CN103314000B - 使用具有大孔中性吸附树脂的吸附-脱附色谱用于富集衍生自甜叶菊的糖苷组合物中的新蛇菊苷b和/或新蛇菊苷d的方法 - Google Patents

使用具有大孔中性吸附树脂的吸附-脱附色谱用于富集衍生自甜叶菊的糖苷组合物中的新蛇菊苷b和/或新蛇菊苷d的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及使用吸附/脱附色谱以制备包含新蛇菊苷B和/或新蛇菊苷D的经富集的组合物的用途。使用吸附‑脱附色谱工艺可从衍生自甜叶菊的糖苷组合物制备富集新蛇菊苷B和/或新蛇菊苷D组分的组合物，该色谱工艺中色谱床的固定相包含大孔中性吸附树脂。

Description

使用具有大孔中性吸附树脂的吸附-脱附色谱用于富集衍生 自甜叶菊的糖苷组合物中的新蛇菊苷B和/或新蛇菊苷D的 方法
相关申请的交叉引用
本申请要求享有2010年11月19日提交的，名为“METHOD FOR THE ENRICHMENT OFREBAUDIOSIDE AND/OR REBADIOSIDE D IN STEVIA-DERIVED GLYCOSIDE COMPOSITIONSUSING ABSORB-DESORB CHROMATOGRAPHY WITH A MACROPOROUS NUETRALADSORBENT RESIN”的美国临时专利申请61/415,548的权益，将其全部援引加入本文。
技术领域
本发明涉及使用吸附/脱附色谱以制备包含新蛇菊苷B和/或新蛇菊苷D(reb-B和/或reb-D)的经富集的组合物。如本文所述，已经发现使用吸附-脱附色谱工艺从衍生自甜叶菊的糖苷组合物中可制备经富集的reb-B和/或reb-D，该色谱工艺中色谱床的固定相包含大孔中性吸附树脂。可用树脂的实例包括“SP70”和“SP710”(购自Mitsubishi)和“FPX66”(购自Dow)。
发明内容
在一些实施方案中，本发明提供了制备包含reb-B、reb-D的至少一种或它们的混合物的经富集的组合物的方法，该方法包括以下步骤：
(A)提供pH经调节的衍生自甜叶菊的糖苷溶液，其包含：(i)选自reb-B和reb-D的至少一种糖苷，和(ii)至少一种其他的衍生自甜叶菊的糖苷；
(B)提供大孔中性吸附树脂；
(C)使大孔中性吸附树脂与衍生自甜叶菊的糖苷溶液接触，以使衍生自甜叶菊的糖苷溶液中的至少一部分糖苷被吸附至吸附剂上；
(D)提供至少一种包含乙醇和水的混合物的洗脱溶剂，配制该洗脱溶剂，以从吸附剂选择性地洗脱reb-B、reb-D或它们的混合物；
(E)使大孔中性吸附树脂与乙醇和水的洗脱溶剂接触，以洗脱富集选自reb-B和reb-D的至少一种糖苷的组合物；以及
(F)任选地从大孔中性吸附树脂洗脱至少一部分剩余的被吸附的糖苷。
在本发明的某些实施方案中，衍生自甜叶菊的糖苷溶液的pH可以是碱性的pH。在这些实施方案的某些中，pH经调节的衍生自甜叶菊的糖苷溶液的pH可以为约8至约11。在其他实施方案中，pH经调节的衍生自甜叶菊的糖苷溶液的pH可以为约8至约10。在这些实施方案的一些中，至少一种洗脱溶剂包含约20-35％w/w的乙醇和约65-80％w/w的水。在其他的实施方案中，至少一种洗脱溶剂包含约25-33％w/w的乙醇和约67-75％w/w的水。在这些实施方案中，富集至少一种糖苷的组合物富集reb-B和reb-D。在这些实施方案的一些中，用后续洗脱溶剂从大孔中性吸附树脂洗脱至少一部分剩余的被吸附的糖苷，其中后续洗脱溶剂包含约36-100％w/w的乙醇和约0-64％w/w的水，并且用后续洗脱溶剂洗脱的组合物富集reb-A。
