CN103261219B - 突变通道视紫红质2 - Google Patents
突变通道视紫红质2 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103261219B CN103261219B CN201180052156.9A CN201180052156A CN103261219B CN 103261219 B CN103261219 B CN 103261219B CN 201180052156 A CN201180052156 A CN 201180052156A CN 103261219 B CN103261219 B CN 103261219B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- cys
- ion channel
- catch
- glu
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108010035848 Channelrhodopsins Proteins 0.000 title claims abstract description 22
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 21
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 21
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 17
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 171
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 claims description 64
- 108090000862 Ion Channels Proteins 0.000 claims description 64
- 239000011575 calcium Substances 0.000 claims description 50
- 235000020945 retinal Nutrition 0.000 claims description 28
- 239000011604 retinal Substances 0.000 claims description 22
- 206010034972 Photosensitivity reaction Diseases 0.000 claims description 18
- NCYCYZXNIZJOKI-OVSJKPMPSA-N Retinaldehyde Chemical compound O=C\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C NCYCYZXNIZJOKI-OVSJKPMPSA-N 0.000 claims description 18
- 230000036211 photosensitivity Effects 0.000 claims description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 17
- 210000004295 hippocampal neuron Anatomy 0.000 claims description 15
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 claims description 12
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 11
- 102000004330 Rhodopsin Human genes 0.000 claims description 10
- 108090000820 Rhodopsin Proteins 0.000 claims description 10
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 claims description 10
- NCYCYZXNIZJOKI-IOUUIBBYSA-N 11-cis-retinal Chemical compound O=C/C=C(\C)/C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C NCYCYZXNIZJOKI-IOUUIBBYSA-N 0.000 claims description 9
- YFHXZQPUBCBNIP-UHFFFAOYSA-N fura-2 Chemical compound CC1=CC=C(N(CC(O)=O)CC(O)=O)C(OCCOC=2C(=CC=3OC(=CC=3C=2)C=2OC(=CN=2)C(O)=O)N(CC(O)=O)CC(O)=O)=C1 YFHXZQPUBCBNIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 claims description 8
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 7
- 238000002001 electrophysiology Methods 0.000 claims description 6
- 230000004907 flux Effects 0.000 claims description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 6
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 claims description 5
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 claims description 5
- 230000007831 electrophysiology Effects 0.000 claims description 5
- 210000002592 gangliocyte Anatomy 0.000 claims description 5
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 claims description 5
- 150000004492 retinoid derivatives Chemical class 0.000 claims description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 5
- ZALHPSXXQIPKTQ-UHFFFAOYSA-N (+-)-2,6-Dimethyl-octan Natural products CCC(C)CCCC(C)C ZALHPSXXQIPKTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 201000004569 Blindness Diseases 0.000 claims description 4
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 4
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 claims description 4
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 claims description 4
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 4
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims description 3
- 206010047571 Visual impairment Diseases 0.000 claims description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 3
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 210000000449 purkinje cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 150000003726 retinal derivatives Chemical class 0.000 claims description 3
- 208000029257 vision disease Diseases 0.000 claims description 3
- 230000004393 visual impairment Effects 0.000 claims description 3
- 101100230376 Acetivibrio thermocellus (strain ATCC 27405 / DSM 1237 / JCM 9322 / NBRC 103400 / NCIMB 10682 / NRRL B-4536 / VPI 7372) celI gene Proteins 0.000 claims description 2
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 claims description 2
- 210000001052 bipolar neuron Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000003078 multipolar neuron Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000001510 pseudounipolar neuron Anatomy 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 2
- DIOQZVSQGTUSAI-UHFFFAOYSA-N decane Chemical compound CCCCCCCCCC DIOQZVSQGTUSAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims 2
- 210000000609 ganglia Anatomy 0.000 claims 1
- -1 naphthyl retinene Chemical compound 0.000 claims 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 claims 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 claims 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 89
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 89
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 74
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 46
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 36
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 35
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 30
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 30
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 description 26
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 24
- 230000008859 change Effects 0.000 description 23
- 108091006146 Channels Proteins 0.000 description 20
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 20
- 238000001994 activation Methods 0.000 description 20
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 19
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 17
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 17
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 14
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 14
- 230000008569 process Effects 0.000 description 14
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 13
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 12
- 230000004044 response Effects 0.000 description 12
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 11
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 11
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 11
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 11
- 230000002336 repolarization Effects 0.000 description 11
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 10
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 10
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 10
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 10
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 10
- 230000002999 depolarising effect Effects 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 108010062745 Chloride Channels Proteins 0.000 description 8
- 102000011045 Chloride Channels Human genes 0.000 description 8
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 8
- 241000269370 Xenopus <genus> Species 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 8
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 8
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 8
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 230000036982 action potential Effects 0.000 description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 7
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 7
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- 102000004257 Potassium Channel Human genes 0.000 description 6
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 6
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 6
- 108020001213 potassium channel Proteins 0.000 description 6
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 6
- 208000003098 Ganglion Cysts Diseases 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 5
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 208000005400 Synovial Cyst Diseases 0.000 description 5
- 238000001720 action spectrum Methods 0.000 description 5
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 5
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 5
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 5
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 5
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 5
