CN105037569B

CN105037569B - 一种甜叶悬钩子水溶性多糖用于保护肝脏及激活乙醛脱氢酶的应用

Info

Publication number: CN105037569B
Application number: CN201510268270.5A
Authority: CN
Inventors: 邹晓青; 冯小婕; 彭圣明
Original assignee: Xiangtan University
Current assignee: Xiangtan University
Priority date: 2015-05-19
Filing date: 2015-05-19
Publication date: 2017-11-03
Anticipated expiration: 2035-05-19
Also published as: CN105037569A

Abstract

本发明提供了一种从蔷薇科悬钩子属植物甜叶悬钩子提取的水溶性多糖用于保护肝脏及激活乙醛脱氢酶的应用。

Description

一种甜叶悬钩子水溶性多糖用于保护肝脏及激活乙醛脱氢酶的应用

技术领域

一种从蔷薇科悬钩子属植物甜叶悬钩子提取的水溶性多糖用于保护肝脏及激活乙醛脱氢酶的应用，属于医药用途。

背景技术

乙醛脱氢酶(acetaldehyde dehydrogenase，ALDH)(EC1.2.1.10)(CAS[9028-91-5])，作为醛脱氢酶的一种，负责催化乙醛氧化为乙酸的反应。在酒精代谢中起主要作用，广泛存在于各种动物、植物和微生物体内。哺乳动物乙醛脱氢酶根据其亚细胞定位、结构及动力学特性和原始序列的相似性可以分为三类：第一类存在于细胞质中(ALDH1)，第二类存在于线粒体中(ALDH2)，第三类则是可诱导性的细胞质的乙醛脱氢酶和可诱导性的微粒体的乙醛脱氢酶(如ALDH3)。乙醛脱氢酶2(ALDH2)是存在于线粒体内的广泛参与体内醛类物质氧化的一种醛类氧化酶，ALDH2基因位于第12号染色体，它的主要多态性位于外显子12的G1510A，正常的等位基因记为ALDH2*1，单碱基突变的等位基因记为ALDH2*2。突变基因表达的酶中，残基487的谷氨酸变为赖氨酸，造成酶的催化活性基本丧失。有ALDH2*2突变表达出的酶无法正常代谢乙醇的氧化产物乙醛，血液乙醛浓度增高，造成一系列饮酒后的不良反应，如脸红、头晕、心跳加快等。而纯合子的ALDH22*2活性近乎为零。由于ALDH2*2携带者对乙醛代谢较差，有认为乙醛对肝脏的损伤是酒精肝在亚洲人群中常见的原因。有研究表明，ALDH2突变型患者阿尔茨海默病的发病率更高，ALDH2的失活导致乙醛的蓄积与乙醇性多发性神经病变有关，ALDH2可减轻神经细胞的氧化应激损伤，对神经保护具有重要的意义，激活ALDH2将为神经退行性变疾病的治疗提供靶点。同时又研究提出，ALDH2基因参与了冠状动脉粥样硬化性心脏病(CHD)的发生发展过程，在缺氧心肌中ALDH2基因下调，ALDH2对氧化刺激导致的神经细胞、内皮细胞损伤有明显的拮抗作用，而ALDH2基因G487A多态性有可能成为老年CHD发生的独立危险因素。

酒精性肝病是由于长期大量饮酒导致的肝脏疾病。初期通常表现为脂肪肝，进而可发展成酒精性肝炎、肝纤维化和肝硬化。其主要临床特征是恶心、呕吐、黄疸、可有肝脏肿大和压痛。并可并发肝功能衰竭和上消化道出血等。严重酗酒时可诱发广泛肝细胞坏死，甚至肝功能衰竭。酒精性肝病是我国常见的肝脏疾病之一，严重危害人民健康。

