KR20110018924A - 세포주, 2차 전달물질의 광학적 조절을 위한 시스템 및 방법 - Google Patents

세포주, 2차 전달물질의 광학적 조절을 위한 시스템 및 방법 Download PDF

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더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티
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Abstract

광-활성화 분자에 대해서 다양한 방법, 장치 및 조성물이 사용된다. 세포 내에서 2차 전달물질을 생성하기 위해 이러한 방법 중 하나가 사용된다. 키메라 광 반응성 멤브레인 단백질 (예를 들면 로돕신(rhodopsin))을 발현하기 위한 뉴클레오티드 서열이 1종 이상의 이종 수용체 서브유닛{예를 들면 아드레날린성 수용체 (알파1, 베타2)}에 의해 변형된다. 광에 반응하여 2차 전달물질을 생성하기 위해 광 반응성 멤브레인 단백질이 세포 내에서 발현한다.

Description

세포주, 2차 전달물질의 광학적 조절을 위한 시스템 및 방법{CELL LINE, SYSTEM AND METHOD FOR OPTICAL CONTROL OF SECONDARY MESSENGERS}
관련 문서
본 특허 문서는 2008년 5월 29일 출원되고 발명의 영문 명칭이 "Cell Line, System and Method for Optical Control of Secondary Messengers;"인 미국 특허 가출원 일련 번호 61/057,108을 35 U.S.C. §119(e) 하에 우선권으로 주장하고, 기초를 이루는 상기 가출원은 거명에 의해 완전히 본원에 도입된다.
전자 제출된 자료의 거명에 의한 도입
본 출원과 함께 제출되고, 하기와 같이 확인되는 컴퓨터-판독가능 뉴클레오티드/아미노산 서열 목록 전체가 거명에 의해 포함된다: 2009년 4월 29일 생성된 파일명 "STFD195PCT_ST25.txt"의 1개의 12,342 바이트 ASCII (텍스트) 파일.
본 발명은 일반적으로 광학적 자극에 반응하여 2차 전달물질을 생성하는 시스템 및 접근법에 관한 것이고, 보다 구체적으로 광에 반응하여 2차 전달물질을 생성하는 것에 관련된 세포주, 뉴클레오티드 서열, 키메라 단백질 및 그의 용도에 관한 것이다.
구아닌 뉴클레오티드-결합 단백질 (G 단백질)은 비활성 구아노신 디포스페이트 (GDP) 상태 및 활성 구아노신 트리포스페이트 (GTP) 결합 상태 사이에서 전환되는 것으로 알려져 있다. 상기 두 상태는 세포 내에서의 2차 전달물질의 방출에 연관된다. 방출된 2차 전달물질은 다운스트림 세포 과정을 조절하는 기능을 할 수 있다.
2차 전달물질은 빠르게 생성/방출되는 신호 분자를 포함한다. 이들 분자는 세포 내의 이펙터 단백질을 활성화함으로써 세포의 반응을 발생시킨다. 세포의 신호 시스템의 예로는 포스포이노시톨 시스템, 고리형 아데노신 모노포스페이트 (cAMP) 시스템, 및 아라키돈산 시스템을 들 수 있다.
G 단백질의 상이한 상태 사이의 변화는 G 단백질-커플링 수용체 (GPCRs), G 단백질-연결 수용체 (GPLR), 세븐 트랜스멤브레인 도메인 수용체 (7TM 수용체) 또는 헵타헬리칼(heptahelical) 수용체라고 불리우는 단백질에 의해 촉발될 수 있다. 이 단백질 군은 다양한 트랜스멤브레인 수용체를 포함한다. 이들 수용체는 세포 내부로의 신호 도입 경로를 활성화함으로써 외부 자극 (예를 들면 광, 뉴로 트랜스미터, 냄새 또는 호르몬)에 반응한다. 구체적으로, 리간드는 도입 경로를 연결하고 활성화하여 G 단백질이 전환 상태가 되도록 한다. GPCR-관련 활성은 다수의 질병에 관여하므로, GPCRs는 많은 제약 및 처리의 표적이다.
시장의 모든 의약 중 30% 이상이 G-단백질 커플링 수용체 (GPCRs)를 표적으로 하고 있으며, 이들 의약 중 다수는 2차 전달물질 cAMP의 생성 또는 억제에 관한 것으로 알려져 있다. cAMP가 직접적으로 관련하는 다수의 병리학적 과정이 있고, 이는 신경생리학적, 내분비학적, 심장, 신진대사 및 면역성 질병을 포함한다. 복잡한 포유 동물 거동의 연구에서, 기술적인 한계로 인해 세포 내의 신호 과정에 대해 시공간적으로 정확히 조절하지 못하였다. 2차 전달물질 레벨, 예를 들면 cAMP 레벨을 조절하기 위한, 화학에 기초한 최근 방법은 상대적으로 느리게 운용되고, 현재 연구되는 문제점은 특정 조직, 예를 들면 신경 또는 심장 조직과 관련하여 신체에서 사용하는 빠른 시간의 활성이다. 종종 이러한 화학적-방법은 상기 빠른 시간으로 프로빙하기 위한 속도를 결여한다 (예를 들면, 신규한 처리법을 스크리닝).
발명의 요약
본 발명은 2차 전달물질의 생성 및 이미징 장치 및 이들의 구현에 관련된 상술한 문제점 및 다른 문제점을 극복하기 위한 것이다. 본 발명은 다수의 구현 및 적용을 예시하고 있고, 이 중 일부는 하기에 요약되어 있다.
본 발명의 실시태양에 따르면, 세포 내에서 2차 전달물질을 생성하기 위한 방법이 사용된다. 키메라 광 반응성 멤브레인 단백질 (예를 들면, 로돕신)을 발현하기 위한 뉴클레오티드 서열은 1종 이상의 이종 수용체 서브유닛 {예를 들면, 아드레날린성 수용체 (알파1, 베타2)}에 의해 변형된다. 광에 반응하여 2차 전달물질을 생성하기 위해 광 반응성 멤브레인 단백질은 세포 내에서 발현한다.
본 발명의 실시태양에 따르면, 세포 내 전달물질과 관련한 추정 처리 요법 (예를 들면 상기 2차 전달물질을 통해 작용하는 의약 또는 전기 자극 또는 임의의 것)의 효능을 평가하기 위한 방법이 사용된다. 키메라 광 반응성 멤브레인 단백질 (로돕신)을 발현하기 위한 뉴클레오티드 서열은 1종 이상의 이종 수용체 서브유닛 {예를 들면, 아드레날린성 수용체 (알파1, 베타2)}에 의해 변형된다. 광에 반응하여 2차 전달물질을 생성하기 위해 광 반응성 멤브레인 단백질은 세포 내에서 발현한다. 단백질은 광에 노출된다. 처리의 효과를 평가한다.
본 발명의 실시태양은 1종 이상의 이종 수용체 서브유닛 {예를 들면, 아드레날린성 수용체 (알파1, 베타2)}을 갖는 키메라 광 반응성 멤브레인 단백질 (로돕신)을 발현하는 세포에 관한 것이다.
본 발명의 실시태양은 1종 이상의 이종 수용체 서브유닛 {예를 들면, 아드레날린성 수용체 (알파1, 베타2)}을 갖는 키메라 광 반응성 멤브레인 단백질 (로돕신)을 발현하기 위한 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다.
상기 본 발명의 요약은 나타낸 각 실시태양 또는 본 발명의 모든 구현을 기술하기 위한 것이 아니다. 이하의 도면 및 상세한 설명은 이들 실시태양을 더욱 구체적으로 보여준다.
본 발명은 하기의 도면과 연결하여 본 발명의 다양한 실시태양의 상세한 설명을 고려하면 더욱 완전하게 이해될 수 있다.
도 1A는, 본 발명의 실시태양의 예에 따른, 옵토Gs 및 옵토Gq를 나타내는 도면을 나타낸다.
도 1B는, 본 발명의 실시태양의 예에 따른, 감염되지 않거나, 옵토Gs 또는 옵토Gq에 의해 감염된 세포의 cAMP, cGMP, 및 IP1의 효소-결합 면역 흡착 검사(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA))를 나타낸다.
도 1C는, 본 발명의 실시태양의 예에 따른, 옵토Gs 및 옵토Gq의 mCherry 퓨전 단백질로 감염된 세포의 Ca-이미지를 나타낸다.
도 2는, 본 발명의 실시태양의 예에 따른, 옵토Gs 및 옵토Gq의 mCherry 퓨전 단백질로 감염된 세포의 Ca-이미지를 나타낸다.
도 3A는, 본 발명의 실시태양의 예에 따른, 다양한 구조체를 발현하는 HEK 세포에 대한 cAMP, IP1 및 IP3 레벨을 나타낸다.
도 3B는, 본 발명의 실시태양의 예에 따른, 렌티바이러스 발현 벡터, 옵토-α1AR-발현 세포의 GAD 염색법, 및 10분의 광학적 자극 후에 관찰한 옵토XR-발현 세포 (mCherry+)에서의 pCREB 활성화를 나타낸다.
도 4A는, 본 발명의 실시태양의 예에 따른, 형질 도입된 측좌핵의 광 전극 표적화, 스파이크 파 형태 및 지적된 구조체에 대한 베이스라인 신호 속도를 나타낸다.
