CN103275972B

CN103275972B - 大白菜抗根肿病CRb基因的连锁分子标记、引物及抗根肿病植株的选择方法

Info

Publication number: CN103275972B
Application number: CN201310132230.9A
Authority: CN
Inventors: 朴钟云; 张腾; 赵�卓; 陈慧慧; 陈静静; 张椿雨; 李宏博; 李海燕; 李艳辉
Original assignee: Shenyang Agricultural University
Current assignee: Shenyang Agricultural University
Priority date: 2012-09-05
Filing date: 2013-04-16
Publication date: 2015-02-04
Anticipated expiration: 2033-04-16
Also published as: CN104726552B; CN104726552A; CN104894228A; CN104894228B; CN103275972A

Abstract

本发明提供了与大白菜抗根肿病CRb基因紧密连锁的5个分子标记、引物及抗病植株的选择方法。这5个标记，分别为TCR25、TCR108、TCR116、TCR30、TCR74，与CRb基因之间的遗传距离分别为0.07cM、0.04cM、0.08cM、0.19cM、0.27cM，可用于芸薹种包括结球白菜和青梗菜抗根肿病基因的分子标记辅助选择。在辅助选择过程中同时使用这些标记，选择理论准确度可达到100%。这5个标记重复性好，可靠性高，检测成本低，省时省力。

Description

大白菜抗根肿病CRb基因的连锁分子标记、引物及抗根肿病植株的选择方法

技术领域

本发明涉及与大白菜抗根肿病基因CRb紧密连锁的分子标记、引物序列以及筛选大白菜抗根肿病植株的方法。

背景技术

2002年，本课题组获得了1份抗芸薹根肿病的大白菜双单倍体系‘CRShinki DH’系，研究表明该抗病材料抗芸薹根肿菌生理小种2、4和8（Piao等，Conversion of AFLP marker linked to clubroot resistance gene into SCAR marker. 2002，J Kor SocHort Sci 43:653–665）。进一步研究证明抗根肿病基因为显性单基因，并命名为CRb （Piao等，SCAR and CAPS mapping of CRb, a gene conferring resistance to Plasmodiophora brassicae in Chinese cabbage （Brassica rapa ssp. pekinensis），Theor Appl Genet，2004，108:1458-1465）。

在芸薹种抗根肿病品种转育过程中，每代都需要采用田间接种根肿病菌的方法鉴定中间材料的基因型，而且环境条件会影响到正确中间材料的选择，这样势必影响转育进程，因此抗病品种转育难的问题还没有彻底解决。分子标记辅助选择技术（MAS）可能是最终解决这一问题的有效途径。

目前，只有国内沈阳农业大学朴钟云等（2004）获得了与芸薹种抗根肿病基因CRb连锁的CAPS标记。其中最近的两个侧翼标记TCR05和TCR09，见（Piao等，SCAR and CAPS mapping of CRb, a geneconferring resistance to Plasmodiophora brassicae in Chinese cabbage（Brassica rapa ssp. pekinensis），TheorAppl Genet，108:1458-1465），但这些标记与CRb的遗传距离较远。因此，本实验在这两个CAPS标记基础上，开发与大白菜抗根肿病基因CRb紧密连锁的标记，精细定位该基因，从而简化大白菜抗根肿病品种的转育程序。

发明内容

发明目的是：

（1）提供与大白菜抗根肿病基因CRb紧密连锁的分子标记；

（2）提供由所述标记的全长序列和PCR引物序列；

（3）提供在对大白菜抗根肿病基因进行辅助选择的过程中对上述标记进行应用的方法。

（4）通过特异引物PCR扩增可对待测植株进行苗期鉴定，大大提高育种效率，缩短了育种进程。

本发明提供的技术方案如下：

1．与大白菜抗根肿病CRb基因紧密连锁的分子标记：TCR25、TCR108、TCR116、TCR30、TCR74分别具有如下核苷酸序列：

（1）TCR25（301bp）：

5’-CGTTTAAATTTGTTTATACGATGCAAATTCACTAGTTTATATGATATATATGTATACTATATATATATTTGATATATATATATATATATATATATATTTGGATTGTAACCACCTCGAATTTTGAGATAATTATCATGTGAAAACGAAGACAAAAAAAAATTATGGGCATATTGATTGTATCTAATAAATTAATCATCCGATTAGTATATTCAAAATTAAAAAAAATCTTTATATTTTAAGAGAAATAGTGATAATGTCAAATATAACACACAAAAAAAATTCATATTCTGTTAATGGGACA-3’

（2）TCR108（1366bp）:

5'-TCTGTCATGTATTATTTAGAACAAAAATATTATTAATATTAATTAACAATATCTTTATATATTTGTCATTTATTTTTATATACTTTTATATACACATACATGTGCACCTTGATGTGAGTACTTTATAAGTATTTACCACTACTGAAATATCTATATTTTTTTTGAAGTTGAAATATTTTTTTCTTAATGCTTCTTTCACTACCGACCAAATTGTAGTGAAATGATTAGTCTTAATAATTTTCTTTTCTTTTTCTTGAACTATTATCCGTTTACAAACTATAATATGAAACCATTGGTTCGACATGACAATTATCTAAAATTTATAACATAAAAATTAACAAATAATAATAATTTTTGGTTTTTACCGAAAAACTAACAAATCAAACATTCTAACAGAAAAAAACCAAAAAATAATTTAAAACCGAACCAATATCTAGATTAAACAGATTTAATGTGTTTTTATTAAAAATAACGAAACTAATAATCACATGCCGCGCAAGGCGCGGATTATTACCTAGTAATTTTAGTAAAAAAAAACATGGCTGTTTTTTTACAGTCATATATATTTTTCTTTGACAATTGATTTGACGTACAGGTATCTGTTCAAAAAATGAGTATCTGACATGACAAAAATAAGATTCAGTTGCATTCGATCTTCTCTTTTTATAGTTGCATTTGATCATTATTTCTATAAAAATACATATGATGCCCAACATGTAGTATTACAAATCGTTATATTTAAATAAGGTAACAAAAATATTTTTTTTATTTAAAAAAACAAAAATATTTTGAAATGCTTTTTCGTTTAGGATTTTAAATAGCCAACTATTAAAATAAAATATAAACCACCGCAAAAGAAAAAAAAGTAACAGCTATCAGAAATTCAGAATATAAAAAACGTATAGGTTCACGGGTCTCCGATATGCCATGGTGGAGTTTCGTAACTACAACTGCATGAAGAGAGCTTTTGAGATGGTTTAAAATTTTAAATCAGTAAAACTGAAAATCGAGAATGTGAATATTTATTATCATTTTCCTTAAATTGTCTATTAAATATCATTAAATTTTAATTTTATTTATCACCAGAAAAGGAAAAGAATCTATAAGATACAGTTAAAAAAAAAGAATCTATAAGATACATATTAGTTGACTGAAAGGAGATTAAATTATAATTAATGTAGACAGAGTACAATGAATTAACATGTTTGATTGGAAAACAGTTTTATATAGTAGTACATTCTTATATATTTAATTTTAAGATTAGAAGTAACACAGAATAAGATACTGATATTATAAAGATGCTTTGACTAGTCAAGGTACACTGTTCCATACGTTTGTGTGCCAAGGAAACATGCATGAGTGCATC-3’

(3)TCR116(1520bp):

5'-CTATATACCATTTTACAAACACCAAAACTGTTAATAAACTAATCAGTTAAGAAGAGATAAGTTGTTTTAACACCTGTTGCTTTGGCGAAAATCAAAACCAAAACCAAAAAGGGTTTTGCCTTCTTCGAATCCCCAACCAAGCATCTCAACAATCATCTCATGGAAGTAGAACACTGACTCGCGTCCAACCATCTACACAAAAGTCTTTGACTTGATCAACAATCTACACAAAGCTAACGTGTAGAGACTATATAAACATTTACCATATCAGGGTCTAAGACATCGATTGCAAGCAGGCCAGCTCTGTCTTGAGGAACCACAATACTCGTGTTTGCGTCGAGAGTGATCGTTTTACCTGTTCCACATGAAAACGTTTCCTCAGAGAGCTTAAACAAAGCTAAAAGCTAATGACTTTTCTATAAAAAATGAAACTTTTTTTTTTGTTTACCAGTTGAAGGATCGAAGCGAGACCACATCTTTGTCCGAAACTCGTGGTCGGCACCGAAGATTCTGACCCAGACACGCTCTTCTTTCCCGGTGTCATGATCAACGGCGTTGAGAATCGAGCCGGCGATACCCGGGACGAGAAGAACCGGGTCGAGAGTCGGGTCAACGTAGGGTTTCTGGGTTGAAGTCTTGAGCTTTAGAAAGGTCTCTACTGATCGAGTGATCTCTTCCAGTAATAAAGCCATTTGTTGAATCGATTTAAGAAAATCCAATTTGGGGAAATTAGGGTTTGTGTGAGAGATGTGAAGACAAAAGGGTGGAACTTTGGAATTTAAGCCGTACAAGTTAAGGAGGGAAGAAAACAATCTTGTAATCTATATCATTTAAATAAATGATTTAATTTTTCAAATGGATAACGTAAGATTGAAATAATTGATACTTCCAATAACAAATTAATTAATAATTTAATAATATTATCTGGGATTCCATTGGGATTATTAATTATTACGATATATTTATGGTTAATGGGTCACAGGCTTATTATATTTTACACAACCCCCTCTATTTTGTTTCTGTTTTCAATTTGTCTCTGACTTTAGATTTGATCACAGAAGCCCACAACCTCAGGGCTCCCGGTTGAGATATCAGCTGGAAAGTCCGGTTCTGGACTTTCAATTTTGTGGAGACAAACAAACCAGTTACAGGATTGGAAAATAGTTTCTAAACTAAATAAAAATTGAGTTACAAGATTTTTTTAATCAACAAGGTCCCTATCAAGATTGTAAATCTTACATGGAGCCTTGCATTTCAGGAAAAGCAATGTTGTAGCCGGAGGAAAAGTTTATTTATGATCAGACCAACATTGTCTCAACTACTGAGACTGCAAACTGTAACATGATAAACATCAAGCTTTTATTTTCTCAAAGCATACTACTCAAACATCACTTTAAAATGTTAAAAGACTCGAACTTTATTTGGCAACTTTCTGTAGACAGAAATCAACTCAAGTGTGAAAACTTTGATCTTTTTATTCATTTGGAGAATCTGTGTCGATCATGAGGCGAGGAGTAATC-3’

