CN103406101B - 一种染料亲和磁性微球的制备及用于乳清中乳铁蛋白分离的应用 - Google Patents

一种染料亲和磁性微球的制备及用于乳清中乳铁蛋白分离的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种染料亲和磁性微球的制备方法及其采用该染料亲和磁性微球分离乳清中乳铁蛋白的应用，本发明在磁性Fe3O4纳米粒子的表面制备了具有分离功能的染料亲和吸附剂，包括磁性壳聚糖微球的制备和活性红120染料功能化，在Fe3O4纳米粒子表面功能化后得到的亲和吸附剂对乳清中的乳铁蛋白具有分离性能，且该染料亲和磁性微球可以重复使用。

Description

一种染料亲和磁性微球的制备及用于乳清中乳铁蛋白分离的应用
技术领域
本发明属于食品分离技术领域，涉及乳清中乳铁蛋白的分离，特别是一种染料亲和磁性微球的制备及其用于乳清中乳铁蛋白分离的应用。
背景技术
乳铁蛋白（Lactoferrin，Lf）是一种天然活性糖蛋白，具有广谱抗菌、抗病毒、调节机体免疫力等多种生物学功能。由于婴幼儿的免疫系统发育不成熟，致使他们的抗感染能力比儿童和成人弱，易出现肠道问题而影响营养摄入，进而影响生长发育。将Lf添加到婴幼儿配方奶粉中可以帮助婴幼儿抵抗大肠杆菌等微生物，降低腹泻的发生率。Lf作为婴儿奶粉的重要配料成份，市场需求量巨大，但纯度高的Lf价格昂贵，其主要原因是乳铁蛋白的分离、纯化方法有待进一步完善。传统的乳铁蛋白分离方法主要包括色谱法、微滤/超滤法、盐析沉淀法，等。色谱法虽然能得到纯度较高的Lf，但其操作过程复杂，成本较高；微滤/超滤操作简单，适合大批量生产，但产品纯度较低；盐析沉淀法较为简单，但产品纯度不高，且会影响Lf的活性。因此，开发一种操作简单、价格低廉、产品纯度较高的Lf分离方法是乳铁蛋白分离、纯化的重要研究问题之一。
基于磁性纳米粒子的分离技术是一种新兴的分离技术，具有操作简单，分离快速，不需要昂贵仪器等优点，已成为当前分离、纯化领域的研究热点之一。
发明内容
本发明的目的在于，利用磁性纳米粒子进行Lf的分离，主要涉及磁性纳米粒子的表面修饰和表面功能化，从而构建一种染料亲和磁性微球；并采用该染料亲和磁性微球分离乳清中的乳铁蛋白，以获得一种分离快速、操作简便、产品纯度高的乳铁蛋白分离方法。
为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：
一种染料亲和磁性微球的制备方法，其特征在于，具体按如下步骤进行：
步骤一，磁性纳米材料（磁核）制备：
A）利用化学共沉淀法制备Fe3O4纳米粒子，各试剂的质量比配方为：FeCl3·6H2O：FeCl2·4H2O：H2O=2.3751：0.8735：250；
B）称取FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O，溶解于去离子水中，于500rpm搅拌速率下搅拌至透明；
C）通入氮气（N2）10～15min以排除空气；
D）滴加氨水调节溶液pH>10，搅拌10min，80℃水浴保温30min，得到沉淀物；
E）将沉淀物分别用乙醇和去离子水洗涤3次，得到Fe3O4纳米粒子。
步骤二，磁核表面壳聚糖修饰（磁性壳聚糖微球）：
A）将步骤一制备的Fe3O4纳米粒子1g加入盛有200mL石蜡和10mLSpan–80的烧杯中，搅拌均匀；
B）称取1.5g壳聚糖，溶解于50mL质量浓度为5%的醋酸水溶液中；
C）将两种液体混合，并于800rpm的搅拌速率下搅拌30min；
D）加入2.5mL25%戊二醛，并于800rpm继续搅拌30min；
E）加入2.5mL25%戊二醛，并于800rpm再搅拌2h，60℃水浴中保温2h；
F）去除上清液后的沉淀物用石油醚、丙酮、无水乙醇洗涤，在40℃烘箱中干燥24h，即得磁性壳聚糖微球。
步骤三，磁性壳聚糖微球的表面功能化（染料亲和磁性微球）：
A）取步骤二得到的磁性壳聚糖微球2g，加入到200mL浓度为2mg/mL的活性红120溶液中，60℃水浴搅拌30min；
B）加入10mL浓度3.4mol/L的NaCl溶液，继续搅拌30min；