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 5
- 210000001320 hippocampus Anatomy 0.000 description 5
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 230000028161 membrane depolarization Effects 0.000 description 5
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- FTEDXVNDVHYDQW-UHFFFAOYSA-N BAPTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)C1=CC=CC=C1OCCOC1=CC=CC=C1N(CC(O)=O)CC(O)=O FTEDXVNDVHYDQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 4
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 4
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000412 dendrimer Substances 0.000 description 4
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 4
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 4
- 230000004438 eyesight Effects 0.000 description 4
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 4
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 4
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 4
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 4
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 4
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 4
- NCYCYZXNIZJOKI-UHFFFAOYSA-N vitamin A aldehyde Natural products O=CC=C(C)C=CC=C(C)C=CC1=C(C)CCCC1(C)C NCYCYZXNIZJOKI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 3
- 238000002679 ablation Methods 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 3
- 230000010221 calcium permeability Effects 0.000 description 3
- 210000005056 cell body Anatomy 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 3
- 230000005595 deprotonation Effects 0.000 description 3
- 238000010537 deprotonation reaction Methods 0.000 description 3
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 3
- 230000005283 ground state Effects 0.000 description 3
- 230000000971 hippocampal effect Effects 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 108091008695 photoreceptors Proteins 0.000 description 3
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 3
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 3
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 3
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 3
- UQNAFPHGVPVTAL-UHFFFAOYSA-N 2,3-Dihydroxy-6-nitro-7-sulfamoyl-benzo(f)quinoxaline Chemical compound N1C(=O)C(=O)NC2=C1C=C([N+]([O-])=O)C1=C2C=CC=C1S(=O)(=O)N UQNAFPHGVPVTAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QZXAEJGHNXJTSE-UHFFFAOYSA-N 7-(ethylamino)-4,6-dimethylchromen-2-one Chemical compound O1C(=O)C=C(C)C2=C1C=C(NCC)C(C)=C2 QZXAEJGHNXJTSE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000702423 Adeno-associated virus - 2 Species 0.000 description 2
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N Aniline Chemical compound NC1=CC=CC=C1 PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N D-lysine Chemical compound NCCCC[C@@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 206010029350 Neurotoxicity Diseases 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 206010044221 Toxic encephalopathy Diseases 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000009460 calcium influx Effects 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 229920000736 dendritic polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 230000002964 excitative effect Effects 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- 238000010304 firing Methods 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- DZNKOAWEHDKBEP-UHFFFAOYSA-N methyl 2-[6-[bis(2-methoxy-2-oxoethyl)amino]-5-[2-[2-[bis(2-methoxy-2-oxoethyl)amino]-5-methylphenoxy]ethoxy]-1-benzofuran-2-yl]-1,3-oxazole-5-carboxylate Chemical compound COC(=O)CN(CC(=O)OC)C1=CC=C(C)C=C1OCCOC(C(=C1)N(CC(=O)OC)CC(=O)OC)=CC2=C1OC(C=1OC(=CN=1)C(=O)OC)=C2 DZNKOAWEHDKBEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005404 monopole Effects 0.000 description 2
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 2
- 230000008587 neuronal excitability Effects 0.000 description 2
- 230000007135 neurotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000228 neurotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 210000002763 pyramidal cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 210000000964 retinal cone photoreceptor cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 2
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 210000000225 synapse Anatomy 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 2
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000002834 transmittance Methods 0.000 description 2
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 2
- OBSLWIKITOYASJ-AZEWMMITSA-N (2r,3s,4s,5r,6s)-6-(hydroxymethyl)-3-(methylamino)oxane-2,4,5-triol Chemical compound CN[C@@H]1[C@H](O)O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@H]1O OBSLWIKITOYASJ-AZEWMMITSA-N 0.000 description 1
- XFDMUBAPCIJDBR-UHFFFAOYSA-N 2-phosphonopentanoic acid Chemical compound CCCC(C(O)=O)P(O)(O)=O XFDMUBAPCIJDBR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VDAVEASVPZDNQB-UHFFFAOYSA-N 3,7-dimethyl-Decane Chemical compound CCCC(C)CCCC(C)CC VDAVEASVPZDNQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VOROEQBFPPIACJ-UHFFFAOYSA-N 5-Phosphononorvaline Chemical class OC(=O)C(N)CCCP(O)(O)=O VOROEQBFPPIACJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 239000012099 Alexa Fluor family Substances 0.000 description 1
- 239000000592 Artificial Cell Substances 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- 241000244203 Caenorhabditis elegans Species 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102220598266 Cancer/testis antigen family 45 member A10_C36A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 108091005462 Cation channels Proteins 0.000 description 1
- 241000195597 Chlamydomonas reinhardtii Species 0.000 description 1
- 241000282552 Chlorocebus aethiops Species 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 244000241257 Cucumis melo Species 0.000 description 1
- 235000015510 Cucumis melo subsp melo Nutrition 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 206010011878 Deafness Diseases 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 208000010772 Dog disease Diseases 0.000 description 1
- OTMSDBZUPAUEDD-UHFFFAOYSA-N Ethane Chemical compound CC OTMSDBZUPAUEDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N Ethene Chemical compound C=C VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241000175212 Herpesvirales Species 0.000 description 1
- 244000285963 Kluyveromyces fragilis Species 0.000 description 1
- 235000014663 Kluyveromyces fragilis Nutrition 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 102000001675 Parvalbumin Human genes 0.000 description 1
- 108060005874 Parvalbumin Proteins 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 206010034960 Photophobia Diseases 0.000 description 1
- 102100032709 Potassium-transporting ATPase alpha chain 2 Human genes 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102220467332 Protein BEX4_L94A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 108010083204 Proton Pumps Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 241000555745 Sciuridae Species 0.000 description 1
- 241000710961 Semliki Forest virus Species 0.000 description 1
- 241000638935 Senecio crassissimus Species 0.000 description 1
- 108010052164 Sodium Channels Proteins 0.000 description 1
- 102000018674 Sodium Channels Human genes 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000195615 Volvox Species 0.000 description 1
- 241000195614 Volvox carteri Species 0.000 description 1
- 108091093126 WHP Posttrascriptional Response Element Proteins 0.000 description 1
- FJJCIZWZNKZHII-UHFFFAOYSA-N [4,6-bis(cyanoamino)-1,3,5-triazin-2-yl]cyanamide Chemical compound N#CNC1=NC(NC#N)=NC(NC#N)=N1 FJJCIZWZNKZHII-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000004178 amaranth Substances 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 239000000823 artificial membrane Substances 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000005441 aurora Substances 0.000 description 1
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 229920006317 cationic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000027288 circadian rhythm Effects 0.000 description 1
- 239000004927 clay Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 description 1
- 238000010226 confocal imaging Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 1