（4）TCR30（703bp）：

5’-CGTGGATCTCGTCTTCAGGTACACATCATCGCTTCTTGTCTTTGATCAGATTACTGATTTTGAGACAAAAGTTTCCAACTTTCGATCCGTTTTTCTGTGTCCAAACTAAAATACTCTGTTTTTGTTCATGAAACCTCTGTTTCTCATACTAGGATGCTCTGTTTTTGCTCTTAAACCTCTGTTTCTCAAACTAAAGTCTGATCTTTTGATTTTTTTTTTGGCATAAGTGTACAATAGCAATGGCTCGATCTGCGGTTGATGAGACATCAGACTCGGGAGCATTTCAAAGAACTGCTTCAACATTCCGTAACTTCGTCTCAAGAGATTCCAACTCTCAGTTTCCAGCTGAATCTGGAAGATACCATCTTTACATATCGTATGCTTGTCCATGGGCTTCTAGATGCATCTCATACTTGAAGATTAAAGGACTTGACGATGCTATAAGCTTCTCGGTTCGTTGACTCAAAAGCCCTTTTCAAACTGCTTATGTTCATTACAATAATAGTTTCCTTGTTTGGTTTGCATCAGTCTGTTAAACCCATTTGGGGAAGAACAAAAGAAAGTGATGAGCATATGGGATGGGTCTTCCCGGATTCAGACAATGAGGTCGAAGGAGCTGACTCGGACAATCTTAATGGTGCTAAAAGTGTAAGAGAACTCTATGAGATTGCTAGTCCCAACTACACCGGGAAGTATACTGTTC -3’

（5）TCR74（333bp）：

5’-TTGAACCATAGGAGGGATAGTTGTTATTCATAATTTAATAGGAAAATTTTCAAAATTTTGAGAAATTCATACTAAAATCTTTTGAGAGATGATCAAAATTGTAGTATCTTGTAACAGTTTTTTATATATATATAAAAAAAAAAGGAGACCGGAAACAAAAATGGTTTAATTAATTAATTATTAAAATAACCAAGCCAATTAAAACATTGAAGATTCATATAACTTAGCCCAAAATGAAGAAGTATAAGGCCCAAATAACTAAGATACACAGTGACACTACTACTCCGCGCCAACTAAACGACAGTAATCATCACTCTATCCATCCATCACCAT-3’

2．上述标记TCR25、TCR108、TCR116、TCR30、TCR74的特异性扩增引物分别具有如下序列：

（1）TCR25：

F TCR25: 5’- CGTTTAAATTTGTTTATACGATGCA -3’

R TCR25: 5’- TGTCCCATTAACAGAATATGAATTT -3’

以及由TCR25序列开发的所有引物。

（2）TCR108

F TCR108: 5’- TCTGTCATGTATTATTTAGA-3’

R TCR108: 5’- GATGCACTCATGCATGTTTC-3’

以及由TCR30序列开发的所有引物。

（3）TCR116

F TCR116: 5’-CTATATACCATTTTACAAAC-3’

R TCR116: 5’-GATTACTCCTCGCCTCATGA-3’

以及由TCR30序列开发的所有引物。

（4）TCR30

F TCR30：5’- CGTGGATCTCGTCTTCAGGT-3’

R TCR30：5’-GGAACAGTATACTTCCCGGTGT-3’

以及由TCR30序列开发的所有引物。

（5）TCR74

F TCR74：5’- TTGAACCATAGGAGGGATAGTTG -3’

R TCR74：5’- ATGGATGATGGATGGATAGAGTG -3’

以及由TCR74序列开发的所有引物。

3．上述标记TCR25、TCR108、TCR116、TCR30、TCR74在辅助选择中的应用方法为：

（1）用CTAB等方法对待测材料进行基因组DNA的提取

（2）PCR扩增:

a. 反应体系：10 μL体系，各组分物质的含量分别为15 ng 模板DNA; 5 pmol·L^-1 primer; 1.0 mmol·L^-1 dNTP; 1×PCR Buffer; 0.5 U Taq DNA polymerase; ddH₂O补齐10 μL，混匀，离心；

b. 扩增程序：预变性94℃/5min; 94℃/30s; 60℃/45s; 72℃/30s; 35个循环后; 72℃延伸10min; 最后4 ℃保存。

c. 电泳：

TCR25、TCR30、TCR74：将扩增产物与等体积的上样缓冲液混合（98%formamide, 10 mM EDTA, 0.001% xylene cyanol 和bromphenol blue）。94℃变性6min，之后在DNA测序电泳仪上进行变性聚丙烯酰胺凝胶（6%）电泳，70 W条件下电泳1.5小时。电泳结束后，进行银染。

TCR108、TCR116:将扩增产物与等体积的上样缓冲液混合（98% formamide, 10 mM EDTA, 0.001% xylene cyanol 和bromphenolblue）。之后在琼脂糖凝胶电泳仪上进行琼脂糖凝胶（1%）电泳，100V条件下电泳30分钟。电泳结束后，在紫外灯下观察、成像。

d. 判断

① 在使用TCR25的引物的扩增结果中如果能够检测到两条带(301bp和小于301bp），则带有301bp条带的材料含有大白菜抗根肿病基因CRb的概率约为99.93%。

② 在使用TCR108的引物的扩增结果中如果能够检到条带（1366bp），则带有1336bp条带的材料含有大白菜抗根肿病基因CRb的概率约为99.96%。

③ 在使用TCR116的引物的扩增结果中如果能够检测到条带（1520bp）,则带有1520bp条带的材料含有大白菜抗根肿病基因CRb的概率约为99.92%。

④在使用TCR30的引物的扩增结果中如果能够检测到两条带（703bp和小于703bp），则带有703bp条带的材料含有大白菜抗根肿病基因CRb的概率约为99.81%。

⑤在使用TCR74的引物的扩增结果中如果能够检测到两条带（333bp和小于333bp）,则带有333bp条带的材料含有大白菜抗根肿病基因CRb的概率约为99.73%。

如果①、②、③、④、⑤5项中的扩增结果均可获得，则待测材料具有大白菜抗根肿病基因CRb的概率为100%。

有益效果如下：

上述标记TCR25、TCR108、TCR116、TCR34、TCR74与芸薹种抗根肿病基因CRb紧密连锁，可广泛应用于芸薹种抗根肿病基因CRb的分子标记辅助选择育种。本发明通过特异引物PCR扩增可对待测植株进行苗期鉴定，大大提高育种效率，缩短育种进程。

附图说明

图1：TCR25、TCR108、TCR116、TCR30和TCR74在亲本及部分F₂代个体上的扩增结果；

图1中符号分别表示为：

A: TCR25扩增结果；

B: TCR30扩增结果；

C: TCR74扩增结果；

D:TCR108扩增结果；

E:TCR116扩增结果；

P₁: 抗病亲本‘CR Shinki DH’系，该材料出自文献(Piao等，Conversion of AFLP marker linked to clubroot resistancegene into SCAR marker. 2002，J Kor Soc Hort Sci 43:653–665)包含抗病基因CRb对根肿菌生理小种2、4、8具有抗性;

P₂: 感病亲本‘QG501’;

R：F₂代群体中抗病F₂单株；

S：F₂代群体中感病F₂单株；

*：F₂代群体中在大白菜抗根肿病基因CRb位点和分子标记间发生交换的单株；

箭头所指为抗病基因连锁标记；

图2：大白菜抗根肿病 CRb 基因的标记连锁图；

具体实施方式

实施例1：大白菜抗根肿病基因CRb紧密连锁标记的获得

一、分离群体的构建

以含抗根肿病基因CRb的大白菜‘CR Shinki DH’系为父本，易感染根肿病的青梗菜自交系‘QG501’为母本杂交获得F₁，所获F₁代植株全部表现为抗病。以上两个亲本‘CR Shinki DH’和‘QG501’均保存于沈阳农业大学。选择单株F₁自交构建F₂代作图群体，群体数为2896个。在播种的全部2896个F₂群体中，于2012年8月初种植于沈阳农业大学百草园温室，十天后接种根肿菌。于同年9月进行抗病性鉴定，2896个F₂群体中2203个抗病，693个感病，经卡方检验符合2:1的分离比（χ²=1.67<χ² _0.05=3.84）。选31个抗病个体自交获得F_2:3家系用于抗病性鉴定，31个F_2:3家系中，全部抗病有9个，出现分离的有14个，全部感病有8个，经卡方测验符合1: 2:1的分离比例(χ²=0.3476< χ² _0.05,2=5.99)。

二、DNA的提取

1.在1.5ml离心管中加入498 uL 1×CTAB提取液（2% CTAB，100mmol/L Tris-HCl，20mmol/L EDTA，1.4mol/L NaCl，）以及2 uLβ-巯基乙醇，摇匀；

2.取0.2g幼嫩叶片，在液氮条件下研磨至粉末，加入到含有CTAB提取液和β-巯基乙醇的离心管中，摇匀；

3.随后将离心管放入65℃水浴中，每隔5分钟摇一次，水浴30min；

4.取出离心管，加入等体积的氯仿:异戊醇混合物（24:1），摇晃10min后，常温下12000r/min离心10min；

5.将上清液转移到另一离心管中，加入等体积的氯仿:异戊醇（24:1）,摇晃10min后，常温下12000r/min离心10min；

6.将上清液移至另一离心管当中，加入2倍体积事先预冷的无水乙醇，混匀后，将抱团的DNA挑入到装有400uL TE缓冲液的离心管中溶解；

7.加入1.5uL RNaseA（10ug/uL）,混匀后37℃保存30min；

8.重复步骤5；

9.将上清液转移到另一离心管中，向离心管中加入50uL 3mol/L NaAC溶液和预冷的等体积的异丙醇，-20℃沉淀20min；

10.4℃条件下12000r/m离心10min，弃掉上清液，加入75%的乙醇清洗2次；

11.在超净工作台上风干DNA，加入50 μL TE（Tris-EDTA）溶解DNA，-20 ℃冰箱中保存。

实施例2：大白菜抗根肿病基因CRb连锁的标记的获得和鉴定

一、多态性引物的筛选

根据piao等2004年发表的抗根肿病CRb基因的2个侧翼标记TCR05和TCR09序列（Piao等，SCAR and CAPS mapping of CRb, a geneconferring resistanceto Plasmodiophora brassicae in Chinese cabbage (Brassica rapa ssp. pekinensis)，Theor Appl Genet，108:1458-1465)，发现该基因位于芸薹种A3染色体205 kb区间。自Brassica Database数据库网站（http://brassicadb.org）下载该序列，分析发现该区段序列存在19个基因和30个SSR。随机选择其中5个基因和25个SSR，利用Primer5.0软件设计引物，共设计引物35对。

利用设计的35对引物扩增亲本‘CR Shinki DH’系和‘QG501’的DNA，筛选出5个亲本间具有多态性的标记，分别命名为TCR25、TCR108、TCR16和TCR30和TCR74为这5个分子标记的序列分别为：

（1）TCR25（301bp）：

（2）TCR108（1366bp）:

(3)TCR116(1520bp):

（4）TCR30（703bp）：

（5）TCR74（333bp）：

根据上述序列分别设计并合成了一对引物，并命名为F TCR25/R TCR25、F 108/R TCR108、F TCR116/R TCR116、F TCR30/R TCR30、F TCR74/R TCR74序列如下：

（1）TCR25：

F TCR25: 5’- CGTTTAAATTTGTTTATACGATGCA -3’

R TCR25: 5’- TGTCCCATTAACAGAATATGAATTT -3’

（2）TCR108

F TCR108: 5’- TCTGTCATGTATTATTTAGA-3’

R TCR108: 5’- GATGCACTCATGCATGTTTC-3’

（3）TCR116

F TCR116: 5’-CTATATACCATTTTACAAAC-3’

R TCR116: 5’-GATTACTCCTCGCCTCATGA-3’

（4）TCR30

F TCR30：5’- CGTGGATCTCGTCTTCAGGT-3’

R TCR30：5’-GGAACAGTATACTTCCCGGTGT-3’

（5）TCR74

F TCR74：5’- TTGAACCATAGGAGGGATAGTTG -3’

R TCR74：5’- ATGGATGATGGATGGATAGAGTG -3’

二、分子标记的鉴定

为了验证这些分子标记的可靠性，对含抗根肿病基因CRb的大白菜‘CR Shinki DH’系和易感根肿病的青梗菜自交系‘QG501’及其2896个F₂代个体进行了PCR扩增。扩增结果表明，使用TCR25的引物F TCR25/ R TCR25进行扩增，在抗病亲本‘CR Shinki DH’系和F₂代个体上均能扩增出一条301bp的条带，在感病亲本‘QG501’和F₂代个体上均能扩增出一条小于301 bp的条带，（附图 1A）；使用TCR30的引物F TCR30/ R TCR30进行扩增，在抗病亲本‘CR Shinki DH’系和F₂代个体上均能扩增出一条703bp的条带，在感病亲本‘QG501’和F₂代个体上均能扩增出一条小于703bp的条带 (附图 1B)；使用TCR74的引物F TCR74/R TCR74进行扩增，在抗病亲本‘CR Shinki DH’系和F₂代个体上均能扩增出一条333bp的条带，在感病亲本‘QG501’和F₂代个体上均能扩增出一条小于333bp的条带 (附图 1C)；使用TCR108的引物F TCR108/R TCR108进行扩增，在抗病亲本‘CR Shinki DH’ 系和F₂代个体上均能扩增出一条1366bp的条带，在感病亲本‘QG501’和F₂代个体上均不能扩增出条带 (附图 1D)；使用TCR116的引物F TCR116/ RTCR116进行扩增，在抗病亲本‘CR Shinki DH’系和F₂代个体上均能扩增出一条1520bp的条带，在感病亲本‘QG501’和F₂代个体上均不能扩增出条带 (附图 1E)。

三、遗传图谱构建

根据F₂群体的筛选结果，利用JOINMAP 4.0软件构建CRb基因的遗传连锁图谱（附图 2），由图可知TCR25、TCR108、TCR116、TCR30、TCR74，分别定位于距离CRb基因0.07cM、0.04cM、0.08cM、0.19cM、0.27cM处。

实施例3：5个与大白菜抗根肿病基因CRb连锁分子标记在辅助选择大白菜抗根肿病植株中的应用

一、基因组DNA的提取

按实施例1中的方法进行基因组DNA的提取

二、PCR扩增:

a. 反应体系：10 μL体系，各组分物质的含量分别为15 ng template; 5 pmol·L^-1 primer; 1.0 mmol·L^-1 dNTP; 1×PCRBuffer; 0.5 U Taq DNA polymerase; ddH₂O补齐10 μL，混匀，离心；

三、电泳：

四、结果分析

SEQUENCE LISTING

<110> 沈阳农业大学

<120> 大白菜抗根肿病CRb基因的连锁分子标记、引物及抗根肿病植株的选择方法

<160> 15

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 301

<212> DNA

<213> 大白菜（Brassica rapa spp. pekinnesis)

<400> 1

cgtttaaatt tgtttatacg atgcaaattc actagtttat atgatatata tgtatactat 60

atatatattt gatatatata tatatatata tatatatttg gattgtaacc acctcgaatt 120

ttgagataat tatcatgtga aaacgaagac aaaaaaaaat tatgggcata ttgattgtat 180

ctaataaatt aatcatccga ttagtatatt caaaattaaa aaaaatcttt atattttaag 240

agaaatagtg ataatgtcaa atataacaca caaaaaaaat tcatattctg ttaatgggac 300

a 301

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 大白菜（Brassica rapa spp. pekinnesis)

<400> 2

cgtttaaatt tgtttatacg atgca 25

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 大白菜（Brassica rapa spp. pekinnesis)

<400> 3

tgtcccatta acagaatatg aattt 25

<210> 4

<211> 1366

<212> DNA

<213> 大白菜（Brassica rapa spp. pekinnesis)

<400> 4

tctgtcatgt attatttaga acaaaaatat tattaatatt aattaacaat atctttatat 60

atttgtcatt tatttttata tacttttata tacacataca tgtgcacctt gatgtgagta 120

ctttataagt atttaccact actgaaatat ctatattttt tttgaagttg aaatattttt 180

ttcttaatgc ttctttcact accgaccaaa ttgtagtgaa atgattagtc ttaataattt 240

tcttttcttt ttcttgaact attatccgtt tacaaactat aatatgaaac cattggttcg 300

acatgacaat tatctaaaat ttataacata aaaattaaca aataataata atttttggtt 360

tttaccgaaa aactaacaaa tcaaacattc taacagaaaa aaaccaaaaa ataatttaaa 420

accgaaccaa tatctagatt aaacagattt aatgtgtttt tattaaaaat aacgaaacta 480

ataatcacat gccgcgcaag gcgcggatta ttacctagta attttagtaa aaaaaaacat 540

ggctgttttt ttacagtcat atatattttt ctttgacaat tgatttgacg tacaggtatc 600

tgttcaaaaa atgagtatct gacatgacaa aaataagatt cagttgcatt cgatcttctc 660

tttttatagt tgcatttgat cattatttct ataaaaatac atatgatgcc caacatgtag 720

tattacaaat cgttatattt aaataaggta acaaaaatat tttttttatt taaaaaaaca 780

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ataaaccacc gcaaaagaaa aaaaagtaac agctatcaga aattcagaat ataaaaaacg 900

tataggttca cgggtctccg atatgccatg gtggagtttc gtaactacaa ctgcatgaag 960

agagcttttg agatggttta aaattttaaa tcagtaaaac tgaaaatcga gaatgtgaat 1020

atttattatc attttcctta aattgtctat taaatatcat taaattttaa ttttatttat 1080

caccagaaaa ggaaaagaat ctataagata cagttaaaaa aaaagaatct ataagataca 1140

tattagttga ctgaaaggag attaaattat aattaatgta gacagagtac aatgaattaa 1200

catgtttgat tggaaaacag ttttatatag tagtacattc ttatatattt aattttaaga 1260

ttagaagtaa cacagaataa gatactgata ttataaagat gctttgacta gtcaaggtac 1320

actgttccat acgtttgtgt gccaaggaaa catgcatgag tgcatc 1366

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 大白菜（Brassica rapa spp. pekinnesis)