도 4B는, 본 발명의 실시태양의 예에 따른, 광 자극에 의한 생체 내 광 전극 기록을 나타낸다.
도 4C는, 본 발명의 실시태양의 예에 따른, 밝음 대 베이스라인에 대한 스파이킹 주파수의 변화를 나타낸다.
도 4D는, 본 발명의 실시태양의 예에 따른, 신호 속도 변화 동력학을 나타낸다.
도 5A는, 본 발명의 실시태양의 예에 따른, 형질 도입된 영역의 정위 표적화, 광 섬유가 이식된 자유롭게 움직이는 마우스, 장소 선호 장치의 도면 및 테스트 및 자유롭게 돌아다니는 마우스의 트레이스를 나타낸다.
도 5B는, 본 발명의 실시태양의 예에 따른, 대조 및 옵토-α1AR에 대한 선호도를 나타낸다.
도 5C는, 본 발명의 실시태양의 예에 따른, 다양한 오픈 필드 테스트에 있어서, 총 거리의 결과를 나타낸다.
본 발명에 다양한 변형 및 별법적인 형태가 적용가능한 한편, 이의 상세사항이 도면에서 예의 방식으로 제시되었고, 상세하게 기술될 것이다. 그러나, 본 발명을 기술된 특정 실시양태에 한정하려는 의도가 아님을 이해하여야 한다. 이에 반하여, 본 발명의 취지 및 범주 내에 속하는 모든 변형, 등가물 및 별법을 포함하도록 의도된다.
본 발명은 다양한 광학-기초 시스템 및 방법의 실질적인 적용을 가능하게 하는데 유용한 것으로 믿어지고, 본 발명은 세포 내에서 2차 전달물질 레벨의 광학적 조절을 다루는 시스템 및 방법에 있어서 특히 적합하게 사용되는 것으로 밝혀졌다. 본 발명이 반드시 상기 적용에 국한되는 것은 아니지만, 상기 맥락에서 사용되는 다양한 예를 논의함으로써 본 발명의 다양한 측면이 이해될 수 있다.
본 발명의 실시태양은 광학적 자극에 반응하여 세포 내에서 2차 전달물질의 방출을 야기하는 키메라 멤브레인 단백질을 포함한다. 특정 경우에 있어서, 키메라 단백질은 광이성질체화를 통해 광에 반응하여 입체배좌(conformation)를 겪는 단백질 및 이종 수용체 서브유닛의 조합이고, 따라서 광에 의해 활성화된다. 이종 수용체 서브유닛을 포함하도록 변형될 수 있는 광-반응성 단백질의 예로 로돕신 또는 레티닐리덴(retinylidene) 단백질을 들 수 있다.
본 발명의 한 실시태양에 따르면, 세븐 트랜스멤브레인 α-헬리칼 도메인을 함유하는 것으로 여겨지는 단백질은 2차 전달물질과 관련된 이종 수용체 서브유닛을 포함하는 것으로 변형된다. 세포 멤브레인에서 발현될 때, 단백질은 광에 반응하여 등각(conformal) 변화를 겪는다. 등각 변화는 2차 전달물질의 방출/생성을 촉발한다.
본 발명의 실시태양은 광학적 자극에 반응하여 세포 내에 2차 전달물질의 방출시키는 키메라 멤브레인 단백질을 코딩하기 위한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명의 실시태양은 이종 및 키메라 멤브레인 단백질을 발현하는 세포를 포함한다. 키메라 멤브레인 단백질은 광학적 자극에 반응하여 세포 내에서 2차 전달물질의 방출을 촉발한다. 특정 실시태양에서, 키메라 멤브레인 단백질의 발현은 생체 내에서 일어난다. 다른 실시태양에서, 키메라 멤브레인 단백질의 발현은 시험관 내에서 일어난다.
본 발명의 실시태양은 적절한 수용체 서브유닛을 포함하도록 구아닌 뉴클레오티드-결합 단백질 커플링 수용체 단백질 (GPCR)을 변형함으로써 임의의 적절한 2차 전달물질을 생성하도록 구현될 수 있다.
본 발명의 실시태양은 다양한 광의 파장 및 세기에 반응하는 단백질을 사용할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 실시태양은 키메라 GPCR 단백질을 사용하여 관심사인 2차 전달물질 활성의 임의의 다운스트림 효과를 측정하는 것을 포함한다.
본 발명의 실시태양은 포유 동물 세포, 줄기 세포, 식물 세포, 및 효모 및 대장균(E. coli)과 같은 단세포 생물을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는 다양한 세포형의 키메라 GPCR 단백질의 발현에 관한 것이다.
본 발명의 특정 실시태양은 시각화를 용이하게 하기 위해 형광 단백질을 접합한 키메라 단백질의 최적화된 발현 및 광에 의해 유도된 2차 전달물질의 활성의 다운스트림 효과를 연구하기 위한 양식(modality)의 최적화된 사용에 관한 것이다.
본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 실시태양은 특정 세포 집단 내에서 발현하도록 키메라 GPCR 단백질을 유전학적으로 표적화하는 것에 관한 것이다. 세포-유형 특정 프로모터는 표적 세포 유형에서 선택적으로 발현되어 존재한다 (예를 들면, 뉴론을 표적으로 하는 시냅신-1; 심장 조직을 표적으로 하는 트로포닌 변이체). 상기 키메라 GPCR 단백질의 프로모터 업스트림을 발현 벡터에 위치시키는 것은 단백질의 발현을 관심 세포 유형에서 표적화하는 데 사용될 수 있다. 이는 유도 가능한, 가역적, 아니면 조절 가능한 프로모터 시스템, 예를 들면 Tet-반응, ER-반응 및 Cre/Lox 시스템을 포함한다.
본 발명의 실시태양의 한 예에 따르면, 유전학적으로 코딩 가능한 단백질이 관심 세포 유형에서 발현될 때, 광에 반응하여 고리형 아데노신 모노포스페이트(cAMP)가 생성되도록 개발된다. 예를 들면, 이는 제약의 스크리닝을 포함하지만 이에 국한되지 않는 세포 생리학에 대한 다운스트림 효과를 시각화하는데 유용할 수 있다. 다른 실시태양은 광에 반응하여 2차 전달물질을 방출시키는 키메라 및 이종 GPCR을 사용한다. 2차 전달물질의 예로는 cAMP, 고리형 구아노신 모노포스페이트 (cGMP), 이노시톨 트리포스페이트/이노시톨 1,4,5-트리포스페이트/트리포스포이노시톨 (IP3) 및 아라키돈산을 포함한다.
본 발명의 실시태양에 따르면, 세포 내 전달물질과 관련한 추정 처리 요법(예를 들면 상기 2차 전달물질을 통해 작용하는 의약 또는 전기 자극 또는 임의의 것)의 효능을 평가하기 위한 방법이 사용된다. 키메라 광 반응성 멤브레인 단백질 (예를 들면 로돕신)을 발현하기 위한 뉴클레오티드 서열은 1종 이상의 이종 수용체 서브유닛 {예를 들면, 아드레날린성 수용체 (알파1, 베타2)}에 의해 변형된다. 광에 반응하여 2차 전달물질을 생성하기 위해 광 반응성 멤브레인 단백질은 세포 내에서 발현한다. 단백질은 광에 노출된다. 처리의 효과를 평가한다.
광은 원하는 자극 프로파일에 따라 적용될 수 있다. 한 실시태양에 있어서, 발현된 멤브레인 단백질은 수십 밀리세컨드 안에 광에 반응한다. 따라서, 자극 프로파일은 빠르게 연속되는 광 펄스의 시리즈를 포함할 수 있고, 예를 들면, Ca2 + 민감성 염료를 사용하여 그 효과를 모니터링할 수 있다.
이러한 경우, 세포는 처음에는 처리 없이도 자극될 수 있다. 일단 처리가 가해지면, 세포는 그 후 다시 자극될 수 있다. 처리의 효과를 평가하기 위해 각 테스트 결과를 비교할 수 있다.
상기 처리는 넓은 범위로 다양하고 상이하게 구현될 수 있고, 이것은 제약, 세포의 변형 (유전적 또는 그 외), 세포의 물리적 파라미터 (예를 들면, 온도 변화 또는 전기 자극) 또는 생물에 적용되는 처리 요법을 포함하지만, 이에 국한되지는 않는다.
한 실시태양에 있어서, 처리는 발현된 멤브레인 단백질의 광학적 자극이다. 이러한 경우, 효과는, 예를 들면 치료할 장애와 관련된 증상을 모니터링 함으로써 측정될 수 있다.
다른 실시태양에 있어서, 처리 요법은 질병 또는 장애의 모델링의 일부로서 사용된다. 예를 들면, 질병 모델이 사용될 수 있고 (세포 또는 동물), 단백질이 발현되고 처리 요법이 평가되기 전에 백그라운드/베이스라인 상태를 평가할 수 있다.