- 231100000895 deafness Toxicity 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 description 1
- 230000010502 episomal replication Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000028023 exocytosis Effects 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000013213 extrapolation Methods 0.000 description 1
- 238000003473 flash photolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000002485 formyl group Chemical group [H]C(*)=O 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-UHFFFAOYSA-N gentamicin Chemical class O1C(C(C)NC)CCC(N)C1OC1C(O)C(OC2C(C(NC)C(C)(O)CO2)O)C(N)CC1N CEAZRRDELHUEMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 150000002357 guanidines Chemical class 0.000 description 1
- 208000016354 hearing loss disease Diseases 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 210000003552 inferior colliculi Anatomy 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 230000010220 ion permeability Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000009940 knitting Methods 0.000 description 1
- 208000013469 light sensitivity Diseases 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000002479 lipoplex Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000001259 mesencephalon Anatomy 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000000329 molecular dynamics simulation Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000002161 motor neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000005405 multipole Effects 0.000 description 1
- 230000004118 muscle contraction Effects 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 125000001624 naphthyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 238000009806 oophorectomy Methods 0.000 description 1
- 239000013307 optical fiber Substances 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000005622 photoelectricity Effects 0.000 description 1
- 230000001443 photoexcitation Effects 0.000 description 1
- 230000004310 photopic vision Effects 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 230000007096 poisonous effect Effects 0.000 description 1
- 230000010287 polarization Effects 0.000 description 1
- 231100000719 pollutant Toxicity 0.000 description 1
- 229910052573 porcelain Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001242 postsynaptic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 238000004080 punching Methods 0.000 description 1
- 210000001747 pupil Anatomy 0.000 description 1
- 239000005297 pyrex Substances 0.000 description 1
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 1
- 239000003340 retarding agent Substances 0.000 description 1
- 210000000880 retinal rod photoreceptor cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 102220029346 rs34541442 Human genes 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000009291 secondary effect Effects 0.000 description 1
- 230000035807 sensation Effects 0.000 description 1
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 description 1
- 210000001044 sensory neuron Anatomy 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000008054 signal transmission Effects 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001103 thalamus Anatomy 0.000 description 1
- 230000001550 time effect Effects 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 229910052724 xenon Inorganic materials 0.000 description 1
- FHNFHKCVQCLJFQ-UHFFFAOYSA-N xenon atom Chemical compound [Xe] FHNFHKCVQCLJFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/405—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from algae
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及具有提高特性的突变通道视紫红质、编码其的核酸构建体、携带该核酸构建体的表达载体、包含所述核酸构建体或表达载体的细胞及其相应的用途。
Description
技术领域
本发明涉及具有提高性能的突变通道视紫红质、编码其的核酸构建体、携带该核酸构建体的表达载体、包含所述核酸构建体或表达载体的细胞及其相应的用途。
背景技术
光门控的、内向整流阳离子通道，通道视紫红质-2(ChR2)已经变成用于体外和体内的神经元靶向光激活的优选工具1-4。尽管野生型(WT)ChR2可以用于光诱导的去极化，但正在进行找寻用于将来潜在的临床应用的具有提高的光敏感性的ChR2突变体(WO 03/084994和5-7)。尽管例如脑组织的透光率低，但较高的效率能够使远离所施加的光源的细胞层去极化。光敏感性的提高还将解决在连续照明下由于完全WT ChR2激活需要的高蓝光强度(480nm下1018-1019ph s-1cm-2)引起的潜在细胞损伤的问题。具有较高光敏感性的变体对于关于视力恢复的研究也是关键的8，9。在蛋白质水平上，只能通过延长开放状态的时长和/或通过升高通道的单位电导来获得较高的光效率，因为由于ChR2发色团视黄醛的性质，光敏感性本身只能略微提高。之前的研究已经证明分别在螺旋3和4中的C128和D156位的突变导致显著减缓的通道动力学，开放时长长达30分钟或更长，从而产生500-倍或甚至更高的光敏感性5，6。这些C128和D156突变体可以通过红光在可变的开放次数关闭。尽管光敏感性较好，它们的缓慢关闭动力学仍然是其应用的限制因素。
因此，对呈现出较高光敏感性和较快响应动力学的光诱导阳离子通道仍然存在需求。
发明内容
发明概述
因为已知细胞内膜表面电位受到Ca++的强烈影响，改变膜下细胞内Ca++水平将导致膜的去极化并且在神经元中导致电压-门控的Na+通道的激活。因此，发明人假设可以通过借助Ca++内流升高内膜表面电位而间接地提高神经元的光敏感性。发明人令人惊讶地发现了具有增强的Ca++-渗透性的ChR2突变体，在下文中称为CatCh，即钙转运通道视紫红质(Calcium translocating Channelrhodopsin)。与WT ChR2相比较，在海马神经元中表达时，CatCh具有高四倍的Ca++-渗透性，高70倍的光敏感性和更快的响应动力学。增强的光敏感性和快的动力学显示出源于相对高的光-门控Ca++内流，这升高了内膜表面电位并且激活了Ca++-激活的大电导钾(BK)通道。[Ca++]i的增加升高了内部表面电位，有助于电压-门控的Na+-通道的激活并且间接地提高光敏感性。通过Ca++-依赖性BK-通道激活显著加速了光刺激后的复极化。CatCh例证了一种新的原理，通过该原理可以将光-门控通道工程化以提高神经元刺激的光敏感性。它的特征，如引发精确和快速的动作电位而同时只需要低光强度来激活，为光-门控通道在临床应用中的使用打开了道路。
因此，在第一个方面中，本发明涉及一种光诱导离子通道，其中光诱导离子通道包含与SEQ ID NO：1(CHOP-2)的1-309位所示的氨基酸序列具有至少70％同源性并且在对应于SEQ ID NO：1的L132的位置包含突变的氨基酸序列。
在相似的第二个方面中，本发明还涉及一种通道视紫红质，其包含根据第一个方面的光诱导离子通道和视黄醛或视黄醛衍生物。
此外，在第三个方面中，本发明提供了一种核酸构建体，其包含编码根据第一个方面的光诱导离子通道的核苷酸序列。
在再另一个方面中，本发明提供了一种表达载体，其包含编码根据第一个方面的光诱导离子通道的核苷酸序列或根据第三个方面的核酸构建体。
此外，提供了一种细胞，其包含根据第二个方面的通道视紫红质、根据第三个方面的核酸构建体或根据第四个方面的表达载体。
此外，本发明涉及根据第一个方面的光诱导离子通道、第二个方面的通道视紫红质、根据本发明的核酸构建体或表达载体和根据本发明的细胞作为药物的用途。特别地，涉及根据本发明的表达载体在基因治疗中的用途。
更具体地，涉及根据本发明的光诱导离子通道、通道视紫红质、核酸构建体、表达载体或细胞在失明或视力下降的治疗中的用途。
在再另一个方面中，本发明提供了根据第一个方面的光诱导离子通道(其另外在对应于SEQ ID NO：1的128位的位置具有苏氨酸、丝氨酸或丙氨酸和/或在对应于SEQ IDNO：1的156位的位置具有丙氨酸)在癌细胞消融中的用途。
在最后的一个方面中，本发明涉及根据第一个方面的光诱导离子通道或根据第二个方面的通道视紫红质或根据本发明的细胞在高通量筛选中的用途。
优选实施方案的详细描述
在第一个方面中，本发明涉及一种光诱导离子通道，其中该光诱导离子通道包含与SEQ ID NO：1(CHOP-2)的1-309位所示的氨基酸序列，更优选与SEQ ID NO：1的1-315位所示的氨基酸序列，或甚至与SEQ ID NO：1的1-737位所示的氨基酸序列具有至少70％同一性并且在对应于SEQ ID NO：1中的L132位的位置包含突变的氨基酸序列。
野生型CHOP2具有以下氨基酸序列：
MDYGGALSAV GRELLFVTNP VVVNGSVLVP EDQCYCAGWIESRGTNGAQT ASNVLQWLAAGFSILLLMFY AYQTWKSTCGWEEIYVCAIE MVKVILEFFF EFKNPSMLYL ATGHRVQWLRYAEWLLTCPVILIHLSNLTG LSNDYSRRTM GLLVSDIGTI VWGATSAMAT GYVKVIFFCL GLCYGANTFF HAAKAYIEGYHTVPKGRCRQ VVTGMAWLFF VSWGMFPILF ILGPEGFGVL SVYGSTVGHT IIDLMSKNCW GLLGHYLRVLIHEHILIHGD IRKTTKLNIG GTEIEVETLV EDEAEAGAVN KGTGKYASRE SFLVMRDKMK EKGIDVRASLDNSKEVEQEQ AARAAMMMMN GNGMGMGMGM NGMNGMGGMN GMAGGAKPGL ELTPQLQPGR VILAVPDISMVDFFREQFAQ LSVTYELVPA LGADNTLALV TQAQNLGGVD FVLIHPEFLRDRSSTSILSR LRGAGQRVAAFGWAQLGPMR DLIESANLDG WLEGPSFGQG ILPAHIVALV AKMQQMRKMQ QMQQIGMMTGGMNGMGGGMGGGMNGMGGGN GMNNMGNGMG GGMGNGMGGN GMNGMGGGNG MNNMGGNGMA GNGMGGGMGG NGMGGSMNGMSSGVVANVTP SAAGGMGGMM NGGMAAPQSP GMNGGRLGTN PLFNAAPSPL SSQLGAEAGM GSMGGMGGMSGMGGMGGMGG MGGAGAATTQ AAGGNAEAEM LQNLMNEINR LKRELGE(SEQ ID NO：1)
本发明的光诱导离子通道是具有至少5个跨膜螺旋的膜蛋白，其能够结合光敏性多烯。优选的是具有6或7个跨膜螺旋的跨膜蛋白。然而，本发明也涵盖具有超过7个螺旋，例如，8、9或10个跨膜螺旋的跨膜蛋白。此外，本发明涵盖除了跨膜部分以外还包括C-和/或N-末端序列的跨膜蛋白，其中C-末端序列可以延伸至被膜包围的腔的内部，例如，细胞的胞质或脂质体的内部，或者也可以排列在膜外表面上。这同样适用于任选存在的N-末端序列，其同样可以排列在腔内以及在膜的外表面上。C-和/或N-末端序列的长度原则上没有限制；然而，优选的是具有1至1000个氨基酸，优选1至500个，尤其优选5至50个氨基酸的未包埋在膜内的C-末端序列的光诱导离子通道。与C-末端序列的长度无关，未包埋在膜内的位于N-末端的序列优选包含1至500个氨基酸，尤其优选5至50个氨基酸。跨膜螺旋的概念是本领域技术人员公知的。这些通常是α-螺旋蛋白结构，其通常包含20至25个氨基酸。然而，取决于膜的性质(其可以是天然膜，例如细胞膜或质膜，或也可以是合成的膜)，跨膜片段也可以更短或更长。例如，人造膜中的跨膜片段可以包含多达30个氨基酸，但另一方面，也可以只有少许氨基酸，例如12至16个。
在优选的实施方案中，光诱导离子通道包含与SEQ ID NO：1的1-309位所示的氨基酸序列具有至少70％同一性，优选至少75％同一性，更优选至少80％同一性，甚至更优选至少85％同一性，如至少90％同一性，并且最优选至少95％同一性的氨基酸序列。
在另一个优选的实施方案中，光诱导离子通道包含与SEQ ID NO：1的1-315位所示的氨基酸序列具有至少70％同一性，优选至少75％同一性，更优选至少80％同一性，甚至更优选至少85％同一性，如至少90％同一性，并且最优选至少95％同一性的氨基酸序列。
通常，当一些氨基酸序列与所比对序列之间的序列同一性是至少x％时，氨基酸序列与另一个氨基酸序列或上述的SEQ ID NO：1具有“至少x％的同一性”。可以使用例如公众可获得的计算机同源性程序，如在NCBI主页http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi上提供的“BLAST”程序，使用其中提供的缺省设置来进行这样的比对。计算核酸序列组的序列同一性百分比的更多方法是本领域已知的。
这样的包含与SEQ ID NO：1的1-309或1-315位所示的氨基酸序列具有至少70％同一性的氨基酸序列的光诱导离子通道的实例是来自莱茵衣藻(C.reinhardii)的CHOP1(gi：15811379)、来自强壮团藻(Volvox carteri)的CHOP2(gi：167650748)和CHOP1(gi：167650744)，或CHOP2或CHOP1的任何其他直系同源物(ortholog)或等位基因变异体。
在甚至更优选的实施方案中，光诱导离子通道包含SEQ ID NO：1(CHOP-2)的1-309位所示的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：1(CHOP-2)的1-309位所示的氨基酸序列组成，除了L132位的突变。
在另一个甚至更优选的实施方案中，光诱导离子通道包含SEQ ID NO：1(CHOP-2)的1-315位所示的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：1(CHOP-2)的1-315位所示的氨基酸序列组成，除了L132位的突变。
在SEQ ID NO：1中的L132位或在对应于L132的位置处的突变可以是置换、添加和/或缺失。然而，优选地，所述突变是置换，更优选地选自L132C、L132S、L132E、L132D和L132T，最优选其中所述置换是L312C。尽管实验数据限于L132C，但设想置换L132S、L132E、L132D和L132T将呈现出相似特性，因为所有这些置换将提高通道的极性。
此外，光诱导离子通道包含进一步的(半)保守性置换。保守性置换是侧链和化学性质相关的氨基酸家族内发生的那些置换。这样的家族的实例是具有碱性侧链、具有酸性侧链、具有非极性脂肪族侧链、具有非极性芳香侧链、具有不带电的极性侧链、具有小的侧链、具有大的侧链等的氨基酸。典型的半保守性和保守性置换是：