<400> 5

tctgtcatgt attatttaga 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 大白菜（Brassica rapa spp. pekinnesis)

<400> 6

gatgcactca tgcatgtttc 20

<210> 7

<211> 1520

<212> DNA

<213> 大白菜（Brassica rapa spp. pekinnesis)

<400> 7

ctatatacca ttttacaaac accaaaactg ttaataaact aatcagttaa gaagagataa 60

gttgttttaa cacctgttgc tttggcgaaa atcaaaacca aaaccaaaaa gggttttgcc 120

ttcttcgaat ccccaaccaa gcatctcaac aatcatctca tggaagtaga acactgactc 180

gcgtccaacc atctacacaa aagtctttga cttgatcaac aatctacaca aagctaacgt 240

gtagagacta tataaacatt taccatatca gggtctaaga catcgattgc aagcaggcca 300

gctctgtctt gaggaaccac aatactcgtg tttgcgtcga gagtgatcgt tttacctgtt 360

ccacatgaaa acgtttcctc agagagctta aacaaagcta aaagctaatg acttttctat 420

aaaaaatgaa actttttttt ttgtttacca gttgaaggat cgaagcgaga ccacatcttt 480

gtccgaaact cgtggtcggc accgaagatt ctgacccaga cacgctcttc tttcccggtg 540

tcatgatcaa cggcgttgag aatcgagccg gcgatacccg ggacgagaag aaccgggtcg 600

agagtcgggt caacgtaggg tttctgggtt gaagtcttga gctttagaaa ggtctctact 660

gatcgagtga tctcttccag taataaagcc atttgttgaa tcgatttaag aaaatccaat 720

ttggggaaat tagggtttgt gtgagagatg tgaagacaaa agggtggaac tttggaattt 780

aagccgtaca agttaaggag ggaagaaaac aatcttgtaa tctatatcat ttaaataaat 840

gatttaattt ttcaaatgga taacgtaaga ttgaaataat tgatacttcc aataacaaat 900

taattaataa tttaataata ttatctggga ttccattggg attattaatt attacgatat 960

atttatggtt aatgggtcac aggcttatta tattttacac aaccccctct attttgtttc 1020

tgttttcaat ttgtctctga ctttagattt gatcacagaa gcccacaacc tcagggctcc 1080

cggttgagat atcagctgga aagtccggtt ctggactttc aattttgtgg agacaaacaa 1140

accagttaca ggattggaaa atagtttcta aactaaataa aaattgagtt acaagatttt 1200

tttaatcaac aaggtcccta tcaagattgt aaatcttaca tggagccttg catttcagga 1260

aaagcaatgt tgtagccgga ggaaaagttt atttatgatc agaccaacat tgtctcaact 1320

actgagactg caaactgtaa catgataaac atcaagcttt tattttctca aagcatacta 1380

ctcaaacatc actttaaaat gttaaaagac tcgaacttta tttggcaact ttctgtagac 1440

agaaatcaac tcaagtgtga aaactttgat ctttttattc atttggagaa tctgtgtcga 1500

tcatgaggcg aggagtaatc 1520

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 大白菜（Brassica rapa spp. pekinnesis)

<400> 8

ctatatacca ttttacaaac 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 大白菜（Brassica rapa spp. pekinnesis)

<400> 9

gattactcct cgcctcatga 20

<210> 10

<211> 703

<212> DNA

<213> 大白菜（Brassica rapa spp. pekinnesis)

<400> 10

cgtggatctc gtcttcaggt acacatcatc gcttcttgtc tttgatcaga ttactgattt 60

tgagacaaaa gtttccaact ttcgatccgt ttttctgtgt ccaaactaaa atactctgtt 120

tttgttcatg aaacctctgt ttctcatact aggatgctct gtttttgctc ttaaacctct 180

gtttctcaaa ctaaagtctg atcttttgat tttttttttg gcataagtgt acaatagcaa 240

tggctcgatc tgcggttgat gagacatcag actcgggagc atttcaaaga actgcttcaa 300

cattccgtaa cttcgtctca agagattcca actctcagtt tccagctgaa tctggaagat 360

accatcttta catatcgtat gcttgtccat gggcttctag atgcatctca tacttgaaga 420

ttaaaggact tgacgatgct ataagcttct cggttcgttg actcaaaagc ccttttcaaa 480

ctgcttatgt tcattacaat aatagtttcc ttgtttggtt tgcatcagtc tgttaaaccc 540

atttggggaa gaacaaaaga aagtgatgag catatgggat gggtcttccc ggattcagac 600

aatgaggtcg aaggagctga ctcggacaat cttaatggtg ctaaaagtgt aagagaactc 660

tatgagattg ctagtcccaa ctacaccggg aagtatactg ttc 703

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 大白菜（Brassica rapa spp. pekinnesis)