실험 결과는 표적화된 이온 채널의 광학적으로 야기된 cAMP 조절이 cAMP-유도자 및 cAMP-표적화 양이온 채널을 갖는 감염 세포에 의해 시각화될 수 있고, 그 결과 얻어진 활성을 Ca2 +-민감성 염료를 사용하여 시각화할 수 있음을 나타낸다. ADHD 및 심장의 채널 질환과 같은 다수의 질병 상태에서의 cAMP의 적용을 고려하면, 2차 전달물질 활성의 유전학적-코딩 가능하고, 광학적-활성화된 조절자의 모음(suite)은 치료 양식뿐만 아니라 신규한 치료법의 스크리닝에 있어서 유용할 수 있다. 단백질은 다양한 다른 2차 전달물질 (예를 들면 IP3), 레티날(retinal) 결합 부위의 엔지니어링 또는 상이한 흡수/작용 스펙트럼을 갖는 키메라 로돕신 또는 콘 옵신의 선택에 의한 광 활성화를 위한 다른 색상, 및 2차 전달물질의 다른 다운스트림 효과, 예를 들면 칼슘 신호 및/또는 키나아제 활성과 함께 사용하기 위해 엔지니어링될 수 있다.
도 1A, 1B 및 1C는 개발된 2차 전달물질 신호 ('옵토XRs')의 광-활성화 유도자의 두 개의 예인 옵토Gs 및 옵토Gq의 실험 데이터를 나타낸다. 이들 광-활성화 유도자는 로돕신/GPCR 키메라 현상이다. 옵토Gq는 Gq 신호의 광-반응성 조절을 제공하는 반면, 옵토Gs는 Gs 신호의 광-반응성 조절을 제공한다.
옵토Gs 및 옵토Gq 둘 모두에 있어서, 어둠에서 베이스라인 cAMP 및 IP3 레벨에 무시할 수 없는 차이가 있고, 다른 2차 전달물질 경로, 예를 들면 cGMP로의 교차가 없다는 것을 나타낸다. 옵토Gq의 광 자극으로 나타나는 cAMP 레벨의 증가는 IP3 생성의 예측된 다운스트림 효과이다.
도 1A는 본 발명의 실시태양의 예에 따른 옵토Gs 및 옵토Gq의 도면을 나타낸다. 각 단백질에 있어서, 로돕신의 세포 내 루프는 보통 Gs (베타2) 또는 Gq (알파1)에 커플링되는 아드레날린성 단백질의 것으로 치환된다. 유전자 코딩 서열은 인간 및 뮤린(murine) 세포에서의 발현을 위해 최적화된다. 그 결과로 얻어진 서열의 예로 옵토Gs: 서열 번호 1 및 서열 번호 2; 및 옵토Gq: 서열 번호 3 및 서열 번호 4를 포함한다.
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 단백질의 아미노산 서열은 일관되고, 상호교환 가능하거나 또는 등가 결과를 제공하는 유전자 서열의 변이 (예를 들면, 점 돌연변이)에까지 확장되는 실시태양에 의해 뒷받침되는 비제한적인 예로서 나타내어진다.
도 1B는, 본 발명의 실시태양에 따른, 감염되지 않거나, 옵토Gs 또는 옵토Gq로 감염된 세포의 cAMP (상부), cGMP (중간) 및 IP1 (하부; IP3의 분해 생성물)의 효소-결합 면역 흡착 검사 (ELISA)를 나타낸다. 도 1B의 결과는, 기재된 바와 같이, 점당 1분 동안 504　nm의 광 (20 nm 대역폭)으로 자극하거나 또는 어둠 속에 방치한 세포로부터 얻는다.
자극은 환경-조절된 역 배양 현미경 (레이카(Leica) DMI6000B)을 사용하여 구현된다. cAMP 분석에 있어서, 분석의 포화(saturating), 양성 대조군으로서 30분 동안 일부 세포를 10uM 포스콜린(forskolin)으로 처리한다. 옵토Gs는 광에 반응하여 cAMP 레벨을 현격하게 증가시킨다. 옵토Gs에 의한 cAMP의 베이스라인의 유의할만한 증가 또는 cGMP 또는 IP3 레벨의 편차가 관찰되지 않는다. 옵토Gq는 cGMP 레벨을 크게 변화시키지 않으면서 광에 반응하여 IP3 레벨을 현격하게 증가시킨다. IP3 생성과 함께 cAMP 레벨의 증가는 세포 내 Ca2 + 방출의 결과인 것으로 여겨진다.
도 1C는, 본 발명의 실시태양의 예에 따른, 옵토Gs 및 옵토Gq의 mCherry 퓨전 단백질로 감염된 세포의 Ca-이미징을 나타낸다. cAMP를 검출하기 위해, 고리형 뉴클레오티드를 관문으로 하는 Ca2 + 채널의 cAMP-선택성 돌연변이체 CNGA2를 과량의 옵토Gs로 감염시킨다. IP3는 세포 내 Ca2 + 스토어의 방출을 활성화하고, 이에 따라 신뢰할 수 있는 Gq 활성화의 신호를 제공한다. 또한, 조절 집단을 과량의 돌연변이체 CNGA2와 함께 mCherry만으로 감염시킨다. 세포에 푸라(fura)-2를 로딩하고 (20-25분 인큐베이션), 340 nm 및 380 nm에 매 2초마다 2 ms 노출시킨다. 대조 집단에서 의미 있는 신호가 검출되지 않은 반면, 옵토Gs 및 옵토Gq 각각에 있어서는 Ca 신호를 얻기 충분한 신호를 얻었다.
도 1은 특정 실험 설정으로부터 얻어진 데이터를 나타내지만, 본 발명은 이에 국한되지 않는다. 예를 들면, 감염 이외의 다양한 운반 기술이 고려될 수 있는데, 이것은 바이러스 도입, 탄도 유전자 운반 (유전자 총) 및 자발적인 핵산 업테이크(uptake)를 포함하지만, 이에 국한되지는 않는다.
베이스-로돕신은 임의의 적절한 이종 수용체 서브유닛, 예를 들면 알파2-아드레날린성 수용체 또는 도파민 D2 수용체 또는 세로토닌 5HT2A 수용체와 같은 Gi-커플링 수용체, 또는 도파민 D1A 수용체 또는 대사형 글루탐산 수용체와 같은 기타 Gs- 또는 Gq-커플링 수용체와 함께 사용되도록 변형될 수 있다.
실시태양의 한 예에 따르면, 베이스-로돕신은 소, 유럽 가축우(Bos taurus)로부터 유도된 단백질이다.
한 실시태양에 따르면, 상술한 베이스-로돕신 이외의 베이스-단백질도 사용될 수 있고, 다양한 7-트랜스멤브레인 단백질, 예를 들면 콘 옵신 (적색, 녹색, 또는 청색), 다른 종의 로돕신, 및 도파민 또는 세로토닌 수용체와 같은 리간드-관문 수용체를 포함한다.
다양한 구현은 포유 동물의 생체 내 적용에 관한 것이다. 이들 구현은 테스트 및 신경 회로 확인 및 질병 모델을 포함하지만, 이에 국한되지는 않는다.
도 3A 및 3B는 2차 전달물질 신호의 광-활성화 유도자의 2개의 예인 옵토Gs (옵토-β2AR) 및 옵토Gq (옵토-α1AR)의 생체 내 적용에 의한 실험 데이터를 나타낸다. 본 발명의 측면은 G-단백질-커플링 수용체 (GPCRs)들의 통상적 구조-함수 관계를 이용하여 수용체-개시 생화학적 신호 경로를 높은 시공간적 정확성으로 활용하고 조절하는 유전적으로 코딩된 광학적 툴 ('옵토XRs')의 다용도 군의 사용 및 개발에 관한 것이다.
도 3A 및 3B에서 나타낸 결과는 광에 반응하여 뚜렷하고, 표적화된 신호 경로를 선택적으로 활용하는 2개의 특정 옵토XRs에 관한 것이다. 2개의 옵토XRs는 생체 내 측좌핵에서의 스파이크 신호(firing)에 있어서 상반된 효과를 나타내고, 측좌핵에 정확히 시간을 맞춘 옵토XR 광자극만으로 자유롭게 움직이는 마우스가 조정된 선호 장소를 갖도록 하기에 충분하다. 옵토XR 접근법은 거동하는 포유 동물에 대한 생화학적 신호의 통상적인 영향에 대한 가설을 표적화 할 수 있고 일시적으로 정확한 방식으로 시험하는 것을 가능하게 한다.
세포 내 신호에 대한 광학적 조절은 포유 동물에게서 구현되는데, GPCRs의 공통된 구조-함수 관계를 사용하여 신호를 이펙터에 연결하는 신규한 도입 이론에 의해 복수의 분명한 옵신/GPCR2 키메라를 생체 내에서 개발 및 발현한다. 다양한 구현예에 따르면, 1종 이상의 키메라 옵신-수용체 단백질은 포유 동물 생체 내에서 작용하고, 특정 세포를 표적화할 수 있고, 정확히 시간을 맞춘 광 펄스에 반응하도록 엔지니어링된다. 상기 접근법은 고속의 광학적 자극 (및 단백질 반응)을 사용하여 정확하게 정해진 거동-관련 시간에 일어나는 세포 내 생화학적 사건을 테스트하고 특성화하는 것을 가능하게 한다. 수 개의 비제한적 구현예는, 박동성 대 긴장성 조정, 상이한 변조 시스템 사이의 동조(synchrony), 및 특정 세포 유형에 있어서 시간에 따른 다른 근본적인 생리적 및 병리적 과정을 포함한다.