此外，本领域技术人员将认识到空间结构所需要的位置上的甘氨酸不应当被置换，并且脯氨酸不应当被引入具有α-螺旋或β-折叠结构的蛋白质部分中。
在另一个优选的实施方案中，光诱导离子通道包含共有基序L(I)DxxxKxxW(F，Y)。括号内给出的氨基酸在各种情况下可以替代其前面的氨基酸。这种共有序列是围绕视黄醛结合氨基酸赖氨酸的基序。
用天然存在的光强度激活CatCh而同时维持高的时间精确性的可能性使得其成为独特的候选物，特别是对于基因治疗的视力恢复尝试以及其他生物医学应用。由于降低的光需求，甚至可以通过远离其474nm的光谱最大值的激发来产生CatCh尖峰，例如，使用绿光(532nm-参见图4d)。由于降低的光需求，在作用光谱的外侧发挥作用是可行的，并且有助于组织渗透。
因此，如与海马神经元中的WT CHOP-2相比，本发明的突变光诱导离子通道的光敏感性优选提高超过5倍，优选超过10倍，更优选超过20倍，如30倍，甚至更优选超过40倍，如50倍，并且最优选超过60倍，或甚至超过70倍。此外，如通过海马神经元中的完整细胞电生理学记录测定的，与WT CHOP-2相比，本发明的突变光诱导离子通道呈现出提高至少1.5倍，更优选2倍，或甚至更优选2.5倍的刺激频率。如实施例中所示，WT-Chop2在海马神经元中呈现出约10Hz至高达约20Hz的刺激频率，其中20Hz下的信号发生已经是不准确的。此外，本领域技术人员将认识到固有的峰电位频率(spike frequency)还取决于细胞类型。例如，听细胞具有高达500Hz的固有峰电位频率。此外，已经在体外进行了实验，即在环境温度下。然而，本领域技术人员将预期刺激频率在温血动物(如哺乳动物)中甚至更高，因为动力学也是温度依赖性的。因此，取决于细胞类型和温度，如通过完整细胞电生理学记录所测定的，预期与WT CHOP-2比较，本发明的突变光诱导离子通道还呈现出提高至少5倍的刺激频率，优选至少10倍，如至少20倍，或至少30倍，或更优选至少40倍，至少50倍，如至少60倍，或至少70倍，甚至更优选至少80倍，至少90倍，或至少100倍，最优选至少125倍，如至少150倍，或至少175倍，并且甚至最优选至少200倍的刺激频率。以下实施例中举例说明了海马神经元培养和来自海马神经元的电生理学记录。
简而言之，从新生的P1 Sprague-Dawley大鼠(Jackson实验室)分离海马，并用木瓜蛋白酶(20U ml-1)在37℃下处理20min。用补充了10％胎牛血清的DMEM(Invitrogen/Gibco，高葡萄糖)洗涤海马，并在少量的这种溶液中研磨。将～75,000细胞涂布于24-孔平板中的聚-D-赖氨酸/层粘连蛋白涂覆的玻璃盖玻片上。3小时后，用培养培养基(含有2％B-27补充剂，2mM Glutamax-I和100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的Neurobasal A)替换涂布培养基。涂布后5-10天，使用lipofectamine 2000试剂(Invitrogen)转染突变体ChR2(L132C)-YFP和ChR2(WT)-YFP。或者，涂布后4-9天，可以将2-5×109GC/ml的病毒(AAV2/7-CAG-ChR2(L132C)-2A-EGFP-WPRE-bGH)加入各个孔中。以下实施例中详细描述了腺相关病毒载体构建体的典型构建。转导后5天表达变得可见。对于任一个实验，没有全-反式视黄醛添加到培养培养基或记录培养基中。
对于在培养的海马神经元中的完整细胞记录，将具有5-10MΩ电阻的膜片移液器填充滴定至pH 7.2的129mM葡萄糖酸钾、10mM HEPES、10mM KCl、4mM MgATP和0.3mMNa3GTP。将Tyrode’s溶液用作细胞外溶液(125mM NaCl，2mM KCl，2mM CaCl2，1mM MgCl2，30mM葡萄糖和25mM HEPES，滴定至pH 7.4)。名义上无Ca++-细胞外溶液包含这一相同的溶液，除了其具有0mM Ca++和3mM Mg++。在兴奋性突触传导阻滞剂1，2，3，4-四氢-6-硝基-2，3-二氧代-苯并[f]喹喔啉-7-磺酰胺(NBQX，10μM，Sigma)和D(-)-2-氨基-5-膦酰基戊酸(AP-5，50μM，Sigma)的存在下进行记录。对于电压钳记录，将1μM河豚毒素加入细胞外溶液中。为了抑制BK-通道活性，加入1mM TEA。在装备有荧光灯的倒置Zeiss Axiovert 25显微镜上进行记录。通过EGFP-或YFP-介导的荧光证明了成功的蛋白质表达。神经元接入电阻为15-40MΩ并且监控整个实验过程中的稳定性。使用Axopatch 200A放大器(AxonInstruments，Union City，CA)放大电生理信号，在10kHz下过滤，用Axon Digidata 1600(50Hz)数字化并使用pClamp9软件(AxonInstruments)获取和分析。使用来自二极管-泵浦固态激光器(Pusch OptoTech GmbH；λ1＝473nm，P1＝100mW，λ2＝532nm，P2＝50mW)的各种长度的光脉冲或来自受激准分子泵浦染料激光器(Coumarin 2，λ＝450nm)的10ns闪光来引起光电流。比光强度是在离细胞～500μm距离处的400μm直径石英光纤(STE-F100/400-Y-VIS/NIR；Laser 2000，Wessling，德国)末端的强度。从表达ChR2(L132C)-YFP和ChR2(L132C)-2A-EGFP的神经元测得的电流是相同的。
此外，在另一个优选实施方案中，如通过HEK293细胞上的Fura-2-成像所测定的，与WT CHOP-2相比，本发明的突变光诱导离子通道的钙传导性提高至少两倍，优选至少三倍，更优选至少四倍。为了测定钙传导性，将Fura-2AM(5mM；Invitrogen)在室温下加载30min至1小时。加载后，将细胞在不含Ca++的140mM NaCl溶液(140mM NaCl，7mM EGTA，2mMMgCl2和10mM HEPES)中回收。通过使用460/40nm滤镜(Visitron Systems，Puchheim，德国)的500ms曝光来激发黄色荧光蛋白以从其YFP-荧光估算各细胞的表达水平。然后将溶液替换成由90mM CaCl2、7mM EGTA、2mM MgCl2和10mM HEPES组成的细胞外Ca++-溶液。在黑暗中15min后，用蓝光(460/40nm)刺激光门控通道10s。用340nm(340/20)和380nm(380/20)激发Fura-2，并且用CCD相机检测发射的光(540/80nm)(所有滤镜都来自VisitronSytems，Puchheim，德国)。
如上所示，突变光诱导离子通道可以另外包含进一步的突变，优选置换。在一个优选实施方案中，光诱导离子通道可以另外包含至少一个以下的氨基酸残基：对应于SEQ IDNO：1的253位的位置的天冬氨酸；对应于SEQ ID NO：1的257位的位置的赖氨酸；对应于SEQID NO：1的260位的位置的色氨酸；对应于SEQ ID NO：1的123位的位置的谷氨酸；对应于SEQID NO：1的134位的位置的组氨酸或精氨酸，优选精氨酸；对应于SEQ ID NO：1的128位的位置的苏氨酸、丝氨酸或丙氨酸；和/或对应于SEQ ID NO：1的156位的位置的丙氨酸。因此，突变光诱导离子通道可以包含以下在指定位置处的氨基酸残基的组合中的一个，所述位置对应于SEQ ID NO：1：
Cys 132+Asp 253；Cys 132+Lys 257；Cys 132+Trp 260；Cys 132+Glu 123；Cys132+His 134；Cys 132+Arg 134；Cys 132+Thr 128；Cys 132+Ser 128；Cys 132+Ala 128；Cys 132+Ala 156；
Cys 132+Asp 253+Lys 257；Cys 132+Asp 253+Trp 260；Cys 132+Asp 253+Glu123；Cys 132+Asp 253+His 134；Cys 132+Asp 253+Arg 134；Cys 132+Asp 253+Thr 128；Cys 132+Asp 253+Ser 128；Cys 132+Asp 253+Ala 128；Cys 132+Asp 253+Ala 156；
Cys 132+Lys 257+Trp 260；Cys 132+Lys 257+Glu 123；Cys 132+Lys 257+His134；Cys 132+Lys 257+Arg 134；Cys 132+Lys 257+Thr 128；Cys 132+Lys 257+Ser 128；Cys 132+Lys 257+Ala 128；Cys 132+Lys 257+Ala 156；
Cys 132+Trp 260+Glu 123；Cys 132+Trp 260+His 134；Cys 132+Trp 260+Arg134；Cys 132+Trp 260+Thr 128；Cys 132+Trp 260+Ser 128；Cys 132+Trp 260+Ala 128；Cys 132+Trp 260+Ala 156；
Cys 132+Glu 123+His 134；Cys 132+Glu 123+His 134；Cys 132+Glu 123+Arg134；Cys 132+Glu 123+Thr 128；Cys 132+Glu 123+Ser 128；Cys 132+Glu 123+Ala 128；Cys 132+Glu 123+Ala 156；
Cys 132+His 134+Thr 128；Cys 132+His 134+Ser 128；Cys 132+His 134+Ala128；Cys 132+His 134+Ala 156；
Cys 132+Arg 134+Thr 128；Cys 132+Arg 134+Ser 128；Cys 132+Arg 134+Ala128；Cys 132+Arg 134+Ala 156；
Cys 132+Thr 128+Ala 156；Cys 132+Ser 128+Ala 156；Cys 132+Ala 128+Ala156；
Cys 132+Asp 253+Lys 257+Trp 260；Cys 132+Asp 253+Lys 257+Glu 123；Cys132+Asp 253+Lys 257+His 134；Cys 132+Asp 253+Lys 257+Arg 134；Cys 132+Asp 253+Lys 257+Thr 128；Cys 132+Asp 253+Lys 257+Ser 128；Cys 132+Asp 253+Lys 257+Ala128；Cys 132+Asp 253+Lys 257+Ala 156；
Cys 132+Lys 157+Trp 260+Glu 123；Cys 132+Lys 157+Trp 260+His 134；Cys132+Lys 157+Trp 260+Arg 134；Cys 132+Lys 157+Trp 260+Thr 128；Cys 132+Lys 157+Trp 260+Ser 128；Cys 132+Lys 157+Trp 260+Ala 128；Cys 132+Lys 157+Trp 260+Ala156；
Cys 132+Trp 260+Glu 123+His 134；Cys 132+Trp 260+Glu 123+Arg 134；Cys132+Trp 260+Glu 123+Thr 128；Cys 132+Trp 260+Glu 123+Ser 128；Cys 132+Trp 260+Glu 123+Ala 128；Cys 132+Trp 260+Glu 123+Ala 156；
Cys 132+Glu 123+His 134+Thr 128；Cys 132+Glu 123+His 134+Ser 128；Cys132+Glu 123+His 134+Ala 128；Cys 132+Glu 123+His 134+Ala 156；
Cys 132+Glu 123+Arg 134+Thr 128；Cys 132+Glu 123+Arg 134+Ser 128；Cys132+Glu 123+Arg 134+Ala 128；Cys 132+Glu 123+Arg 134+Ala 156；
Cys 132+His 134+Thr 128+Ala 156；Cys 132+His 134+Ser 128+Ala 156；Cys132+His 134+Ala 128+Ala 156；
Cys 132+Arg 134+Thr 128+Ala 156；Cys 132+Arg 134+Ser 128+Ala 156；Cys132+Arg 134+Ala 128+Ala 156；
Cys 132+Asp 253+Lys 257+Trp 260+Glu 123；Cys 132+Asp 253+Lys 257+Trp260+His 134；Cys 132+Asp 253+Lys 257+Trp 260+Arg 134；Cys 132+Asp 253+Lys 257+Trp 260+Thr 128；Cys 132+Asp 253+Lys 257+Trp 260+Ser 128；Cys 132+Asp 253+Lys257+Trp 260+Ala 128；Cys 132+Asp 253+Lys 257+Trp 260+Ala 156；
Cys 132+Lys 257+Trp 260+Glu 123+His 134；Cys 132+Lys 257+Trp 260+Glu123+Arg 134；Cys 132+Lys 257+Trp 260+Glu 123+Thr 128；Cys 132+Lys 257+Trp 260+Glu 123+Ser 128；Cys 132+Lys 257+Trp 260+Glu 123+Ala 128；Cys 132+Lys 257+Trp260+Glu 123+Ala 156；
Cys 132+Trp 260+Glu 123+His 134+Thr 128；Cys 132+Trp 260+Glu 123+His134+Ser 128；Cys 132+Trp 260+Glu 123+His 134+Ala 128；Cys 132+Trp 260+Glu 123+His 134+Ala 156；
Cys 132+Trp 260+Glu 123+Arg 134+Thr 128；Cys 132+Trp 260+Glu 123+Arg134+Ser 128；Cys 132+Trp 260+Glu 123+Arg 134+Ala 128；Cys 132+Trp 260+Glu 123+Arg 134+Ala 156；
Cys 132+Glu 123+Arg 134+Thr 128+Ala 156；Cys 132+Glu 123+Arg 134+Ser128+Ala 156；Cys 132+Glu 123+Arg 134+Ala 128+Ala 156；
Cys 132+Glu 123+His 134+Thr 128+Ala 156；Cys 132+Glu 123+His 134+Ser128+Ala 156；Cys 132+Glu 123+His 134+Ala 128+Ala 156；
Cys 132+Asp 253+Lys 257+Trp 260+Glu 123+His 134；Cys 132+Asp 253+Lys257+Trp 260+Glu 123+Arg 134；Cys 132+Asp 253+Lys 257+Trp 260+Glu 123+Thr 128；Cys 132+Asp 253+Lys 257+Trp 260+Glu 123+Ser 128；Cys 132+Asp 253+Lys 257+Trp260+Glu 123+Ala 128；Cys 132+Asp 253+Lys 257+Trp 260+Glu 123+Ala 156；
Cys 132+Lys 257+Trp 260+Glu 123+His 134+Thr 128；Cys 132+Lys 257+Trp260+Glu 123+His 134+Ser 128；Cys 132+Lys 257+Trp 260+Glu 123+His 134+Ala 128；Cys 132+Lys 257+Trp 260+Glu 123+His 134+Ala 156；
Cys 132+Lys 257+Trp 260+Glu 123+Arg 134+Thr 128；Cys 132+Lys 257+Trp260+Glu 123+Arg 134+Ser 128；Cys 132+Lys 257+Trp 260+Glu 123+Arg 134+Ala 128；Cys 132+Lys 257+Trp 260+Glu 123+Arg 134+Ala 156；
Cys 132+Trp 260+Glu 123+Arg 134+Thr 128+Ala 156；Cys 132+Trp 260+Glu123+Arg 134+Ser 128+Ala 156；Cys 132+Trp 260+Glu 123+Arg 134+Ala 128+Ala 156；
Cys 132+Trp 260+Glu 123+His 134+Thr 128+Ala 156；Cys 132+Trp 260+Glu123+His 134+Ser 128+Ala 156；Cys 132+Trp 260+Glu 123+His 134+Ala 128+Ala 156；
Cys 132+Asp 253+Lys 257+Trp 260+Glu 123+His 134+Thr 128；Cys 132+Asp253+Lys 257+Trp 260+Glu 123+His 134+Ser 128；Cys 132+Asp 253+Lys 257+Trp 260+Glu 123+His 134+Ala 128；Cys 132+Asp 253+Lys 257+Trp 260+Glu 123+His 134+Ala156；
Cys 132+Asp 253+Lys 257+Trp 260+Glu 123+Arg 134+Thr 128；Cys 132+Asp253+Lys 257+Trp 260+Glu 123+Arg 134+Ser 128；Cys 132+Asp 253+Lys 257+Trp 260+Glu 123+Arg 134+Ala 128；Cys 132+Asp 253+Lys 257+Trp 260+Glu 123+Arg 134+Ala156；
Cys 132+Lys 257+Trp 260+Glu 123+His 134+Thr 128+Ala 156；Cys 132+Lys257+Trp 260+Glu 123+His 134+Ser 128+Ala 156；Cys 132+Lys 257+Trp 260+Glu 123+His 134+Ala 128+Ala 156；
Cys 132+Lys 257+Trp 260+Glu 123+Arg 134+Thr 128+Ala 156；Cys 132+Lys257+Trp 260+Glu 123+Arg 134+Ser 128+Ala 156；Cys 132+Lys 257+Trp 260+Glu 123+Arg 134+Ala 128+Ala 156；