<400> 11

cgtggatctc gtcttcaggt 20

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 大白菜（Brassica rapa spp. pekinnesis)

<400> 12

ggaacagtat acttcccggt gt 22

<210> 13

<211> 333

<212> DNA

<213> 大白菜（Brassica rapa spp. pekinnesis)

<400> 13

ttgaaccata ggagggatag ttgttattca taatttaata ggaaaatttt caaaattttg 60

agaaattcat actaaaatct tttgagagat gatcaaaatt gtagtatctt gtaacagttt 120

tttatatata tataaaaaaa aaaggagacc ggaaacaaaa atggtttaat taattaatta 180

ttaaaataac caagccaatt aaaacattga agattcatat aacttagccc aaaatgaaga 240

agtataaggc ccaaataact aagatacaca gtgacactac tactccgcgc caactaaacg 300

acagtaatca tcactctatc catccatcac cat 333

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 大白菜（Brassica rapa spp. pekinnesis)

<400> 14

ttgaaccata ggagggatag ttg 23

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 大白菜（Brassica rapa spp. pekinnesis)

<400> 15

atggatgatg gatggataga gtg 23

Claims

1.与大白菜抗根肿病CRb基因紧密连锁的分子标记：TCR30，其特征在于，标记如下核苷酸序列：

TCR30：

5’-CGTGGATCTCGTCTTCAGGTACACATCATCGCTTCTTGTCTTTGATCAGATTACTGATTTTGAGACAAAAGTTTCCAACTTTCGATCCGTTTTTCTGTGTCCAAACTAAAATACTCTGTTTTTGTTCATGAAACCTCTGTTTCTCATACTAGGATGCTCTGTTTTTGCTCTTAAACCTCTGTTTCTCAAACTAAAGTCTGATCTTTTGATTTTTTTTTTGGCATAAGTGTACAATAGCAATGGCTCGATCTGCGGTTGATGAGACATCAGACTCGGGAGCATTTCAAAGAACTGCTTCAACATTCCGTAACTTCGTCTCAAGAGATTCCAACTCTCAGTTTCCAGCTGAATCTGGAAGATACCATCTTTACATATCGTATGCTTGTCCATGGGCTTCTAGATGCATCTCATACTTGAAGATTAAAGGACTTGACGATGCTATAAGCTTCTCGGTTCGTTGACTCAAAAGCCCTTTTCAAACTGCTTATGTTCATTACAATAATAGTTTCCTTGTTTGGTTTGCATCAGTCTGTTAAACCCATTTGGGGAAGAACAAAAGAAAGTGATGAGCATATGGGATGGGTCTTCCCGGATTCAGACAATGAGGTCGAAGGAGCTGACTCGGACAATCTTAATGGTGCTAAAAGTGTAAGAGAACTCTATGAGATTGCTAGTCCCAACTACACCGGGAAGTATACTGTTC-3’。

2.权利要求1所述的与大白菜抗根肿病CRb基因紧密连锁的分子标记：TCR30的PCR特异性扩增引物，其特征在于，如下序列：

TCR30

F TCR30：5’-CGTGGATCTCGTCTTCAGGT-3’

R TCR30：5’-GGAACAGTATACTTCCCGGTGT-3’。

3.权利要求1所述的与大白菜抗根肿病CRb基因紧密连锁的分子标记，其特征在于TCR30在辅助选择中的应用方法是：

(1)用CTAB方法对待测材料进行基因组DNA的提取

(2)PCR扩增:

a.反应体系：10μL体系，各组分物质的含量分别为15ng模板DNA；5pmol·L^-1primer；1.0mmol·L^-1dNTP；1.0uL 10×PCR Buffer；0.5U Taq DNApolymerase；ddH₂O补齐10μL，混匀，离心；

b.扩增程序：预变性94℃/5min；94℃/30s；60℃/45s；72℃/30s；35个循环后；72℃延伸10min；最后4℃保存；

c.电泳：

将扩增产物与等体积的上样缓冲液混合，94℃变性6min，之后在DNA测序电泳仪上进行6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，70W条件下电泳1.5小时，电泳结束后，进行银染；

d.判断

权利要求2所述的扩增引物的扩增结果中如果能够检测到703bp和小于703bp两条带，则带有703bp条带的材料含有大白菜抗根肿病基因CRb的概率约为99.81％。