포유 동물 구현은 성공적으로 행해졌다. 구현의 한 예에 있어서, Gt-커플링된 소 로돕신과 함께 Gq-커플링 인간 α1a아드레날린성 수용체 (α1AR) 및 Gs-커플링 햄스터 β2-아드레날린성 수용체 (β2AR)의 보존된 잔기를 우선 정렬시킴으로써, 로돕신의 세포 내 루프를 특정 아드레날린성 수용체의 것으로 대체한다 (도 1A). 세포 내 영역 (카르복시-말단 도메인 포함)의 교환을 구조 모델에 기초한 각 수용체에 맞게 엔지니어링하여 Gt로부터의 G-단백질 커플링을 전달하고, 포유 동물의 생체 내 발현에 대해 각 수용체를 최적화한다. 다양한 리간드에 의해 활성화될 때, 천연 수용체는 리간드-편향된 신호 현상에 있어서 캐노니칼(canonical) 및 비캐노니칼 경로를 활용하기 위해 복수의 합체(ensemble) 상태를 경험할 수 있다. 옵토XRs는 생물학적 관점에 따른 방식으로 광을 감지할 때 단일 활성 합체 상태를 선택하는 경향이 있다.
키메라를 코딩하는 유전자 (옵토-α1AR 및 옵토-β2AR)는 형광 단백질에 융합된다. 기능적 옵토XR 발현은 옵토-α1AR만으로 감염되거나 (Gq를 통해 [Ca2 +]i를 활용할 것으로 예상됨) 또는 옵토-β2AR 및 cAMP-관문 Ca2 + 채널 CNGA2-C460W/E583M 둘 모두로 감염시킨 (Gs를 통해 고리형 AMP를 활용할 것으로 예상됨) HEK 세포에 있어서 이미지화된 [Ca2 +]i (세포 내 칼슘 농도)를 통해 확인된다. 비율계량 [Ca2 +]i 이미징은 60초의 녹색 광 자극 (504 +/- 6 nm, 7 mW mm-2)이 옵토XR의 현저한 다운스트림 [Ca2 +]i 신호를 이끌어 내기에 충분하지만, 대조 조건에 있어서는 그렇지 않다는 것을 나타내는데 (도 2), 이를 통해 기능적 발현을 확인하였다. 각 옵토XR에 의해 조절된 신호의 특이성을 테스트하기 위해, 형질 도입된 HEK 세포를 60초 동안 3 mW mm-2 504 +/- 6 nm 광으로 조명한 후 분해하고 면역 분석법을 통해 cGMP, cAMP 및 IP1 (IP3의 분해 생성물)의 레벨을 분석하였다. 광학적 자극은 옵토-β2AR-발현 세포에 있어서 IP3 (도 3A, 중간), [Ca2 +]i (도 2), 또는 실질적인 어둠 활성을 활용하지 않고 야생형 AR의 약리적 자극에 의해 달성되는 것과 비견할만한 cAMP의 유의할만한 생성을 발생시키기 때문에, 캐노니칼 패턴은 분자 디자인에 상응하는 옵토-β2AR에 대해 예상되는 것과 같다 (도 3A, 상부). 대조적으로, 광학적 자극은, 옵토-α1AR-발현 세포에서, 야생형α1AR의 약리적 자극에 의해 유도되는 레벨과 비견할만한 IP3 신호의 유의할만한 상향조절을 발생시킨다 (도 3A, 중간). [Ca2 +]i 상승 (도 2)과 함께, 이들 데이타는 Gq 활용에 있어서 예상되는 패턴을 나타내는데, 이 패턴은 옵토-β2AR-발현 세포에서는 나타나지 않는다 (도 3A, 상부). 구조체를 발현하는 세포의 광학적 자극은 cGMP 레벨을 조절할 수 없고 (도 3A, 하부), 키메라 단백질 신호 특이성을 추가로 나타낸다. 옵토XRs이 작용 스펙트럼을 천연 로돕신과 가깝게 유지하는 것을 나타내는 유사한 분석은 생물학적으로 적절한 광 플럭스의 범위에 걸쳐 신호를 통합할 수 있고, 야생형 수용체와 유사한 정도로 p42/p44-MAPK 신호에 대한 비캐노니칼 경로를 활성화할 수 있다.
레티날 보조인자의 보충이 필요한지 여부를 포함하여, 손상되지 않은 신경 조직에 있어서 옵토XR 성능을 테스트하였다. 상기 테스트 중 하나에서, 시냅신-I 프로모터의 조절하에 옵토XR 퓨전 유전자를 운반하는 렌티바이러스 벡터 (다른 잠재적 Gs/Gq-반응성 세포 조직 요소, 예를 들면 아교 및 내피 세포보다 국소 뉴론의 생화학적 조정을 표적화하기 위함; 도 3B, 상부 좌측)를 다 자란 마우스의 측좌핵 내로 정위적(stereotactically)으로 주사하였다. 이 전략은 측좌핵 중 세포체수상돌기 컴파트먼트(somatodendritic compartments)를 갖는 뉴론의 생화학적인 조정을 표적화하고 (추가의 서브타입 특이성이 없는 ~95%GABAergic 미디엄 스파이니 뉴론(medium spiny neuron); 도 3B, 좌측), 렌티바이러스가 액손(axons)을 통해 세포를 도입하지 않기 때문에 통로의 섬유 또는 구심성 시냅스이전-말단을 배제한다. 도입 2주 후, 측좌핵의 급성 관상 슬라이스를 인공 뇌척수액 중에서 제조하고, 광학적으로 10분 동안 자극하고, 즉시 고정하고, Ser 133-포스포릴화 CREB (pCREB), cAMP 및 Ca2 +-커플링 신호 캐스캐이드의 생화학적 통합자로 염색하였다. 외인 레티노이드의 보충 없이, 유의하게 상승한 pCREB이 옵토XR-발현 집단 (도 3B, 우측)에서 발견되었지만, 조명을 받지 않은 조직에서는 그러하지 않았다.
형질 도입된 측좌핵을 표적화한 광 전극으로 멀티-유닛 생체 내 뉴런의 신호를 기록함으로써 측좌핵 국소 전기 활성에 대한 옵토XR 활성화의 기능적 결과를 측정하였다 (도 4A). 어둠에서는 구조체에 대한 베이스라인 신호 속도의 유의할만한 차이가 발견되지 않았다 (도 4A, 하부 우측). Gs를 표적화한 앞선 약리적 연구와 일치되게, 광학적 자극은 옵토-β2AR-발현 측좌핵에 있어서 네트워크 신호의 감소를 가져왔다 (도 4B에서 좌측 트레이스는 효과 동력학을 나타내고, 도 4C 및 4D 각각은 데이터의 요약을 나타냄). 광학적 자극은 옵토-α1AR-발현 측좌핵에 있어서 신호를 증가시켰다 (도 4B 우측; 도 4C, 4D). 스파이크 주파수 히스토그램은 신호 속도에 대한 옵토XR 효과의 동력학이 신호의 전기적 개시보다는 생화학적 개시와 일치되는 것을 나타낸다 (도　4D). 이러한 전기 생리학적 데이타는, 이전의 생화학적인 확인과 조합하여, 옵토XRs이 생체 내에서 기능적으로 발현하여, 세포 내 캐스케이드의 차별화된 광활성화 조절 및 네트워크 생리학의 조절을 가능하게 한다는 것을 뒷받침한다.
한 구현예에 있어서, 자유롭게 움직이는 마우스의 거동을 조절에 대한 정확하게 시간을 맞춘 옵토XR 자극의 능력을 분석하는데 있어서 광 유전이 사용된다. 휴대 가능한 고체-상태 광 운반체는 옵토XRs의 유전자 삽입 발현과 결합하여 조작적 거동에 있어서 사용되는 일시적으로 정확한 방식으로 측좌핵 뉴론 내의 세포 내 신호를 광학적으로 조절한다(도 5A). 동일 초점 분석은 국소 측좌핵 뉴론에 국한한 발현을 나타내고; 특히 구심성 섬유, 측좌핵에 투영한 먼 영역, 아교 세포, 또는 주변 영역에서 표지가 관찰되지 않았다. 광학적 자극은 3일의 조작적으로 조건화된 장소 선호 분석의 일환으로 형질 도입된 측좌핵을 표적화하였다 (도 5A). 각 테스트 날에, 동물이 장소 선호 장치를 자유롭게 돌아다닐 수 있게 하였다 (도 5A, 하부). 첫째날, 동물은 광학적 자극 없이 장치를 마음껏 돌아다녔다. 둘째날, 동물이 지정되고 조건화된 챔버에 자유롭게 들어갈 때마다, 형질 도입된 영역에 등록(register)된 레이저-다이오드-커플링 광 섬유는 강한 보상(reward) 동안 모노아민성 주입의 예상 세기에 근사한 값으로 10 Hz에서 광 펄스를 운반하였다. 경로 추적은 유연한 광섬유 접근법이 모든 챔버로 완전히 방해받지 않고 돌아다닐 수 있게 하는 것을 나타낸다 (도 5A, 하부). 셋째날, 동물은 다시 광학적 자극 없이 장치를 마음껏 돌아다니고, 조건화된 챔버에서 지낸 시간을 두 개의 독립적인, 블라인디드(blinded) 스코어러에 의해 수량화하였다. 분명하게, 옵토-α1AR을 발현하는 동물은 광학적 자극 후에 장치의 조건화된 쪽에 대한 선호도가 크게 증가하는 것을 나타낸다 (도 5B). 일시적으로 정확한 생화학적 조정의 효과를 2개로 분리된 옵토-α1AR 동물의 집단에 대하여 재생성할 수 있는 반면 (n=5-6, P<0.05, 각 집단이 조건화된 챔버에 있는 시간에 대한 스튜던트 t-테스트; 전체 집단에 대해서는 n=11, P<0.01), 다른 옵신 유전자, 옵토-β2AR 및 ChR2는 선호에 대한 영향에 있어서 덜 효과적인 것으로 나타났다. 오픈 필드 테스트에서 동일한 동물 집단에 가해지는 동일한 광학적 자극이 이동 거리 또는 벽 근접 선호에 유의할만한 영향을 주지 않는 것으로 보아, 측좌핵 뉴론에 있어서 옵토-α1AR 자극의 효과는 보상-관련 거동에 특이적이고, 불안-관련 거동 또는 운동 활성의 직접적인 조정에까지 확장되지 않는다 (도 5C).
상기 실험과 일관되는 특이적 및 비제한적 구현예를 이하에 기재한다. 생체 내 기록 및 분석은 마우스의 형질 도입된 측좌핵으로 낮춘 팁-팁의 거리가 200-400 mm인 전극/섬유를 갖는 (전극 팁을 정수리점 아래로 4.8-5.2mm) 기록 전극 (1MV 텅스텐, A-M 시스템)에 연결된 200 mm 직경의 멀티-모드 광섬유로 이루어지는 광 전극 (토르 랩스(Thorlabs))을 사용하여 수행되고, 정위 틀 (데이비드 코프 인스트루먼트)에 위치시키고, 이소플루란으로 마취시켰다. 473nm 다이오드 레이저(크리스탈레이저(CrystaLaser))로부터의 광은 섬유를 통해 전달하였다. 전기 신호를 밴드패스 필터링하고, 증폭하고 (0.3-1kHz, 1800 마이크로일렉트로드 AC 앰플리파이어, A-M 시스템), p클램프(pClamp) 10.0 (몰레큘러 디바이스(Molecular Device))로 분석하였다. 스파이크를 역치에 의해 검출하고, 개별적으로 검사를 통해 확인하였다.
거동 분석은 473 nm 청색 다이오드 레이저 (크리스탈레이저)에 연결되고 캐뉼라 표적화 측좌핵 (팁으로부터 0-100 mm)에 등록된 광섬유 (200 mm 직경, 토르 랩스)를 통해 적용되는 광학적 자극을 사용하여 수행하였다. 함수 발생기(아길렌트(Agilent) 33220A)를 통해 옵토XRs에 대해 50 ms 펄스 너비를 갖는 광이 운반된다. 자유롭게 돌아다니는 것이 가능하도록 챔버 사이의 벽을 제거한 표준 장치 (에스디 인스트루먼트(SD Instruments))에서 장소 선호를 행하였다. MATLAB (매스워크스(Mathworks))에서 작동하는 커스텀 톨링 스크립트(custom tallying script)를 사용하는 2개의 독립적인, 블라인디드 옵저버에 의해, 각 챔버에서 지낸 시간의 양에 대한 데이터를 비디오를 통해 분석하였다. 오픈 필드 테스트에서, 길이가 40340 cm인 정사각형의 오픈 필드에 동물을 위치시키고; 장소 선호 실험에서와 같은 파라미터로 광 자극을 운반하였다. 자동화된 소프트웨어 (뷰포인트(Viewpoint))를 사용하여 중앙 15315 cm의 정사각형 대 외각의 환형 (필드의 나머지)에서의 총 시간 및 거리에 대하여 비디오를 분석하였다.
투키(Tukey) 사후 테스트 (그래프패드 프리즘(GraphPad Prism))와 함께 원-웨이 ANOVA 또는 양방 스튜던트 t-테스트 (마이크로소프트 엑셀(Microsoft Excel)에서 계산)를 사용하여 지적된 곳에 대한 통계 분석을 수행하였다. 모든 것을 요약한 막대 그래프는 평균 +/- s.e.m.으로 나타내고, 중요도는 다음과 같이 나타낸다: *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.
다양한 본 발명의 실시태양의 놀라운 결과 및 효과를 뒷받침하는 추가의 상세한 설명은 본원에 거명에 의해 도입된 문헌 [Temporally precise in vivo control of intracellular signaling, Raag D. Airan, et al ., Nature 458, 1025-1029 (23 April 2009)]에서 찾을 수 있다.
이하의 기재는 본 발명의 실시태양에 따른 특정 및 비제한적 방법에 대한 상세한 설명을 제공한다. 본 발명의 범위 내에서 이러한 방법의 다수의 변형을 상도할 수 있다.
벡터 제조
옵토-α1AR 및 옵토-β2AR의 포유 동물 코돈 최적화 서열(도 1A의 아미노산 서열)을 합성하고, pcDNA3.1 내로 복제하며, NotI 부위를 사용하여 YFP 또는 mCherry의 N-말단 (초기 코돈이 삭제됨)에 융합하였다. 옵토XR과 mCherry/YFP 사이의 연결자는 5' GCGGCCGCC 3'이다. p렌티 시냅신I hChR2 mCherry WPRE 벡터의 AgeI 및 EcoRI부위 내로 각 옵토XR mCherry에 대한 형질 전이 유전자를 복제하여 시냅신I 옵토XR mCherry를 함유하는 렌티바이러스 벡터를 제조하였다.
렌티바이러스 생성
높은 역가(titer) 렌티바이러스를 제조하였다. 간단하게, 10% FBS를 함유하는 DMEM으로 배양한 4-층 세포 팩토리 (눈크(Nunc))에서 HEK 293FT 세포를 판상 배양하여 90% 전면 생장시켰다. 690 ㎍의 상술한 렌티바이러스 벡터 및 2개의 헬퍼 플라스미드 (690 ㎍의 pΔCMVR8.74 및 460 ㎍의 pMD2.G)로 세포를 공-감염시켰다. 감염 15시간 후에 배질을 변경하였다. 감염 24시간 후, 5 mM 부티르산 나트륨을 함유하는 200-220 mL의 무혈청 울트라컬쳐(UltraCULTURE) (캄브렉스(Cambrex))으로 배질을 변경하였다. 감염 40시간 후, 이제 바이러스를 함유하는 배양 상등액을 1000 rpm에서 5분 동안 회전시켜 세포 파편을 제거한 다음 0.45 ㎛ 저-단백질-결합 필터 플라스크를 사용하여 여과하였다. SW 28 회전자 (베크만(Beckman))를 사용하여 55,000g에서 2시간 동안 투명해진 상등액을 초원심분리하여 바이러스를 침전시켰다. 원심분리 후, 상등액을 버리고, 얻어진 바이러스 펠렛을 총 100 μL의 차가운(4℃) PBS에 용해시켰다. 7000 rpm에서 5분 동안 재현탁된 바이러스를 원심분리하여 잔여 세포 및 바이러스 파편을 제거하였다. 분액을 추가로 사용할 때까지 -80℃에서 냉동시킨다.
동물 수술 및 거동
10-12 주령의 암컷 C57BL/6 마우스를 가두고, 스탠포드 대학의 실험실 척추 동물 프로토콜 (Laboratory Vertebrate Animals protocol of Stanford University)에 따라 다루었다. 다음과 같이 바이러스 용액을 우측 측좌핵에 운반하였다. 동물을 이소플루란으로 마취시키고, 털을 머리의 상부로부터 깎았다. 이소플루란으로 마취하는 동안, 동물의 머리를 정위틀 (데이비드 코프 인스트루먼트(David Kopf Instruments))에 위치시켰다. 중앙선 두피 절개를 행하고, ~1 mm 직경 개두를 정수리점에서 1.10 mm 전방, 및 1.45 mm 측면으로 드릴링하였다. 바이러스를 예비-로딩한 빗각의 33 게이지 바늘 (나노필, 월드 프리시젼 인스트루먼트(NanoFil, World Precision Instruments))을 측좌핵 내로 낮추고 (바늘 침을 정수리점에서 배쪽으로 4.70-4.80 mm으로 함), 1.0 μL의 바이러스를 자동화 주사기 펌프 (나노필, 월드 프리시젼 인스트루먼트)를 사용하여 100 nL/분으로 주사하였다. 주사 후, 바늘을 빼기 전에 조직 이완 및 액 확산을 위해 3-5 분 그대로 두었다. 급성 슬라이싱 또는 생체 내 기록 실험을 위해 표적화된 동물을 위해, 개두 부위를 치과용 시멘트(랑 덴탈(Lang Dental))로 채우고, 벳본드(VetBond)(3M)를 사용하여 절개를 닫았다. 거동 분석을 위해 표적화된 동물에 대해, 캐뉼라 (C316G, 페데스탈 아래로 4.5 mm를 절단; 플라스틱스원(PlasticsOne))를 두개골에 페데스탈 플러쉬(pedestal flush)와 함께 위치시킨다. 캐뉼라를 메타본드(Metabond (파르켈(Parkell)) 및 치과용 시멘트 (랑 덴탈)를 사용하여 고정하였다. 벳본드 또는 시멘트를 건조한 후, 동물을 틀에서 분리시키고 추가의 조작 전에 적어도 1주일간 회복시켰다. 거동 실험을 위한 대조 동물도 실험 동물과 같이 동일한 조작 (수술, 캐뉼라 이식, 광 자극)을 하고, 바이러스 대신에 비히클 (PBS)만을 주사한다. 장소 선호 실험을 위해, 챔버 중 어느 한쪽 (>70% 또는 <10%) 또는 중앙 챔버 (>40%)에 대한 베이스라인 선호를 나타내지 않는 동물을 연구에 사용되도록 하였는데, >90%의 모든 동물이 편향되지 않고, 균형이 잡힌 장소 선호 설계를 위한 기준을 충족하였다.
급성 슬라이스 제조
동물을 이소플루란으로 마취시키고, 수술용 가위 (파인 사이언스 툴(Fine Science Tools))를 사용하여 목을 절단하였다. 측좌핵을 함유하는 관상(coronal), 275 ㎛-두께의 슬라이스를 절단하고, 64mM NaCl, 2.5mM KCl, 1.25mM NaH2PO4, 25mM NaHCO3, 10mM 글루코스, 120mM 수크로스, 0.5mM CaCl2 및 7mM MgCl2 (95% O2/5% CO2로 평형을 맞춤)를 함유하는 절단 용액에 보관하였다. 슬라이싱 후, 슬라이스를 절단 용액에서 32-35℃에서 30분 동안, 그 다음 실온에서 실험할 때까지 인큐베이션하였다. 생체 외 옵토XR 자극을 위해, 슬라이스를 업라이트 현미경 (BX51W, 올림푸스(Olympus))의 스테이지 상에 로딩하고, 124mM NaCl, 3mM KCl, 1.25mM NaH2PO4, 26mM NaHCO3, 10mM 글루코스, 2.4mM CaCl2, 및 1.3mM MgCl2 (95% O2/5% CO2로 평형을 맞춤)를 함유하는 인공 뇌척수액으로 관류시켰다. 300W 람브다(Lambda) DG-4 (수터(Sutter))로부터의 광을 473 nm±20 nm 밴드패스 필터 (셈락(Semrock))를 통과시키고 4X 대물렌즈 (0.28 NA)를 사용하여 10분 동안 슬라이스에 적용한 후, 즉시 다음 분석을 위해 고정시켰다.
신호 확인 분석
HEK293FT 세포 (인비트로겐(Invitrogen))를 24 웰 플레이트 중 리포펙타민(Lipofectamine) 2000 (인비트로겐)을 사용하여 감염시키고, 감염 4-6 시간 후 무혈청 배질로 변경하였다. Ca2 + 이미징을 위해, 매트리겔-코팅된 커버슬립 상에 플레이팅한 세포에 1μM ATR를 함유하는 티로드(Tyrode) 중 F-127 플루로닉(Pluronic)/DMSO (프로브스(Probes)) 중 5㎍/ml 푸라-2 AM를 20-25분 동안 37℃ 및 5% 대기 CO2에서 로딩하였다. 로딩 후, 300W 람브다 DG-4 (수터)를 조절하는 메타플루어 (액손 인스트루먼트(Axon Instruments))를 사용하는 올림푸스 BX51W 상의 340nm/380nm에서 커버슬립을 이미징한다. 면역 분석법을 위해, 감염 18-24 시간 후, 1 μM ATR 및 50 mM LiCl (IP1 분해를 막기 위해)를 첨가하고, 플레이트를 환경-조절된 현미경 (레이카(Leica) DMI6000; 37℃, 5% 대기 CO2)으로 이동시켰다. 5　구역/웰을 각각 1분 동안 광학적으로 자극한다 (수터 300W 람브다 DG-4; 셈락 504/12nm 밴드패스 필터; 10X 0.30 NA 대물 렌즈); 3　웰/조건. 인큐베이션 후 (cAMP/cGMP: 20 분; IP1: 1 시간), 세포를 분해하고, HTRF (시스바이오(CisBio)) 및 바이오텍 시너지4 리더(Biotek Synergy4 reader)로 분석하였다.
면역조직화학 및 동일초점 분석
생체 내 자극 후, PBS (pH 7.4) 중에서 얼음으로 차갑게 한 4% 파라포름알데히드 (PFA)로 자극을 마친 후 90분 동안 마우스의 심장을 통과하도록 관류시켰다. 뇌를 제거하고, 4% PFA 중에 밤새 고정시킨 후, PBS 중 30% 수크로스에서 평형을 맞추었다. 냉동 마이크로톰(microtome) 상에서 관상, 40 ㎛-두께 박편으로 절단하고, 면역조직화학을 위해 가공될 때까지 4℃에서 저온보호물질 중에 보관하였다. 부동성 박편을 PBS 중에서 세정한 후 30분 동안 0.3% Tx100 및 3% 일반 당나귀 혈청 (NDS) 중에 인큐베이션하였다. 급성 슬라이싱 실험에 있어서, 자극을 준 후 바로 얼음으로 차갑게 한 4% PFA에 275 ㎛-두께의 슬라이스를 1시간 동안 고정시키고, 0.5% Tx100 및 3% NDS으로 배양하였다. MAPK 분석에 있어서, HEK293 세포 자극 후 바로 커버슬립을 15분 동안 고정시키고, 0.6% H2O2로 인큐베이션한 후, 3% NDS 중 0.1% Tx100으로 투과하였다. 마우스 안티-GAD67 1:500 (Millipore, Billerica, MA); 래빗 안티-cfos 1:500 (Calbiochem, San Diego, CA); 래빗 안티-포스포-CREB Ser133 1:500 (Millipore)에 대해 0.01% Tx100 및 3% NDS 중에서 밤새 1차 항체 인큐베이션을 행하였다. 박편을 세정하고, FITC 또는 Cy5 (Jackson Laboratories, West Grove, PA)에 접합된 2차 항체 (1:1000)와 함께 3시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. DAPI (1:50,000)와 함께 20분 인큐베이션한 후, 박편을 세정하고 PVD-DABCO와 함께 현미경 슬라이드에 적재하였다. 나머지를 밤새 1차 항체 인큐베이션 (래빗 안티-포스포Erk1/2; 안티-포스포-MAPK p38 1:500 (Promega, Madison, WI); 마우스 모노클로날(monoclonal) 안티-도파민 D1 수용체 1:50 (Chemicon); 래빗 폴리클로날(polyclonal) 안티-도파민 D2 수용체 1:50 (Millipore); 염소 폴리클로날 안티-콜린 아세틸트랜스페라아제 1:200 (Millipore))한 후, 바이오티닐화한 2차 항체 (1:500, Jackson Laboratories)와 함께 인큐베이션, 아비딘-비오틴-홍당무 퍼옥시다제 처리 (ABC Kit, Vector Labs, Burlingame, CA), 및 제조자의 지침에 따라 TSA 검출 (Perkin Elmer, Shelton, CT)을 행하였다.
동일초점 형광 이미지를 20X/0.70NA 또는 40X/1.25NA 오일 침지 대물렌즈를 사용하는 레이카 TCS SP5 스캐닝 레이저 현미경에서 얻었다. 조건 당 4개의 시리얼 스택 이미지를 캐뉼라 관 아래로 500 ㎛ 영역 내에서 얻었다. 볼로시티(Volocity (임프로비젼(Improvision)) 소프트웨어를 사용하여 cfos 또는 pCREB 면역반응성의 평균 픽셀 세기의 측정을 위해 DAPI 염색을 사용하여 핵의 윤곽을 그렸다. 양성 또는 pCREB-활성 세포를 세기 역치에 의해 확인하고, 실험 조건을 모른 채로 이미지를 얻고 분석을 행하였다.
도 3B에 제시된 데이터의 원 수치 pCREB 세기 (au). 각 하위군에 대한 평균 및 SEM (볼드); 하위군 대 대조군의 양방 t-테스트에 대한 p-값 (이텔릭체).
옵토-α1AR 옵토-β2AR
mCherry - + - +
평균 65.326 97.95309 63.6385 82.83284
SEM 3.758281 7.199024 3.847409 6.907057
p-값 vs . mCherry - 0.000272 0.019559
도 4A에 제시된 데이터의 원 수치 베이스라인 신호 속도 (Hz). 각 하위군에 대한 평균 및 SEM (볼드); 하위군 대 대조군의 t-테스트에 대한 p-값 (이텔릭체).
XFP oα1AR oβ2AR
평균 2.596154 2.439357 2.687798
SEM 0.436406 0.603845 0.346556
p-값 vs 베이스 0.834496 0.869791
도 4C에 제시된 데이터의 신호 속도 (Hz)에 있어서 원 수치 변화를 베이스라인 자체 ('베이스') 내 및 베이스라인과 광 자극 기간 ('밝음') 사이에서 계산하였다.
