CN103405467B - 茶氨酸、茶多糖和甜刺茶提取物作为醛糖还原酶抑制剂的应用 - Google Patents
茶氨酸、茶多糖和甜刺茶提取物作为醛糖还原酶抑制剂的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了茶氨酸、茶多糖和甜刺茶提取物作为醛糖还原酶抑制剂的医药用途。所述茶多糖是以甜刺茶为原料通过水提取、分离后得到的产物。所述甜刺茶提取物的主要成分和成分含量为：茶多酚45%-55%，茶多糖5%-8%，茶氨酸19%-30%，咖啡因9%-11%，且茶多酚、茶多糖、茶氨酸和咖啡因的总质量百分含量小于99%，其余为杂质。
Description
技术领域
本发明属于一种蔷薇科悬钩子属植物甜刺茶提取物领域，茶氨酸、茶多糖和甜刺茶提取物作为醛糖还原酶抑制剂的医药用途。
背景技术
大量的临床证据表明，糖尿病并发症的发病与体内多元醇途径的激活即醛糖还原酶（aldose reductase,AR）的活性增强具有明显的相关关系。转基因和基因敲除动物实验也一致表明，醛糖还原酶基因的表达与否决定着糖尿病并发症的发病。醛糖还原酶是多元醇途径上的第一个酶也是关键限速酶，在辅酶NADPH的参与下催化还原反应，将葡萄糖转化为山梨醇，而山梨醇在山梨醇脱氢酶的催化下氧化为果糖。当血糖正常时，葡萄糖主要在己糖激酶催化下通过糖酵解途径代谢，相对于己糖激酶而言，醛糖还原酶对葡萄糖的催化活性很弱（Km=90mM)。在高血糖状态下，己糖激酶达到饱和，过剩的葡萄糖将激活醛糖还原酶而激活多元醇代谢途径。多元醇代谢途径中葡萄糖的转化产物山梨醇具有较高极性，不易穿过生物膜扩散而蓄积在组织中，结果导致组织肿胀损伤。被激活的多元醇途径又累积过量的氧化型辅酶，形成氧化应激反应而产生活性氧，继而活化蛋白激酶C等一系列下游生化过程和炎症反应，引发糖尿病并发症的发生。同时，多元醇途径的代谢产物果糖，比葡萄糖更易与蛋白质发生非酶糖基化作用，产生糖基化终末产物而诱发糖尿病并发症。
由于醛糖还原酶活性的异常增强与糖尿病并发症相关关系的明确确立，能够抑制多元醇途径的醛糖还原酶抑制剂也成为糖尿病并发症药物开发所关注的焦点。很多临床实验证明了醛糖还原酶抑制剂对于糖尿病并发症具有防治作用。醛糖还原酶抑制剂的开发始于20世纪60年代，到目前已开发了数量众多的醛糖还原酶抑制剂，目前最为关注的抑制剂主要有四大类：第一类是羧酸类衍生物。最早的醛糖还原酶抑制剂四亚甲基戊二酸即属于这一类化合物,也因此开启了醛糖还原酶抑制剂研究的先河。此类代表性化合物有epalrestat、ponalrestat、tolrestat和zopolrestat。目前醛糖还原酶抑制剂上市药物依帕司他（epalrestat，1992年在日本上市）和托瑞司他（tolrestat，由Wyeth－Ayerst公司1989年首先在爱尔兰上市）都属于这一类化合物。第二类是环状酰亚胺衍生物，主要为海因类及其类似物，经典化合物为sorbinil、minalrestat、ranirestat和fidarestat；第三类是磺酰类化合物，这是一类非羧酸、非海因类化合物，总体数量并不多，但似乎能够克服海因类的毒性副作用和羧酸类的药动学弱点。第四类是黄酮及类黄酮化合物。
糖尿病血管并发症发病机制复杂，自1966年发现多元醇通路及其活性增强在糖尿病周围神经病变发病中的作用，首次揭示了糖尿病血管并发症的分子机制，其后人们对糖尿病血管并发症的认识逐渐深入，指导着糖尿病血管并发症药物的开发。目前糖尿病血管并发症药物研究的主要思路，是以代谢机制中关键代谢过程的调节为目标，改善导致血管并发症发生发展的病理生理过程。醛糖还原酶抑制剂是热点研究的一个方向。黄酮化合物作为经典的醛糖还原酶抑制剂，已经有大量的研究基础。自20世纪70年代中期以来，相当数量的黄酮及类黄酮化合物如槲皮素、芹菜素、木犀草素、金雀异黄酮等被发现具有醛糖还原酶抑制活性。