Cys 132+Asp 253+Lys 257+Trp 260+Glu 123+His 134+Thr 128+Ala 156；Cys132+Asp 253+Lys 257+Trp 260+Glu 123+His 134+Ser 128+Ala 156；Cys 132+Asp 253+Lys 257+Trp 260+Glu 123+His 134+Ala 128+Ala 156；
Cys 132+Asp 253+Lys 257+Trp 260+Glu 123+Arg 134+Thr 128+Ala 156；Cys132+Asp 253+Lys 257+Trp 260+Glu 123+Arg 134+Ser 128+Ala 156；Cys 132+Asp 253+Lys 257+Trp 260+Glu 123+Arg 134+Ala 128+Ala 156。
然而，在以上列表中，Cys132也可以被Ser132、Glu132、Asp132或Thr132置换。
通常，通过待用所述离子通道转染的细胞产生光诱导离子通道功能化所需的视黄醛或视黄醛衍生物。根据其构型，视黄醛可以是全-反式视黄醛、11-顺式-视黄醛、13-顺式-视黄醛或9-顺式-视黄醛。然而，还考虑了本发明的突变光诱导离子通道可以整合到载体、脂质体或其他人造细胞膜中。因此，在第二个方面中，本发明提供了一种通道视紫红质，其包含根据第一个方面的光诱导离子通道和视黄醛或视黄醛衍生物。优选地，视黄醛衍生物选自3，4-脱氢视黄醛、13-乙基视黄醛、9-dm-视黄醛、3-羟基视黄醛、4-羟基视黄醛、萘基视黄醛、3，7，11-三甲基-十二烷-2，4，6，8，10-五烯醛、3，7-二甲基-癸烷-2，4，6，8-四烯醛、3，7-二甲基-辛烷-2，4，6-三烯醛和6-7阻旋(rotation-blocked)视黄醛、8-9阻旋视黄醛和10-11阻旋视黄醛。此外，第一个方面的优选实施方案对应于第二个方面的优选实施方案。
在第三个方面中，本发明还涉及一种核酸构建体，其包含编码根据第一个方面的光诱导离子通道的核苷酸序列。为了确保最佳表达，还可以对编码DNA进行适当地修饰，例如，通过添加合适的调控序列和/或靶向序列和/或通过将编码DNA序列与选定宿主的优选密码子使用进行匹配。靶向序列可以编码将光诱导离子通道靶向于细胞内的特定位点或区室的C-端延伸序列，如靶向于突触或突触后位点、靶向于轴突-丘或内质网。核酸可以结合另外的元件，例如，启动子以及转录起始和终止信号以及翻译起始和终止信号以及聚腺苷酸化信号，以用于本发明蛋白质序列的表达。启动子可以是诱导型的或组成型的、通用的或细胞特异性的启动子。细胞特异性启动子的实例是对于双极细胞特异性的mGlu6-启动子。启动子、载体和其他元件的选择是本领域普通技术人员技能水平内的常规设计事件。文献中描述了许多这样的元件，并且是可通过商业供应商获得的。
因此，在第四个方面中，本发明提供了一种表达载体，其包含编码根据第一个方面的光诱导离子通道的核苷酸序列或根据第三个方面的核酸构建体。在优选的实施方案中，载体适用于基因治疗，特别是其中载体适用于病毒介导的基因转移。术语“适用于病毒介导的基因转移”在此意思是所述载体可以包装在病毒中，并且因此递送至目标位点或细胞。适用于基因治疗的病毒的实例是逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、痘病毒、α病毒、狂犬病病毒、semliki森林病毒和疱疹病毒。这些病毒的差异在于它们多好地将基因转移至它们识别并能够感染的细胞中，以及它们是否永久或临时地改变细胞的DNA。然而，基因治疗还包括非病毒方法，如应用裸DNA、lipoplex和阳离子多聚物(polyplex)以及树状聚合物(dendrimer)。
如上所述，可以将所得到的核酸序列引入细胞中，例如，使用病毒作为载体或通过转染，包括例如通过化学转染剂(如，Lipofectamine，Fugene等)、电穿孔、磷酸钙共沉淀和DNA的直接扩散。实施例中详细描述了用于转染细胞的方法并且适用于相应的受体细胞。使用DNA的转染产生了稳定的细胞或细胞系(如果转染的DNA整合至基因组中)或是不稳定(瞬时)的细胞或细胞系(其中转染的DNA以染色体外形式存在)。此外，通过使用游离型复制质粒可以获得稳定的细胞系，这意味着染色体外质粒的遗传受到整合至细胞基因组中的控制元件的控制。通常，合适载体或质粒的选择取决于预定的宿主细胞。
因此，在第五个方面中，本发明涉及一种细胞，其包含根据第二个方面的通道视紫红质、根据第三个方面的核酸构建体或根据第四个方面的表达载体。
如将在以下进行描述的，根据本发明的突变光诱导离子通道的一个应用是失明受试者(如，人或动物)的治疗。存在着其中天然视细胞不再起作用但所有神经连接能够持续运作的多种疾病。目前，已经在各个研究中心中进行了尝试以在视网膜上植入具有人造陶瓷光细胞的薄膜。这些光细胞意图用来使视网膜的次生但仍然完整的细胞去极化，并且由此引发神经脉冲(仿生眼)。根据本发明的光控离子通道在这些神经节细胞、无长突细胞或双极细胞中的有意表达将是极好的解决方案并且能够获得更高的三维目视分辨率。
例如，可以简单地实现突变光诱导离子通道结合至本来不表达相应通道的细胞的膜中，其包括使用已知的重组DNA技术的程序首先将编码该离子通道的DNA结合至合适的表达载体中，例如质粒、粘粒或病毒，然后用其转化目标细胞，并且在这一宿主中表达蛋白质。接着，以合适的方式处理细胞，例如，用视黄醛，以使得能够在蛋白质和视黄醛之间形成席夫氏碱连接。
在优选的实施方案中，这发生在各种酵母中，如对于视紫红质(如，细菌视紫红质和/或牛视紫红质)已经成功进行的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)或毕赤酵母(Pichia pastoris)。
还可以在特定的哺乳动物细胞系统或昆虫细胞系统中实现表达。因此，在优选的实施方案中，细胞是哺乳动物细胞或昆虫细胞。用游离型载体来实现作为瞬时表达的表达，优选在黑素瘤细胞(例如，BLM细胞系)、COS细胞(通过“非洲绿猴肾CV1”细胞的感染产生)或HEK细胞(“人胚胎肾细胞”，例如，HEK293细胞)，或BHK细胞(“幼仓鼠肾细胞”)中，或者在CHO细胞(“中国仓鼠卵巢细胞”)、骨髓瘤细胞或MDCK细胞(“Madine-Darby犬肾细胞”)中或在用杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞中以稳定表达的形式来实现表达。因此，在更优选的实施方案中，哺乳动物细胞是COS细胞、BHK细胞、HEK293细胞、CHO细胞、骨髓瘤细胞或MDCK细胞。
在恢复视力的情况中，在最优选的实施方案中，哺乳动物细胞是感光细胞、视杆细胞、视锥细胞、视网膜神经节细胞、双极神经元、神经节细胞、假单极神经元、多极神经元、锥体神经元、浦肯野细胞或颗粒细胞。
神经元是通过电和化学信号发生来处理和传递信息的电兴奋细胞，其中通过突触(与其他细胞的专门化连接)发生化学信号发生。存在多种专门类型的神经元，如对触觉、声音、光和各种影响感觉器官的细胞的其他刺激作为响应的感觉神经元、接收来自大脑和脊髓的信号并引起肌肉收缩和影响腺体的运动神经元，以及将神经元连接大脑或脊髓的相同区域内的其他神经元的中间神经元。通常，神经元具有细胞体、树突和轴突。树突是源于细胞体的丝状体，通常延伸数百微米并且多次分支。轴突是在称为轴突丘的部位从细胞体产生的特殊细胞丝。神经元的细胞体常常产生多个树突，但从不产生超过一个轴突，尽管轴突在终止前可以分支数百次。在大部分的突触处，信号从一个神经元的轴突发送至另一个的树突。然而，存在这些规则的许多例外情况：缺少树突的神经元、没有轴突的神经元、将一个轴突连接另一个轴突或将树突连接另一个树突的突触，等等。大多数神经元在解剖学上可以进一步表征为单极或假单极(树突和轴突来自相同的突起)、双极(轴突和单个树突在细胞体的相对末端)、多极(具有超过两个树突并且可以进一步分类为(i)具有长投射的轴性突起的Golgi I神经元，如锥体细胞、浦肯野细胞和前角细胞，和(ii)Golgi II：其轴性突起局部投射的神经元，如颗粒细胞。
感光细胞，是在视网膜中发现的能够进行光传导的专门神经元。两种经典的感光器是视杆和视锥，其各自产生由视觉细胞所用的信息。视网膜神经节细胞是位于眼睛视网膜内表面附近的神经元类型。这些细胞具有树突和投射至前顶盖(pretectum)(中脑)、下丘脑中的视交叉上核和侧膝体(丘脑)的长轴突。小部分几乎对视觉很少或没有任何作用，但自身是光敏感性的。它们的轴突形成视网膜下丘脑束并且作用于昼夜节律和瞳孔光反射，瞳孔的恢复尺寸。它们通过两种中间神经元类型：双极细胞和无长突细胞，从光感受器接收视觉信息。无长突细胞是视网膜中的中间神经元，并且负责70％的对视网膜神经节细胞的输入。双极细胞，其负责另外30％的对视网膜神经节细胞的输入，通过无长突细胞来调控。作为视网膜的一部分，双极细胞存在于光感受器(视杆细胞和视锥细胞)和神经节细胞之间。它们直接或间接地起作用以将来自光感受器的信号传递至神经节细胞。
细胞可以进行分离(和遗传修饰)、维持并在合适的温度和气体混合物中(通常，37℃，5％CO2)培养，任选在本领域技术人员已知的细胞孵育器中，并且在实施例中对特定细胞系或细胞类型进行了举例说明。各种细胞类型的培养条件可能发生变化，并且对于特定细胞类型的条件的变化可能导致不同的表型。除了温度和气体混合物以外，细胞培养系统中最常见的变化因素是生长培养基。用于生长培养基的配方可以特别地在pH、葡萄糖浓度、生长因子和其他营养素成分的存在方面发生变化。生长培养基可以是商购得到的，或可以根据组成来制备，所述组成可以获自美国典型微生物保藏中心(ATCC)。用于补充培养基的生长因子常常源自动物血，如小牛血清。此外，可以将抗生素加入生长培养基中。培养细胞上进行的常规操作包括更换培养基以及细胞传代。
对于CatCh，存在其他潜在的应用领域。因为Ca++是重要的细胞内调节剂，CatCh打开了对细胞的精细调节的Ca++内平衡进行光学干预的途径，从而调节其状态和活性。在基础研究中，CatCh可以用于光学地控制Ca++-依赖性胞吐作用而作为螯合Ca++(caged Ca++)的替代26(例如，突触处的递质释放)、通过钙激活的激酶和磷酸酶光学地激活下游细胞内过程或通过将CatCh靶向于细胞内区室(如Golgi器或内质网)而诱导细胞凋亡。
因此，本发明的进一步方面是根据第一个方面的光诱导离子通道或根据第二个方面的通道视紫红质或根据第三个方面的核酸构建体或根据本发明的细胞作为药物的用途。特别地，本发明的表达载体可以用于基因治疗中。更具体地，根据第一个方面的光诱导离子通道、根据第二个方面的通道视紫红质、根据第三个方面的核酸构建体或根据本发明的细胞可以用于失明或视力下降的治疗。然而，由于高达300Hz的快速峰电位启动的作用和加速的复极化，还设想光诱导离子通道在听力的重建或耳聋的治疗中的用途。
此外，根据第一个方面的突变光诱导离子通道可以包含另外的置换(因此称为SFO，或慢突变体，参见表1)，其导致持久的光诱导钙内流，其随后导致细胞死亡。因此，设想了另外在对应于SEQ ID NO：1的128位的位置具有苏氨酸、丝氨酸或丙氨酸的根据本发明的光诱导离子通道在癌细胞消融中的用途。例如，可以通过经由癌细胞表面标志物的病毒介导的基因转移来使根据本发明的表达载体靶向于癌细胞。此外，应该注意到，特别地逆转录病毒优先整合至快速分裂的细胞中，如癌细胞。因此，根据本发明的光诱导离子通道主要表达并且整合至癌细胞的细胞膜中。在通过光进行刺激时，这些离子通道将开放并且诱导持久的钙内流，因此导致癌细胞的死亡。这样的用途在自然暴露于光的癌细胞的消融中特别有利，如黑素瘤癌细胞。因此，在优选的实施方案中，所述癌是黑素瘤癌。
在最后一个方面中，本发明涉及根据第一个方面的光诱导离子通道，或根据第二个方面的通道视紫红质或根据本发明的细胞在高通量筛选中的用途。高通量筛选(HTS)是一种用于科学实验中的方法，尤其是用于药物发现中，并且涉及生物和化学领域。HTS允许研究者在短时期内高效地进行数百万次生物化学、遗传或药理学测试，通常是通过现代机器人技术、数据加工和控制软件、液体操作装置和灵敏的检测器的组合。通过这种方法，可以快速地鉴别出调节特定生物分子途径的活性剂；特别是改变离子通道的物质，如根据本发明的光诱导离子通道、Ca++-诱导钾通道或BK通道。例如，可以在宿主细胞中共表达Ca++-诱导钾通道和光诱导离子通道。在通过光进行刺激时，光诱导通道将开放并且细胞内Ca++浓度将增加，由此激活钾通道。因此，将接收到膜电位的变化，其可以通过电位敏感性染料来监测，如RH 421(N-(4-硫代丁基)-4-(4-(4-(二戊基氨基)苯基)丁二烯基)吡啶，内盐)。因此这样的HTS可以包括以下步骤：(i)将表达Ca++诱导(钾)通道和根据本发明的光诱导离子通道的细胞接触针对Ca++-离子通道的候选试剂，(ii)施加光刺激以诱导光诱导通道，(iii)测定膜电位的改变(混合信号)，和(iv)将步骤(iii)中测定的信号与经历步骤(ii)的只表达根据本发明的光诱导离子通道的细胞中测定的信号(单一信号)相比较。膜电位变化的降低表示有发展前景的Ca++-诱导(钾)通道的调节剂。推想这样的方法产生了大约5∶1的信噪比，这与在只表达Ca++-诱导通道的细胞上进行的直接测量相比改善了很多。由于改善的信噪比，所述方法，特别是通过使用光诱导离子通道，可能特别适用于HTS。
本质上，HTS使用一种途径在相对短的时间内收集大量关于许多物质对特定靶标的效应的实验数据。在这种情况下，筛选是具有单一目标(通常测试科学假设)的较大的实验，随后所有这一数据可以应用于这一目标。对于HTS，可以将根据本发明的细胞接种于组织平板中，如多孔平板，例如，96-孔平板。然后，使平板中的细胞接触测试物质足以与目标离子通道相互作用的时间。平板中孔与孔之间的测试物质可以不同。在经过孵育时间后，对平板上的所有孔进行测量，人工地或通过机器测量，并且任选地与没有接触测试物质的细胞的测量值进行比较。当研究者使用膜片钳时，人工测量可能是必需的，从而寻找自动化途径中尚未实施的效应。另外，专门的自动分析仪器可以在孔上运行多种实验(如，分析特定频率的光或高通量膜片钳测量)。在这种情况下，仪器输出各个实验的结果，例如作为数值网格，其中各数字对应于获自单个孔的值。取决于这个第一分析的结果，通过在新的分析平板中使用与鉴定为活性(即，改变细胞内环核苷酸水平的)物质的相似的那些物质，研究者可以在同一筛选中进行后续实验，并且随后重新运行该实验以收集进一步的数据，优化化学试剂的结构以提高试剂对细胞的效应。自动化是HTS实用性中的重要因素。专门的机器人通常负责单一分析平板从形成至最终分析的整个使用期间内的众多过程。HTS机器人通常可以同时制备和分析许多平板，因而进一步加快数据收集过程。适用于根据本发明的HTS的装置的实例包括Fluorometric Imaging Plate Reader(FLIPRTM；Molecular Devices)、FLEXstationTM(Molecular Devices)、Voltage Ion Probe Reader(VIPR，AuroraBiosciences)、Ratio(ATTO)。
在下文中，通过不是意图限制本发明范围的附图和实施例来举例说明本发明。
附图说明
图1.基于光感视紫红质2结构的ChR2同源性模型(PDB编码1H2S)。用于半胱氨酸扫描的目标区域(R115至T139)位于跨膜螺旋3(TM3)中并且用红色突出显示。插图分别显示突变的L132C、氢键合的C128和D156(其连接TM3和TM4，如通过虚线表示的)以及用于质子供体(H134)和质子受体(E123)的同源残基的推定位置。通过由席夫氏碱共价连接的全反式视黄醛(ATR)和K257形成了发色团。将通过除去亮氨酸的甲基形成的空腔描绘为球，并且覆盖在半胱氨酸残基的突变的巯基(黄色球)上。用VMD30绘制该图。
图2.HEK293细胞和非洲爪蟾(Xenopus)卵母细胞中CatCh的生物物理表征。(a)左图，在-60mV下表达CatCh(黑色)和WT ChR2(红色)的HEK293细胞中测量的响应于500ms蓝光脉冲的稳态电流幅度的总结，显示为平均值±s.d.(n＝6)。右图，相对于稳态电流标准化的光电流的关断动力学(off-kinetics)的比较。(b)左图，响应于1-s蓝色473-nm光脉冲的实际光电流。将描记线相对于峰值光电流幅度标准化以说明与WT(红色)相比CatCh(黑色)稳态-峰值电流比例的提高。右图，相对于峰值电流标准化的光电流开通动力学(on-kinetics)的比较。(c)在-120mV下80mM细胞外Ca++(pH 9)中表达CatCh和WT ChR2的非洲爪蟾卵母细胞的473-nm光响应(连续的下方描记线)。注射Ca++螯合剂BAPTA至1mM最终胞质浓度消除了内在Ca++-激活的氯离子通道的叠加电流，同时保持了残留的通道视紫红质Ca++-电流(虚的上方描记线)。将电流相对于WT ChR2峰值电流标准化，并且作为六个其他实验的典型电流。注意到BATPA注射之前和之后CatCh的较大光电流幅度差异，其表明与WT ChR2相比提高的Ca++渗透性。(d)在-80mV下HEK293细胞中CatCh的离子流特征(n＝6，参见方法)。(e)与140mM NaCl(-●-，WT ChR2和CatCh叠加的)相比，90mM CaCl2中WT ChR2(-■-)和CatCh(-▲-)的电流-电压关系。将电流相对于-100mV下的WT ChR2电流标准化。CaCl2中CatCh的逆转电位转变成正电位，其表明提高的Ca++-渗透性(平均值±S.d.，n＝5)。(f)在90mM细胞外Ca++存在下，在表达WT ChR2(●)和CatCh(■)的HEK293细胞中对10s 460nm光(蓝条)的Ca++-内流的Fura-2测量(n＝10)，其显示出在CatCh中细胞内Ca++的增加四倍的升高(对照为未转染的HEK293细胞，▲)。
图3.在海马培养神经元中的CatCh表达。(a)在CAG启动子下表达ChR2(L132C)-2A-EGFP的培养海马神经元的共焦图像。比例尺20μm。(b)通过473-nm蓝光的600ms脉冲(J473nm1×1019光子s-1cm-2)引起的CatCh(黑色)和WT(红色)典型光电流的比较。(c)稳态电流幅度的总结(-60mV，n-6)。
图4.快速和高灵敏度神经光刺激。(a-d)来自响应于2-s光脉冲的表达CatCh的海马神经元的典型完整细胞电流-钳记录。(a)WT所需要的473-nm光强度诱导了去极化阻断(J473nm1×1017光子s-1cm-2)。(b)降低的光强度重新建立了激活(firing)(J473nm1×1016光子s-1cm-2)。(c)峰电位-激活(spike-firing)的典型光-调谐曲线(Jmax9.7×1016光子s-1em-2，平均值±s.d.，2轮)。(d)中度的绿色532-nm照射也引发了动作电位串(train)(J532nm2.5×1017光子s-1cm-2)。(e)由25个1-ms 473-nm光脉冲(J473nm3×1018光子s-1cm-2，平均值±s.d.，[振动])组成的整个光脉冲串中的光脉冲-峰电位潜伏期，在2mM细胞外Ca++(■)中和作为5Hz下的对照，在3mM细胞外Mg++中(■)，其将潜伏期增加至与WT ChR2相似的值。(f)以50Hz速率响应1-ms 473-nm脉冲的峰电位激活(J473nm2.8×1019光子s-1cm-2)和(g)在10Hz下响应于10ns 473-nm光脉冲(J473nm1×1025光子s-1cm-2)。(h)由于BK通道被1mM TEA的抑制导致的不完整的膜复极化(双头箭头)。脉冲串的第3峰电位(黑色)、TEA应用后的第1峰电位(红色)和第3峰电位(蓝色)的重叠(J473nm1.8×1018光子s-1cm-2)。(i)细胞外溶液中Ca++被Mg++取代减缓了峰复极化并且引起延长的去极化(5Hz，左图)和较高频率的多个峰电位的形成(20Hz，右图)(J473nm8.3×1018光子s-1em-2)。