在本发明的其他特别的实施方案中，衍生自甜叶菊的糖苷溶液的pH可以是略酸性的pH。在这些实施方案中，pH经调节的衍生自甜叶菊的糖苷溶液的pH可以为约4至约7。在这些实施方案的一些中，至少一种洗脱溶剂包含约20-35％w/w的乙醇和约65-80％w/w的水。在其他的实施方案中，至少一种洗脱溶剂包含约25-33％w/w的乙醇和约67-75％w/w的水。在这些实施方案中，富集至少一种糖苷的组合物富集reb-D。在这些实施方案的一些中，用后续洗脱溶剂从大孔中性吸附树脂洗脱至少一部分剩余的被吸附糖苷，其中后续洗脱溶剂包含约36-100％w/w的乙醇和约0-64％w/w的水，并且用后续洗脱溶剂洗脱的组合物富集reb-A和reb-B。
在本发明其他的特别方面，衍生自甜叶菊的糖苷溶液的pH可以是非常酸性的pH。在这些实施方案中，pH经调节的衍生自甜叶菊的糖苷溶液的pH可以为约1至约4。在其他实施方案中，pH经调节的衍生自甜叶菊的糖苷溶液的pH可以为约1至约3。在这些实施方案的一些中，至少一种洗脱溶剂包含约40-65％w/w的乙醇和约35-60％w/w的水。在其他的实施方案中，至少一种洗脱溶剂包含约40-60％w/w的乙醇和约40-60％w/w的水。在这些实施方案中，富集至少一种糖苷的组合物富集reb-A和reb-D。在这些实施方案的一些中，用后续洗脱溶剂从大孔中性吸附树脂洗脱至少一部分剩余的被吸附糖苷，其中后续洗脱溶剂包含约61-100％w/w的乙醇和约0-39％w/w的水，并且用后续洗脱溶剂洗脱的组合物富集reb-B。
在本发明的实施方案中，大孔中性吸附树脂包括二乙烯基苯大孔树脂。本发明还涉及根据本发明描述的方法制备的经富集的组合物。
附图说明
图1A和图1B显示了“新蛇菊苷B”和“新蛇菊苷D”的结构。
图2为实施例1中每种洗脱的各种糖苷的回收图，显示了在pH 5.8下用SP710处理之后的浸渍水中的各种糖苷的回收率。
图3为实施例2中在不同乙醇浓度下洗脱的样品的糖苷曲线图，显示了在用SP710处理之后，用氯化铁和石灰处理的浸渍水中的各种糖苷的回收率。
图4为实施例3中进样过程中从柱上洗脱的糖苷浓度图，显示了用浸渍水上样过程中从SP70洗脱的糖苷浓度。
图5为实施例3中用15％的乙醇冲洗和用100％的乙醇洗脱过程中从柱上洗脱的糖苷浓度图，显示了用15％的乙醇冲洗和用100％的乙醇洗脱过程中从SP70洗脱的糖苷浓度。
图6为实施例4中进样、冲洗和洗脱过程中的糖苷浓度图，显示了在pH 2下的SP70上样、冲洗和洗脱过程中的糖苷浓度。
图7显示了实施例4中洗脱过程中收集的新蛇菊苷A、甜菊苷、新蛇菊苷B和新蛇菊苷D的质量(mass)，即显示了相对于洗脱液的乙醇浓度，在pH 2下的SP洗脱过程中的糖苷回收。
图8为实施例5中进样、冲洗和洗脱过程中的糖苷浓度图，显示了上样、冲洗和洗脱过程中的糖苷浓度。
图9显示了实施例5中洗脱过程中收集的新蛇菊苷A、甜菊苷、新蛇菊苷B和新蛇菊苷D的量，即显示了洗脱过程中收集的RA、Stev、RB和RD的量。
具体实施方式
Reb-B和reb-D具有理想的感官特性。例如，reb-B比reb-A的苦味更少且具有稍微较少的甜味。纯粹的组分感官数据显示了reb-B中苦味的降低，其表明reb-B和reb-A的混合物可具有较少的苦味。与有显著降低苦味的reb-A相比，Reb-D具有类似或更强烈的甜味。由于reb-D和reb-B降低的苦味，预计reb-D、reb-B和reb-A的混合物会具有改善的味道。
