CN103399062A

CN103399062A - 一种基于光电化学传感的Pb2+超灵敏检测新方法

Info

Publication number: CN103399062A
Application number: CN2013103347368A
Authority: CN
Inventors: 唐文渊; 韩得满; 李永敏; 贾文平
Original assignee: Taizhou University
Current assignee: Taizhou University
Priority date: 2013-08-01
Filing date: 2013-08-01
Publication date: 2013-11-20
Anticipated expiration: 2033-08-01
Also published as: CN103399062B

Abstract

本发明涉及一种基于Pb²⁺诱导的G-四链体DNA酶构象转变为基础的光电化学传感器的构建，可以有效的实现Pb²⁺超灵敏传感，属于分析化学的光电化学传感技术领域。本发明通过设计Pb²⁺取代K⁺引起G-四链体DNA酶的构象转变导致酶活性降低，从而影响在CdS量子点修饰ITO电极上的酶生物催化沉淀反应来实现Pb²⁺光电化学传感测定。本发明首次将G-四链体DNA酶引入光电化学传感体系用于Pb²⁺的检测，且该传感器具有高选择性和高灵敏度的优点，Pb²⁺的检测限达到1.0×10^-8M。

Description

一种基于光电化学传感的Pb2+超灵敏检测新方法

技术领域

本发明属于分析化学的光电化学传感技术领域，涉及一种基于Pb²⁺诱导的G-四链体DNA酶构象转变导致酶活性降低引起体系光电流变化为基础的光电化学传感器的构建，可以有效实现Pb²⁺超灵敏检测。

背景技术

光电化学过程指的是光敏材料在光照作用下所发生的经由电子激发及电荷转移的光电转换过程。电化学生物传感器作为一种独立的集成检测装置，已经对生化、医疗领域产生了日益重要的影响。随着纳米技术和材料化学的快速发展，在光电化学过程与电化学生物传感器结合的基础上发展出了新一代光电化学生物传感，从而为探索各类生物学相互作用提供了一种新的灵敏检测方法。本质上，和其它已经建立的分析技术如电致化学发光一样，光电化学分析也是一种基于传统电化学的分析技术。因此，该方法继承了后者的诸多优点，如价格低廉，设备简单，灵敏度高。但是，两者之间也存在了很大的差异，光电化学传感技术具有一些在传统电化学平台上难以实现的优点。在光电化学检测中，光被用作激发信号来激发光电化学物质，而电信号则作为检测信号，该过程与电致化学发光正好相反。由于采用了两种不同形式的激发和检测信号，该技术背景信号较低，故具有很高的灵敏度。实际上，在使用相同设计进行同一物质检测时，基于光电化学的方法也比基于电化学的方法呈现出更好的检测性能。

因为其在分析领域已展现出的优点以及在未来分析中令人期待的潜力，光电化学生物传感在分析领域受到了越来越多的关注。但是光电化学传感技术用于金属离子测定的报道较少，到目前为止，还没有关于光电化学传感测定Pb²⁺的报道。

本发明利用Pb²⁺会诱导改变K⁺稳定的G-四链体DNA酶的构象，从而降低其催化活性的特点来设计Pb²⁺光电传感新体系。在这样的系统中，增加Pb²⁺浓度会使G-四链体DNA酶的催化活性降低，从而抑制生物催化沉淀来减少光电流的降低。该系统利用特定的Pb²⁺取代K⁺后对G-四链体DNA酶活性降低的原理，结合酶生物催化沉积技术来实现Pb²⁺超灵敏传感检测。

发明内容

本发明的内容就是提供一种基于光电化学传感的Pb²⁺测定新方法。

本发明的技术方案如下：

基于光电化学传感的Pb²⁺超灵敏检测新方法，包括以下步骤：

a.CdS量子点的合成：

在100mL三颈瓶中加入30-50mL0.01M CdCl₂溶液和250μL巯基乙酸，搅拌的同时向溶液中通入氮气30-40min。在此期间，使用1M的NaOH溶液凋节混合液的pH到合适数值(7-13)。然后，加入3-7mL0.1M Na₂S溶液，在110℃下通氮气加热回流4h左右。在此实验中，选择合适的pH值，保持CdCl₂溶液浓度和体积不变的情况下，通过调整所加入的0.1M硫化钠溶液的体积，就可以得到具有不同S/Cd的CdS量子点。合成的CdS量子点保存于4℃的冰箱中待用；

b.多层修饰膜电极的制备：

ITO导电玻璃切成小片之后，放在2M左右KOH的异丙醇溶液中煮沸约15min，然后用大量清水冲洗，在105-120℃环境下干燥2h，备用。将洗净干燥后的ITO电极浸入2％邻苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯溶液10min左右，取出后用水洗涤；再浸入备用的CdS量子点溶液中约10min，取出后用水洗涤；该过程重复3-5次，得到所需的多层修饰膜电极；