图5.CatCh的光谱表征。光激发后，CatCh(黑色描记线)突变体动力学中与WT(红色描记线)相当地并在光中间体的存在下进入光循环。该图描绘了450nm激发后的光谱变化，具有去质子化席夫氏碱的特征性波长，P390(381nm，上图)，对于P520，主要处于开放状态(541nm，第二幅图)，和基态(440nm，第三幅图)。第一红移的中间体，推测为P500，没有分解，并且只检测为偏移。席夫氏碱以微秒的时程(τ＝50μs)去质子化，这是由于在381nm处的低幅度而难以观察到的一个事件，伴随541nm处的上升。P520中间体的上升发生在之后的过程中(t＝1.5ms)，在其衰变之前(t＝9ms)，由此增加第二持久的物质(P480)。基态(D470)在以下过程(t＝10s)中回复。光循环中的转变类似WT中观察到的那些。至于电流测量中的开通和关断动力学，突变没有引起功能状态的总体变化。开放状态主要是通过P520中间体确定的。与WT中较低的P520相比，在P390幅度的情况中发现了主要的差异。因此，L132C突变没有影响发色团位点处的光反应。注意到光循环的光谱动力学数据在50mM Ca++的存在下没有改变。
图6.在非洲爪蟾卵母细胞中通过两个电极-电压-钳测定了CatCh的作用谱。在不存在Ca++的情况下，在不同波长(λ)下测量电流幅度(如实施例中所示)，相对于光子流量标准化(n＝6)。基态(-)和作用谱(■)的比较。
图7.通过Ca++诱导的表面电位变化。已知跨膜的电压降取决于所施加的电位差(Ψ’)并且通过表面电位(Φ0)来改变。通常Φ0取决于负表面电荷密度，其可以通过用反离子屏蔽来改变。因此，可以通过膜的外侧或内侧上的表面电荷的改变来影响电压门控的钠通道(和其他电压敏感性通道)的激活18。在我们的情况中，通过CatCh传导的Ca++中和了神经元内膜面上的负表面电荷。通过这一作用，诱导了对膜电位的去极化效应，从而导致在较低光强度下动作电位的诱导。在a-c中描绘了这种机制的示意图(按照Hille 2001)。(a)在黑暗中，CatCh通道关闭，膜上的电位差异，EM(施加的外部电位)，等同于静息膜电位(在此设定为-60mV)。为了简单起见，将Φ0设定为Φ0’。(b)在CatCh的光激发时，发生了常见的膜去极化Na+内流。然而，进入神经元的另外的Ca++提高了内膜面上的表面电位(Φ0”)。Ca++内流越高，Φ0”越为正性(通过双头箭头表示)，并且跨膜的电压降越小。这有助于电压门控的钠通道的激活。(c)通过用Mg++取代细胞外Ca++(Mg++不渗透通过CatCH并且早已存在于细胞溶质中达到～4mM)，只发生较小的去极化作用。这是由于与Ca++相比，Mg++与细胞外膜侧的结合较弱，这略微降低了细胞外表面电位Φ0’。注意到表面电位的去极化效应随着跨膜电压降的斜率降低而提高。
具体实施方式
实施例
CatCh的构建和生物物理表征
与之前的方法相反，本发明人的目的在于鉴定在WT ChR2内其突变改变了阳离子渗透性的残基。发明人着重于第三跨膜结构域，因为该结构域内的几个突变的残基已经显示出改变通道的光循环和门控(图1)5-7，12。将从Arg115至Thr139的各残基单独地用半胱氨酸置换并在非洲爪蟾卵母细胞中筛选其功能变化。
光谱学。按照之前所述的5，13，在毕赤酵母中表达并从其纯化CatCh。进行了闪光光解研究并且在从受激准分子泵浦染料激光器(450nm，2-3mJ)的10ns激光闪光激发后测量吸光率变化13。
L132C(CatCh)突变在电流描记线的振幅和形状上都呈现出显著变化。
HEK293细胞培养和分子生物学。在HEK293细胞中转染C-末端截短的ChR2(L132C)-YFP(载体：pcDNA(-)-chop2-309-(L132C)-EYFP)，并且在所有时间保持在G418选择下(0.6mg/ml；PAA Germany，德国)。对于野生型WT ChR2，按照所述的13，将C-末端截短的ChR2-YFP(载体：pcDNA4TO-chop2-309-EYFP)稳定地转染至HEK293-Trex细胞中(Invitrogen)，培养并诱导。在从测量前24小时用人密码子优化的pcDNA3.1(-)-ChR2-YFP构建体(WT，H134R或L132C)瞬时转染的HEK293细胞(Effectene，QIAGEN)测定峰-稳态关系。
HEK293细胞上的电生理学记录。在水平DMZ-Universal牵拉器(系列号No.5318904120B，Zeitz-Instruments，Augsburg，德国)上从薄壁硼硅玻璃(GB150-8P，Science Products，Hofheim，德国)制得具有2-4Ω电阻的膜片电极(patch pipette)。光电流用完整细胞膜片钳方法记录并且通过来自二极管-泵浦固态激光器(Pusch Opto TechGmbH，Baden Baden，德国；λ＝473nm)的聚焦至400μm光纤中的光脉冲来激活。通过快速的计算机控制的光闸(Uniblitz LS6ZM2，Vincent Associates)来施加光脉冲。在光波导末端测量给出的所有光强度。为了获得对于不同阳离子的渗透率的估计值，我们测量了光电流-电压关系并确定了逆转电位。细胞内溶液含有140mM NaCl、7mM EGTA、2mM MgCl2和10mM Tris(pH＝9)，而细胞外溶液含有140mM NaCl、2mM MgCl2和10mM Tris(pH＝9)。对于阳离子渗透性，外部的140mM NaCl分别替换为140mMKCl、90mM CaCl2或90mM MgCl2。当pH从9降至7.4(6)时，从电流-电压关系的逆转电位偏移确定质子渗透性。根据Goldman-Hodgkin-Katz(GHK)公式计算渗透率比例，包括Na+、K+、H+和Ca++项。
在HEK293细胞中，转染后24h，与WT ChR2相比，蓝光诱导的CatCh的稳态电流具有～2.5倍高的幅度(CatCh：25.0±8.8pA/pF；WT：10.1±4.1pA/pF；平均值±s.d.，n＝6，-60mV，图2a)。稳态-峰电流之比也从WT的0.37±0.18增加至CatCh的0.71±0.16(图2b)。在重复的蓝光刺激过程中，CatCh峰电流消失。当没有通过黄光过早地诱导恢复时，在黑暗中数分钟内恢复。相反，在相同条件下，WT ChR2峰电流的完全恢复花了20秒钟13。与WT ChR2(τon＝214±2s，τoff＝10±1ms，n＝9，pH 7.4，-60mV；平均值±s.d.；图2a、b，图5下图，表1)相比，CatCh的激活和失活时间常数(τon＝590±3s，τoff＝15±2ms，n＝9，pH 7.4，-60mV，平均值±s.d.)略长。
接着，发明人将所描述的对通道性能的效应与光循环中的光谱变化进行了比较。纯化CatCh上的闪光光解实验揭示只有与WT ChR2光谱的小偏离13(参见图5)。1.早期P390中间体，其代表去质子化的席夫氏碱，几乎不能检测出。2.中间体P520，其代表通道的开放状态，显示出9ms略微延长的存在时间，与通过电生理学测定的τoff值相当。对于突变体H134R获得了相似的开放存在时间值，其显示出在未改变的单位电导下加倍的活性2，14。因此，还是在CatCh的情况中，开放状态的减速的动力学可能造成了HEK293细胞中测得的2.5倍增加的稳态电流，由此单位电导保持未变。按照之前所描述的14，这一点使用稳态噪音分析通过测量CatCh的单通道电导进行了证实。
噪音分析。按照之前所描述的14，在HEK293细胞上进行了实验，并且在室温(23℃)下进行。电极液含有1mM胍-HCl、199mM NMG-Cl(N-甲基葡糖胺)、10mM EGTA、2mM MgCl2和20mM Hepes(pH 7.4)，电解液(bath solution)含有200mM胍-HCl、2mM MgCl2、2mM CaCl2和20mM Hepes(pH 7.4)。在饱和光条件下并且再在其中-60mV的电流应答为最大电流的一半(I0.5；2kHz低通Bessel滤波器；取样速率：100kHz；细胞直径：15μm)的光条件下，在使用电压步进方案的情况下记录响应于蓝光刺激的电流。将-60mV保持电位下延长照明(2min)过程中稳态I0.5的记录用于估算单通道的电导(2kHz低通Bessel滤波器；取样速率：20kHz)。收集未用照明(对照，3次记录)和使用照明(2次记录，在光刺激开始后30秒)的交替记录，进行傅立叶变换，并用Lorentzian函数从近似值估算单通道电导(对于详细内容，参见14)。选择较低的光强度，以获得光门控通道的开放和关闭的最大波动。
与WT ChR2和H134R噪音分析实验一致，将胍用作传导离子。注意到通道的动力学特性与渗透阳离子无关14。对于200mM胍，在室温下(23℃)，不同功率谱的评价产生了140±5fS的单通道电导γ(n＝6，-60mV)，这与外推的150fB的室温WT ChR2单通道电导相似14。与H134R相比，从噪音分析测定的CatCh的开放概率未变(P。～0.6)。因此，增加的开放通道时间可以容易地说明所观察到的光电流的2.5倍增加，然而，可能不能排除略微增强的CatCh副本的表达。
非洲爪蟾卵母细胞制备和分子生物学。将没有细胞外暴露的半胱氨酸残基的C-末端截短的ChR2变体(残基1-315)(含有突变C34A和C36A)亚克隆至载体pTLN中27。通过QuickChange定点诱变(Stratagene)引入单一半胱氨酸突变，并且通过测序进行验证。使用SP6mMessage mMachine试剂盒(Ambion，Austin，TX)制备mRNA。将50nl cRNA(其包括30ng的WT ChR2/CatCh mRNA)注入各个非洲爪蟾卵母细胞中。在部分卵巢切除术后通过胶原酶处理获得卵母细胞。cRNA注射后，在全反式视黄醛(1μM，来自1mM的乙醇原液)中孵育卵母细胞并且在18℃下在含有1mg/ml庆大霉素的ORI缓冲液(90mM NaCl、2mM KCl、2mM CaCl2和5mMMops，pH 7.4)中保持两至四天。
非洲爪蟾卵母细胞上的双电极-电压钳。用75-W氙弧灯和450±25nm带通滤波器激活光电流，将带通滤波器的光耦合至具有～1018光子s-1cm-2输出的1-mm光导中。对于各个波长，使用窄带宽滤波器(398-645nm；±10nm；K-系列Balzer)记录作用光谱，并结合中性密度滤光器来获得～1.4×1017光子s-1cm-2的输出。为了产生作用光谱，将ORI溶液中的Ca++替换为Ba++以抑制CaCC电流。将各个波长下的电流幅度标准化以表示相等的光子暴露量。然后将通过光谱学测定的基础光谱与平均化的数据点进行拟合。为了抑制钙激活的氯离子通道(CaCC)的激活，将50nl的快速Ca2+-螯合剂1，2-二(2-氨基苯氧基)乙烷-N，N，N’，N’-四乙酸(BAPTA)的20mM溶液注入各卵母细胞中(在卵母细胞中～1mM的终浓度)。
在非洲爪蟾卵母细胞中，用不同波长激发CatCh揭示了几乎相同的作用光谱，几乎与WT ChR2光谱相同在474nm处具有最大激发波长(图6)。在细胞外Ca++存在下并且在负的保持电位下，由于与钙激活的氯离子通道(CaCC)相似的叠加外向电流，CatCh电流在照明过程中显示出剧烈的幅度增大15，16(图2c)。在表达WT ChR2的卵母细胞中，也观察到了CaCC电流，但它们显著小于CatCh诱导的那些电流(图2c)。对于WT ChR2和CatCh两者，在80mM细胞外Ca++下，将快速Ca++螯合剂BAPTA(1，2-二(2-氨基苯氧基)乙烷-N，N，N’，N’-四乙酸)注入细胞中消除了CaCC电流，而保留了残余的Ca++电流(图2c)1。在注射BAPTA之前和之后CatCh的较大光电流差异支持了CatCh激活后Ca++内流增加的假设。
CatCh的提高的钙渗透性。为了获得CatCh离子渗透性的估算值，在HEK293细胞中测定了光电流-电压关系和不同阳离子的逆转电位。这些实验揭示了钠、钾和镁的渗透性对于WT ChR2是相当的(图2d)1。与WT ChR2(pH/pNa＝2.5*106)相比，CatCh的质子渗透性(pH/pNa＝4*106)略有提高。在将细胞外溶液的140mM Na+替换为90mM Ca++时，通过逆转电位偏移测定了Ca++-渗透性(pca/pNa)。CatCh的相对Ca++-渗透性从WT ChR2的0.15提高至0.24，如从-30.7±2.7mV(WT ChR2，平均值±s.d.，n＝5)至-21.6±3.8mV(CatCh，平均值±s.d.，n＝5；图2e)的逆转电位偏移所证明的。为了进一步量化CatCh的提高的Ca++渗透性，我们在表达CatCh的HEK293细胞上进行了Fura-2钙成像，并且将测得的340/380比例与表达WT ChR2的细胞中测得的比例进行了比较。
HEK293细胞上的Fura-2成像。将Fura-2AM(5mM；Invitrogen)在室温下加载30min至1小时。加载后，将细胞在不含Ca++的140mMNaCl溶液(140mM NaCl，7mM EGTA，2mM MgCl2和10mM HEPES)中回收。使用460/40nm滤波器(Visitron Systems，Puchheim，德国)，通过500ms曝光来激发黄色荧光蛋白，以从其YFP-荧光估算各个细胞的表达水平。然后将溶液替换为细胞外Ca++溶液，其由90mM CaCl2、7mM EGTA、2mM MgCl2和10mM HEPES组成。在黑暗中15min后，用蓝光(460/40nm)将光门控的通道刺激10s。用340nm(340/20)和380nm(380/20)激发Fura-2，并且用CCD相机检测发射的光(540/80nm)(所有滤波器来自VisitronSystems，Puchheim，德国)。
为了排除不同的蛋白质表达水平对钙摄取的影响，将测得的340/380比例对于各单个细胞的YFP-荧光值标准化。图2f显示了在饱和的90mMCa++溶液中10-s蓝光(470nm)光刺激时，表达CatCh的细胞中细胞内Ca++增加比表达WT细胞中的高约4倍。
应用于海马神经元
为了测试CatCh对神经元应用的适用性，在培养的海马锥体细胞中表达构建体。
海马神经元培养。从新生的P1Sprague-Dawley大鼠(Jackson实验室)分离海马，并且在37℃下用木瓜蛋白酶(20U ml-1)处理20min。
用补充了10％胎牛血清的DMEM(Invitrogen/Gibco，高葡萄糖)洗涤海马并且在少量的该溶液中研磨。将～75,000个细胞涂布于24孔平板中聚-D-赖氨酸/层粘连蛋白涂覆的玻璃盖玻片上。3小时后，用培养培养基(含有2％B-27补充剂，2mM Glutamax-I和100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的Neurobasal A)替换涂板培养基。涂板后5-10天，突变体ChR2(L132C)-YFP和ChR2(WT)-YFP使用lipofectamine 2000试剂(Invitrogen)转染。或者，涂板后4-9天，将2-5×109GC/ml病毒(AAV2/7-CAG-ChR2(L132C)-2A-EGFP-WPRE-bGH)加入各个孔中。转导后5天表达变得可见。在培养物生存期间(～5周)，没有观察到神经毒性。对于在此所描述的任一个实验，没有将全-反式视黄醛添加到培养培养基或记录培养基中。
腺相关病毒载体构建。将细胞巨化病毒早期增强子/鸡β-肌动蛋白(CAG)启动子进行PCR扩增并且插入pAA2-Rho-EGFP(由自AlbertoAuricchio惠赠28)中，以获得pAAV2-CAG-EGFP。pAAV2-CAG-EGFP病毒表达质粒另外含有旱獭转录后调控元件(WPRE)和牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化序列。通过接头PCR构建了ChR2(L132C)-2A-EGFP(来自Volker的馈赠-2A自切割肽/CHYSEL29)并且使用Clontech’s融合试剂盒通过EGFP的换位亚克隆至pAAV2-CAG-EGFP中。将病毒载体(pAAV2-CAG-ChR2(L132C)-2A-EGFP-WPRE-bGH)封装(血清型7)并且在宾夕法尼亚大学的基因治疗项目下进行亲和性纯化，具有2.26x1011基因组拷贝/ml的最终感染性病毒滴度。
来自海马神经元的电生理学记录。对于培养的海马神经元中的完整细胞记录，将具有5-10MΩ电阻的膜片电极填充129mM葡萄糖酸钾、10mM HEPES、10mM KCl、4mM MgATP和0.3mM Na3GTP，滴定至pH 7.2。将Tyrode’s溶液用作细胞外溶液(125mM NaCl、2mM KCl、2mMCaCl2、1mM MgCl2、30mM葡萄糖和25mM HEPES，滴定至pH 7.4)。名义上无Ca++细胞外溶液含有这一相同的溶液，除了其具有0mM Ca++和3mM Mg++。在兴奋性突触传导阻滞剂1，2，3，4-四氢-6-硝基-2，3-二氧代-苯并[f]喹喔啉-7-磺酰胺(NBQX，10μM，Sigma)和D(-)-2-氨基-5-膦酰基戊酸(AP-5，50μM，Sigma)的存在下进行记录。对于电压钳记录，将1μM河豚毒素加入细胞外溶液中。为了抑制BK-通道活性，加入1mM TEA。在装备有荧光灯的倒置ZeissAxiovert 25显微镜上进行记录。通过EGFP-或YFP-介导的荧光证明了成功的蛋白质表达。神经元接入电阻为15-40MΩ并且在整个实验过程中监测稳定性。使用Axopatch 200A放大器(Axon Instruments，Union City，CA)放大电生理信号，以10kHz过滤，用Axon Digidata1600(50Hz)数字化，并且使用pClamp9软件(Axon Instruments)获取和分析。使用来自二极管-泵浦固态激光器(Pusch Opto Tech GmbH；λ1＝473nm，P1＝100mW，λ2＝532nm，P2＝50mW)的各种长度的光脉冲或来自受激准分子泵浦染料激光器(Coumarin 2，λ＝450nm)的10ns闪光来引起光电流。在附图图例和文字中标示了特定的光强度，并且其是在离细胞～500μm距离处的400μm直径石英光纤(STE-F100/400-Y-VIS/NIR；Laser 2000，Wessling，德国)的末端处的强度。从表达ChR2(L132C)-YFP和ChR2(L132C)-2A-EGFP的神经元测得的电流是相同的。
共焦成像。为了成像，将具有海马神经元的盖玻片在含有2％蔗糖的PBS缓冲液中的4％仲甲醛中4℃下固定10min。随后将细胞在兔α-GFPIgG(Invitrogen，A11122)中孵育1.5小时，接着在Alexa Fluor 488驴-α-兔IgG(Invitrogen，A21206)中孵育45min。在ZeissLSM 510共焦显微镜(Zeiss，Plan-Neofluar 40×/0.75)上对安置好的盖玻片的免疫荧光进行拍照。
