VIII-præparationer i ikke-inhibitor-hæmophile hunde. Ved denne dosis var CBT'en normal efter 45 min. Blodprøver blev taget og analyseret for tegn på konsumptiv koagulopati (tabel 16 DK 175116 B1 6). Faktor V niveauer, prothrombin-tider, thrombin-koagulerings-tider og blod-pladeniveauer var uændrede af behandlingen. Således blev effektiviteten af vævsfaktorprotein in vivo påvist i en dosis, som ikke forårsagede dissemineret intravasculær koagulation. Den omgående aktivitet blev bekræftet i en tredje 5 hæmophil hund under anvendelse af en dosis på 100 enh. vævsfaktorprotein pr. kg og CBTer gennemført efter 30 og 45 min. Mens effektiviteten blev fastslået ved begge tidspunkter, skete der nogen genblødning ved 45 min.

EKSEMPEL 4

Funktionel homologi mellem okse- og humant vævsfaktorprotein 10 Funktionel homologi mellem okse- og humant vævsfaktorprotein blev vist under anvendelse af den chromogene vævsfaktor-prøvning. Oksevævsfaktorprotein blev renset som beskrevet ovenfor. Humant vævsfaktorprotein blev delvis renset fra placentae under anvendelse af fremgangsmåden beskrevet af Freyssinet et al., Thrombosis and Haemostasis 55 (1): 112-118 (1986), inklusive affini-15 tetschromatografi på concanavalin-A-"Sepharose". Det eluerede materiale fra denne kolonne blev derpå underkastet gelfiltreringschromatografi på en "AcA 44 Ultroger-kolonne som beskrevet tidligere for okseproteinet.

Okse- og humant vævsfaktorprotein (betegnet hhv. BTFP og HTFP i tabel 5) blev prøvet ved den allerede beskrevne standard-chromogen-20 vævsfaktorprøvning. Prøver, som var blevet relipideret før prøvningen, udviste kraftig vævsfaktor-cofaktor-aktivitet (betegnet som hhv. BTFP + PI og HTFP + PI i tabel 5). Prøver, som ikke var blevet relipideret, viste ikke cofaktor-aktivitet ved prøvningen (BTFP - PI og HTFP - PI).

Proteinkoncentrationeme i disse prøver var oksevævsfaktorprotein 0,59 mg/ml 25 og humant vævsfaktorprotein 13,55 mg/ml. Forskellen i proteinkoncentration var et resultat af forskelle i rensningsgraden. Disse resultater er bevis på den funktionelle homologi mellem vævsfaktorproteineme fra humane og okse-kilder.

Rensning af oksehieme-vævsfaktor 17 DK 175116 B1 TABEL 1

Volu- Protein Vævsfaktoraktivitet Sp.act. Rensning Prøve men mg/ml total enh/ml total enh/mg gange _ml_

Acetone hjerne pulver 3500 7,35 25725 1,06 3675 0,14 TBS-vasknings supernatant 3000 6,04 18120 0,16 480 0,1% "Triton" supernatant 3000 1,42 4260 0,52 1560 2% ’’Triton" ekstrat 2750 3,00 8250 14,82 40761 4,94 35,2

Con A "Sepharo- se"supematant 2750 2,4 6600 4,2 1133

Con A "sepharose” eluat 420 0,2 71,4 53,5 22470 314,0 2242

Con A eluat efter koncentrering 15 1,5 23 750,0 11250 489,0 3492 "Ultrogel AcA44” sammenhældning 8 0,83 6,3 1400 10780 1711,0 12221

Karakterisering af delvis renset vævsfaktorprotein 18 DK 175116 B1 TABEL 2

Chromogenisk prøvning Koaguleringstid Prøve_enh./ml_s._ TBS/0,1% "Triton" puffer 0 250 Vævsfaktorprotein 0 249

Relipideret vævsfaktor_1400_66,2_ TABEL 3

Resultater af in vitro vævsfaktorprotein-blandinoskorrektion

Faktor VIII

enh./ml Blødning

Nr. Kanin Infusion før 30 min 60 min tid(min) Vol.