酒精性肝病主要是乙醇及其代谢产物乙醛直接或间接诱导的炎症反应，氧化应激、肠源性内毒素、炎性介质和营养失衡(尤其是蛋白质-热量营养不良)等多种因素相互作用的结果。另外，“二次打击”学说认为，酒精因素作为初次打击，通过氧化应激促使反应性氧化物增加，而诱发肝脏脂肪聚集。在氧化应激相关的脂质过氧化及炎性细胞因子的作用下，使脂肪变的肝细胞发生第二次打击，造成炎症、坏死和纤维化。乙醛是肝细胞内乙醇代谢的主要产物，其药理毒性比乙醇更为剧烈。乙醛可通过多种途径作用于肝组织，首先，乙醛可直接作用于肝组织，对肝脏产生毒性作用。其次，乙醛还可损伤大多数肝细胞的线粒体和微管，进而引起脂肪酸氧化和肝细胞分泌功能障碍，导致肝细胞内脂肪酸蓄积和分泌性蛋白贮留。大量研究已经显示乙醛在活体生理状态下能与多种蛋白发生共价结合，形成稳定的和不稳定的乙醛蛋白加和物(APA)。其形成不但改变了蛋白质的结构，而且造成了蛋白质功能异常，如蛋白酶失活、DNA修复蛋白功能障碍、谷胱甘肽耗竭、线粒体损伤、氧利用障碍和胶原蛋白合成增加。而且可作为抗原诱生免疫反应，产生相应抗体，引起肝细胞炎症、坏死及纤维组织增生。

甜叶悬钩子是蔷薇科悬钩子属的一个变种，属于多年生有刺灌木，主要生长于我国广西省的山区，由于其叶味道甘甜，口感独特，故又称广西甜茶，是广西特有的无毒、低热量、高甜度的野外珍稀天然植物。在民间有悠久的应用历史，长期以来当地百姓一直以其叶当茶饮用，也用来代糖加工食品。根据广西中药药物标准记载，甜叶悬钩子具有清热降火、润肺生津、止咳祛痰的功效。其食用性以及药用性早已为当地民间医药所证实。但是直至上世纪80年代的全国药物调查中发现，虽然悬钩子植物在我国各地均有分布，但都不具备广西甜叶悬钩子这种甜味，因此该植物被植物学家李树刚确定为悬钩子的变种，与其它悬钩子区分来。自上世纪80年代发现该物种以来，我国逐步展开了对甜叶悬钩子的研究，在其食用和药用等方面获得了一定的进展。研究表明，甜叶悬钩子叶片中含有丰富的必需氨基酸、黄酮昔、甜叶悬钩子苷、多酚、维生素以及人体所必需的多种微量元素；甜叶悬钩子粗提物具有降糖、降脂、抗炎、抗过敏、改善皮肤瘙痒等多种药理活性。

多糖是一类具有广泛生物活性的天然大分子化合物，广泛分布于自然界高等植物、藻类、微生物(细菌和真菌)及动物体内。多糖类物质是除蛋白质和核酸之外的又一类重要的生物大分子，是很多植物药发挥药效的物质基础，植物多糖具有复杂的、多方面的生物活性和功能，如免疫调节功能、抗感染、抗辐射、抗凝血、降血糖、降血脂、促进核酸与蛋白质的生物合成以及抗衰老等作用。如甘草多糖具有明显的抗病毒和抗肿瘤作用；黑木耳多糖、银杏外种皮多糖和芦荟多糖可抗肿瘤和增强人体免疫功能；柴胡多糖具有抗辐射、增强免疫功能等生物学作用；麦冬多糖具有降血糖及免疫增强作用；爬山虎多糖具有抗病毒和抗衰老作用；石斛多糖、牡蛎多糖、玉郎伞多糖等植物多糖具有保护急性酒精性肝损伤的作用，且石斛多糖、玉郎伞多糖可增加肝组织ALDH活性，加速乙醛代谢。目前已有部分天然多糖类化合物用于临床，显示出良好的疗效，已然成为天然药物及保健品研发中的重要部分。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：从蔷薇科悬钩子属植物甜叶悬钩子提取的水溶性多糖用于保护肝脏及激活乙醛脱氢酶。

本发明的技术方案是：

1.从蔷薇科悬钩子属植物甜叶悬钩子提取水溶性多糖

将甜叶悬钩子干叶粉碎后，用体积百分数为80％-85％的乙醇水溶液在60-80℃浸泡80-100min，抽滤，弃滤液，茶渣用去离子水在50-70℃保温浸取两次，每次90-150min，冷却后抽滤，合并两次滤液，加入相当于浓缩物三倍体积的无水乙醇，4℃静置过夜沉淀，离心分离，得到沉淀物a，称重，用丙酮、乙醚、乙醇交替洗涤3次，加去离子水溶解，加入相当于沉淀物a质量的2％-3％的三氯乙酸，于4℃静置90-150min，离心分离，取上清滤液置于蒸馏水中透析20-30h，每隔8h换一次透析液，透析后的溶液冷冻干燥，即得到甜叶悬钩子水溶性多糖。

2.从蔷薇科悬钩子属植物甜叶悬钩子提取的水溶性多糖的结构特征的检测

(1)总糖含量、糖醛酸含量、蛋白质含量

采用苯酚-硫酸法测定蔷薇科悬钩子属植物甜叶悬钩子提取水溶性多糖、草酸盐溶果胶类多糖、碱溶性多糖的总糖含量，采用间羟基联苯比色法测定其糖醛酸含量，采用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量，其结果见实施例表1。

(2)单糖组成

采用气相色谱测定蔷薇科悬钩子属植物甜叶悬钩子提取水溶性多糖、草酸盐溶果胶类多糖、碱溶性多糖单糖组成，结果显示，甜叶悬钩子提取水溶性多糖主要由核糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖5种单糖组成，其摩尔比为0.146∶0.403∶17.745∶1.436∶0.382。

(3)红外光谱

甜叶悬钩子提取水溶性多糖中较大的吸收峰有3409.92cm^-1、1648.13cm^-1、1410.84cm^-1、1237.84cm^-1、1098.03cm^-1、875.06cm^-1，如实施例图1所示。3409.92cm^-1附近出现强吸收峰是由于糖类的O-H和蛋白质N-H伸缩振动引起的，存在分子内氢键；在3000-2800cm^-1之间存在小的吸收峰，是糖类C-H伸缩振动(-CH2-)引起的吸收峰；1648.13cm^-1附近的吸收峰属于酰胺I带吸收峰；1410.84cm^-1附近的吸收峰是由C-C-H或H-C-O产生的，而在1237.84cm^-1处的吸收峰也是由该基团中的C-O产生的，1098.03cm^-1附近为糖醛酸的特征吸收峰；在875.06cm^-1处的特征吸收峰，是β-D-吡喃糖C-H的变角振动所引起的，表明该组分含有β-D-吡喃葡萄糖环，分子以β-糖苷键连接，650-450cm^-1处出现吸收峰表明甜叶悬钩子提取水溶性多糖中含有酰氨基，由红外光谱图可以推断甜叶悬钩子提取水溶性多糖是β-D-吡喃环蛋白多糖。

(4)平均分子量及分子量分布

通过高效凝胶渗透色谱法测定从蔷薇科悬钩子属植物甜叶悬钩子提取的水溶性多糖、草酸盐溶果胶类多糖、碱溶性多糖的分子量，结果如实施例图2以及表2所示；从蔷薇科悬钩子属植物甜叶悬钩子提取的水溶性多糖重均分子量Mw为8.29^E+04，数均分子量Mn为3.29^E+03，质均分子量Mz为1.80^E+06，Mw/Mn为25.23。