CatCh突变体在海马培养物(图3a)中强烈地表达数周而没有神经毒性的信号，并且与在HEK293细胞中一样，在完整细胞记录中呈现出较高的稳态-峰比例，并且响应于473-nm蓝光，与具有164±39pA(-60mV，n＝6，平均值±s.d.)的WT相比，644±31pA(-60mV，n＝6，平均值±s.d.)的电流幅度提高了约四倍(图3b)。在电流钳模式中，通常用于激活WT的人工高光强度(1018-1019光子s-1cm-2)驱使表达CatCh的锥体细胞进入去极化段(图4a)。为了诱导可靠的峰电位串，将光强降低2个对数单位(5*1016-2*1017光子s-1cm-2)以达到视锥光感受器驱动的亮视觉的天然范围内的光强度(图4b)17。图4c显示出锥体细胞的光强度依赖性激活速率的代表性调谐曲线。平均化的最大激活速率位于8.2×1016±2.5×1016光子s-1cm-2(平均值±s.d.，n＝5)。表达CatCh的神经元的较高光效能有助于使用远离峰值灵敏度的波长来激活，如在图4d中用绿光(532nm)举例说明的。就使用穿透较深的绿光的更高效组织募集而言，这可以提供益处。我们将表达CatCh的神经元显著增强的光敏感性归因于增强的Ca++渗透性，由此短暂地提高了胞质膜表面的表面电位10，11，18，19(对于Ca++对表面电位的作用的解释参见图7)。在光激发过程中，CatCh作为膜结合的快速Ca++-源，其通过暂时地提高局部的细胞内表面Ca++浓度，由此中和负的表面电荷(图7)。已知这引起了内部表面电位向更正的值偏移，因而将膜去极化(图7)17，18。结果是在更负的膜电位下激活电压门控的Na+-通道18。在短的光脉冲后或在关闭固定光后，Ca++在胞质内快速(微秒)达到平衡，导致快速恢复和动作电位的立即消失。因此，对于CatCh，与WT ChR2相比，需要较低的光电流并且因之需要较少的光用于峰电位启动。在相似的光强度(2.8×1018光子s-1cm-2)下，CatCh的光脉冲-峰电位潜伏期(～5-6ms；图4e)(具有较小的抖动)比WT ChR2的潜伏期(～10ms)短3。发明人进一步测试了CatCh在高频率光刺激下诱导单动作电位的能力。一串1-ms长的蓝色473-nm光脉冲(2.8×1019光子s-1cm-2)驱动了高达50Hz频率的100％可靠的峰电位串(n＝8；图4f-大部分锥体细胞在超过50Hz时甚至使用直接电流注入也没有良好地效应)。另一方面，WT需要至少2-ms光脉冲来可靠地诱导峰电位并且这仅在高达20Hz的频率下完成12。我们通过10ns蓝光脉冲(1.1×1025光子s-1cm-2)(脉冲长度足够短以致在各CatCh蛋白中只能诱导单次翻转)进一步使得CatCh的短激活时间变得更短并引发了高达10Hz频率的单动作电位(图4g)。然而，快速刺激频率还需要细胞在各峰电位之后的快速复极化。尽管CatCh与WT相比具有减低的τoff，但在CatCh激活过程中～4倍的Ca++-内流的增加(参见Fura-2测量，图2f)表现为足以激活足够的Ca++激活大电导钾通道(BK通道)20，从而有效地在各个动作电位后在微秒范围内将细胞复极化至其初始静息电位。为了证明通过BK通道介导了快速复极化，我们将100μM钾通道抑制剂四乙铵(TEA)加入细胞外溶液中并且观察到通常在WT ChR2的脉冲刺激方案中看到的不完全膜复极化以及平台电位的产生3(图4h)。
总之，与表达WT的细胞相比，表达CatCh的神经元呈现出较快的峰电位开始、较快的复极化和提高的光敏感性(对于比较，参见表1)。在不存在外部Ca++但存在3mM Mg++(其对表面电位具有不太明显的作用11，18(图7)并且不是通过WT ChR2或CatCh传导的)的情况下的对照实验支持了上述解释：1)光脉冲-峰电位潜伏期增加至WT ChR2值(图4e)，2)与在Ca++存在下观察到的快速峰复极化不同，观察到与WT ChR2实验中看到的相似的延长人工去极化(图4i，左图)，3)在Ca++不存在的情况下，在其他方面相同的实验条件下相同的光强度由～10mV导致了降低的去极化和4)在Ca++不存在的情况下，如从延长的CatCh开放时间预期的，重新产生了多尖峰形成(图4i，右图)。
因此，本发明人已经证明了CatCh(具有升高的Ca++渗透性的通道视紫红质)同时具有提高的光敏感性和快速动力学，并且因此胜过WTChR2以及公开的慢速和快速突变体(对于不同ChR2变体的性能的比较，参见表1)。
讨论
在最初看到CatCh(WT ChR2的L132C突变体)时，与WT ChR2相比较显示出相当不引人注意的结果：1)开放状态的期间增加两倍，2)P520中间体在光循环动力学中的衰减减速，3)单通道电导未改变，和4)轻微红移的吸收最大值(4nm)。通过测得的参数可以容易地解释2.5倍的光电流增加而没有表达水平的相关增加。然而，再次考虑时，从表达CatCh的非洲爪蟾卵母细胞获得的电压钳数据的更进一步检查给出了针对升高的Ca++渗透性的第一个暗示，这然后通过测定逆转电位和HEK293细胞上的钙成像实验得到了证实。着眼于图1中的模型，通过形成更柔性的结构并且因此形成空腔可能有助于Ca++-渗透性的提高，如对于光驱动的质子泵细菌视紫红质的L94A突变所示的(比较图1)21。该空腔位于作为保守跨膜螺旋三(TM3)的部分(仅离开C128的螺旋转角)的疏水性补片上。操控C128(TM3)和D156(TM4)之间的相互作用显著地减缓了ChR2的反应循环5，6，这是在细菌视紫红质突变体L93A(即，L94的相邻残基)中也观察到的效应22，23。在ChR2中，TM3和TM4的相互作用似乎影响了门控和选择性两者，指向作为光反应至离子孔的变换器的结构元件24。较小的并且更疏水的半胱氨酸的插入可能增加螺旋片段的灵活性，从而有助于Ca++的进入。
当呈现到海马锥体细胞时，与WT ChR2相比，CatCh呈现出～70倍的光敏感性提高。通常，通过强烈延长的开放通道时间来实现这种增加的光效能2，6，13。而对于CatCh不是这种情况。所观察到的光敏感性明显不同于迄今为止对于其他通道视紫红质所观察到的。如以下所解释的，通过CatCh的Ca++内流诱导了对神经元兴奋性的次生效应。尽管与WT相比具有较慢的关断动力学，但CatCh在高频率光刺激过程中显示出提高的峰电位可靠性和精确性，从而减少了额外的峰电位并消除了在高于20Hz刺激频率下表达WT的细胞中通常观察到的人工平台电位3，7，12。在室温下传送的1-ms光脉冲在表达CatCh的锥体细胞中诱导了高达50Hz的可靠的峰电位串(它们的天然尖峰形成的自然极限；图4f)。在更快形成尖峰的细胞上(如皮层小白蛋白(paravalbumin)中间神经元)的较高频率的CatCh介导峰电位诱导仍有待测试12。由于通道视紫红质动力学是温度依赖性的，具有～2.3的Q10 14，发明人预期在37℃的体内实验中具有3.2倍加速的CatCh动力学而不损失光敏感性。这使得CatCh介导的峰电位刺激可以高达至少300Hz。提高的光敏感性结合快速动力学和高时间精确性使得我们能够用短至10ns的光脉冲激活CatCh，其在各CatCh分子中激活单次翻转，接着是单一峰电位。通过在照明过程中增加的神经元中的Ca++内流最好地解释了可激发细胞中的观察结果。注意到由提高的渗透性引起的Ca++对驱动力的作用可以忽略。然而，我们可以将CatCh认为是光门控的膜结合Ca++源(“膜结合的螯合Ca++”)，其瞬时地将Ca++递送至细胞膜的胞质表面，只要CatCh通道开放。这暂时地中和了内膜表面上的负电荷，由此提高了表面电位，这等同于膜的去极化11(图7)。如所预期的，当细胞外Ca++被非渗透的Mg++替换时，所有观察到的Ca++对动作电位的效应消失，恢复了WT ChR2的表型。这证明了所观察到的Ca++效应是由于细胞外Ca++的内流引起的，而不是由通过CatCh在细胞器(如内质网)中的潜在表达导致的[Ca++]i升高引起的。这种经由表面电位发生的快速初始去极化将WT ChR2表达细胞中的～10ms的光脉冲-峰电位潜伏期3减半至CatCh表达细胞中的～5ms。与WT ChR2相比，CatCh的峰值-稳定电流比降低很多(参见表1)。因此，在CatCh的持续照明过程中，细胞的去极化水平几乎保持稳定。在持久照明过程中连续的Ca++内流可以激活钙激活非选择性阳离子通道，这进一步支持了稳定去极化水平的维持。另一方面，成功的高频脉冲刺激的先决条件是各次动作电位后细胞的快速复极化。与WT相比略有增加的CatCh开放状态的时间会限制其最大刺激频率。然而，增强的Ca++渗透性通过有效地激活大电导钙门控钾通道(BK通道)克服了这种限制。这在各次动作电位后的微秒范围内重新建立了神经元的静息膜电位。通过用开放通道阻滞剂TEA抑制BK通道证实了这一理论，TEA导致在脉冲刺激方案的长度内神经元的持久去极化。
与已经可得的光遗传学工具相比，CatCh具有提高的光敏感性，这与慢突变体13或SFO6相似，但由于其提高的Ca++-渗透性以及对神经元兴奋性的效果而具有快得多的响应动力学。这使得CatCh优于可用的ChR2变体，其必须以快速动力学为代价来建立高光敏感性，而反过来对于快速通道视紫红质也是一样7，12(对于综述，参见表1)。
关于光遗传学应用，我们注意到在各个实验准备中对于确认最佳光脉冲参数是重要的，如刺激长度和强度，因为特定的响应最终将受到神经元固有的生物物理特性和CatCh表达水平的控制。
参考文献列表
WO03/084994
1.Nagel，G.等Channelrhodopsin-2，a directly light-gated cation-selective membrane channel.Proc Natl Acad Sci USA 100，13940-13945(2003).
2.Nagel，G.等Light activation of channelrhodopsin-2in excitable cellsof Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses.Curr Biol 15，2279-2284(2005).
3.Boyden，E.，Zhang，F.，Bamberg，E.，Nagel，G.&Deisseroth，K.Millisecond-timescale，genetically targeted optical control of neural activity.NatNeurosci 8，1263-1268(2005).
4.Zhang，F.等Multimodal fast optical interrogation of neuralcircuitry.Nature 446，633-639(2007).
5.Bamann，C.，Gueta，R.，Kleinlogel，S.，Nagel，G.&Bamberg，E.Structuralguidance of the photocycle of channelrhodopsin-2by an interhelical hydrogenbond.Biochemistry 49，267-278(2010).
6.Bemdt，A.，Yizhar，O.，Gunaydin，L.，Hegemann，P.&Deisseroth，K.Bi-stableneural state switches.Nat Neurosci 12，229-234(2009).
7.Lin，J.，Lin，M.，Steinbach，P.&Tsien，R.Characterization of engineeredchannelrhodopsin variants with improved properties and kinetics.Biophys J 96，1803-1814(2009).
8.Lagali，P.等Light-activated channels targeted to ON bipolar cellsrestore Visual function in retinal degeneration Nat Neurosci 11，667-675(2008).
9.Bi，A.等Ectopic expression of a microbial-type rhodopsin restoresvisual responses in mice with photoreceptor degeneration.Neuron 50，23-33(2006).
10.B.&Hodgkin，A.The action of calcium on theelectrical properties of squid axons.J Physiol(Lond)137，218-244(1957).
11.Hille，B.649-662(Sinauer Associates，Sunderland Massachusetts USA，2001).
12.Gunaydin，L.等Ultrafast optogenetic control.Nat Neurosci 13，387-392(2010).
13.Bamann，C.，Kirsch，T.，Nagel，G.&Bamberg，E.Spectral characteristics ofthe photocycle of channelrhodopsin-2and its implication for channelfunction.J Mol Biol 375，686-694(2008).
14.Feldbauer，K.等Channelrhodopsin-2is a leaky proton pump.Proc NatlAcad Sci USA(2009).
15.Caldwell，J.等Increases in intracellular calcium triggered bychannelrhodopsin-2potentiate the response of metabotropic glutamate receptormGluR7.J Biol Chemistry 283，2430024307(2008).
16.Weber，W.-M.Ion currents in Xenopus laevis oocytes：state of theart.Biochim Biophys Acta 1421，213-233(1999).
17.Thyagarajan，S.等Visual function in mice with photoreceptordegeneration and transgenic expression of channelrhodopsin 2in ganglioncells.J Neurosci 30，8745-8758(2010).
18.Hille，B.，Woodhull，B.&Shapiro，B.Negative surface charge near sodiumchannels of nerve：divalent ions，monovalent ions，and pH.Philos Trans R SocLond B Biol Sci 270，301-318(1975).
19.Muller，R.&Finkelstein，A.The effect of surface charge on thevoltage-dependent conductance induced in thin lipid membranes bymonazomycin.J General Physiol 60，285-306(1972).
20.Faber，E.&Sah，P.Calcium-activateed potassium-channels：multiplecontributions to neuronal function.Neuroscientist 9，181-194(2003).
21.Joh，N.，Oberai，A.，Yang，D.，Whitelegge，J.&Bowie，J.Similar energeticcontributions of packing in the core of membrane and water-soluble proteins.JAm Chem Soc 131，10846-10847(2009).
22.Subramaniam，S.，Faruqi，A.，Oesterhelt，D.&Henderson，R.Electrondiffraction studies of light-induced conformational changes in the Leu-93→Ala bacteriorhodopsin mutant.Proc Nat Acad Sci USA 941767-1772(1997).
23.Subramaniam，S.，Greenhalgh，D.，Rath，P.，Rothschild，K.&Khorana，H.Replacement of leucine-93by alanine or threonine slows down the decay ofthe N and O intermediates in the photocycle of bacteriorhodopsin：implicationsfor proton uptake and 13-cis-retinal all-trans-retinal reisomerization.ProcNatl Acad Sci USA 88，6873-6877(1991).
24.Nack，M.等The DC gate in Channelrhodopsin-2：crucial hydrogenbonding interaction between C128and D156.Photochemical&PhotobiologicalSciences 9，194-198(2010).
25.Busskamp，V.等Genetic reactivation of cone photoreceptors restoresvisual responses in retinitis pigmentosa..Science 329，413-417(2010).
26.Ellis-Davies，G.C.R.Neurobiology with caged calcium.Chem Rev 108，1603-1613(2008).
27.Lorenz，C.，Pusch，M.&Jentsch，T.Heteromultimeric ClC chloridechannels with novel properties.Proc Natl Acad Sci USA 92，13362-13366(1996).
28.Allocca，M.等Novel adeno-associated virus serotypes efficientlytransduce murine photoreceptors.J Virology 81，11372-11380(2007).
29.de Felipe，P.等E unum pluribus：multiple proteins from a self-processing polyprotein.Trends Biotechnol 24，68-75(2006).
30.Humphrey，W.，Dalke，A.and Schulten，K.VMD-Visual Molecular Dynamics.JMolec Graphics 14，33-38(1996).