c.Pb²⁺的光电化学测定体系的构建：

如图1所示，寡核苷酸是通过1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚安盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺耦合反应固定到CdS量子点修饰的ITO电极上。室温下，首先将CdS量子点修饰电极浸没在包含20毫克1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚安盐酸盐和10毫克N-羟基琥珀酰亚胺的1.0毫升蒸馏水中约一小时，然后用10mM pH值为7.4磷酸缓冲液小心冲洗。随后，将20-30μL1μM的寡核苷酸滴在电极表面并且在4℃环境下放置8-12小时，用磷酸缓冲液冲洗电极去除未固定的寡核苷酸。然后将寡核苷酸修饰电极浸泡在1mM乙醇胺中，于4℃封闭2h，再用10mM磷酸缓冲液小心冲洗后，备用。接下来，将寡核苷酸修饰电极浸没在含有10mM KAc的10mM Tris-HAc缓冲液(pH值7.4)中，水浴加热到90℃，慢慢冷却到25℃。然后加入0.2μM氯高铁血红素，在室温下反应20-30分钟，形成K⁺稳定G-四链体DNA酶。在室温下加入不同浓度的Pb²⁺和0.002％(v/v)聚乙二醇辛基苯基醚，作用20-30分钟。然后，把处理过的G-四链体修饰电极浸泡在含有0.2mM4-氯萘酚和0.2mM过氧化氢溶液10-20分钟。最后，冲洗电极，在实验室自己搭建的光电化学测试系统上测量各自的光电流强度。该测定条件：500W的氙灯作为激发光源，光通过单色器照射到工作电极上，入射光的强度通过辐照计测定，390nm波长处的光电流强度约为400μW/cm²；光电测试中采用三电极体系：工作电极为电极面积为0.25cm²的ITO电极，Pt丝电极作为对电极，Ag/AgCl电极(饱和KCl)作为参比电极，光电流由CHI750a电化学工作站(上海辰华仪器公司)测定。光电流的测定均在恒定的电位(0V vs饱和Ag/AgCl)及在含0.1M维生素C的0.1M磷酸缓冲液(pH＝7.4)中进行，检测前通高纯氮气约15min除氧，测定时保持氮气氛。

与现有技术相比本专利技术具有以下优点：

1.选择性好，常见的金属离子基本不干扰；

2.灵敏度较高，检测限为1.0×10^-8M；

3.操作简便，用简单的光电仪器即可。

附图说明

图1为生物催化沉积放大光电化学生物传感器设计原理图。

图2为不同浓度的铅离子光电流响应图。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步具体的说明；但是本发明并不限于这些实施例。

实施例1：

在100mL三颈瓶中加入50mL0.01M CdCl₂溶液和250μL巯基乙酸，搅拌的同时向溶液中通入氮气30min。在此期间，使用1M的NaOH溶液调节混合液的pH到11。然后，加入5mL0.1M Na₂S溶液，在110℃下通氮气加热回流4h。在此系列实验中，可以得到S/Cd配比为1：1的CdS量子点。将洗净干燥后的ITO电极浸入2％邻苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯溶液10min，取出后用水洗涤；再浸入备用的CdS量子点溶液中10min，取出后用水洗涤；该过程重复3次，得到所需的多层膜修饰电极；接下来在室温下将CdS量子点修饰电极浸没在包含20毫克1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和10毫克N-羟基琥珀酰亚胺的1.0毫升蒸馏水中一小时，然后用10mM pH值为7.4磷酸缓冲液小心冲洗。随后，将20μL1μM的寡核苷酸(5′-NH₂(CH₂)₆-TGGGTAGGGCGGGTTGGGAAA-3′)滴在电极表面并且在4℃环境下放置12小时，冲洗电极去除未固定的寡核苷酸。然后将寡核苷酸修饰电极用1mM乙醇胺(封闭剂)于4℃封闭2h，再用10mM磷酸缓冲液小心冲洗后，备用。随后将寡核苷酸修饰电极浸没在含有10mM KAc的10mM Tris-HAc缓冲液(pH值7.4)中，水浴加热到90℃，再慢慢冷却到25℃。然后加入0.2μM氯高铁血红素，在25℃下反应30分钟，使其形成K⁺稳定的G-四链体DNA酶。在室温下加入不同浓度的Pb²⁺和0.002％(v/v)聚乙二醇辛基苯基醚，作用30分钟。然后，把G-四链体修饰电极浸泡在含有0.2mM4-氯萘酚和0.2mM过氧化氢缓冲液中10分钟。最后，冲洗电极，在实验室自己搭建的光电化学测试系统上测量各自的光电强度，线性关系见图2，相应的检测限为1.0×10^-8M。

应用实施例1：

把实施例1的体系用于椒江水样的测定，100μg/L Pb²⁺加标回收率平均值为98.52％(n＝3)，体现出该方法可靠程度高。

应用实施例2：

把实施例1的体系用于废水样品的测定，测定平均值为58.4μg/L(n＝3)，与石墨炉原子吸收法测定结果(59.2μg/L)相吻合，100μg/L Pb²⁺加标回收率平均值为97.34％(n＝3)，体现出该方法具有较好的准确度和可靠性。