옵토-β2AR 옵토-α1AR
베이스 밝음 베이스 밝음
평균 0.061788 -0.68113 -0.01287 3.816198
SEM 0.134665 0.162402 0.336387 0.812251
p-값 vs 베이스 0.000861 0.000239
따라서, 본 발명의 실시태양은 세포 내 신호의 광유전적(optogenetic) 조절에 관한 것이고, 거동하는 포유 동물 내의 생체 내에서 작동하고, 극히 낮은 어둠 활성을 나타내고, 천연 수용체의 복수 신호 분자 다운스트림의 복합 직물을 활용하는 동시에 일시적 정확성에 있어서 유용하기 때문에, 다른 접근법 각각의 긍정적인 측면 다수를 하나의 기술에 합친다. 유사한 실시태양은 무수히 많은 신경전달물질 및 내분비선 호르몬을 포함하는 다른 조절자에 의해 촉발된 세븐-트랜스멤브레인-의존 신호 경로의 통상적인 중요성을 직접적으로 조사한다. 다른 실시태양은, 옵토XR 접근법을, 흥분성 세포까지 확장시켜 광 유전적으로 표적화된 광 민감성을 갖는 광섬유 심층 표적화의 다용도 통합에 활용하는 방식으로 사용한다. 상기 실시태양 중 하나는 다양한 비-흥분성 조직에 있어서 일시적으로 정확한 생화학적 신호의 통상적인 중요성의 조사에 관한 것이다.
본 발명의 실시태양은 리간드-편향된 신호의 현상에 대한 고려에 관한 것인데, 상기 다양한 리간드는 합체 수용체의 입체형태 상태를 안정화할 수 있고, 이에 의해 교대 도입 캐스캐이드에의 결합에 있어서 수용체의 세포 내 작용을 편향시킨다. 옵토XRs는 약리적 조작과 동일한 레벨로 상기 교대 케스캐이드를 유도하는데 사용되지만 (예를 들면, 야생형β2AR에 작용하는 천연 리간드와 비교하여 옵토-β2AR은 MAPK 활성화에 있어서 유사한 변화를 유도할 수 있음), 각각의 옵토XRs는 리간드 편향된 신호에 기여하는 모든 입체형태의 상태의 조절이 항상 가능하지 않을 수 있다는 것이 밝혀졌다. 레티날-기재 툴은 포유 동물 조직의 내인성 발색단의 존재 및 어둠에서의 특히 낮은 활성 때문에 특히 유용할 수 있다. 광 유전학은 고속, 단일-성분 레티날-결합 모듈에 연결된 다양한 이펙터의 형태를 취할 수 있고, 광학의 일시적 정확성에 활용한다.
본 발명의 실시태양은 옵토XR 방법을 사용하여 미생물의 옵신 대처 전략을 보완하고, 거동하는 포유 동물에 작용하는 고속, 표적화 가능한 세포의 조절의 다른 관점을 제공한다.
본 발명의 다른 실시태양에 따르면, 상이한 작용 스펙트럼을 갖는 공지된 옵신 유전자를 기초로 하여 파장-이동된 버젼의 옵토XRs가 사용된다. 이러한 옵토XRs는 생화학 및 전기 조절의 분리 가능한 채널을 제공하는 데 있어 특히 유용할 수 있다.
본원에 논의된 특정 단백질 서열의 변이체는 본 발명의 실시태양과 일관된다. 일부 변이체는 이들 단백질 서열과 약 75% 이상의 상동성을 갖는 반면, 다른 변이체는 약 80%, 85% 또는 90% 이상의 상동성을 갖는다. 일부 실시태양에 있어서, 상동성은 약 93 내지 약 95 또는 약 98% 정도로 높다. 본 발명의 조성물은 본원에 개시된 단백질 및 핵산 서열을 포함하고, 상기 서열과 약 50% 이상의 상동성 (100% 상동성 포함)을 갖는 변이체를 포함한다.
본원에서 논의된 다양한 실시태양은 점차적으로 복잡해지는 질의(interrogation)에 대한 고속 회로 판독 기술 및 평상 활동 및 질병 상태 모두에서의 신경 회로망의 리버스 엔지니어링과 통합될 수 있다.
상술한 다양한 실시태양은 단지 예시의 방식으로만 제공된 것이며, 이에 의해 본 발명이 제한되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 당업자는 본원에 실증 및 기재된 예시적인 실시태양 및 적용을 엄격하게 따르지 않고, 상기 논의 및 실례를 기초로 하여 다양한 변형 및 변화를 행하는 것을 용이하게 상도할 수 있을 것이다. 예를 들면, 이러한 변화는 생성된 2차 전달물질의 변이체를 포함할 수 있다. 이러한 변형 및 변화는 하기 청구항에 제시된 본 발명의 본질 및 범위로부터 벗어나지 않는다.
SEQUENCE LISTING <110> Airan, Raag Deisseroth, Karl <120> CELL LINE, SYSTEM AND METHOD FOR OPTICAL CONTROL OF SECONDARY MESSENGERS <130> STFD.195PCT <150> US 61/057,108 <151> 2008-05-29 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1302 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rhodopsin/GPCR chimerism <400> 1 atgaacggaa cagagggccc aaacttttac gttcccttct ccaataagac tggggtcgtg 60 agaagcccat ttgaggcgcc tcaatactac cttgctgagc cgtggcagtt ttctatgctc 120 gctgcttaca tgttcttgct gatcatgctg gggttcccta tcaatttcct gacgctgtac 180 gttatagcaa agttcgaacg cctccaaacc gtgttgaact acatactcct taacctcgcg 240 gttgccgacc tcttcatggt tttcgggggt ttcaccacca ccctctacac ctcccttcac 300 ggctacttcg tgttcggccc taccggatgc aatctggaag gctttttcgc aacgctgggg 360 ggggagattg ccctttggag cctggtggtc ttggccatag agaggtacgt ggtggtcaca 420 tccccattca agtaccagag tttgcttaca aagaacaagg ctatcatggg ggtcgccttc 480 acatgggtga tggcgctggc ttgcgctgcc ccaccgctgg taggctggtc ccggtatatt 540 ccggagggaa tgcagtgcag ttgtgggatc gactactaca 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Phe Ser Asn Lys 1 5 10 15 Thr Gly Val Val Arg Ser Pro Phe Glu Ala Pro Gln Tyr Tyr Leu Ala 20 25 30 Glu Pro Trp Gln Phe Ser Met Leu Ala Ala Tyr Met Phe Leu Leu Ile 35 40 45 Met Leu Gly Phe Pro Ile Asn Phe Leu Thr Leu Tyr Val Ile Ala Lys 50 55 60 Phe Glu Arg Leu Gln Thr Val Leu Asn Tyr Ile Leu Leu Asn Leu Ala 65 70 75 80 Val Ala Asp Leu Phe Met Val Phe Gly Gly Phe Thr Thr Thr Leu Tyr 85 90 95 Thr Ser Leu His Gly Tyr Phe Val Phe Gly Pro Thr Gly Cys Asn Leu 100 105 110 Glu Gly Phe Phe Ala Thr Leu Gly Gly Glu Ile Ala Leu Trp Ser Leu 115 120 125 Val Val Leu Ala Ile Glu Arg Tyr Val Val Val Thr Ser Pro Phe Lys 130 135 140 Tyr Gln Ser Leu Leu Thr Lys Asn Lys Ala Ile Met Gly Val Ala Phe 145 150 155 160 Thr Trp Val Met Ala Leu Ala Cys Ala Ala Pro Pro Leu Val Gly Trp 165 170 175 Ser Arg Tyr Ile Pro Glu Gly Met Gln Cys Ser Cys Gly Ile Asp Tyr 180 185 190 Tyr Thr Pro His Glu Glu Thr Asn Asn Glu Ser Phe Val Ile Tyr Met 195 200 205 Phe Val Val His Phe Ile Ile Pro Leu Ile Val Ile Phe Phe Cys Tyr 210 215 220 Gly Arg Val Phe Gln Val Ala Lys Arg Gln Leu Gln Lys Ile Asp Lys 225 230 235 240 Ser Glu Gly Arg Phe His Ser Pro Asn Leu Gly Gln Val Glu Gln Asp 245 250 255 Gly Arg Ser Gly His Gly Leu Arg Arg Ser Ser Lys Phe Cys Leu Lys 260 265 270 Glu His Lys Ala Leu Arg Met Val Ile Ile Met Val Ile Ala Phe Leu 275 280 285 Ile Cys Trp Leu Pro Tyr Ala Gly Val Ala Phe Tyr Ile Phe Thr His 290 295 300 Gln Gly Ser Asp Phe Gly Pro Ile Phe Met Thr Ile Pro Ala Phe Phe 305 310 315 320 Ala Lys Thr Ser Ala Val Tyr Asn Pro Val Ile Tyr Ile Met Met Asn 325 330 335 Lys Gln Phe Arg Ile Ala Phe Gln Glu Leu Leu Cys Leu Arg Arg Ser 340 345 350 Ser Ser Lys Ala Tyr Gly Asn Gly Tyr Ser Ser Asn Ser Asn Gly Lys 355 360 365 Thr Asp Tyr Met Gly Glu Ala Ser Gly Cys Gln Leu Gly Gln Glu Lys 370 375 380 Glu Ser Glu Arg Leu Cys Glu Asp Pro Pro Gly Thr Glu Ser Phe Val 385 390 395 400 Asn Cys Gln Gly Thr Val Pro Ser Leu Ser Leu Asp Ser Gln Gly Arg 405 410 415 Asn Cys Ser Thr Asn Asp Ser Pro Leu Thr Glu Thr Ser Gln Val Ala 420 425 430 Pro Ala <210> 3 <211> 1485 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rhodopsin/GPCR chimerism <400> 3 atgaatggga ccgagggtcc aaatttttac gtacccttta gtaacaagac tggcgtggtg 60 cgcagtccat tcgaagcccc acagtactac ctcgcagagc cgtggcaatt ctcaatgctg 120 