Claims (17)
1.一种光诱导离子通道，其中所述光诱导离子通道包含除了L132的置换外，SEQ IDNO:1(CHOP-2)的1-309位所示的氨基酸序列，且其中该置换是L132C，其中通过HEK293细胞上的Fura-2成像所测定的，与wt CHOP-2相比，钙传导性提高至少两倍。
2.权利要求1的光诱导离子通道，其中所述光诱导离子通道由SEQ ID NO:1(CHOP-2)的1-309位所示的氨基酸序列组成，除了L132位的置换外，其中该置换是L132C。
3.权利要求1的光诱导离子通道，其中
(a)与海马神经元中的wt CHOP-2相比，光敏感性提高超过5倍；和/或
(b)通过HEK293细胞上的Fura-2成像所测定的，与wt CHOP-2相比，钙传导性提高至少三倍；和/或
(c)通过海马神经元中的完整细胞电生理学记录所测定的，与wt CHOP-2相比，刺激频率提高至少1.5倍。
4.前述任一项权利要求的光诱导离子通道，其中所述光诱导离子通道包含共有基序L(I)DxxxKxxW(F,Y)。
5.一种通道视紫红质，其包含根据权利要求1-4所述的光诱导离子通道和视黄醛或视黄醛衍生物。
6.权利要求5的通道视紫红质，其中所述视黄醛衍生物选自3,4-脱氢视黄醛、13-乙基视黄醛、9-dm-视黄醛、3-羟基视黄醛、4-羟基视黄醛、萘基视黄醛、3,7,11-三甲基-十二烷-2,4,6,8,10-五烯醛；3,7-二甲基-癸烷-2,4,6,8-四烯醛、3,7-二甲基-辛烷-2,4,6-三烯醛、和6-7阻旋视黄醛、8-9阻旋视黄醛和10-11阻旋视黄醛。
7.一种核酸构建体，其包含编码根据权利要求1-4任一项所述的光诱导离子通道的核苷酸序列。
8.一种表达载体，其包含编码根据权利要求1-4任一项所述的光诱导离子通道的核苷酸序列或根据权利要求7的核酸构建体。
9.权利要求8的表达载体，其中所述载体适用于基因治疗。
10.权利要求9的表达载体，其中所述载体适用于病毒介导的基因转移。
11.一种细胞，其包含根据权利要求5或6的通道视紫红质、根据权利要求7的核酸构建体或根据权利要求8-10任一项的表达载体。
12.权利要求11的细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞或昆虫细胞，或其中所述细胞是酵母细胞。
13.权利要求12的细胞，其中所述细胞是来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)或毕赤酵母(Pichia pastoris)的酵母细胞。
14.权利要求12的细胞，其中所述哺乳动物细胞是视杆细胞、视锥细胞或视网膜神经节细胞。
15.权利要求12的细胞，其中所述哺乳动物细胞是
(a)感光细胞、双极神经元、神经节细胞、假单极神经元、多极神经元、锥体神经元、蒲肯野氏细胞或颗粒细胞；或
(b)黑素瘤细胞、COS细胞、BHK细胞、HEK293细胞、CHO细胞、骨髓瘤细胞或MDCK细胞。
16.根据权利要求1-4任一项的光诱导离子通道，或根据权利要求5或6的通道视紫红质，或根据权利要求7的核酸构建体，或根据权利要求8-10任一项的表达载体，或根据权利要求11-15任一项的细胞在制备用于治疗失明或视力下降的药物中的用途。
17.根据权利要求1-4任一项的光诱导离子通道，或根据权利要求5或6的通道视紫红质，或根据权利要求11-15任一项的细胞在高通量筛选中的用途。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US38079310P | 2010-09-08 | 2010-09-08 | |
| US61/380,793 | 2010-09-08 | ||
| EP10175832 | 2010-09-08 | ||
| EP10175832.4 | 2010-09-08 | ||
| PCT/EP2011/065510 WO2012032103A1 (en) | 2010-09-08 | 2011-09-08 | Mutant channelrhodopsin 2 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103261219A CN103261219A (zh) | 2013-08-21 |
| CN103261219B true CN103261219B (zh) | 2017-05-17 |
Family
ID=42979822
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201180052156.9A Active CN103261219B (zh) | 2010-09-08 | 2011-09-08 | 突变通道视紫红质2 |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8748578B2 (zh) |
| EP (1) | EP2614079B1 (zh) |
| JP (1) | JP5933556B2 (zh) |
| KR (1) | KR101945962B1 (zh) |
| CN (1) | CN103261219B (zh) |
| AU (1) | AU2011298745B2 (zh) |
| BR (1) | BR112013005634A2 (zh) |
| CA (1) | CA2810757C (zh) |
| DK (1) | DK2614079T3 (zh) |
| ES (1) | ES2545992T3 (zh) |
| HR (1) | HRP20150846T1 (zh) |
| HU (1) | HUE025952T2 (zh) |
| IL (1) | IL225060A (zh) |
| MX (1) | MX347453B (zh) |
| PL (1) | PL2614079T3 (zh) |
| PT (1) | PT2614079E (zh) |
| RU (1) | RU2595384C2 (zh) |
| SG (1) | SG188409A1 (zh) |
| SI (1) | SI2614079T1 (zh) |
| WO (1) | WO2012032103A1 (zh) |
Families Citing this family (50)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8926959B2 (en) | 2005-07-22 | 2015-01-06 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | System for optical stimulation of target cells |
| WO2007024391A2 (en) | 2005-07-22 | 2007-03-01 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Light-activated cation channel and uses thereof |
| US9238150B2 (en) | 2005-07-22 | 2016-01-19 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Optical tissue interface method and apparatus for stimulating cells |
| US10052497B2 (en) | 2005-07-22 | 2018-08-21 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | System for optical stimulation of target cells |
| US9274099B2 (en) | 2005-07-22 | 2016-03-01 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Screening test drugs to identify their effects on cell membrane voltage-gated ion channel |
| AU2007247929A1 (en) | 2006-05-04 | 2007-11-15 | Pennsylvania College Of Optometry | Restoration of visual responses by In Vivo delivery of rhodopsin nucleic acids |
| WO2008086470A1 (en) | 2007-01-10 | 2008-07-17 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | System for optical stimulation of target cells |
| WO2008101128A1 (en) | 2007-02-14 | 2008-08-21 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | System, method and applications involving identification of biological circuits such as neurological characteristics |
| WO2008106694A2 (en) | 2007-03-01 | 2008-09-04 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Systems, methods and compositions for optical stimulation of target cells |
| US10434327B2 (en) | 2007-10-31 | 2019-10-08 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Implantable optical stimulators |
| US10035027B2 (en) | 2007-10-31 | 2018-07-31 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Device and method for ultrasonic neuromodulation via stereotactic frame based technique |
| BRPI0911448A2 (pt) | 2008-04-23 | 2019-02-26 | The Board Of Trustees For The Leland Stanford Junior University | sistemas, métodos e composições para simulação óticas de células alvo |
| EP2610350B1 (en) | 2008-05-29 | 2014-12-17 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Cell line, system and method for optical control of secondary messengers |
| AU2009260029B2 (en) | 2008-06-17 | 2016-03-17 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods, systems and devices for optical stimulation of target cells using an optical transmission element |
| BRPI0915583A2 (pt) | 2008-06-17 | 2016-01-26 | Univ Leland Stanford Junior | aparelho e métodos para controle do desenvolvimento celular |
| US9101759B2 (en) | 2008-07-08 | 2015-08-11 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Materials and approaches for optical stimulation of the peripheral nervous system |
| NZ602416A (en) | 2008-11-14 | 2014-08-29 | Univ Leland Stanford Junior | Optically-based stimulation of target cells and modifications thereto |
| CN106011073A (zh) | 2010-03-17 | 2016-10-12 | 小利兰·斯坦福大学托管委员会 | 光敏离子透过性分子 |
| US9453241B2 (en) | 2010-05-04 | 2016-09-27 | Wayne State University | AAV-mediated subcellular targeting of heterologous rhodopsins in retinal ganglion cells |
| AU2011323237B2 (en) | 2010-11-05 | 2015-11-12 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Optically-controlled CNS dysfunction |
| WO2012061688A1 (en) | 2010-11-05 | 2012-05-10 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Optogenetic control of reward-related behaviors |
| AU2011323226B2 (en) | 2010-11-05 | 2015-03-12 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Light-activated chimeric opsins and methods of using the same |
| US10568307B2 (en) | 2010-11-05 | 2020-02-25 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Stabilized step function opsin proteins and methods of using the same |
| JP6145043B2 (ja) | 2010-11-05 | 2017-06-07 | ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー | 光遺伝的方法で使用するための光の上方変換 |
| AU2011323228B2 (en) | 2010-11-05 | 2016-11-10 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Control and characterization of memory function |
| US8696722B2 (en) | 2010-11-22 | 2014-04-15 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Optogenetic magnetic resonance imaging |
| WO2013090356A2 (en) | 2011-12-16 | 2013-06-20 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Opsin polypeptides and methods of use thereof |
| EP2817068B1 (en) | 2012-02-21 | 2017-04-12 | The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University | Compositions for treating neurogenic disorders of the pelvic floor |
| HUE040487T2 (hu) | 2012-03-05 | 2019-03-28 | Univ Wayne State | Csatornarodopszin-2 (CHOP2) mutációk azonosítása és alkalmazási eljárások |
| ES2742492T3 (es) | 2013-03-15 | 2020-02-14 | Univ Leland Stanford Junior | Control optogenético del estado conductual |
| US9636380B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-05-02 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Optogenetic control of inputs to the ventral tegmental area |
| US10220092B2 (en) | 2013-04-29 | 2019-03-05 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Devices, systems and methods for optogenetic modulation of action potentials in target cells |
| EP3033427A4 (en) | 2013-08-14 | 2017-05-31 | The Board Of Trustees Of The University Of the Leland Stanford Junior University | Compositions and methods for controlling pain |
| JP6118239B2 (ja) * | 2013-11-29 | 2017-04-19 | 雅敏 堀 | 害虫の防除方法及び防除装置 |
| WO2015167639A1 (en) * | 2014-02-07 | 2015-11-05 | Massachusetts Institute Of Technology | Blue light-activated ion channel molecules and uses thereof |
| WO2015142984A1 (en) * | 2014-03-18 | 2015-09-24 | Washington University | Methods and compositions for red-shifted chromophore substitution for optogenetic applications |
| WO2015161308A1 (en) * | 2014-04-18 | 2015-10-22 | Massachusetts Institute Of Technology | Mutant channelrhodopsins with altered ion selectivity |
| WO2016209654A1 (en) | 2015-06-22 | 2016-12-29 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods and devices for imaging and/or optogenetic control of light-responsive neurons |
| WO2017207761A1 (en) | 2016-06-03 | 2017-12-07 | Max-Planck-Gesellschaft Zur Foerderung Der Wissenschaften E.V. | Mutant light-inducible ion channel of chrimson |
| US20190218256A1 (en) * | 2016-06-03 | 2019-07-18 | MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Mutant light-inducible ion channel of channelrhodopsin |
| JP6779546B2 (ja) * | 2016-11-06 | 2020-11-04 | ナノスコープ テクノロジーズ エルエルシーＮａｎｏｓｃｏｐｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｌｃ | 視力回復のための多特性オプシンによる光遺伝学的調節及びその別の用途 |
| US11294165B2 (en) | 2017-03-30 | 2022-04-05 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Modular, electro-optical device for increasing the imaging field of view using time-sequential capture |
| WO2018189247A1 (en) * | 2017-04-12 | 2018-10-18 | MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | New optogenetic tool |
| CN110483645B (zh) * | 2018-05-14 | 2023-05-12 | 郑州大学第一附属医院 | 线粒体定位质子泵型视紫红质、其突变蛋白及其应用 |
| JP7242851B2 (ja) * | 2018-07-26 | 2023-03-20 | カウンシル・オブ・サイエンティフィック・アンド・インダストリアル・リサーチ・アン・インディアン・レジスタード・ボディ・インコーポレイテッド・アンダー・ザ・レジストレーション・オブ・ソサエティーズ・アクト・(アクト・21・オブ・1860) | 子宮頸がんのグレード検出のためのスクリーニングキットおよびその調製方法 |
| WO2020054868A1 (ja) | 2018-09-14 | 2020-03-19 | 国立大学法人名古屋工業大学 | 光応答性タンパク質及びその利用 |
| EP4119666A4 (en) * | 2020-03-13 | 2024-04-03 | Nagoya Institute Of Technology | LIGHT-SENSITIVE PROTEIN FOR COLOR RECOGNITION AND ITS USE |
| WO2022176754A1 (ja) * | 2021-02-18 | 2022-08-25 | 国立大学法人名古屋工業大学 | 青色光もしくは藍色光応答性タンパク質及びその利用 |
| EP4223768A1 (en) | 2022-02-04 | 2023-08-09 | Georg-August-Universität Göttingen Stiftung Öffentlichen Rechts, Universitätsmedizin | Novel mutant bacteriorhodopsin-like-channelrhodopsin ion channel |
| WO2024092248A1 (en) * | 2022-10-28 | 2024-05-02 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Enhanced light gated potassium selective channelrhodopsin |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003084994A2 (de) * | 2002-04-11 | 2003-10-16 | MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Verwendung von biologischen photorezeptoren als direkt lichtgesteuerte ionenkanäle |
| EP2112510A1 (de) * | 2008-04-22 | 2009-10-28 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Verwendung von biologischen Photorezeptoren als direkt lichtgesteuerte lonenkanäle |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2112501A1 (de) | 1998-02-05 | 2009-10-28 | Novartis Ag | Verfahren und Vorrichtung zur Lumineszenzmessung |
| AU2007247929A1 (en) * | 2006-05-04 | 2007-11-15 | Pennsylvania College Of Optometry | Restoration of visual responses by In Vivo delivery of rhodopsin nucleic acids |
| NZ602416A (en) * | 2008-11-14 | 2014-08-29 | Univ Leland Stanford Junior | Optically-based stimulation of target cells and modifications thereto |
-
2011
- 2011-09-08 US US13/821,353 patent/US8748578B2/en active Active
- 2011-09-08 DK DK11760432.2T patent/DK2614079T3/en active
- 2011-09-08 CN CN201180052156.9A patent/CN103261219B/zh active Active
- 2011-09-08 JP JP2013527595A patent/JP5933556B2/ja active Active
- 2011-09-08 EP EP11760432.2A patent/EP2614079B1/en active Active
- 2011-09-08 ES ES11760432.2T patent/ES2545992T3/es active Active
- 2011-09-08 AU AU2011298745A patent/AU2011298745B2/en active Active
- 2011-09-08 RU RU2013115454/10A patent/RU2595384C2/ru active
- 2011-09-08 WO PCT/EP2011/065510 patent/WO2012032103A1/en active Application Filing
- 2011-09-08 SG SG2013016332A patent/SG188409A1/en unknown
- 2011-09-08 MX MX2013002591A patent/MX347453B/es active IP Right Grant
- 2011-09-08 PT PT117604322T patent/PT2614079E/pt unknown
- 2011-09-08 KR KR1020137008660A patent/KR101945962B1/ko active IP Right Grant
- 2011-09-08 PL PL11760432T patent/PL2614079T3/pl unknown
- 2011-09-08 CA CA2810757A patent/CA2810757C/en active Active
- 2011-09-08 SI SI201130552T patent/SI2614079T1/sl unknown
- 2011-09-08 BR BR112013005634A patent/BR112013005634A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2011-09-08 HU HUE11760432A patent/HUE025952T2/en unknown
-
2013
- 2013-03-05 IL IL225060A patent/IL225060A/en active IP Right Grant
-
2015
- 2015-08-10 HR HRP20150846TT patent/HRP20150846T1/hr unknown
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003084994A2 (de) * | 2002-04-11 | 2003-10-16 | MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Verwendung von biologischen photorezeptoren als direkt lichtgesteuerte ionenkanäle |
| EP2112510A1 (de) * | 2008-04-22 | 2009-10-28 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Verwendung von biologischen Photorezeptoren als direkt lichtgesteuerte lonenkanäle |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Mutantions in Cys 128 cause extreme decelerations of the Channelrhodopsin-2 kinetics;A Berndt;《Biophysical Journal》;20090201;第96卷(第3期);3465 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP2614079B1 (en) | 2015-07-15 |
| SG188409A1 (en) | 2013-04-30 |
| KR20130108335A (ko) | 2013-10-02 |
| DK2614079T3 (en) | 2015-08-10 |
| AU2011298745B2 (en) | 2015-05-07 |
| PL2614079T3 (pl) | 2016-01-29 |
| PT2614079E (pt) | 2015-10-06 |
| US20130281379A1 (en) | 2013-10-24 |
| MX2013002591A (es) | 2013-07-22 |
| RU2595384C2 (ru) | 2016-08-27 |
| US8748578B2 (en) | 2014-06-10 |
| HRP20150846T1 (hr) | 2015-09-11 |
| AU2011298745A1 (en) | 2013-03-21 |
| KR101945962B1 (ko) | 2019-02-08 |
| IL225060A (en) | 2016-10-31 |
| MX347453B (es) | 2017-04-27 |
| ES2545992T3 (es) | 2015-09-17 |
| CN103261219A (zh) | 2013-08-21 |
| CA2810757C (en) | 2020-06-09 |
| RU2013115454A (ru) | 2014-10-20 |
| JP5933556B2 (ja) | 2016-06-15 |
| WO2012032103A1 (en) | 2012-03-15 |
| CA2810757A1 (en) | 2012-03-15 |
| EP2614079A1 (en) | 2013-07-17 |
| JP2013544494A (ja) | 2013-12-19 |
| BR112013005634A2 (pt) | 2017-06-27 |
| SI2614079T1 (sl) | 2015-10-30 |
| HUE025952T2 (en) | 2016-04-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103261219B (zh) | 突变通道视紫红质2 | |
| JP6590786B2 (ja) | 光活性化キメラオプシンおよびその使用方法 | |
| Lin et al. | Optogenetic inhibition of synaptic release with chromophore-assisted light inactivation (CALI) | |
| Ino et al. | A fluorescent sensor for real-time measurement of extracellular oxytocin dynamics in the brain | |
| KR20110018924A (ko) | 세포주, 2차 전달물질의 광학적 조절을 위한 시스템 및 방법 | |
| WO2003016486A2 (en) | Bio-synthetic photostimulators and methods of use | |
| Contreras et al. | Melanopsin activates divergent phototransduction pathways in intrinsically photosensitive retinal ganglion cell subtypes | |
| US11384132B2 (en) | Mutant light-inducible ion channel of chrimson | |
| US20190218256A1 (en) | Mutant light-inducible ion channel of channelrhodopsin | |
| AU2015203097B2 (en) | Light-activated chimeric opsins and methods of using the same | |
| JP2020516295A (ja) | 新規光遺伝学ツール | |
| Carbonneau | Role of the α1 subunit of the dihydropyridine receptor in excitation-contraction coupling in skeletal myotubes |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |