CN102735639A - 非标记型均相比色检测铅离子的方法 - Google Patents
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Abstract
一种非标记型均相比色检测铅离子的方法,由制备金纳米棒、配制核酸探针母液、测定金纳米棒-核酸探针溶液的紫外光谱、制作标准曲线、检测样品溶液中的铅离子步骤组成。本发明采用金纳米棒的等离子共振吸收光学性质和Pb2+能够诱导富G碱基DNA形成G-四链体结构,建立了一种快速简单比色检测Pb2+的方法。本发明经过检测灵敏度和选择性实验,结果表明,本发明检测铅离子的线性范围为5nM~1μM,检测限为3nM,具有方法简单、经济、选择性好、灵敏度高等优点,可用于样品中铅离子的检测。
Description
技术领域
本发明属于分析检测技术领域,具体涉及一种非标记型均相比色检测铅离子的方法。
背景技术
重金属对环境的污染引起人们极大的关注,因为它严重影响人类健康。特别是Pb2+,对人类健康和环境造成严重的威胁。铅具有不可降解性,并且能在环境中长期存在。铅作用于人体后能产生神经毒素,会造成心脏、肾脏慢性炎症,抑制大脑发育,降低运动功能和神经传导速度。美国环境保护署规定饮用水含铅量不得超过15μg/L(72nmol/L)。因此,建立准确有效的铅检测方法具有重要的应用价值和实际意义。
目前铅离子检测方法主要有:电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)、原子荧光光谱法(AFS)、原子吸收光谱法(AAS)和反相高效液相色谱法等。尽管这些方法灵敏、准确,但是或多或少存在一些缺点,例如,费时、仪器销售价格贵或需要高级设备等等。因此,急需研究一种简便、经济、高灵敏和高选择性的铅检测方法。
比色法能够做到简单、快速检测生理和环境中的金属离子。其中金纳米棒由于其纳米结构的特殊性而得到广泛的关注,它有两个等离子吸收峰,分别是横向等离子吸收峰和纵向等离子吸收峰。横向等离子吸收峰位于520nm左右,纵向等离子吸收峰通常大于600nm。由溴化十六烷基三甲铵包被的金纳米棒,不仅稳定性好,而且金纳米棒表面带正电荷,由于其具有独特的物理特性,而广泛应用于医学影像和生物传感领域。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服上述铅离子检测方法的缺点,提供一种方法简单、快速、易于操作、灵敏度高、选择性好的非标记型均相比色检测铅离子的方法。
解决上述技术问题所采用的技术方案由下述步骤组成:
1、制备金纳米棒
(1)制备金种
将7.5mL浓度为0.1mol/L的溴化十六烷基三甲铵加入含有98μL质量分数为1%的HAuCl4和152μL超纯水的烧瓶中,搅拌,加入600μL浓度为10mmol/L的NaBH4,搅拌2分钟,静置2小时,制备成金种。
(2)制备金纳米棒溶液
在47.6mL 0.1mol/L的溴化十六烷基三甲铵中加入788μL质量分数为1%的HAuCl4和1600μL H2O,再依次加入300μL 0.01M AgNO3和320μL 0.1mol/L抗坏血酸作为还原剂,搅拌2分钟,加入215μL金种,搅拌20秒,30℃静置24小时,制备成金纳米棒溶液装入棕色广口瓶,置于冰箱4℃保存备用。
2、配制核酸探针母液
按常规方法将T30695核苷酸用10mmol/L pH为7.4的三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液配制成物质的量浓度为100μmol/L的T30695核酸溶液,储存于-20℃备用。
T30695核苷酸DNA序列为5’-GGGTGGGTGGGTGGGT-3’,该核苷酸DNA序列来源于American Chemical Society数据库,并命名为T30695。
将T30695核酸溶液用10mmol/L pH为7.4的三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液稀释成5μmol/L的核酸探针母液,置于冰箱4℃保存备用。
3、测定金纳米棒-核酸探针溶液的紫外光谱
将金纳米棒溶液与10mmol/L的三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液混合,并加入5μmol/L的核酸探针母液混合均匀,5μmol/L的核酸探针母液与10mmol/L的三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液、金纳米棒溶液的体积比为1:50~70:150~200,制备成金纳米棒-核酸探针溶液,用紫外分光光度计测定紫外光谱。
4、制作标准曲线
向金纳米棒-核酸探针溶液中逐级加入铅离子标准溶液,依次配制成物质的量浓度为5nmol/L、10nmol/L、50nmol/L、100nmol/L、500nmol/L、1μmol/L、2μmol/L、3μmol/L的铅离子标准溶液,用紫外分光光度计测定上述不同浓度铅离子标准溶液的紫外光谱,以lg浓度为5nmol/L-1μmol/L铅离子溶液为横坐标X,吸光度的变化值ΔA为纵坐标Y,吸光度的变化值ΔA:
ΔA=A0-A
式中A0为金纳米棒-核酸探针溶液中金纳米棒的长轴吸光度,A为在金纳米棒-核酸探针溶液中加入铅离子标准溶液后金纳米棒的长轴吸光度。由origin 8.0软件作图得标准曲线:
Y=0.03245X+0.3030
线性相关系数为0.9932。
5、检测样品溶液中的铅离子
(1)水样的预处理:
量取自来水100mL,煮沸5分钟去除氯,备用;
(2)将金纳米棒-核酸探针溶液与预处理的水样按体积比为3:1混合均匀,采用标准加入法进行铅离子的回收,按下式计算铅离子的回收率:
R%=m测/m实
式中m测是待测样品中铅的质量,m实是标准样品中铅的质量。
在本发明的测定金纳米棒-核酸探针溶液的紫外光谱步骤3中,将金纳米棒溶液与10mmol/L的三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液混合,并加入5μmol/L的核酸探针母液混合均匀,5μmol/L的核酸探针母液与10mmol/L的三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液、金纳米棒溶液的优选体积比为1:55~65:160~200,制备成金纳米棒-核酸探针溶液,用紫外分光光度计测定紫外光谱。
在本发明测定金纳米棒-核酸探针溶液的紫外光谱步骤3中,将金纳米棒溶液与10mmol/L的三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液混合,并加入5μmol/L的核酸探针母液混合均匀,5μmol/L的核酸探针母液与10mmol/L的三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液、金纳米棒溶液的体积比为1:60:180,制备成金纳米棒-核酸探针溶液,用紫外分光光度计测定紫外光谱。
附图说明
图1是采用实施例1检测不同浓度铅离子的紫外吸收光谱图。
图2是采用实施例1检测不同浓度铅离子的紫外吸收变化线性曲线图。
图3是采用实施例1检测不同金属离子的紫外吸收变化图。
图4是采用实施例1检测不同金属离子的紫外吸收的颜色变化图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明,但本发明不限于这些实施例。
实施例1
本实施的非标记型均相比色检测铅离子的方法由下述步骤组成:
1、制备金纳米棒
(1)制备金种
将7.5mL浓度为0.1mol/L的溴化十六烷基三甲铵加入含有98μL质量分数为1%的HAuCl4和152μL超纯水的烧瓶中,搅拌,加入600μL浓度为10mmol/L的NaBH4,搅拌2分钟,静置2小时,制备成金种。
(2)制备金纳米棒溶液
在47.6mL 0.1mol/L的溴化十六烷基三甲铵中加入788μL质量分数为1%的HAuCl4和1600μL H2O,再依次加入300μL 0.01M AgNO3和320μL 0.1mol/L抗坏血酸作为还原剂,搅拌2分钟,加入215μL金种,搅拌20秒,30℃静置24小时,制备成金纳米棒溶液装入棕色广口瓶,置于冰箱4℃保存备用。
2、配制核酸探针母液
按常规方法将T30695核苷酸用10mmol/L pH为7.4的三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液配制成物质的量浓度为100μmol/L的T30695核酸溶液,储存于-20℃备用;
T30695核苷酸DNA序列为5’-GGGTGGGTGGGTGGGT-3’,该核苷酸DNA序列来源于American Chemical Society数据库,并命名为T30695。
将T30695核酸溶液用10mmol/L pH为7.4的三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液稀释成5μmol/L的核酸探针母液,置于冰箱4℃保存备用;
3、测定金纳米棒-核酸探针溶液的紫外光谱
将150μl金纳米棒溶液与50μl浓度为10mmol/L的三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液混合,并加入0.8μl浓度为5μmol/L的核酸探针母液混合均匀,5μmol/L的核酸探针母液与10mmol/L的三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液、金纳米棒溶液的体积比为1:60:180,制备成金纳米棒-核酸探针溶液,用U-3900H紫外分光光度计测定紫外光谱见图1。在图1中,曲线a为金纳米棒-核酸探针溶液的紫外吸收光谱图。
4、制作标准曲线
向金纳米棒-核酸探针溶液中逐级加入铅离子标准溶液,依次配制成物质的量浓度为5nmol/L、10nmol/L、50nmol/L、100nmol/L、500nmol/L、1μmol/L、2μmol/L、3μmol/L的铅离子标准溶液,用U-3900H紫外分光光度计测定上述不同浓度铅离子标准溶液的紫外光谱,测得吸光度依次为0.346、0.329、0.315、0.298、0.281、0.267、0.239、0.232,见图1。在图1中横坐标X是以lg浓度为5nmol/L-1μmol/L铅离子溶液,纵坐标Y是吸光度的变化值ΔA,吸光度的变化值ΔA:
ΔA=A0-A
式中A0为金纳米棒-核酸探针溶液中金纳米棒的长轴吸光度为0.377,A为在金纳米棒-核酸探针溶液中加入铅离子标准溶液后金纳米棒的长轴吸光度依次为0.346、0.329、0.315、0.298、0.281、0.267。见图2,由origin 8.0软件作图得标准曲线:
Y=0.03245X+0.3030
线性相关系数为0.9932。
5、检测样品溶液中的铅离子
(1)水样的预处理:
打开水管放水20分钟,量取自来水100mL,煮沸5分钟去除氯,备用;
(2)将150μl金纳米棒溶液-核酸探针溶液与50μl预处理的水样混合均匀,采用标准加入法进行铅离子的回收,加入标准铅离子溶液检测浓度为30nmol/L和60nmol/L,检测结果见表1,按下式计算铅离子的回收率:
R%=m测/m实
式中m测是待测样品中铅的质量,m实是标准样品中铅的质量,计算结果见表1。
表1自来水中铅离子加标回收率
注:a为三次测定的平均值;b为标准偏差。
由表1可见,回收率为100.3%~103.5%,表明该方法可以有效地检测水样中的铅离子。
实施例2
本实施的非标记型均相比色检测铅离子的方法由下述步骤组成:
在测定金纳米棒-核酸探针溶液的紫外光谱步骤3中,将120μl金纳米棒溶液与40μl浓度为10mmol/L的三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液混合,并加入0.8μl浓度为5μmol/L的核酸探针母液混合均匀,5μmol/L的核酸探针母液与10mmol/L的三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液、金纳米棒溶液的体积比为1:50:150,制备成金纳米棒-核酸探针溶液,用U-3900H紫外分光光度计测定紫外光谱。其它步骤与实施例1相同。
实施例3
本实施的非标记型均相比色检测铅离子的方法由下述步骤组成:
在测定金纳米棒-核酸探针溶液的紫外光谱步骤3中,将160μl金纳米棒溶液与56μl浓度为10mmol/L的三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液混合,并加入0.8μl浓度为5μmol/L的核酸探针母液混合均匀,5μmol/L的核酸探针母液与10mmol/L的三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液、金纳米棒溶液的体积比为1:70:200,制备成金纳米棒-核酸探针溶液,用U-3900H紫外分光光度计测定紫外光谱。其它步骤与实施例1相同。
实施例4
本实施的非标记型均相比色检测铅离子的方法由下述步骤组成:
在测定金纳米棒-核酸探针溶液的紫外光谱步骤3中,将128μl金纳米棒溶液与44μl浓度为10mmol/L的三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液混合,并加入0.8μl浓度为5μmol/L的核酸探针母液混合均匀,5μmol/L的核酸探针母液与10mmol/L的三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液、金纳米棒溶液的体积比为1:55:160,制备成金纳米棒-核酸探针溶液,用U-3900H紫外分光光度计测定紫外光谱。其它步骤与实施例1相同。
实施例5
本实施的非标记型均相比色检测铅离子的方法由下述步骤组成:
在测定金纳米棒-核酸探针溶液的紫外光谱步骤3中,将160μl金纳米棒溶液与52μl浓度为10mmol/L的三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液混合,并加入0.8μl浓度为5μmol/L的核酸探针母液混合均匀,5μmol/L的核酸探针母液与10mmol/L的三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液、金纳米棒溶液的体积比为1:65:200,制备成金纳米棒-核酸探针溶液,用U-3900H紫外分光光度计测定紫外光谱。其它步骤与实施例1相同。
为了验证本发明的有益效果,发明人进行了大量的实验室研究实验,各种试验情况如下:
1、检测灵敏度
检测灵敏度试验方法与实施例1的步骤1~步骤3相同。
在制作标准曲线步骤4中,制作标准曲线的过程与实施例1相同。按下式计算检出限:
式中Sb是11次空白测定的标准偏差为0.00628,Xc是对一个浓度为C的标准溶液进行3次平行测定得到的响应信号为0.346,Xb为11次空白测定的平均值为0.3774,C为检测铅离子标准溶液的最小浓度5nmol/L。计算结果,检出限可达3nmol/L,实验结果表明,本发明检测均相溶液中铅离子的灵敏度较高。
2、选择性
将实施例1中的铅离子标准溶液分别用Ag+、K+、Cd2+、Cu2+、Ni2+、Ba2+、Zn2+、Hg2+、Mg2+、Ca2+、Fe3+、Al3+标准溶液替换。用U-3900H紫外分光光度计测定紫外光谱,记录吸光度,并计算加入各金属离子标准溶液前后金纳米棒-核酸探针溶液吸光度的变化ΔA:
ΔA=A0-A
式中A0为金纳米棒-核酸探针溶液中金纳米棒的长轴吸光度为,A为在金纳米棒-核酸探针溶液中加入金属离子标准溶液后金纳米棒的长轴吸光度,其中Pb2+的物质的量浓度为2μmol/L,其它金属离子标准溶液的浓度均为5μmol/L。检测不同金属离子的紫外吸收变化图见图3,检测不同金属离子的紫外吸收的颜色变化图见图4。由图3、图4可见,只有当加入铅离子标准溶液后,金纳米棒长轴吸光度及颜色发生明显地变化,而其它金属离子标准溶液几乎不会引起金纳米棒长轴吸光度及颜色的变化,说明本发明检测均相溶液中铅离子具有较好的选择性。
Claims (3)
1.一种非标记型均相比色检测铅离子的方法,由下述步骤组成:
(1)制备金纳米棒
①制备金种
将7.5mL浓度为0.1mol/L的溴化十六烷基三甲铵加入含有98μL质量分数为1%的HAuCl4和152μL超纯水的烧瓶中,搅拌,加入600μL浓度为10mmol/L的NaBH4,搅拌2分钟,静置2小时,制备成金种;
②制备金纳米棒溶液
在47.6mL 0.1mol/L的溴化十六烷基三甲铵中加入788μL质量分数为1%的HAuCl4和1600μL H2O,再依次加入300μL 0.01M AgNO3和320μL 0.1mol/L抗坏血酸作为还原剂,搅拌2分钟,加入215μL金种,搅拌20秒,30℃静置24小时,制备成金纳米棒溶液装入棕色广口瓶,置于冰箱4℃保存备用;
(2)配制核酸探针母液
按常规方法将T30695核苷酸用10mmol/L pH为7.4的三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液配制成物质的量浓度为100μmol/L的T30695核酸溶液,储存于-20℃备用;
T30695核苷酸DNA序列为5’-GGGTGGGTGGGTGGGT-3’;
将T30695核酸溶液用10mmol/L pH为7.4的三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液稀释成5μmol/L的核酸探针母液,置于冰箱4℃保存备用;
(3)测定金纳米棒-核酸探针溶液的紫外光谱
将金纳米棒溶液与10mmol/L的三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液混合,并加入5μmol/L的核酸探针母液混合均匀,5μmol/L的核酸探针母液与10mmol/L的三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液、金纳米棒溶液的体积比为1:50~70:150~200,制备成金纳米棒-核酸探针溶液,用紫外分光光度计测定紫外光谱;
(4)制作标准曲线
向金纳米棒-核酸探针溶液中逐级加入铅离子标准溶液,依次配制成物质的量浓度为5nmol/L、10nmol/L、50nmol/L、100nmol/L、500nmol/L、1μmol/L、2μmol/L、3μmol/L的铅离子标准溶液,用紫外分光光度计测定上述不同浓度铅离子标准溶液的紫外光谱,以lg浓度为5nmol/L-1μmol/L铅离子溶液为横坐标X,吸光度的变化值ΔA为纵坐标Y,吸光度的变化值ΔA:
ΔA=A0-A
式中A0为金纳米棒-核酸探针溶液中金纳米棒的长轴吸光度,A为在金纳米棒-核酸探针溶液中加入铅离子标准溶液后金纳米棒的长轴吸光度。由origin 8.0软件作图得标准曲线:
Y=0.03245X+0.3030
线性相关系数为0.9932;
(5)检测样品溶液中的铅离子
①水样的预处理:
量取自来水100mL,煮沸5分钟去除氯,备用;
②将金纳米棒-核酸探针溶液与预处理的水样按体积比为3:1混合均匀,采用标准加入法进行铅离子的回收,按下式计算铅离子的回收率:
R%=m测/m实
式中m测是待测样品中铅的质量,m实是标准样品中铅的质量。
2.根据权利要求1所述的非标记型均相比色检测铅离子的方法,其特征在于:在测定金纳米棒-核酸探针溶液的紫外光谱步骤3中,将金纳米棒溶液与10mmol/L的三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液混合,并加入5μmol/L的核酸探针母液混合均匀,5μmol/L的核酸探针母液与10mmol/L的三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液、金纳米棒溶液的体积比为1:55~65:160~200,制备成金纳米棒-核酸探针溶液,用紫外分光光度计测定紫外光谱。
3.根据权利要求1所述的非标记型均相比色检测铅离子的方法,其特征在于:在测定金纳米棒-核酸探针溶液的紫外光谱步骤3中,将金纳米棒溶液与10mmol/L的三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液混合,并加入5μmol/L的核酸探针母液混合均匀,5μmol/L的核酸探针母液与10mmol/L的三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液、金纳米棒溶液的体积比为1:60:180,制备成金纳米棒-核酸探针溶液,用紫外分光光度计测定紫外光谱。
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