C）加入4mL浓度2.4mol/L的Na2CO3溶液，在80℃反应4h；
D）反应结束后，将得到的磁性壳聚糖微球分别用50～60℃的温水、甲醇、2mol/L的NaCl，6mol/L的尿素和蒸馏水洗涤，即得活性红120功能化了的磁性亲和微球。
得到的活性红120功能化了的磁性亲和微球可用于乳清中乳铁蛋白的分离应用，根据申请人的试验表明，所得的乳铁蛋白的纯度可达90%以上。
附图说明
图1是磁性亲和微球的形貌和粒径分布，其中（a）是磁性微球形貌，（b）是粒径分布。
图2是磁性亲和微球分离乳清中乳铁蛋白各成分的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。泳道1：蛋白质分子量标准；泳道2：原乳清；泳道3：吸附后的上清液；泳道4：Lf标品；泳道5：浓缩的洗脱样。
以下结合附图和发明人给出的实施例对本发明作进一步的详细说明。
具体实施方式
需要说明的是，以下的实施例只是较佳的例子，本发明并不限于这些实施例，对于本领域的技术人员来说，在本发明给出的范畴内进行技术特征的添加和替换，均属于本发明的保护范围。
本实施例给出一种染料亲和磁性微球的制备方法，在磁性纳米材料的表面先修饰壳聚糖，再连接活性红120染料对其表面进行功能化，即得到了染料亲和磁性微球，具体按如下步骤进行：
步骤一，磁性纳米材料（磁核）制备：
A）利用化学共沉淀法制备Fe3O4纳米粒子。各试剂的质量比配方为：FeCl3·6H2O：FeCl2·4H2O：H2O=2.3751：0.8735：250；
B）称取FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O，溶解于去离子水中，于500rpm搅拌速率下搅拌至透明；
C）通入氮气（N2）10～15min以排除空气；
D）滴加氨水调节溶液pH>10，搅拌10min，80℃水浴保温30min，得到沉淀物；
E）将沉淀物分别用乙醇和去离子水洗涤3次，得到Fe3O4纳米粒子。
步骤二，磁核表面壳聚糖修饰（磁性壳聚糖微球）：
A）将步骤一制备的Fe3O4纳米粒子1g加入盛有200mL石蜡和10mLSpan–80的烧杯中，搅拌均匀；
B）称取1.5g壳聚糖，溶解于50mL质量浓度为5%的醋酸水溶液中；
C）将两种液体混合，并于800rpm的搅拌速率下搅拌30min；
D）加入2.5mL25%戊二醛，并于800rpm继续搅拌30min；
E）加入2.5mL25%戊二醛，并于800rpm再搅拌2h，60℃水浴中保温2h；
F）去除上清液后的沉淀物用石油醚、丙酮、无水乙醇洗涤，在40℃烘箱中干燥24h，即得磁性壳聚糖微球。
步骤三，磁性壳聚糖微球的表面功能化（染料亲和磁性微球）：
A）取步骤二得到的磁性壳聚糖微球2g，加入到200mL浓度为2mg/mL的活性红120溶液中，60℃水浴搅拌30min；
B）加入10mL浓度3.4mol/L的NaCl溶液，继续搅拌30min；
C）加入4mL浓度2.4mol/L的Na2CO3溶液，在80℃反应4h；
D）反应结束后，将得到的磁性壳聚糖微球分别用50～60℃的温水、甲醇、2mol/L的NaCl，6mol/L的尿素和蒸馏水洗涤，即得活性红120功能化了的磁性亲和微球。
活性红120功能化了的磁性亲和微球的形貌和粒径分布如图1所示。
将制得的活性红120功能化了的磁性亲和微球，按100mg磁性亲和微球：30mL乳清的比例加入乳清中；在200r/min摇床上震荡1h，进行Lf吸附操作，于4℃、10000r/min离心15min，去上清液，收集表面吸附有乳铁蛋白的磁性亲和微球；用0.02mol/L、pH7.0的磷酸缓冲液洗涤3次；加入1mol/L NaCl（pH7.0）于200r/min摇床上振荡0.5h，进行洗脱操作；用永磁铁收集磁性亲和微球；洗脱液即为经过磁性亲和微球分离所得的乳铁蛋白溶液；永磁铁收集的磁性亲和微球仍然具有吸附性能，可重复使用。
洗脱液用质量分数为12%的分离胶和质量分数为4%的浓缩胶进行聚丙烯酰胺凝胶电泳实验，分析获得的Lf的纯度。电泳结果表明，由活性红120功能化了的磁性亲和微球分离所得的乳铁蛋白的纯度可达90%以上，如图2所示。