甜刺茶(RubusSuavissmusS，Lee，)，一种蔷薇科悬钩子属多年生有刺灌木，是广西、湖南、贵州交界山区特有的野生甜味植物，叶可入茶入药，当地人有用它煮粽子、煮茶粥的传统，又因为它植株带刺儿，当地人形象地称它为“刺儿茶”。据技术监督部门出示的测试报告表明：甜刺茶含有丰富的茶氨酸、茶多糖、茶多酚、维生素及微量元素。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提供茶氨酸、茶多糖和甜刺茶提取物作为醛糖还原酶抑制剂的医药用途。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：
本发明的技术方案之一：茶氨酸在作为醛糖还原酶抑制剂方面的应用。
本发明的技术方案之二：茶多糖在作为醛糖还原酶抑制剂方面的应用。
所述茶多糖是优选以甜刺茶为原料通过水提取、分离后得到的产物。
所述茶多糖的提取方法优选为：将甜刺茶粉碎，加入相对于甜刺茶的质量为8-12倍的水，在60℃-80℃下浸泡提取2-3次，每次30-60分钟，将水提液进行浓缩，浓缩液用90%-95%的乙醇沉淀，其中乙醇的用量为浓缩液质量的2-3倍，离心得沉淀物a，沉淀物a加水制成水溶液，再用无水乙醇沉淀，离心得沉淀物b，将沉淀物b干燥，得到茶多糖。
本发明的技术方案之三：甜刺茶提取物在作为醛糖还原酶抑制剂方面的应用，所述甜刺茶提取物的主要成分和成分含量为：茶多酚45%-55%，茶多糖5%-8%，茶氨酸19%-30%，咖啡因9%-11%，且茶多酚、茶多糖、茶氨酸和咖啡因的总质量百分含量小于99%，其余为杂质。
所述甜刺茶提取物的制备方法优选为：将甜刺茶粉碎，加入相对于甜刺茶的质量为8-12倍的水，在75℃-85℃下浸泡提取1-3次，每次30-60分钟，过滤，合并滤液，蒸发，干燥，得甜刺茶提取物。
下面对本发明做进一步的解释和说明：
本发明公开了甜刺茶提取物的制备方法，甜刺茶提取物以及甜刺茶水提物的主要成分之一茶氨酸和茶多糖，对于醛糖还原酶的抑制作用。
1、甜刺茶提取物的制备方法为：选用当年采收的大舜皇甜刺茶干茶叶，将甜刺茶干茶叶样品粉碎并称取50g于烧杯中，加入80℃蒸馏水500ml（茶水比1：10），80℃保温浸泡45分钟，过滤；茶叶滤渣再加80℃蒸馏水500ml保温浸泡45分钟，过滤。将过滤茶汤混合后以旋转蒸发仪在50℃旋干，真空干燥，即得甜刺茶提取物。
2、醛糖还原酶抑制实验方法及结果如下：
我们通过匀浆、离心、不同浓度硫酸胺溶液梯度沉淀、透析等方法从牛晶状体中提取醛糖还原酶粗酶。以DL-甘油醛为底物、还原型辅酶Ⅱ（NADPH）为辅酶，37℃，340nm处连续记录10分钟反应体系吸光度的变化，计算不同浓度甜刺茶水提取物对醛糖还原酶的抑制活力。然后以抑制率对抑制剂浓度的对数作图，于50%抑制率处得到半数抑制率浓度IC50。结果表明，甜刺茶水提取物具有较强的体外抑制醛糖还原酶作用，量效关系明显。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1：甜刺茶提取物在作为醛糖还原酶抑制剂方面的应用
1、甜刺茶提取物的制备方法为：选用当年采收的大舜皇甜刺茶干茶叶，将甜刺茶干茶叶样品粉碎并称取50g于烧杯中，加入80℃蒸馏水500ml（茶水比1：10），80℃保温浸泡45分钟，过滤；茶叶滤渣再加80℃蒸馏水500ml保温浸泡45分钟，过滤。将过滤茶汤混合后以旋转蒸发仪在50℃旋干，真空干燥，即得甜刺茶提取物。其提取率为22.34±1.96%，结果见表1。用酒石酸亚铁比色法测量茶多酚含量，茚三酮显色法测茶氨酸含量，蒽酮-硫酸法测茶多糖含量，邻苯二胺法测咖啡因含量，结果见表2。
表1甜刺茶水提取物的提取率
