ES2426095T3

ES2426095T3 - Línea celular, sistema y procedimiento para el control óptico de mensajeros secundarios

Info

Publication number: ES2426095T3
Application number: ES09759107T
Authority: ES
Inventors: Raag D. Airan; Karl Deisseroth
Original assignee: Leland Stanford Junior University
Current assignee: Leland Stanford Junior University
Priority date: 2008-05-29
Filing date: 2009-05-29
Publication date: 2013-10-21
Anticipated expiration: 2029-05-29
Also published as: JP2019054817A; EP2610350A1; JP6513588B2; JP6637581B2; MX2010012986A; EP2857519A1; US20170081388A1; BRPI0913285A2; WO2009148946A2; IL209575A0; US20150218547A1; JP2011523851A; KR20110018924A; ES2532235T3; US20110112179A1; WO2009148946A3; AU2009256457B2; US9453215B2; CA2726128C; US20130331441A1

Abstract

Un procedimiento para generar mensajeros secundarios en una célula, comprendiendo elprocedimiento: modificar una secuencia nucleotídica para expresar una proteína de membrana basada en rodopsina sensible a laluz quimérica con una o más subunidades de receptor heterólogas; y expresar la proteína de membrana sensible a la luz en una célula para producir un mensajero secundario enrespuesta a la luz; expresar en la célula un canal catiónico dirigido al mensajero secundario que es sensible al mensajero secundario; yvisualizar la actividad resultante usando tintes sensibles a cationes.

Description

Línea celular, sistema y procedimiento para el control óptico de mensajeros secundarios.

Material presentado electrónicamente

[0001] Una lista de secuencias nucleotídicas/aminoacídicas legible por ordenador presentada conjuntamente con la presente invención.

Campo de la Invención

[0002] La presente invención se refiere generalmente a sistemas y enfoques para generar mensajeros secundarios en respuesta al estimulo óptico y, más particularmente, a líneas celulares, secuencias nucleotídicas, proteínas quiméricas y usos de las mismas, cada una relacionada con la producción de mensajeros secundarios en respuesta a la luz.

Antecedentes

[0003] Se cree que las proteínas de unión a nucleótidos de guanina (proteínas G) alternan entre un estado de difosfato de guanosina (GDP) inactivo y un estado unido a trifosfato de guanosina (GTP) activo. Estos dos estados se han vinculado a la liberación de un mensajero secundario dentro de una célula. El mensajero secundario liberado puede funcionar para regular los procesos celulares corriente abajo.

[0004] Los mensajeros secundarios incluyen moléculas de señalización que se generan/liberan rápidamente. Estas moléculas producen respuestas celulares al activar las proteínas efectoras dentro de la célula. Los sistemas de señalización celulares ejemplares incluyen el sistema de fosfoinositol, el sistema de monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) y el sistema de ácido araquidónico.

[0005] Los cambios entre los diferentes estados de las proteínas G se pueden desencadenar como un resultado de proteínas denominadas receptores acoplados a proteína G (GPCR), receptores unidos a proteína G (GPLR), receptores de siete dominios de transmembrana (receptores 7TM) o receptores heptahelicoidales. Esta familia de proteínas incluye una diversidad de receptores transmembrana. Estos receptores responden a los estímulos externos (por ejemplo, luz, neurotransmisores, olores u hormonas) activando las rutas de transducción de señal internas a la célula. Específicamente, los ligandos unen y activan las rutas de transducción causando en consecuencia que las proteínas G alternen los estados. La actividad relacionada con GPCR se asocia con muchas enfermedades y, de esta manera, los GPCR son el objetivo de muchos productos farmacéuticos y tratamientos.

[0006] Se cree que más del 30% de todos los fármacos en el mercado se dirigen a los receptores acoplados a la proteína G (GPCR) y que muchos de esos fármacos se relacionan con la producción o inhibición del mensajero secundario cAMP. Existe una abundancia de procesos patológicos que implican directamente el cAMP, incluyendo enfermedades neurofisiológicas, endocrinológicas, cardiacas, metabólicas e inmunes. En el estudio de comportamientos de mamífero complejos, las limitaciones tecnológicas han impedido un control espaciotemporalmente preciso sobre los procesos de señalización intracelular. Los procedimientos basados en productos químicos actuales para modular los niveles de mensajeros secundarios, tales como niveles de cAMP, operan relativamente de manera lenta y presentan problemas para estudiar la actividad en las escalas de tiempo rápido que el cuerpo usa en conexión con cierto tejido, tal como en el tejido nervioso cardiaco. Estos procedimientos químicos carecen frecuentemente de la velocidad para sondear estas escalas de tiempo rápido (por ejemplo, mientras que se clasifican para productos terapéuticos novedosos).

[0007] Kim y col., Biochemistry 2005, Vol. 44, 2284-2292 describen la activación accionada por luz de señalización del receptor adrenérgico 12 mediante una rodopsina quimérica que contiene los bucles citoplásmaticos del receptor adrenérgico 12. Ahmad y col., FASEB Journal 2007, Vol. 21, 449-455 describen quimeras de Drosophila y proteínas de rodopsina bovina.

Resumen de la Invención

[0008] La presente invención se dirige a superar los retos que se han mencionado anteriormente y otros relacionados con la generación de mensajeros secundarios y dispositivos de formación de imágenes relacionados y sus implementaciones. La presente invención se ilustra en varias implementaciones y aplicaciones, algunas de las cuales se resumen a continuación.

[0009] En un aspecto, la invención proporciona un procedimiento para generar mensajeros secundarios en una célula, comprendiendo el procedimiento: modificar una secuencia nucleotídica para expresar una proteína de membrana basada en rodopsina sensible a la luz quimérica con una o más subunidades de receptor heterólogas; expresar la proteína de membrana sensible a la luz en una célula para producir un mensajero secundario en respuesta a la luz; expresar en la célula un canal catiónico dirigido al mensajero secundario que es sensible al mensajero secundario; y visualizar la actividad resultante usando tintes sensibles a cationes. La invención se define adicionalmente por las reivindicaciones adjuntas. Como se describe en este documento, se pone en práctica un procedimiento para generar mensajeros secundarios en una célula.

[0010] Una secuencia nucleotídica para expresar una proteína de membrana sensible a la luz quimérica (por ejemplo, rodopsina) se modifica con una o más subunidades de receptor heterólogas {por ejemplo, un receptor adrenérgico (alfa 1, Beta2)}. La proteína de membrana sensible a la luz se expresa en una célula para producir un mensajero secundario en respuesta a la luz.

[0011] Como se describe en el presente documento, se implementa un procedimiento para evaluar la eficacia de un régimen de tratamiento putativo (por ejemplo, un fármaco o estimulo eléctrico o cualquiera que funcione a través de estos mensajeros secundarios) en relación con mensajeros intracelulares. Una secuencia nucleotídica para expresar una proteína de membrana sensible a la luz quimérica (rodopsina) se modifica con una o más subunidades de receptor heterólogas {por ejemplo, un receptor adrenérgico (alfa1, Beta2)}. La proteína de membrana sensible a la luz se expresa en una célula para producir un mensajero secundario en respuesta a la luz. La proteína se expone a la luz. Se evalúan los efectos del tratamiento.

[0012] Como se describe en este documento, se desvela una célula que expresa una proteína de membrana sensible a luz quimérica (rodopsina) con una o más subunidades de receptor heterólogas {por ejemplo, un receptor adrenérgico (alfa1, Beta2)}.

[0013] Como se describe en este documento, se desvela una secuencia nucleotídica para expresar una proteína de membrana sensible a la luz quimérica (rodopsina) con una o más subunidades de receptor heterólogas {por ejemplo, un receptor adrenérgico (alfa1, Beta2)}.

[0014] El resumen anterior de la presente invención no pretende describir cada realización ilustrada o cada implementación de la presente invención. Las figuras y la descripción detallada que se indican a continuación ejemplifican más particularmente estas realizaciones.

Breve Descripción de los Dibujos

[0015] La invención se puede entender más completamente en consideración de la descripción detallada de diversas realizaciones de la invención que se indican a continuación junto con los dibujos adjuntos, en los que:

la figura 1A muestra una representación esquemática que muestra optoGs y optoGq, consistentes con las realizaciones ejemplares de la presente invención;

la figura 1B muestra el Ensayo Inmunoabsorbente Ligando a Enzimas (ELISA) de cAMP, cGMP e IP1 de células transfectadas con ya sea nada, optoGs u optoGq, consistentes con las realizaciones ejemplares de la presente invención;

la figura 1C muestra la formación de imágenes de Ca de células transfectadas con proteínas de fusión mCherry de optoGs y optoGq, consistentes con las realizaciones ejemplares de la presente invención;

la figura 2 la formación de imágenes de Ca de células transfectadas con las proteínas de fusión mCherry de optoGs y optoGq, consistentes con las realizaciones ejemplares de la presente invención;

la figura 3A muestra los niveles de cAMP, IP1 e IP3 para las células HEK que expresan diversas construcciones, consistentes con las realizaciones ejemplares de la presente invención;

la figura 3B muestra un vector de expresión lentiviral, inmunotinción GAD de células que expresan opto-atAR y la activación pCREB observada en células que expresan optoXR (mCherry+) después de 10 min de estimulación óptica, consistentes con las realizaciones ejemplares de la presente invención;

la figura 4A muestra el objetivo de optrodo de accumbens traducidos, formas de onda pico y velocidad de disparo de línea basal para construcciones indicadas, consistentes con las realizaciones ejemplares de la presente invención;

la figura 4B muestra registros de optrodos in vivo con estimulación de luz, consistentes con las realizaciones ejemplares de la presente invención;

la figura 4C muestra el cambio en la frecuencia pico con la luz frente a la línea basal, consistentes con las realizaciones ejemplares de la presente invención;

la figura 4D muestra la cinética de cambio de velocidad de disparo, consistente con las realizaciones ejemplares de la presente invención;

la figura 5A muestra el objetivo estereotáctico de una región transducida, un ratón que se mueve libremente con fibras ópticas implantadas, una representación esquemática del lugar del aparato de preferencia y prueba y un rastro de un ratón que se mueve libremente, consistente con las realizaciones ejemplares de la presente invención;

la figura 5B muestra preferencias para el control y opto-c1AR, consistentes con las realizaciones ejemplares de la presente invención; y

la figura 5C muestra los resultados de la distancia total para diversas pruebas de campo abierto; consistente con las realizaciones ejemplares de la presente invención.

[0016] Mientras que la invención es susceptible a diversas modificaciones y formas alternativas, aspectos específicos de la misma se han mostrado a modo de ejemplo en los dibujos y se describirán con detalle. Sin embargo, se debe entender que la intención no es limitar la invención a las realizaciones particulares descritas. Por el contrarió, la intención es incluir todas las modificaciones, equivalentes y alternativas que entran dentro del espíritu y alcance de la invención.

Descripción Detallada

[0017] Se cree que la presente invención es útil para permitir aplicaciones prácticas de una diversidad de sistemas y procedimientos ópticos, y se ha descubierto que la invención es particularmente adecuada para su uso en sistemas y procedimientos relacionados con el control óptico de los niveles de mensajeros secundarios dentro de una célula. Mientras que la presente invención no se limita necesariamente a tales aplicaciones, se pueden apreciar diversos aspectos de la invención a través de un análisis de diversos ejemplos usando este contexto.

[0018] En este documento, se describe una proteína de membrana quimérica que responde a un estimulo óptico provocando la liberación de un mensajero secundario dentro de la célula. En un caso específico, la proteína quimérica es una combinación de una subunidad de receptor heteróloga y una proteína que experimenta conformación en reacción a la luz a través de fotoisomerización y de esta manera se activa por la luz. Las rodopsinas o proteínas de ritinilideno proporcionan un grupo ejemplar de proteínas sensibles a la luz que se pueden modificar para incluir una subunidad de receptor heteróloga.

[0019] Como se describe en este documento, se modifica una proteína que se cree que contiene siete dominios transmembrana a-helicoidales para incluir una subunidad de receptor heteróloga asociada con un mensajero secundario. Cuando se expresa en una membrana celular, la proteína reacciona a la luz experimentando un cambio conformal. El cambio conformal desencadena la liberación/producción del mensajero secundario.

[0020] En este documento, se desvela una secuencia nucleotídica para codificar una proteína de membrana quimérica que responde a un estimulo óptico provocando la liberación de un mensajero secundario dentro de la célula.

[0021] En este documento, se describe una célula que expresa una proteína de membrana heteróloga y quimérica. La proteína de membrana quimérica responde a estimulo óptico desencadenando la liberación de un mensajero secundario dentro de la célula. En ciertas realizaciones, la expresión de la proteína de membrana quimérica ocurre in vivo. En otras realizaciones, la expresión de la proteína de membrana quimérica ocurre in vitro.

[0022] La presente divulgación puede implementarse para la producción de cualquier mensajero secundario adecuado modificando una proteína de receptor acoplado a una proteína de unión a nucleótidos de guanina (GPCR) que incluye la subunidad de receptor apropiada.

[0023] La presente divulgación permite el uso de proteínas que responden a una diversidad de longitudes de onda e intensidades de luz.

[0024] En este documento, se describe el uso de una proteína GPCR quimérica, como se desvela en este documento, para determinar cualquier efecto corriente abajo de la actividad del mensajero secundario de interés.

[0025] En este documento, se describe la expresión de una proteína GPCR quimérica en una diversidad de tipos celulares incluyendo, pero sin limitación, células de mamífero, células madre, células vegetales, y organismos unicelulares como levadura y E. coli.

[0026] En este documento, se describe una expresión optimizada de una proteína quimérica con proteínas fluorescentes unidas para una fácil visualización, y el uso optimizado de la modalidad para estudiar los efectos corriente abajo de la actividad del mensajero secundario inducida por la luz.

[0027] En este documento, se describe adicionalmente el direccionamiento genéticamente de una proteína GPCR quimérica, como se desvela en este documento, a poblaciones celulares específicas para la expresión en las mismas. Existen promotores específicos del tipo celular que se expresan selectivamente en un tipo de célula diana (por ejemplo, Sinapsina-1 para neuronas diana; variantes de Troponina para tejido cardiaco). La colocación de estos promotores corriente arriba de la proteína GPCR quimérica en un vector de expresión se puede usar para dirigir la expresión de la proteína a un tipo celular de interés. Incluye sistemas de promotor inducibles, reversibles, o de otra manera controlables, tales como la respuesta Tet, respuesta ER y sistemas Cre/Lox.

[0028] De acuerdo con una realización ejemplar de la presente divulgación, se desarrolla una proteína genéticamente codificable, de tal forma que, cuando estas se expresan en tipos celulares de interés, se produce monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) en respuesta a la luz. Esto puede ser útil, por ejemplo, para visualizar los efectos corriente abajo sobre la fisiología celular que incluye, pero sin limitación, una clasificación para productos farmacéuticos. Otras realizaciones usan un GPCR quimérico y heterólogo que da como resultado la liberación de mensajeros secundarios en respuesta a la luz. Los mensajeros secundarios ejemplares incluyen cAMP, monofosfato de guariosina cíclico (cGMP), trifosfato de inositol/1,4,5-trifosfato de inositol/trifosfoinositol (IP3) y ácido araquidónico.

[0029] La invención puede usarse en un procedimiento para evaluar la eficacia de un régimen de tratamiento putativo (por ejemplo, un fármaco o estímulo eléctrico o cualquiera que funcione a través de estos mensajeros secundarios) en relación con los mensajeros intracelulares. Una secuencia nucleotídica para expresar una proteína de membrana sensible a la luz quimérica (por ejemplo, rodopsina) se modifica con una o más subunidades de receptor heterólogas {por ejemplo, un receptor adrenérgico (alfa 1, Beta2)}. La proteína de membrana sensible a la luz se expresa a una célula para producir un mensajero secundario en respuesta a la luz. La proteína se expone a la luz. Se evalúan los efectos del tratamiento.

[0030] La luz se puede aplicar de acuerdo con un perfil de estímulo deseado. En una realización, la proteína de membrana expresada responde a la luz en decenas de milisegundos. De esta manera, el perfil de estímulo puede incluir una serie de pulsos de luz en una sucesión rápida y los efectos resultantes se pueden supervisar usando, por ejemplo, tintes sensibles a Ca2+.

[0031] En un caso, en primer lugar la célula se puede estimular sin el tratamiento. Una vez que el tratamiento se administra, después la célula se puede estimular de nuevo. Los resultados de cada prueba se pueden comparar para evaluar la eficacia del tratamiento.

[0032] El tratamiento puede incluir una amplia diversidad de diferentes implementaciones incluyendo, pero sin limitación, productos farmacéuticos, modificaciones a la célula (genéticas o de otro modo), parámetros físicos de la célula (por ejemplo, cambios de temperatura o estímulo eléctrico) o un régimen de tratamiento aplicado a un organismo.

[0033] En una realización, el tratamiento es el estímulo óptico de la proteína de membrana expresada. En tal caso, la efectividad se puede medir, por ejemplo, supervisando los síntomas asociados con trastorno que se va a tratar.

[0034] En otra realización, el régimen de tratamiento se implementa como parte de la modelación de una enfermedad o trastorno. Por ejemplo, puede usarse un modelo de enfermedad (células o animales) y el estado de fondo/de referencia se puede evaluar antes de que la proteína se exprese y el régimen del tratamiento se evalúe.

[0035] Los resultados experimentales muestran que la regulación del cAMP óptimamente evocada de canales iónicos dirigidos se pueden visualizar al transfectar células tanto con el inductor de cAMP como un canal catiónico dirigido a cAMP y visualizando la actividad resultante usando tintes sensibles a Ca2+. Esta adaptación de los moduladores ópticamente activados, genéticamente codificables de la actividad del mensajero secundario puede ser útil en la clasificación de productos terapéuticos novedosos, así como también siendo una modalidad terapéutica en sí misma, dada la implicación del cAMP en numerosas patologías, como a ADHD y canalopatías cardiacas. La proteína se puede diseñar por ingeniería para su uso con diversos mensajeros secundarios diferentes (por ejemplo, IP3), otros colores para la activación de luz diseñando por ingeniería el sitio de unión retinal o seleccionando para la quimera una rodopsina u opsina de cono con un espectro diferente de absorbancia/acción, y otros efectos corriente abajo del mensajero secundario, tal como señalización de calcio y/o actividad de la cinasa.

[0036] Las figuras 1A, 1B y 1C muestran los datos experimentales de optoGs y optoGq, dos ejemplos de inductores activados con luz de señalización del mensajero secundario ("optoXRs") que se han desarrollado. Estos inductores activados con luz son un quimerismo de rodopsina/GPCR. El OptoGq proporciona un control sensible a la luz de la señalización Gq, mientras que optoGs, proporciona un control sensible a la luz de la señalización de Gs.

[0037] Tanto en optoGs como en optoGq se ha mostrado que existe una diferencia insignificante en los niveles de cAMP e IP3 de referencia en la oscuridad y que no existe cruce con otras rutas del mensajero secundario, tal como cGMP. El aumento de los niveles de cAMP observados con la estimulación de luz de optoGq es un efecto corriente abajo esperado de la producción de IP3.

[0038] La figura 1A muestra una representación esquemática de optoGs y optoGq, consistente con las realizaciones ejemplares de la presente invención. Para cada propina, los bucles intracelulares de la rodopsina se reemplazan por los de las proteínas adrenérgicas acopladas normalmente a Gs (beta2) o Gq (alfa 1). Las secuencias codificantes genéticas se optimizan para la expresión en células humanas y de murino. Los ejemplos de secuencias resultantes incluyen optoGs: SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2; y optoGq: SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4.

[0039] Como se aprecia por el experto en la técnica, las secuencias aminoacídicas de las proteínas se presentan como ejemplos no limitantes en el soporte de las realizaciones que se extienden a las variaciones (por ejemplo, mutaciones puntuales) en la secuencia genética que, de otra manera, proporcionan resultados coherentes, intercambiables o equivalentes.

[0040] La figura 1B muestra el ensayo inmunoabsorbente ligando a enzimas (ELISA) de cAMP (parte superior), cGMP (centro), e IP1 (parte inferior; un producto de degradación de IP3) de las células transfectadas con ya sea nada, optoGs u optoGq, consistentes con una realización ejemplar de la presente invención. Los resultados de la figura 1B se obtuvieron a partir de células que se estimularon con una luz de 504 nm (banda ancha de 20 nm) durante un minuto por punto, o se mantuvieron en la oscuridad, según se indica.

[0041] La estimulación se implementó usando un microscopio de cultivo invertido de ambiente controlado (Leica DMI6000B). En el ensayo de cAMP, algunas células se trataron con forskolina 10 uM durante 30 minutos en forma de un control positivo de saturación del ensayo. El optoGs aumento significativamente los niveles de cAMP en respuesta a la luz. No se descubrió un aumento significativo de la línea de referencia de cAMP, ni desviaciones de los niveles de cGMP o IP3 con optoGs. El OptoGq aumento significativamente los niveles de IP3 en respuesta a la luz sin alterar significativamente los niveles de cGMP. Se creen que un aumento en los niveles de cAMP con la producción de IP3 es una consecuencia de la liberación de Ca2+ intracelular.

[0042] La figura 1C muestra la formación de imágenes de Ca de las células transfectadas con las proteínas de fusión mCherry de optoGs y optoGq, consistente con las realizaciones ejemplares de la presente invención. Para detectar el cAMP, se transfectó un mutante selectivo de cAMP del canal de Ca2+ regulado por nucleótidos cíclicos CNGA2 en exceso de optoGs. El IP3 activa la liberación de depósitos de Ca2+ intracelulares, proporcionando en consecuencia una señal fiable de la activación de Gq. Una población de control también se transfectó con la mCherry sola con el mutante CNGA2 en exceso. Las células se cargaron con fura-2 (20-25 minutos de incubación) y se adquirieron exposiciones de 2 ms de 340 nm y 380 nm cada dos segundos. En cada uno del optoGs y optoGq, las adquisiciones solas fueron suficientes para producir una señal de Ca, mientras que no se detectó ninguna señal significativa en la población de control.

[0043] La figura 1 muestra los datos obtenidos de una configuración experimental específica, sin embargo, la invención no se limita de esta manera. Por ejemplo, se contemplan diversas técnicas de administración diferentes a la transfección incluyendo, pero sin limitación, transducción vírica, administración de genes balísticos (pistola génica) y captación de ácidos nucleicos espontáneos.

[0044] La rodopsina base se puede modificar para su uso con cualquier subunidad de receptor heteróloga adecuada, tal como los receptores acoplados a Gi similares al receptor adrenérgico alfa 2 o el receptor D2 de dopamina o el receptor 5HT2A de serotonina; u otros receptores acoplados a Gs o Gq similares al receptor D1A de dopamina o los receptores de glutamato metabotrópico.

[0045]: De acuerdo con una realización ejemplar, la rodopsina base es una proteína obtenida del bovino Bos

taurus.

[0046]: De acuerdo con una realización, la proteína base diferente de la rodopsina base que se ha

mencionado anteriormente también se puede usar e incluye diversas proteínas 7-transmembrana, tales como las opsinas de cono (rojas, verdes o azules), rodopsinas de otras especies, y receptores regulados por ligandos similares a los receptores de dopamina o serotonina.

[0047] Diversas implementaciones se refieren a aplicaciones in vivo en mamíferos. Estas implementaciones incluyen, pero sin limitación, un circuito neural de prueba y confirmación y modelos de enfermedad.

[0048] Las figuras 3A y 3B muestran los datos experimentales de una aplicación in vivo de optoGs (opto12AR) y optoGq (opto-c1AR), que son dos ejemplos de inductores activados con luz de la señalización del mensajero secundario. Los aspectos de la presente invención se refieren al uso y desarrollo de una familia versátil de herramientas ópticas genéticamente codificadas ('optoXRs') que aprovechan las relaciones de estructura-función comunes entre los receptores acoplados a proteína G (GPCR) para reclutar y controlar, con una alta precisión espacio-temporal, las rutas de señalización bioquímicas iniciadas por receptores.

[0049] Los resultados mostrados en las figuras 3A y 3B se refieren a dos optoXRs específicos que reclutan selectivamente rutas de señalización dirigidas distintas en respuesta a la luz. Los dos optoXR ejercen efectos opuestos sobre el disparo de pico en el núcleo accumbens in vivo, y la fotoestimulación del optoXR cronometrada con precisión en el núcleo accumbens fue suficiente por sí misma para impulsar la preferencia del lugar acondicionado en los ratones que se mueven libremente. El enfoque de optoXR permite la prueba de la hipótesis con respecto al impacto causal de la señalización bioquímica en el comportamiento de los mamíferos, de una manera dirigible y temporalmente precisa.

[0050] El control óptico sobre la señalización intracelular se implemento en mamíferos, usando las relaciones de estructura-función compartidas entre los GPCR para desarrollar y expresar múltiples quimeras de opsina/GPCR2 distintas in vivo con una lógica de transducción novedosa que acopla la señal al efector. Coherentes con diversas implementaciones, se diseñan una o más proteínas de receptor de opsinas quiméricas para que sean funcionales en mamíferos in vivo, dirigibles a las células específicas, y sensibles a los pulsos de luz cronometrados con precisión. Dichos enfoques permiten el uso de un estímulo óptico de alta velocidad (respuesta a la proteína) para someter a prueba y caracterizar los eventos bioquímicos intracelulares en tiempos precisamente definidos y de comportamiento relevantes. Algunas implementaciones ejemplares no limitantes incluyen, modulación pulsátil frente a tónica, sincronía entre diferentes sistemas moduladores, y otros procesos fisiológicos y patológicos fundamentales en tipos celulares definidos sobre un intervalo de intervalos de tiempo.

[0051] Las implementaciones de mamífero se han implementado con éxito. En una implementación ejemplar, los bucles intracelulares de la rodopsina se reemplazaron por los de los receptores adrenérgicos específicos alineando en primer lugar residuos conservados del receptor c1a adrenérgico humano acoplado a Gq (c1AR) y el receptor 12-adrenérgico de hámster acoplado a Gt (12AR) con la rodopsina de bovino acoplada a Gt (figura 1A). Los intercambios de las regiones intracelulares (que incluyen dominios carboxi-terminales) se diseñaron para cada receptor en base a los modelos estructurales para transferir el acoplamiento de la proteína G del Gt, y se optimizó cada receptor para la expresión in vivo en mamíferos. Tras la activación por los ligandos variados, los receptores nativos pueden explorar múltiples estados de conjunto para reclutar rutas canónicas y no canónicas en un fenómeno de señalización mediada por ligando. Los optoXR son probablemente para seleccionar un estado de conjunto activo individual tras la detección de la luz de una manera dependiente en un contexto biológico.

[0052] Los genes que codifican quimeras (opto-c1AR y opto12AR) se condensaron a una proteína fluorescente. La validación de la expresión optoXR funcional se realizó a través de [Ca2+]i formado por imágenes (concentración de calcio intracelular) en células HEK transfectadas con opto-c1AR solo (esperado para reclutar [Ca2+]i a través de Gq), o con tanto opto-12AR (esperado para reclutar AMP cíclico a través de GS) como con el canal Ca2+ regulado por cAMP CNGA2-C460W/E583M. La formación de imágenes de [Ca2+]i ratiométrica demostró que 60 s de estimulación de luz verde (504 + /- 6 nm, 7 mW mm-2) fueron suficientes para conducir señales de [Ca2+]i prominentes corriente abajo de cualquier optoXR, pero no en las condiciones de control (figura 2), revelando una expresión funcional. Para probar la especificidad de las señalización controlada por cada optoXR, se iluminaron células HEK transducidas con 3 mW mm-2 504 +/- 6 nm de luz durante 60 s y después se lisaron y se analizaron para comprobar los niveles de cGMP, cAMP e IP1 (un producto de degradación de IP3) a través de inmunoensayos. El patrón canónico fue como se esperó para el optó-12AR que corresponde a su diseño molecular, ya que la estimulación óptica produjo una producción significativa de cAMP en las células que expresan opto-12AR (figura 3A, parte superior), comparable a la lograda con la estimulación farmacológica del 12AR de tipo natural y sin el reclutamiento de IP3 (figura 3A, centro), [Ca2+]i (figura 2), o actividad oscura sustancial. Por el contrario, la estimulación óptica produjo una regulación ascendente significativa de la señalización de IP3 en las células que expresan opto-c1AR (figura 3A, centro), comparable a los niveles inducidos por la estimulación farmacológica del c1AR de tipo natural. Junto con las elevaciones de [Ca2+]i (figura 2), estos datos revelan el patrón esperado para el reclutamiento de Gq, un patrón que no se observa en las células que expresan opto-12AR (figura 3A, parte superior). La estimulación óptica de células que expresan cualquier construcción son incapaces de modular los niveles de cGMP (figura 3A, parte inferior), indicando adicionalmente la especificidad de señalización de las proteínas quiméricas. Ensayos similares revelaron que los optoXR retienen un espectro de acción cercano al de la rodopsina nativa, son capaces de integrar las señales en un intervalo de flujos de luz biológicamente adecuados, y pueden activar rutas no canónicas a un grado similar que los receptores de tipo natural, como para la señalización p42/p44-MAPK.

[0053] La función del OptoXR en el tejido neural intacto se ha sometido a prueba, incluyendo si la suplementación de los co-factores retínales fue necesaria o no. En una prueba de este tipo, los vectores lentivirales que llevan los genes de fusión optoXR bajo el control del promotor de la sinapsina I (para dirigir la modulación bioquímica a las neuronas locales en lugar de otros elementos tisulares celulares potencialmente sensibles a Gs/Gq, tales como células gliales y endoteliales; figura 3B, parte superior izquierda) se inyectaron estereotácticamente en el núcleo accumbens de ratones adultos. Esta estrategia dirige la modulación bioquímica a las neuronas con compartimentos somatodendríticos en los accumbens (neuronas espinosas medianas GABAergicas al ~95%, sin la especificidad del subtipo adicional; figura 3B, izquierda) y excluye las fibras de paso o terminales presinápticos aferentes, ya que estos lentivirus no transducen las células a través de los axones. Dos semanas después de la transducción, las rebanadas coronales agudas de los accumbens se prepararon en fluido cerebroespinal artificial, se estimularon ópticamente durante 10 min, se fijaron inmediatamente y se tiñeron para el CREB fosforilado con Ser 133 (pCREB), un integrador bioquímico de cascadas de señalización acopladas tanto a cAMP como a Ca2+. Sin la suplementación de los retinoles exógenos, se observó el pCREB significativamente elevado en las poblaciones que expresan optoXR (figura 3B, derecha) y no en el tejido no iluminado.

[0054] Las consecuencias funcionales de la activación del optoXR en la actividad eléctrica local de los accumbens se determinó mediante el registro del disparo neuronal in vivo de múltiples unidades con un optrodo dirigido a los accumbens transducidos (figura 4A). No se observaron diferencias significativas en las velocidades de disparo de referencia en la oscuridad con ninguna construcción (figura 4A, parte inferior derecha). La estimulación óptica dio como resultado una disminución del disparo de red en los accumbens que expresan opto-12AR (el rastro izquierdo en la figura 4B ilustra la cinética de efecto; datos de resumen mostrados en la figura 4C y 4D, respectivamente), de acuerdo con estudios farmacológicos previos que se dirigen al Gs. La estimulación óptica aumentó el disparo en los accumbens que expresan opto-c1AR (figura 4B derecha; figuras 4C y 4D). Los histogramas de frecuencias de pico mostraron que la cinética de los efectos del optoXR en las velocidades de disparo fue coherente con la bioquímica en lugar de la iniciación eléctrica de la señal (figura 4D). Estos datos electrofisiológicos, junto con las validaciones bioquímicas anteriores, apoyan que los optoXR puedan expresarse funcionalmente in vivo, para permitir el control fotoactivable diferencial de las cascadas intracelulares y para modular la fisiología de la red.

[0055] En una implementación, se usaron optogenéticas para evaluar la capacidad de la estimulación del optoXR cronometrada con precisión para modular el comportamiento en ratones que se mueven libremente. La administración de luz de estado sólido portátil se combinó con la expresión transgénica de los optoXR para controlar ópticamente la señalización intracelular dentro de las neuronas accumbens de la manera temporalmente precisa usada para el comportamiento operante (figura 5A). El análisis confocal reveló la expresión que se limita a las neuronas accumbens locales; en particular no se observó etiquetado en las fibras aferentes, en distintas regiones que se proyectan a los accumbens, en glía, o en las regiones circundantes. La estimulación óptica se dirigió a los accumbens transducidos como parte de un ensayo de preferencia de lugar acondicionado operante de tres días (figura 5A). En cada día de la prueba, se dejó que los animales explorasen libremente el aparato de preferencia del lugar (figura 5A, parte inferior). El día 1, los animales exploraron libremente el aparato sin estimulación óptica. El día 2, cada vez que el animal entró libremente a la cámara acondicionada designada, una fibra óptica acoplada a un diodo láser registrada a la región transducida suministró pulsos de luz a 10 Hz a aproximadamente la intensidad probable de la entrada monoaminérgica durante una fuerte recompensa. El rastreo de la ruta reveló que el procedimiento de fibra óptica flexible permitió una exploración completa y no impedida de todas las cámaras (figura 5A, parte inferior). El día 3, los animales exploraron libremente de nuevo el aparato sin estimulación óptica, y el tiempo agotado en la cámara acondicionada se cuantificó por dos clasificadores ciegos independientes. Notablemente, los animales que expresan opto-c1AR mostraron un fuerte aumento en la preferencia por el lado acondicionado del aparato después de la estimulación óptica (figura 5B). Este efecto de modulación bioquímica temporalmente precisa fue reproducible a través de dos cohortes separados de animales que expresan opto-c1AR (n = 5-6, P<0,05, prueba t de Student para cada cohorte durante el tiempo en la cámara acondicionada; n = 11, P<0,01 para la población total), mientras que los demás genes de opsina, opto-12AR y ChR2, parecieron menos eficaces en la preferencia de conducción. El efecto de la estimulación opto-c1AR en las neuronas accumbens fue específico para el comportamiento relacionado con la recompensa y no se extendió a la modulación directa de comportamientos relacionados con la ansiedad o actividad locomotora, ya que la estimulación óptica idéntica suministrada a un cohorte de los mismos animales en una prueba de campo abierto no reveló ningún efecto significativo en la distancia recorrida o de preferencia para la proximidad de la pared (figura 5C).

[0056] A continuación, se describe una implementación especifica y no limitante que es coherente con los experimentos anteriores. El registro y el análisis in vivo se realizó usando optrodos que consisten en una fibra óptica de múltiples modos de 200 mm de diámetro (Thorlabs) acoplada a un electrodo de registro (tungsteno 1 MV, A-M Systems) con una distancia de punta a punta del electrodo/fibra de 200-400 mm se disminuyeron en los accumbens transducidos (punta de electrodo 4,8-5,2 mm bajo el bregma) de ratones colocados en una estructura estereostática (David Kopf Instruments) y se anestesiaron con isoflurano. La luz de un láser de diodo de 473 nm (CrystaLaser) se suministró a través de la fibra. Las señales eléctricas se filtraron por paso de banda y se amplificaron (0,3-1 kHz, Amplificador de AC 1800 Microelectrode, A-M Systems) y se analizaron con pClamp 10.0 (Molecular Devices). Las puntas se detectaron por el umbral y se confirmaron individualmente mediante inspección.

[0057] El análisis de comportamiento se realizó usando estimulación óptica que se aplicó a través de una fibra óptica (diámetro de 200 mm, Thor Labs) acoplada a un láser de diodo azul de 473 nm (CrystaLaser) y se registró con una cánula que se dirigía a los accumbens (0-100 mm de punta) . La luz se administró con un ancho de pulso de 50 ms para los optoXR a través de un generador de función (Agilent 33220A). La preferencia de lugar se realizó en un aparato convencional (SD Instruments) con las paredes entre las cámaras retiradas para permitir la libre exploración. Los datos se analizaron a partir del video para observar la cantidad de tiempo gastado en cada cámara por dos observadores ciegos e independientes usando una realización de script de recuento personalizada en MATLAB (Mathworks). Para las pruebas de campo abierto, los animales se colocaron en un campo abierto cuadrado que medía 40340 cm; la estimulación de luz se suministró con los mismos parámetros que para los experimentos de preferencia del lugar. Los videos se analizaron usando un software automatizado (Viewpoint), para comprobar el tiempo total y la distancia en el cuadrado de 15315 cm central frente el anillo exterior (resto del campo).

[0058] El análisis estadístico, cuando se indicó, se realizó usando las pruebas t de Student de dos colas (calculadas en Microsoft Excell) o ANOVA de una vía con pruebas post-hoc de de Tukey (GraphPad Prism). Todas las gráficas de barras de resumen se presentan como media +/- s.e.m., con una significancia que se representa como se indica a continuación: *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001.

[0059] Pueden encontrarse detalles adicionales que apoyan los sorprendentes resultados y la eficacia de diversas realizaciones de la presente invención en Temporally precise in vivo control of intracellular signalling, Raag

D. Airan, y col., Nature 458, 1025-1029 (23 de abril de 2009).

[0060] La siguiente descripción proporciona detalles para el procedimiento específico y no limitante que es coherente con una realización de la presente invención. Se prevén numerosas variaciones de esta metodología y están dentro del alcance de la presente invención.

Construcción del Vector

[0061] Se sintetizaron secuencias optimizadas de codón de mamífero de opto-c1AR y opto-12AR (secuencias aminoacídicas en la figura 1A) y se clonaron en pcDNA3.1, y se condensaron en el extremo N de mCherry o YFP (con su codón de inicio suprimido) usando el sitio Notl. El enlazador entre el optoXR y mCherry/YFP es 5' GCGGCCGCC 3'. Los vectores lentivirales que contienen Sinapsina I optoXR mCherry se construyeron clonando el transgen para cada optoXR mCherry en los sitios AgeI y EcoRI del vector pLenti Sinapsina I hChR2 mCherry WPRE.