Claims (2)

1.染料亲和磁性微球用于乳清中的乳铁蛋白分离应用，所述染料亲和磁性微球的制备方法按如下步骤进行：
步骤一，磁核材料制备：
A)利用化学共沉淀法制备Fe3O4纳米粒子，各试剂的质量比配方为：FeCl3·6H2O：FeCl2·4H2O：H2O＝2.3751：0.8735：250；
B)称取FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O，溶解于去离子水中，于500rpm搅拌速率下搅拌至透明；
C)通入氮气(N2)10～15min以排除空气；
D)滴加氨水调pH>10，搅拌10min，80℃水浴保温30min，得到沉淀物；
E)将沉淀物分别用乙醇和去离子水洗涤3次，得到Fe3O4纳米粒子；
步骤二，磁核表面壳聚糖修饰：
A)将步骤一制备的Fe3O4纳米粒子1g加入盛有200mL石蜡和10mLSpan–80的烧杯中，搅拌均匀；
B)称取1.5g壳聚糖，溶解于50mL质量浓度为5％的醋酸水溶液中；
C)将两种液体混合，并于800rpm的搅拌速率下搅拌30min；
D)加入2.5mL25％戊二醛，并于800rpm继续搅拌30min；
E)加入2.5mL25％戊二醛，并于800rpm再搅拌2h，60℃水浴中保温2h；
F)去除上清液后的沉淀物用石油醚、丙酮、无水乙醇清洗，在40℃烘箱中干燥24h，即得磁性壳聚糖微球，
步骤三，磁性壳聚糖微球的表面功能化：
A)取步骤二得到的磁性壳聚糖微球2g，加入到200mL浓度为2mg/mL的活性红120溶液中，60℃水浴搅拌30min；
B)加入10mL浓度3.4mol/L的NaCl溶液，继续搅拌30min；
C)加入4mL浓度2.4mol/L的Na2CO3溶液，在80℃反应4h；
D)反应结束后，将得到的磁性壳聚糖微球分别用50℃～60℃的温水、甲醇、2mol/L的NaCl，6mol/L的尿素和蒸馏水洗涤，即得活性红120功能化了的磁性亲和微球。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，按照以下步骤操作：
将活性红120功能化了的磁性亲和微球，按100mg磁性亲和微球：30mL乳清的比例加入乳清中；在200r/min摇床上震荡1h，进行乳铁蛋白吸附操作，于4℃、10000r/min离心15min，去上清液，收集表面吸附有乳铁蛋白的磁性亲和微球；用0.02mol/L、pH7.0的磷酸缓冲液洗涤3次；加入pH7.0的1mol/L NaCl于200r/min摇床上振荡0.5h，进行洗脱操作；用永磁铁收集磁性亲和微球；洗脱液即为经过磁性亲和微球分离所得的乳铁蛋白溶液；
洗脱液用质量分数为12％的分离胶和质量分数为4％的浓缩胶进行聚丙烯酰胺凝胶电泳实验，分析获得的乳铁蛋白的纯度。
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