3.从蔷薇科悬钩子属植物甜叶悬钩子提取的水溶性多糖用于保护肝脏及激活乙醛脱氢酶(ALDH)的应用

(1)小鼠急性酒精性肝损伤模型的建立及实验分组：雄性昆明小鼠120只，购自长沙市天勤生物技术有限公司，合格证号：SCXK(湘)2009-0012，实验动物分为空白对照组，急性酒精性肝损伤模型对照组，甜叶悬钩子水溶性多糖高、中、低剂量组，阳性药物水飞蓟宾组；通过一次性给予雄性昆明小鼠6.4g/kg.bw酒精(67％，v/v，12mL/kg.bw)成功复制了急性酒精性肝损伤小鼠模型，1)空白对照组：按每千克体重灌胃10mL蒸馏水，2h后按照每千克体重灌胃12mL蒸馏水；2)急性酒精性肝损伤模型对照组：按每千克体重灌胃10mL蒸馏水，2h后灌胃6.4g/kg.bw酒精；3)阳性药物水飞蓟宾组：按每千克体重灌胃50mg/kg.bw水飞蓟宾溶液，2h后灌胃6.4g/kg.bw酒精；4)甜叶悬钩子水溶性多糖高、中、低剂量组：甜叶悬钩子水溶性多糖高、中、低剂量组分别按每千克体重灌胃甜叶悬钩子水溶性多糖100mg/kg.bw、50mg/kg.bw、25mg/kg.bw，2h后灌胃6.4g/kg.bw酒精；以上各组小鼠给予酒精或蒸馏水灌胃16h后，眼球取血制备血清，颈椎脱臼处死小鼠后迅速取出肝脏称重，并制备肝匀浆。

(2)乙醛脱氢酶及相关生化检测：取血清检测肝功能指标谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的水平，取肝匀浆检测肝脏乙醇脱氢酶(ADH)、乙醛脱氢酶(ALDH)、脂质过氧化终产物丙二醛(MDA)和还原型谷胱甘肽(GSH)的水平。

(3)统计学处理：数据以均数±标准差表示，用SPSS13.0统计学软件进行方差分析，组间比较采用最小显著差数法(LSD)，P≤0.05具有统计学意义。

(4)血清检测肝功能指标ALT和AST活性，结果如实施例表3所示，急性酒精性肝损伤模型对照组与正常对照组相比，其ALT和AST活性明显增高(P≤0.05)，说明灌胃6.4g/kg.bw酒精已经造成肝脏损伤，急性酒精性肝损伤模型成功。灌胃25mg/kg.bw、50mg/kg.bw、100mg/kg.bw甜叶悬钩子水溶性多糖以及50mg/kg.bw水飞蓟宾均显著降低酒精性肝损伤小鼠血清中ALT和AST活性(与急性酒精性肝损伤模型比较P≤0.05)，表现出肝脏保护作用，量效关系明显；肝匀浆氧化应激指标MDA和GSH结果如实施例表4所示，急性酒精性肝损伤模型对照组与正常对照组相比，脂质过氧化终产物MDA增高(P≤0.05)，抗氧化指标GSH降低(P≤0.05)，说明灌胃6.4g/kg.bw酒精已经造成肝脏氧化损伤，灌胃25mg/kg.bw、50mg/kg.bw、100mg/kg.bw甜叶悬钩子水溶性多糖以及50mg/kg.bw水飞蓟宾均显著降低酒精性肝损伤小鼠肝匀浆中脂质过氧化终产物MDA水平，并提高抗氧化指标GSH水平(与急性酒精性肝损伤模型比较P≤0.05)，表现出对肝脏氧化应激损伤的保护作用；肝匀浆检测肝脏ADH和ALDH活性，结果如实施例表5所示，灌胃25mg/kg.bw、50mg/kg.bw、100mg/kg.bw甜叶悬钩子水溶性多糖均显著提高了肝脏匀浆中ALDH活性(与急性酒精性肝损伤模型比较P≤0.05)，量效关系明显，表现出良好的激活乙醛脱氢酶的作用；灌胃50mg/kg.bw、100mg/kg.bw甜叶悬钩子水溶性多糖显著提高了肝脏匀浆中ADH活性(与急性酒精性肝损伤模型比较P≤0.05)，加速了乙醇及乙醇代谢产物乙醛的代谢；分析以上结果表明，甜叶悬钩子水溶性多糖同时从加速乙醇及其代谢产物乙醛代谢以及对肝脏氧化应激损伤的保护这两个方面，发挥对急性酒精性肝损伤的保护作用。