T Kontrol TBS/TX100 5Æ 0 0 ϊϊ~0 15,2 2. Prøvning TFP 233 enh./kg* 4,8 0 0 0,63 0,125 *233 enh./kg vævsfaktor-aktivitet efter relipidering, målt ved den chromogene prøvning.

Overlevelse efter infusion af vævsfaktorprotein 19 DK 175116 B1 TABEL 4

Tid 0 72 timers 1201.

Infusion af TFP* infusion af TFP* overlevel-Nr. Vægt (kg) total enh. enh./kg total enh. enh./kg se (+/-) Ί : ΪΑ2 350 246 350 246 + 2 1,35 350 260 350 260 + 3 1,40 350 250 700 500 + 4 1,33 350 263 1750 1316 + 5 1,41 350 248 0 0 + 6 1,23 350 285 0 0 + ‘Enheder blev bestemt ved chromogen prøvning efter relipidering af vævsfaktorpro-tein-prøver.

TABEL 5

Funktionel homoloqi mellem okse- og human vævsfaktor

Absorbans Vævsaktivitet

Prøve Prøvningsfortynding 405 nm enh/ml BFTP + P1 500 0,785 800 BTFP + P1 1000 0,395 755 BTFP-P1 10 0,000 0 HTFP + P1 500 0,892 950 HTFP + P1 1000 0,491 910 HTFP-P1 10 0,000 0 TABEL 6 20 DK 175116 B1

Blodparametre i normale og hæmophile hunde efter bolusiniekion af vævsfaktorprotein

Dosis Prøvningstid ef-vævsfaktor ter protein infusion PT PTT Faktor V Blodplader

Hund (enh/kg) (min) (s) (s) (enh/ml (106/ml) N 50 Før 12 21 0,81 i.b.

67 12 22 0,96 i.b.

250 30 12 19 1,07 i.b.

60 12 16 1,22 i.b.

H1 50 Før 13 53 1,01 i.b.

150 13 54 1,03 i.b.

250 32 15 71 0,64 i.b.

H2 100 Før 13 51 1,24 205 15 13 51 1,23 169 57 13 51 1,17 223

Koagulationsprøvningens resultater efter bolusinjektion af vævsfaktorprotein i normale og hæmophile hunde.

N = normal hund H1 og H2 = hæmophile hunde i.b. = ikke bestemt

Claims (8)

1. Vævsfaktorprotein-antagonist til farmaceutisk anvendelse.

2. Vævsfaktorprotein-antagonist ifølge krav 1,kendetegnet ved, at den er et antistof.

3. Anvendelse af en vævsfaktorprotein-antagonist til fremstilling af et lægemid del til behandling af et dyr, fortrinsvist et menneske med en hyperkoagulativ blødningsforstyrrelse.

4. Terapeutisk doseringsform til indgivelse på et dyr, fortrinsvist et menneske med en blødningsforstyrrelse karakteriseret ved en hyperkoagulativ tilstand, k e 10 ndetegnet ved, at den omfatter en vævsfaktorprotein-antagonist og et farmaceutisk acceptabelt medium.

5. Anvendelse af en vævsfaktorprotein-antagonist til fremstilling af et lægemiddel til behandling af et dyr, fortrinsvist et menneske med dissemineret intra-vasculær koagulation (DIC).

6. Terapeutisk doseringsform til indgivelse på et dyr, fortrinsvist et mennske med DIC, kendeteg net ved, at den omfatter en vævsfaktorprotein-antagonist og et farmaceutisk acceptabelt medium.

7. Anvendelse ifølge krav 3 eller 5, kendetegnet ved, at vævsfaktorpro-tein-antagonisten er et antistof.

8. Terapeutisk doseringsform ifølge krav 4 eller 6, kendetegnet ved, at vævsfaktorprotein-antagonisten er et antistof.