gccgcttata tgttccttct gattatgctg gggtttccca tcaattttct taccctgtat 180 gtggtagcat gccacagaca tttgcactcc gtattgaatt atattcttct gaacctcgcg 240 gtggcagatc ttttcatggt gttcggcggg tttacgacta ctctgtatac gtccctgcat 300 ggttattttg tgttcgggcc cacaggctgc aacttggaag gcttcttcgc cactcttggc 360 ggtgagatcg ctctttggag cctggtcgtc ctggccatcg agcggtatgt ggtggtgtct 420 tatcctctca gatatcccac catagtgacc cagcggaggg ccattatggg tgtagccttt 480 acctgggtca tggctttggc ctgtgctgct ccccccctgg tgggttggtc ccgctatatt 540 ccagaaggta tgcagtgttc ttgcggaatc gactactata ccccgcacga agagacaaac 600 aacgagtcct tcgtcatata tatgtttgta gtccacttta tcatcccctt gattgttatt 660 tttttttgct atggacgcgt ctacgtcgtg gccaaaaggg agtccagggg cttgaaatct 720 ggactgaaga cagataagag cgattccgag caggtgaccc ttcgcattca taggaagaac 780 gccccagcag gcggaagcgg gatggcatcc gccaagacta aaacccactt ttccgtgcgg 840 cttctcaagt tctcccgcga gaaaaaggcg gcgcgcatgg tcatcatcat ggttatcgcc 900 tttctcattt gctggctgcc ttacgctgga gtcgcgtttt acatcttcac acatcaaggt 960 tctgacttcg gcccaatctt tatgaccatc cctgccttct tcgccaagac ctctgccgtg 1020 tataaccccg ttatctatat tatgatgaac aagcagttcc ggaaggcatt tcagaatgtg 1080 ctgagaatcc aatgcctctg tcggaagcag tctagtaagc atgccctggg gtatactctg 1140 cacccaccca gtcaggctgt agagggccaa cacaaggata tggtgcggat accagtcggt 1200 tccagggaga cattttatcg gattagtaag accgacggag tctgcgagtg gaagtttttc 1260 tcttccatgc ccaggggatc tgcaaggatc acagtttcta aggatcagtc cagctgtacc 1320 acagcccgcg tgcgctccaa atcctttctt caggtctgct gctgtgttgg cccctcaacc 1380 ccctccctcg ataagaacca tcaggttccc accatcaagg tgcacactat atccttgagc 1440 gaaaacggcg aggaagttga aacttcacag gttgcccccg cctaa 1485 <210> 4 <211> 495 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> rhodopsin/GPCR chimerism <400> 4 Met Asn Gly Thr Glu Gly Pro Asn Phe Tyr Val Pro Phe Ser Asn Lys 1 5 10 15 Thr Gly Val Val Arg Ser Pro Phe Glu Ala Pro Gln Tyr Tyr Leu Ala 20 25 30 Glu Pro Trp Gln Phe Ser Met Leu Ala Ala Tyr Met Phe Leu Leu Ile 35 40 45 Met Leu Gly Phe Pro Ile Asn Phe Leu Thr Leu Tyr Val Val Ala Cys 50 55 60 His Arg His Leu His Ser Val Leu Asn Tyr Ile Leu Leu Asn Leu Ala 65 70 75 80 Val Ala Asp Leu Phe Met Val Phe Gly Gly Phe Thr Thr Thr Leu Tyr 85 90 95 Thr Ser Leu His Gly Tyr Phe Val Phe Gly Pro Thr Gly Cys Asn Leu 100 105 110 Glu Gly Phe Phe Ala Thr Leu Gly Gly Glu Ile Ala Leu Trp Ser Leu 115 120 125 Val Val Leu Ala Ile Glu Arg Tyr Val Val Val Ser Tyr Pro Leu Arg 130 135 140 Tyr Pro Thr Ile Val Thr Gln Arg Arg Ala Ile Met Gly Val Ala Phe 145 150 155 160 Thr Trp Val Met Ala Leu Ala Cys Ala Ala Pro Pro Leu Val Gly Trp 165 170 175 Ser Arg Tyr Ile Pro Glu Gly Met Gln Cys Ser Cys Gly Ile Asp Tyr 180 185 190 Tyr Thr Pro His Glu Glu Thr Asn Asn Glu Ser Phe Val Ile Tyr Met 195 200 205 Phe Val Val His Phe Ile Ile Pro Leu Ile Val Ile Phe Phe Cys Tyr 210 215 220 Gly Arg Val Tyr Val Val Ala Lys Arg Glu Ser Arg Gly Leu Lys Ser 225 230 235 240 Gly Leu Lys Thr Asp Lys Ser Asp Ser Glu Gln Val Thr Leu Arg Ile 245 250 255 His Arg Lys Asn Ala Pro Ala Gly Gly Ser Gly Met Ala Ser Ala Lys 260 265 270 Thr Lys Thr His Phe Ser Val Arg Leu Leu Lys Phe Ser Arg Glu Lys 275 280 285 Lys Ala Ala Arg Met Val Ile Ile Met Val Ile Ala Phe Leu Ile Cys 290 295 300 Trp Leu Pro Tyr Ala Gly Val Ala Phe Tyr Ile Phe Thr His Gln Gly 305 310 315 320 Ser Asp Phe Gly Pro Ile Phe Met Thr Ile Pro Ala Phe Phe Ala Lys 325 330 335 Thr Ser Ala Val Tyr Asn Pro Val Ile Tyr Ile Met Met Asn Lys Gln 340 345 350 Phe Arg Lys Ala Phe Gln Asn Val Leu Arg Ile Gln Cys Leu Cys Arg 355 360 365 Lys Gln Ser Ser Lys His Ala Leu Gly Tyr Thr Leu His Pro Pro Ser 370 375 380 Gln Ala Val Glu Gly Gln His Lys Asp Met Val Arg Ile Pro Val Gly 385 390 395 400 Ser Arg Glu Thr Phe Tyr Arg Ile Ser Lys Thr Asp Gly Val Cys Glu 405 410 415 Trp Lys Phe Phe Ser Ser Met Pro Arg Gly Ser Ala Arg Ile Thr Val 420 425 430 Ser Lys Asp Gln Ser Ser Cys Thr Thr Ala Arg Val Arg Ser Lys Ser 435 440 445 Phe Leu Gln Val Cys Cys Cys Val Gly Pro Ser Thr Pro Ser Leu Asp 450 455 460 Lys Asn His Gln Val Pro Thr Ile Lys Val His Thr Ile Ser Leu Ser 465 470 475 480 Glu Asn Gly Glu Glu Val Thr Glu Thr Ser Gln Val Ala Pro Ala 485 490 495

Claims (13)

1종 이상의 이종 수용체 서브유닛을 갖는 키메라 광 반응성 로돕신-기재 멤브레인 단백질을 발현하기 위한 뉴클레오티드 서열을 변형시키는 단계; 및
광에 반응하여 2차 전달물질을 생성하기 위해 광 반응성 멤브레인 단백질을 세포 내에서 발현시키는 단계
를 포함하는 세포 내에서의 2차 전달물질의 생성 방법.
제1항에 있어서, 상기 1종 이상의 이종 수용체 서브유닛은 아드레날린성 수용체를 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 키메라 광 반응성 로돕신-기재 멤브레인 단백질은 세븐 트랜스멤브레인 단백질(seven trans membrane protein)인 방법.
제1항에 있어서, 상기 2차 전달물질은 cAMP, 고리형 구아노신 모노포스페이트 (cGMP), 이노시톨 트리포스페이트/이노시톨 1,4,5-트리포스페이트/트리포스포이노시톨 (IP3) 및 아라키돈산 중 하나인 방법.
제1항에 있어서, 상기 발현 단계가 생체 내에서 행해지는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 발현 단계가 시험관 내에서 행해지는 것인 방법.
제1항에 있어서, 발현된 광 반응성 멤브레인 단백질을 광학적으로 자극하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
1종 이상의 이종 수용체 서브유닛을 갖는 키메라 광 반응성 로돕신-기재 멤브레인 단백질을 발현하기 위한 뉴클레오티드 서열을 변형시키는 단계;
광에 반응하여 2차 전달물질을 생성하기 위해 광 반응성 멤브레인 단백질을 세포 내에서 발현시키는 단계;
단백질을 광에 노출시키는 단계; 및
처리의 효과를 평가하는 단계
를 포함하는 세포 내 전달물질에 관한 추정 처리 요법의 효능 평가 방법.
1종 이상의 이종 수용체 서브유닛을 갖는 키메라 광 반응성 로돕신-기재 멤브레인 단백질을 발현하는 세포.
제9항에 있어서, 상기 1종 이상의 이종 수용체 서브유닛이 알파1 및 베타2 중 적어도 하나의 아드레날린성 수용체인 세포.
1종 이상의 이종 수용체 서브유닛을 갖는 키메라 광 반응성 멤브레인 로돕신-기재 단백질을 발현하기 위한 뉴클레오티드 서열.
서열 번호 1 또는 서열 번호 3에 따른 뉴클레오티드 서열 및 그의 점 돌연변이.
서열 번호 2 또는 서열 번호 4에 따른 아미노산을 발현하는 세포 및 그의 점 돌연변이.
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