本发明的应用效果是：乙醛脱氢酶是神经退行性疾病、心血管疾病、肿瘤以及酒精性肝损伤等诸多慢性疾病的治疗靶点，本发明以急性酒精性肝损伤作为疾病模型，表明甜叶悬钩子水溶性多糖可降低肝脏的氧化应激损伤，同时加速乙醇及其代谢产物乙醛的代谢，具有良好的保护肝脏作用；甜叶悬钩子水溶性多糖作为乙醛脱氢酶的激活剂，具有开发成为神经退行性疾病、心血管疾病、肿瘤以及肝损伤等诸多慢性疾病的治疗药物或者保健用品的前景。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明。

实施例

1.从蔷薇科悬钩子属植物甜叶悬钩子提取水溶性多糖

将甜叶悬钩子干叶粉碎后，用体积分数为80％的乙醇70℃提取90min，抽滤，弃滤液，滤渣用去离子水60℃保温提取两次，每次120min，冷却后抽滤，合并两次滤液，55℃减压蒸馏浓缩，加入三倍体积的无水乙醇沉淀，4℃静置过夜；抽滤收集沉淀a，称重，沉淀a用丙酮、乙醚、乙醇交替洗涤3次，用去离子水溶解，加入相当于沉淀物a质量2.5％的三氯乙酸，4℃静置120min；离心，取上清滤液透析24h，每隔8h换一次透析液(蒸馏水)，透析后的溶液冷冻干燥，得到甜叶悬钩子水溶性多糖。

2.从蔷薇科悬钩子属植物甜叶悬钩子提取水溶性多糖的结构特征的检测

(1)总糖含量、糖醛酸含量、蛋白质含量

采用苯酚-硫酸法测定蔷薇科悬钩子属植物甜叶悬钩子提取水溶性多糖、草酸盐溶果胶类多糖、碱溶性多糖的总糖含量；采用间羟基联苯比色法测定其糖醛酸含量；采用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量，其结果见表1。

表1甜叶悬钩子提取的水溶性多糖总糖含量、糖醛酸含量、蛋白质含量

(2)单糖组成

采用气相色谱测定蔷薇科悬钩子属植物甜叶悬钩子提取的水溶性多糖单糖组成，结果显示，甜叶悬钩子提取的水溶性多糖主要由核糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖5种单糖组成，其摩尔比为0.146∶0.403∶17.745∶1.436∶0.382。

(3)红外光谱

甜叶悬钩子提取水溶性多糖中较大的吸收峰有3409.92cm^-1、1648.13cm^-1、1410.84cm^-1、1237.84cm^-1、1098.03cm^-1、875.06cm^-1，如图1所示。图1中，3409.92cm^-1附近出现强吸收峰是由于糖类的O-H和蛋白质N-H伸缩振动引起的，存在分子内氢键；在3000-2800cm^-1之间存在小的吸收峰，是糖类C-H伸缩振动(-CH2-)引起的吸收峰；1648.13cm^-1附近的吸收峰属于酰胺I带吸收峰；1410.84cm^-1附近的吸收峰是由C-C-H或H-C-O产生的；而在1237.84cm^-1处的吸收峰也是由该基团中的C-O产生的；1098.03cm^-1附近为糖醛酸的特征吸收峰；在875.06cm^-1处的特征吸收峰，是β-D-吡喃糖C-H的变角振动所引起的，表明该组分含有β-D-吡喃葡萄糖环，分子以β-糖苷键连接；650-450cm^-1处出现吸收峰是表明茶多糖中含有酰氨基；由红外光谱可以推断甜叶悬钩子提取水溶性多糖是β-D-吡喃环蛋白多糖。