本发明提供了富集reb-B和/或reb-D的方法，以利用甜味剂组合物中的理想特性。
本发明方法还可以用于通过使用该工艺而从包含reb-A的组合物中去除至少一部分reb-B和/或reb-D，产生包含reb-A的经富集的组合物。
在本发明方法中，衍生自甜叶菊的糖苷溶液可以是从甜叶菊叶提取物制备的溶液，或者衍生自甜叶菊的糖苷溶液可以是结晶工艺的母液。在一些实施方案中，当期待多个富集步骤时，衍生自甜叶菊的糖苷溶液可以是本发明富集工艺的产物。可以存在于衍生自甜叶菊的糖苷溶液中的糖苷的实例包括reb-A、reb-B、reb-C、reb-D、reb-F、甜菊苷、杜尔可苷-A(dulcoside-A)、甜菊双糖苷和覆盆子苷。
在一些实施方案中，在本发明方法中用作原料的衍生自甜叶菊的糖苷溶液包含浸渍水(steep water)，该浸渍水通过以约10：1的水对叶子的比率至约100：1的水对叶子的比率，更通常为约20：1至约50：1将甜叶菊叶浸渍在水中而制备。浸渍通常进行约1至约24小时，更通常为约2小时。浸渍水通常含有约0.1至约5.0重量％的固体，更通常约1至约2重量％的固体。浸渍水还可以以逆流或并流提取通过多次叶提取而制备，以改进衍生自甜叶菊的糖苷的回收。
存在于浸渍水中的固体通常为约15至约30重量％的糖苷，更通常约20重量％至约25重量％的糖苷。存在的糖苷根据甜叶菊叶的种类而变化。通常，reb-A和甜菊苷占所存在糖苷的约50％至约80％，reb-A对甜菊苷的比率为约4：1至约1：4，更通常约2：1至约1：2。
在一些实施方案中，衍生自甜叶菊的糖苷溶液可以在吸附之前浓缩。该溶液可浓缩至10-50重量％的固体，更通常为20-40％(g固体/100g溶液)。
在一些实施方案中，在本发明方法中用作原料的衍生自甜叶菊的糖苷溶液包含主体量的reb-A和一种或多种选自reb-B和reb-D的杂质。通常，不纯的reb-A组合物中reb-B和reb-D的总量可以变化为至多约6重量％。例如，在一些实施方案中，不纯的reb-A组合物包含约90重量％至约96重量％的reb-A；约1重量％至4重量％的reb-B；和约1重量％至约4重量％的reb-D。
在一些实施方案中，在本发明方法中用作原料的衍生自甜叶菊的糖苷溶液包含从甜叶菊叶部分纯化的提取物，其含有约10重量％至约90重量％的reb-A；约0重量％至约40重量％的甜菊苷；约0重量％至约5重量％的reb-B；和约0重量％至约5重量％的reb-D。在其他的实施方案中，衍生自甜叶菊的糖苷溶液包含约80重量％的甜菊醇糖苷(steviolglycoside)；约40重量％至约80重量％的reb-A；约20至约40重量％的甜菊苷；约1至约5重量％的reb-B，和约1至约5重量％的reb-D。
在许多实施方案中，衍生自甜叶菊的糖苷溶液包含溶剂。对于衍生自甜叶菊的糖苷溶液的溶剂组合物通常包括水、或低级醇(如C1-C3醇)与水的混合物。低级醇的实例包括甲醇、乙醇和丙醇(如正丙醇和异丙醇)。也可以使用两种或更多种醇与水的混合物。在许多实施方案中，溶剂组合物仅包含水。在其他的实施方案中，基于溶剂组合物总重，溶剂组合物包含约5重量％至约30重量％的低级醇和约95重量％至约70重量％的水。更通常地，溶剂组合物包含5重量％至约20重量％的低级醇和约95重量％至约80重量％的水。
衍生自甜叶菊的糖苷溶液通常包含约1重量％至约20重量％的溶解固体和约99重量％至约80重量％的溶剂。在一些实施方案中，衍生自甜叶菊的糖苷溶液包含约2重量％至约5重量％的溶解固体和约98重量％至约95重量％的溶剂。
在本发明方法中，固定相吸附剂包括大孔中性吸附树脂。可用的固定相吸附剂包括二乙烯基苯大孔树脂，如以 “DIAIONTMHP20”和“DIAIONTMHP21”(购自Mitsubishi)和“AMBERLITETMFPX66”(购自Dow)的商品名市售的那些树脂。SP70被报导具有800m2/g的表面积、70埃的孔半径和0.45mm的平均粒径。FPX66被描述为具有700m2/g表面积和0.6至0.75mm粒径的大孔芳族聚合物。
在一些实施方案中，有利的是将衍生自甜叶菊的糖苷溶液的pH调节为约7至约11的pH。在其他的实施方案中，衍生自甜叶菊的糖苷溶液的pH可调节为约8至约11的pH。在另外其他的实施方案中，衍生自甜叶菊的糖苷溶液的pH可调节至约8至约10的pH。在另外其他的实施方案中，衍生自甜叶菊的糖苷溶液的pH可调节至约9。pH通常通过加入碱来调节。可用的碱包括氢氧化钠、氢氧化钾、氧化钙(石灰)或氢氧化钙。
在其他的实施方案中，衍生自甜叶菊的糖苷溶液的pH可调节为约4至约7。在另外其他的实施方案中，衍生自甜叶菊的糖苷溶液的pH可调节为约5至约6。在另外其他的实施方案中，衍生自甜叶菊的糖苷溶液的pH可调节为约1至约4。在另外其他的实施方案中，衍生自甜叶菊的糖苷溶液的pH可调节为约1至约3。在另外其他的实施方案中，衍生自甜叶菊的糖苷溶液的pH可调节至约2。
对pH的调节可用于改变吸附树脂对reb-B的结合特性。例如，增大pH可以将reb-B从与吸附树脂的强结合改变为与吸附树脂的弱结合。pH的降低可以使得reb-B与树脂强结合。通过调节pH，可以改变reb-B的洗脱性质，以提供理想的富集曲线。以下提供reb-B对各种吸附树脂的结合性质的归纳。
树脂 pH reb-B
FPX66 5 强结合剂
SP710 9 弱结合剂
SP710 5 强结合剂
SP70 9 弱结合剂
SP70 5 强结合剂
将衍生自甜叶菊的糖苷溶液加至吸附树脂上之后，随后将一种或多种洗脱溶剂加入通过吸附床以洗脱一种或多种经富集部分(fraction)。在许多实施方案中，配制洗脱溶剂以使至少一部分被吸附的reb-B和/或reb-D从吸附剂释放并从床上洗脱。用于洗脱reb-B和/或reb-D的可用的洗脱溶剂包括例如C1-C3醇/水溶液(如乙醇/水溶液)。
本发明富集方法可用于制备包含reb-B、reb-D或reb-B和reb-D两者的经富集的组合物。此外，该方法可以用于从reb-A组合物中去除reb-B和/或reb-D，从而增加reb-A的相对纯度。如本文中使用的，术语“经富集的”意为相比起始组合物中存在的其他糖苷，基于干固体的经富集组分的量的增加。例如，在经富集的组合物中，相对被用作富集工艺的起始组合物的衍生自甜叶菊的糖苷组合物中存在的量，基于干固体的reb-B、reb-D或两者的量增加。例如，在一些实施方案中，经纯化的reb-B和/或reb-D溶液可以包含基于糖苷的约25至约90重量％的reb-A、约10至约50重量％的reb-D；以及0至约2重量％的reb-B。在其他的实施方案中，经纯化的reb-B和/或reb-D溶液包含基于糖苷的约25至约60重量％的reb-A、约10至约50重量％的reb-D；以及5至约2重量％的reb-B。
在本发明的一些实施方案中，可以进行多次富集工艺以增加经富集的组合物的最终纯度。例如，第一次分离而来的经富集的组合物可以加至第二色谱床中以进一步富集该组合物中的reb-B、reb-D或它们的混合物。
由各种比率的乙醇和水组成的洗脱溶剂可用于优选地洗脱富集reb-B、reb-D或reb-B和reb-D组合的组合物。申请人出人意料地发现，与仔细调节衍生自甜叶菊的糖苷溶液的pH相结合，洗脱溶剂中乙醇和水比率的微小改变即可洗脱富集reb-B、reb-D或它们的组合的组合物。
Reb-B和Reb-D的富集
在某些实施方案中，reb-B和reb-D可被优选地洗脱。在这些实施方案中，衍生自甜叶菊的糖苷溶液的pH可以是约7至约11。在其他的实施方案中，衍生自甜叶菊的糖苷溶液的pH可调节为约8至约11。在另外的其他实施方案中，衍生自甜叶菊的糖苷溶液的pH可调节为约8至约10。在另外的其他实施方案中，衍生自甜叶菊的糖苷溶液的pH可调节至约9。
仔细调节pH之后，可以通过洗脱溶剂的乙醇/水比率的调节来优选洗脱reb-B和reb-D。在一个示例性的实施方案中，可以使用含约10-50％w/w的乙醇和约50-90％w/w的水的溶剂来优选洗脱reb-B和reb-D。在其他的实施方案中，洗脱溶剂含约10-40％w/w的乙醇和约60-90％w/w的水。在另外的其他实施方案中，洗脱溶剂含约20-35％w/w的乙醇和约65-80％w/w的水。在另外的其他实施方案中，洗脱溶剂含约25-33％w/w的乙醇和约67-75％w/w的水。通常，洗脱溶剂对糖苷溶液的重量比率为约20:1至1:100(洗脱溶剂份数：糖苷溶液份数)，更通常为约10:1至1:20(洗脱溶剂份数：糖苷溶液份数)。溶剂比率很大程度取决于含糖苷溶液中糖苷的浓度。
在洗脱富集reb-B和reb-D的组合物之后，使用适合的后续洗脱溶剂可将剩余的被吸附的糖苷从树脂上脱附。相比用于优选洗脱reb-B和reb-D的溶剂，该后续洗脱溶剂由百分比更大的乙醇组成。用该后续洗脱溶剂洗脱的组合物可富集reb-A。在一些实施方案中，该后续洗脱溶剂含约36-100％w/w的乙醇和约0-64％w/w的水。该后续洗脱溶剂还可含例如约40-80％w/w的乙醇和约20-60％的水。
Reb-D的富集
在其他的某些实施方案中，reb-D可以被优选地洗脱。在这些实施方案中，衍生自甜叶菊的糖苷溶液的pH可以是约4至约7。在其他实施方案中，衍生自甜叶菊的糖苷溶液的pH可调节为约5至约7。在另外的其他实施方案中，衍生自甜叶菊的糖苷溶液的pH可调节为约5至约6。在仔细调节pH之后，可以通过洗脱溶剂乙醇/水比率的调节来优选洗脱reb-D。在一些实施方案中，洗脱溶剂含约10-40％w/w的乙醇和约60-90％w/w的水。在其他实施方案中，洗脱溶剂含约20-35％w/w的乙醇和约65-80％w/w的水。在另外的其他实施方案中，洗脱溶剂含约25-33％w/w的乙醇和约67-75％w/w的水。在洗脱富集reb-D的组合物之后，使用适合的后续洗脱溶剂可将剩余的被吸附糖苷从树脂上脱附。相比用于优选洗脱reb-D的溶剂，该后续洗脱溶剂由百分比更大的乙醇组成。用该后续洗脱溶剂洗脱的组合物可富集reb-A和reb-B。在一些实施方案中，该后续洗脱溶剂含约36-100％w/w的乙醇和约0-64％w/w的水。该后续洗脱溶剂还可含例如约40-80％w/w的乙醇和约20-60％的水。
Reb-B的富集
在某些其它的实施方案中，可以获得富集reb-B的组合物。这些实施方案可以使用一系列的洗脱。在这些实施方案中，衍生自甜叶菊的糖苷溶液的pH可以为约1至约4。在其他的实施方案中，衍生自甜叶菊的糖苷溶液的pH可调节为约1至约3。在另外的其他实施方案中，衍生自甜叶菊的糖苷溶液的pH可调节至约2。在这些实施方案中，选择衍生自甜叶菊的糖苷溶液的pH，以使得reb-B非常强地与树脂结合。
在这些实施方案中，大部分的衍生自甜叶菊的糖苷被首先洗脱。在一些实施方案中，洗脱溶剂含约30-70％w/w的乙醇和约30-70％w/w的水。在其他的实施方案中，洗脱溶剂含约40-60％w/w的乙醇和约40-60％w/w的水。在另外的其他实施方案中，洗脱溶剂含约45-55％w/w的乙醇和约45-55％w/w的水。该经洗脱的组合物富集reb-A和reb-D。在洗脱该富集reb-A和reb-D的组合物之后，可以使用适合的后续洗脱溶剂然后将富集reb-B的组合物从树脂上脱附。相比用于洗脱富集reb-A和reb-D的组合物的溶剂，该后续洗脱溶剂由百分比更大的乙醇组成。在一些实施方案中，后续洗脱溶剂含约60-100％w/w的乙醇和约0-40％w/w的水。在一些实施方案中，后续洗脱溶剂含约70-100％w/w的乙醇和约0-30％w/w的水。用该后续洗脱溶剂洗脱的组合物可富集reb-B。
在调节pH以使reb-B非常强地与树脂结合的本发明的实施方案中，使用多次洗脱以及每次洗脱中乙醇/水比率的仔细调节，可使富集reb-D、reb-A和reb-B的组合物被单独洗脱。在该实施方案中，reb-D可以首先从柱上洗脱。在一些实施方案中，洗脱富集reb-D的组合物的洗脱溶剂含约10-40％w/w的乙醇和约60-90％w/w的水。在其他的实施方案中，洗脱富集reb-D的组合物的洗脱溶剂含约20-35％w/w的乙醇和约65-80％w/w的水。在另外其他的实施方案中，洗脱富集reb-D的组合物的洗脱溶剂含约25-33％w/w的乙醇和约67-75％w/w的水。
在洗脱富集reb-D的组合物后，然后使用适合的后续洗脱溶剂来洗脱富集reb-A的组合物。在一些实施方案中，该后续洗脱溶剂含约40-60％w/w的乙醇和约40-60％w/w的水。在其他实施方案中，该后续洗脱溶剂含约45-55％w/w的乙醇和约45-55％w/w的水。
在洗脱富集reb-A的组合物后，然后使用适合的进一步后续的洗脱溶剂洗脱富集reb-B的组合物。在一些实施方案中，该进一步后续的洗脱溶剂含约60-100％w/w的乙醇和约0-40％w/w的水。在其他的实施方案中，该进一步后续的洗脱溶剂含约65-90％w/w的乙醇和约10-35％w/w的水。在另外的其他实施方案中，该进一步后续的洗脱溶剂含约70-85％w/w的乙醇和约15-30％w/w的水。
从本发明得到的reb-D富集部分可基于糖苷包含约10重量％至约50重量％的reb-D，并且基本上不含reb-B。从本发明得到的reb-B富集部分可基于糖苷包含约1重量％至约5重量％的reb-B，并且基本上不含reb-D。
现将参考以下的非限制性实施例描述本发明。
实施例
实施例中使用以下缩写。
RD或reb-D：新蛇菊苷-D
RA或reb-A：新蛇菊苷-A
Stv：甜菊苷
RC或Reb-C：新蛇菊苷-C
RF或Reb-F：新蛇菊苷-F
RB或Reb-B：新蛇菊苷-B
SB：甜菊双糖苷
208：新蛇菊苷-A的异构体
SP710：Diaion Sepabead SP710
EtOH：乙醇
实施例1
用室温水提取甜菊叶，获得具有0.58％的溶解固体和pH 5.8的提取物。将370ml体积的浸渍水通过填充SP710树脂、并保持在50℃的25ml的柱子。用148ml的水进一步冲洗柱。合并在进样和初始水冲洗过程中通过的物料用于分析，并将其记为通过部分。连续用50ml的乙醇浓度增大的20至60％(w/w)的乙醇和40至80％(w/w)的水洗脱该柱，并在每次乙醇洗脱之间用35ml水漂洗。收集每次的漂洗水和在每个不同浓度下的乙醇洗脱液，混合并干燥用于分析。图2是对于每次洗脱的各糖苷的回收。约50％的质量没有吸附在柱上，而在被吸附的质量中，其大多数被浓度为40％(w/w)的乙醇和60％(w/w)的水从柱子洗脱。Reb-D在reb-A和甜菊苷之前用最高约30％浓度的乙醇的洗脱出柱子。
相比初始的叶提取物，30％(w/w)的乙醇和70％(w/w)的水所洗脱的部分富集reb-D。
糖苷％
RA Stv RC RB SB RD
进料 36.10 55.32 7.11 0.00 0.00 1.47
30％乙醇 32.56 40.65 3.65 0.08 0.57 22.49
申请人注意到尽管本实施例和其他实施例在升高的温度下进行，但本文描述的方法也可以在环境温度下进行。
实施例2
用室温水提取甜菊叶，用氯化铁和石灰对其进行处理，并过滤以产生具有0.79％的固体和pH 9.5的浸渍水。将400ml的体积以1.6个床体积/小时(BV/hr)通过保持在50℃的25ml SP710柱。用75ml的水冲洗柱，并与在初始进样过程中通过柱的物料合并，并将其记为通过部分。用50ml的乙醇和水的浓度增大的20至70％(w/w)的乙醇和30至80％(w/w)的水，将甜叶菊糖苷洗脱出柱。每次乙醇洗脱之间使用50ml水漂洗柱，并在干燥前将漂洗水与每个浓度的乙醇部分合并。图3是不同乙醇浓度下洗脱样品的糖苷曲线。在该pH下，reb-D、reb-B和甜菊双糖苷在大部分reb-A和甜菊苷之前用30％(w/w)的乙醇和70％(w/w)的水首先洗脱出柱。
相比进料，30％(w/w)的乙醇和70％(w/w)的水洗脱的部分富集了reb-D、reb-B和甜菊双糖苷。
％糖苷
RA Stv RC RD RB SB
Fe/石灰 38.9 52.7 7.4 0.41 0.32 0.31
30％的乙醇洗脱液 31.7 25.3 1.5 31.6 4.2 5.7
实施例3
将填充有SP70树脂的150ml玻璃柱用2个床体积的15重量％的乙醇/85重量％的水溶液平衡。使用15重量％的乙醇/85重量％的水溶液以及含83.9％的reb-A、2.1％的reb-D、4.0％的reb-B和1.6％的甜菊苷的甜叶菊提取物批料制备2重量％的溶液。该溶液以约18.5个床体积通过柱，随后用15重量％的乙醇/85重量％的水溶液洗脱2个床体积，并用100重量％的乙醇脱附3个床体积。进样、洗脱和脱附在55℃下以2BV/hr的流速进行。将物料收集于约50ml样品中，在真空烘箱中80℃下干燥，并通过HPLC分析，以鉴定每个样品中的糖苷浓度。
图4是进样过程中从柱洗脱的糖苷浓度。图5是用15％的乙醇/85重量％的水溶液冲洗和以100％乙醇洗脱过程中从柱子洗脱的糖苷浓度。通过分离10-15个BV流出物，物料会富集RD。经合并的提取物可具有以下组成：
RebA 79.75％
甜菊苷 2.14％
RebC 0.37％
RebD 11.00％
RebB 3.52％
实施例4
将填充有SP70树脂的160ml柱用水平衡，随后进样1440ml的每100g含5g甜叶菊提取物的水溶液，并通过加入柠檬酸将pH调节至2.0。将保持在55℃下的柱以2.5BV/hr进样。然后最初用1.5个BV的水冲洗柱，随后用从0％乙醇开始至100％乙醇结束的乙醇线性梯度洗脱4个BV。最后用100％的乙醇将柱洗脱0.5个BV。甜叶菊提取物包含45.6％的RA、31.8％的Stev、1.3％的RF、9.4％的RC、1.5的RD、2.1％的RB、0.8％的杜克苷A和1.3％的甜菊双糖苷。图6为进样、冲洗和洗脱过程中的糖苷浓度。图7显示了洗脱过程中收集的RA、Stev、RB和RD的质量。RD首先用30％(w/w)的乙醇和70％(w/w)的水洗脱；RA和Stev用50％(w/w)的乙醇和50％(w/w)的水洗脱；而RB用70％(w/w)的乙醇和30％(w/w)的水洗脱。收集30％的乙醇洗脱液、50％的乙醇洗脱液和70％的乙醇洗脱液分别可使提取物分离为RD富集的、RA/Stev富集的和RB富集的料流。可选地，收集进样过程中穿透柱的3.5-5.5个BV的糖苷而得到RB和RD富集的产物。
实施例5
将填充有SP70树脂的120ml柱用水平衡，随后进样1025ml的每100g含5g甜叶菊提取物的水溶液，并通过加入氢氧化钾将pH调节至9.0。将保持在55℃下的柱子以2.5BV/hr进样。然后最初用1.5个BV的水冲洗柱，随后用从0％乙醇开始至100％乙醇结束的乙醇线性梯度洗脱4个BV。最后，最后用100％的乙醇将柱洗脱4个BV。甜叶菊提取物包含45.6％的RA、31.8％的Stev、1.3％的RF、9.4％的RC、1.5的RD、2.1％的RB、0.8％的杜克苷A和1.3％的甜菊双糖苷。图8为进样、冲洗和洗脱过程中的糖苷浓度。图9显示了洗脱过程中收集的RA、Stev、RB和RD的质量。RB和RD首先用30％(w/w)的乙醇和70％(w/w)的水洗脱；RA和Stev用50％(w/w)乙醇和50％(w/w)水洗脱；收集30％的乙醇洗脱液和50％的乙醇洗脱液，分别可使提取物分离为RB/RD富集和RA/Stev富集的料流。
考虑本说明书或从本文公开的发明实践，本发明的其他实施方案对于本领域技术人员是显而易见的。本领域技术人员可以做出对本发明所描述原理和实施方案的各种省略、修改和变化而不背离以下权利要求所表示的本发明真实的范围和精神。

Claims (4)

1.制备包含新蛇菊苷B、新蛇菊苷D的至少一种或它们的混合物的经富集的组合物的方法，该方法包括以下步骤：
(A)提供衍生自甜叶菊的糖苷溶液，其包含：(i)reb-B和reb-D和(ii)reb-A，其中所述衍生自甜叶菊的糖苷溶液的pH为5至6；
(B)提供大孔中性吸附树脂；
(C)使大孔中性吸附树脂与衍生自甜叶菊的糖苷溶液接触，以使衍生自甜叶菊的糖苷溶液中的至少一部分糖苷被吸附至大孔中性吸附树脂上；
(D)提供至少一种包含乙醇和水的混合物的洗脱溶剂，所述洗脱溶剂包含20-35％w/w的乙醇和65-80％w/w的水；
(E)使来自步骤(C)的具有吸附的糖苷的大孔中性吸附树脂与所述乙醇和水的洗脱溶剂接触，以洗脱富集reb-D的组合物；和
(F)使步骤(E)的大孔中性吸附树脂与另一种洗脱溶剂接触，以从大孔中性吸附树脂上洗脱至少一部分剩余的被吸附的糖苷，其中该洗脱溶剂比步骤(D)的洗脱溶剂具有更大比例的乙醇，并且洗脱的组合物富含reb-B。
2.权利要求1的方法，其中步骤(D)的洗脱溶剂包含25-33％w/w的乙醇。
3.权利要求1的方法，其中步骤(F)的洗脱溶剂包含36-100％w/w的乙醇和0-64％w/w的水。
4.权利要求1的方法，其中所述方法还包括将所述衍生自甜叶菊的糖苷溶液的pH有意调节至5-6。
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