本发明中所描述的具体实施例仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

Claims

1.一种基于光电化学传感的Pb²⁺超灵敏检测新方法，其特征在于包括以下步骤：

a.CdS量子点的合成：

在100mL三颈瓶中加入30-50mL0.01M CdCl₂溶液和250μL巯基乙酸，搅拌的同时向溶液中通入氮气30-40min。在此期间，使用1M的NaOH溶液调节混合液的pH到合适数值(7-13)。然后，加入3-7mL0.1M Na₂S溶液，在110℃下通氮气加热回流4h左右。在此实验中，选择合适的pH值，保持CdCl₂溶液浓度和体积不变的情况下，通过凋整所加入的0.1M硫化钠溶液的体积，就可以得到具有不同S/Cd的CdS量子点。合成的CdS量子点保存于4℃冰箱待用；

b.多层修饰膜电极的制备：

ITO导电玻璃切成小片之后，放在2M左右KOH的异丙醇溶液中煮沸约15min，然后用大量清水冲洗，在105-120℃环境下干燥2h，备用。将洗净干燥后的ITO电极浸入2％邻苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯溶液10min左右，取出后用水洗涤；再浸入备用的CdS量子点溶液中约10min，取出后用水洗涤；该过程重复3-5次，得到所需的多层膜修饰电极；

c.Pb²⁺的光电化学测定体系的构建：

寡核苷酸是通过1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺耦合反应固定到CdS量子点修饰的ITO电极上。室温下，首先将CdS量子点修饰电极浸没在包含20毫克1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和10毫克N-羟基琥珀酰亚胺的1.0毫升蒸馏水中约一小时，然后用10mM pH值为7.4磷酸缓冲液小心冲洗。随后，将20-30μL1μM的寡核苷酸滴在电极表面并且在4℃环境下放置8-12小时，用磷酸缓冲液冲洗电极去除未固定的寡核苷酸。然后将寡核苷酸修饰电极浸泡在1mM乙醇胺中，于4℃封闭2h，再用10mM磷酸缓冲液小心冲洗后，备用。接下来，将寡核苷酸修饰电极浸没在含有10mM KAc的10mM Tris-HAc缓冲液(pH值7.4)中，水浴加热到90℃，慢慢冷却到25℃。然后加入0.2μM氯高铁血红素，在室温下反应20-30分钟，形成K⁺稳定G-四链体DNA酶。在室温下加入不同浓度的Pb²⁺和0.002％(v/v)聚乙二醇辛基苯基醚，作用20-30分钟。然后，把处理过的G-四链体修饰电极浸泡在含有0.2mM4-氯萘酚和0.2mM过氧化氢溶液10-20分钟。最后，冲洗电极，然后在实验室自己搭建的光电化学测试系统上测量各自的光电流强度。该测定条件：500W的氙灯作为激发光源，光通过单色器照射到工作电极上，入射光的强度通过辐照计测定，390nm波长处的光电流强度约为400μW/cm²；光电测试中采用三电极体系：工作电极为电极面积为0.25cm²的ITO电极，Pt丝电极作为对电极，Ag/AgCl电极(饱和KCl)作为参比电极，光电流由CHI750a电化学工作站(上海辰华仪器公司)测定。光电流的测定均在恒定的电位(0V vs饱和Ag/AgCl)及在含0.1M维生素C的0.1M磷酸缓冲液(pH＝7.4)中进行，检测前通高纯氮气约15min除氧，测定时保持氮气氛。

2.根据权利要求1所述一种基于光电化学传感的Pb²⁺超灵敏检测新方法，其特征在于：步骤a中所述的量子点为CdS量子点。

3.根据权利要求1所述一种基于光电化学传感的Pb²⁺超灵敏检测新方法，其特征在于：步骤a中所述的CdS量子点为S/Cd为0.8、1.0、1.2等各种比例的CdS量子点。

4.根据权利要求1所述种基于光电化学传感的Pb²⁺超灵敏检测新方法，其特征在于：步骤b中所述交替浸2％邻苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯溶液和CdS量子点溶液的次数为3-5次。

5.根据权利要求1所述一种基于光电化学传感的Pb²⁺超灵敏检测新方法，其特征在于：步骤c中所述的寡核苷酸为能形成G-四链体的单链DNA。

6.根据权利要求1所述一种基于光电化学传感的Pb²⁺超灵敏检测新方法，其特征在于：步骤c中所述的DNA酶为添加氯高铁血红素的K⁺稳定G-四链体DNA酶。

7.根据权利要求1所述一种基于光电化学传感的Pb²⁺超灵敏检测新方法，其特征在于：步骤c中所述的DNA酶构象转变为Pb²⁺取代K⁺所引发的G-四链体DNA酶构象变化。

8.根据权利要求1所述一种基于光化学传感的Pb²⁺超灵敏检测新方法，其特征在于：步骤c中所述的抑制光电强度的方法为生物催化沉淀方法。

9.根据权利要求1所述一种基于光电化学传感的Pb²⁺超灵敏检测新方法，其特征在于：步骤c中所述该测定是在含0.1M维生素C的0.1M磷酸缓冲液(pH＝7.4)中进行。