(4)平均分子量及分子量分布

通过高效凝胶渗透色谱法测定从蔷薇科悬钩子属植物甜叶悬钩子提取的水溶性多糖、草酸盐溶果胶类多糖、碱溶性多糖的分子量，结果如图2及表2所示。

表2甜叶悬钩子提取的水溶性多糖多糖的平均分子量及分子量分布

注：Mw为重量平均分子量，Mn为数均分子量，Mz为质均分子量

(4)血清检测肝功能指标ALT和AST活性，结果如表3所示，急性酒精性肝损伤模型对照组与正常对照组相比，其ALT和AST活性明显增高(P≤0.05)，说明灌胃6.4g/kg.bw酒精已经造成肝脏损伤，急性酒精性肝损伤模型成功。灌胃25mg/kg.bw、50mg/kg.bw、100mg/kg.bw甜叶悬钩子水溶性多糖以及50mg/kg.bw水飞蓟宾均显著降低酒精性肝损伤小鼠血清中ALT和AST活性(与急性酒精性肝损伤模型比较P≤0.05)，表现出肝脏保护作用，量效关系明显；肝匀浆氧化应激指标MDA和GSH结果如表4所示，急性酒精性肝损伤模型对照组与正常对照组相比，脂质过氧化终产物MDA增高(P≤0.05)，抗氧化指标GSH降低(P≤0.05)，说明灌胃6.4g/kg.bw酒精已经造成肝脏氧化损伤，灌胃25mg/kg.bw、50mg/kg.bw、100mg/kg.bw甜叶悬钩子水溶性多糖以及50mg/kg.bw水飞蓟宾均显著降低酒精性肝损伤小鼠肝匀浆中脂质过氧化终产物MDA水平，并提高抗氧化指标GSH水平(与急性酒精性肝损伤模型比较P≤0.05)，表现出对肝脏氧化应激损伤的保护作用；肝匀浆检测肝脏ADH和ALDH活性，结果如表5所示，灌胃25mg/kg.bw、50mg/kg.bw、100mg/kg.bw甜叶悬钩子水溶性多糖均显著提高了肝脏匀浆中ALDH活性(与急性酒精性肝损伤模型比较P≤0.05)，量效关系明显，表现出良好的激活乙醛脱氢酶的作用；灌胃50mg/kg.bw、100mg/kg.bw甜叶悬钩子水溶性多糖显著提高了肝脏匀浆中ADH活性(与急性酒精性肝损伤模型比较P≤0.05)，加速了乙醇及乙醇代谢产物乙醛的代谢；分析以上结果表明，甜叶悬钩子水溶性多糖同时从加速乙醇及其代谢产物乙醛代谢以及对肝脏氧化应激损伤的保护这两个方面，发挥对急性酒精性肝损伤的保护作用。

表3小鼠血清中ALT和AST活性(*与模型组比较P≤0.05)

表4小鼠肝匀浆中MDA和GSH水平(*与模型组比较P≤0.05)

表5小鼠肝匀浆中ADH和ALDH活性(*与模型组比较P≤0.05)

附图说明

图1是甜叶悬钩子提取水溶性多糖红外光谱图；

图2是甜叶悬钩子提取水溶性多糖高效凝胶渗透色谱图。

Claims

1.一种从蔷薇科悬钩子属植物甜叶悬钩子提取的水溶性多糖在制备具有激活乙醛脱氢酶和保护肝脏效应药物中的应用；

所述水溶性多糖总糖含量为42.00±1.83％、糖醛酸含量为13.33±0.58％、蛋白质含量为1.73±0.37％；所述水溶性多糖主要由核糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖5种单糖组成，其摩尔比为0.146∶0.403∶17.745∶1.436∶0.382；所述水溶性多糖重均分子量Mw为8.29^E+04、数均分子量Mn为3.29^E+03、质均分子量Mz为1.80^E+06、Mw/Mn为25.23；

所述从蔷薇科悬钩子属植物甜叶悬钩子提取水溶性多糖的方法为：将甜叶悬钩子干叶粉碎后，用体积百分数为80％-85％的乙醇水溶液在60-80℃浸泡80-100min，抽滤，弃滤液，茶渣用去离子水在50-70℃保温浸取两次，每次90-150min，加入相当于浓缩物三倍体积的无水乙醇，4℃静置过夜沉淀，离心分离，得到沉淀物a，称重，用丙酮、乙醚、乙醇交替洗涤3次，加去离子水溶解，加入相当于沉淀a质量的2％-3％的三氯乙酸，于4℃静置90-150min，离心分离，取上清液置于蒸馏水中透析20-30h，每隔8h换一次透析液，透析后的溶液冷冻干燥，即得到甜叶悬钩子水溶性多糖。