表2甜刺茶水提取物功效成分含量
2.醛糖还原酶(AR)的提取：取牛晶状体1个，剪碎，用5mmol／L，pH=7．4的PBS溶解，电动匀浆；以15000rpm/min离心15min；取上清，加入40％硫酸铵溶液，间歇搅拌30min；再15000rpm/min离心15min；取上清，加入75％硫酸铵溶液，间歇搅拌30min再10000rpm／min离心15min。用PBS溶解沉淀，用10倍体积的5mmol／L，pH=7．4的PBS透析液透析，每4h换1次透析液，透析24小时。以上操作均需在4℃下进行。透析后的提取物即醛糖还原酶粗酶，-70℃冻存备用。
3.醛糖还原酶(AR)活性的测定：酶促反应体系：总体积为200μl，各反应液的终浓度分别为：底物DL-甘油醛2mmol／L，还原型辅酶ⅡNADPH0.2mmol／L，硫酸锂为400mmol/L，β-巯基乙醇为5mmol/L，pH=6.2的PBS（磷酸缓冲液）缓冲液，加入40μl醛糖还原酶粗酶。反应温度为37℃，反应时间为10min，于340nm测定吸光度值(OD)。
酶活性单位定义：37℃时每分钟使反应体系吸光度值变化0.001为一个酶活性单位。
公式为：酶活性单位=ΔAOD×1000：
AR抑制率（%）=[1-（ΔA样品-ΔA空白）/（ΔA对照-ΔA空白）]×100%
表3反应体系成分表：
各组分加入的顺序即按照以上表格从上到下的顺序。
实验结果见表4，从表4的结果可以得出，甜刺茶水提取物具有体外醛糖还原酶抑制活性，且其体外醛糖还原酶抑制活性具有浓度依赖性，其半数抑制浓度为27.30±2.83mg/L。
表4不同浓度甜刺茶水提取物体外醛糖还原酶抑制活性
实施例2：茶氨酸在作为醛糖还原酶抑制剂方面的应用
采用茶氨酸为原料（所述茶氨酸购自阿拉丁试剂（上海）有限公司，高纯级，纯度为99%。），加水配制成不同浓度的茶氨酸溶液，按照实施例1所述的方法测定不同浓度茶氨酸对醛糖还原酶的抑制活力，实验结果见表5，从表5的结果可以得出，茶氨酸具有体外醛糖还原酶抑制活性，且其体外醛糖还原酶抑制活性具有浓度依赖性，其半数抑制浓度为101.00±11.21mg/L。
表5不同浓度茶氨酸体外醛糖还原酶抑制活性
实施例3：茶多糖在作为醛糖还原酶抑制剂方面的应用
采用茶多糖为原料（购自上海蓝平实业有限公司，医药级纯度99%），加水配制成不同浓度的茶氨酸溶液，按照实施例1所述的方法测定不同浓度甜刺茶水提取物对醛糖还原酶的抑制活力，结果见表6所示：从表6的结果可以得出，茶多糖具有体外醛糖还原酶抑制活性，且其体外醛糖还原酶抑制活性具有浓度依赖性，其半数抑制浓度为60.37±9.90mg/L。
表6不同浓度茶多糖体外醛糖还原酶抑制活性
从甜刺茶中提取的茶多糖：将甜刺茶粉碎，加入相对于甜刺茶的质量为10倍的水，在75℃下浸泡提取2次，每次30-40分钟，将水提液进行浓缩。浓缩液用95%乙醇沉淀（浓缩液：95%乙醇=1:2），离心(4000r／min，10min)得沉淀物a，沉淀物a加水制成水溶液，再用无水乙醇沉淀，离心得沉淀物b，将沉淀物b干燥，得到茶多糖。
采用从甜刺茶中提取的茶多糖为原料，加水配制成不同浓度的茶氨酸溶液，按照实施例1所述的方法测定不同浓度甜刺茶水提取物对醛糖还原酶的抑制活力，实验结果见表7，从表7的结果可以得出，甜刺茶提取的茶多糖具有体外醛糖还原酶抑制活性，且其体外醛糖还原酶抑制活性具有浓度依赖性，其半数抑制浓度为56.41±1.58mg/L。
表7不同浓度甜刺茶提取的茶多糖体外醛糖还原酶抑制活性
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1.茶氨酸作为唯一活性成分在制备醛糖还原酶抑制剂药物中的应用。
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