Producción Lentiviral

[0062] Se produjo un lentivirus de alta titulación. En resumen, las células HEK 293FT se colocaron en placas al 90% de confluencia en una fábrica de células en 4 capas (Nunc) cultivada con DMEM que contenía FBS al 10%. Las células se co-transfectaron con 690 !g del vector lentiviral que se ha descrito anteriormente y dos plásmidos auxiliares (690 !g de pLCMVR8.74 y 460 !g de pMD2.G). El medio se cambió 15 horas después de la transfección. 24 horas después de la transfección, el medio se cambió con 200-220 ml de UltraCULTURE sin suero (Cambrex) que contenía butirato sódico 5 mM. 40 horas después de la transfección, el sobrenadante de cultivo, que ahora contenía virus, se hizo girar a 1000 rpm durante 5 min para eliminar los restos celulares y después se filtró usando un matraz de filtro de baja unión a proteína de 0,45 !m. Después, el sobrenadante aclarado se ultracentrifugó durante 2 h a 55.000 g usando un rotor SW 28 (Beckman) para precipitar el virus. Después de la centrifugación, el sobrenadante se desechó y el gránulo viral resultante se disolvió en un total de 100 !l de PBS frío (4 ºC). El virus resuspendido se centrifugó durante 5 min a 7000 rpm para eliminar los restos celulares y virales restantes. Las alícuotas se congelaron a -80 ºC hasta si uso posterior.

Cirugía y comportamiento del animal

[0063] Ratones C57BL/6 hembras, de 10-12 semanas de edad, se alojaron y se manejaron de acuerdo con el protocolo de animales vertebrados de laboratorio de la Universidad de Stanford. La solución del virus se suministró al núcleo accumbens derecho como se indica a continuación. Los animales se anestesiaron con isoflurano y el pelaje de la parte superior de la cabeza se trasquiló. Mientras que estaban bajo los efectos de la anestesia con isoflurano, la cabeza del animal se colocó en una estructura estereotáctica (David Kopf Instruments). Se hizo una incisión en el cuero cabelludo de línea media y se perforó una craneotomía de ~1 mm de diámetro, 1,10 mm anterior, y 1,45 mm lateral al bregma. Después, una aguja de calibre 33 biselada (NanoFil, World Precision Instruments) pre-cargada con el virus se bajó dentro del accumbens (punta de la aguja a 4,70-4,80 mm ventral al bregma) y se inyecto 1,0 !l del virus a 100 nl/min usando una bomba de jeringa automatizada (NanoFil, World Precision Instruments). Después de la inyección, se permitieron 3-5 minutos para la relajación del tejido y la difusión del fluido antes de la retracción de la aguja. Para los animales dirigidos para los experimentos de registro de rebanada aguda o in vivo, la craneotomía se rellenó con cemento dental (Lang Dental) y la incisión se cerró usando VetBond (3M). Para los animales dirigidos para el análisis de comportamiento, se colocaron cánulas (C316G, corte de 4,5 mm bajo el pedestal; PlasticsOne) con lavado de pedestal al cráneo. Las cánulas se fijaron usando Metabond (Parkell) y cemento dental (Lang Dental). Después del secado del VetBond o cemento, los animales se extrajeron de la estructura y se dejaron recuperar durante al menos una semana antes de una manipulación adicional. Los animales de control para los experimentos de comportamiento se sometieron a las mismas manipulaciones (cirugía, implantación de la cánula, estimulación de luz) como los animales experimentales, y se les inyectó el vehículo (PBS) solo en lugar del virus. Para los experimentos de preferencia de lugar, los animales que no mostraron una preferencia de referencia para la cámara lateral (>70% o <10%) o para la cámara central (>40%) se admitieron en el estudio; >90% de todos los animales cumplen estos criterios para un diseño de preferencia del lugar no parcial balanceado.

Preparación de la rebanada aguda

[0064] Los animales se anestesiaron con isoflurano y se decapitaron usando cuchillas quirúrgicas (Fine Science Tools). Se cortaron rebanadas de 275 !m de grosor coronales que contenían accumbens y se almacenaron en una solución de corte que contenía NaCl 64 mM, KCl 2,5 mM, NaH2PO4 1,25 mM, NaHCO3 25 mM, glucosa 10 mM, sacarosa 120 mM, CaCl2 0,5 mM y MgCl2 7 mM (equilibrada con O2 al 95%/CO2 al 5%). Después del rebanado, las rebanadas se incubaron en la solución de corte a 32-35 ºC durante 30 minutos y después a temperatura ambiente hasta la experimentación. Para la estimulación de optoXR ex vivo, las rebanadas se cargaron sobre la plataforma de un microscopio vertical (BX51 W, Olympus) y se perfundieron con un fluido cerebroespinal artificial que contenía NaCl 124 mM, KCl 3 mM, NaH2PO4 1,25 mM, NaHCO3 26 mM, glucosa 10 mM, CaCl2 2,4 mM y MgCl2 1,3 mM (equilibrado con O2 al 95%/CO2 al 5%. Se hizo pasar luz de un Lambda DG-4 de 300 W (Sutter) a través de un filtro de paso de banda de 473 nm ± 20 nm (Semrock) y se aplicó a las rebanadas usando un objetivo de 4 aumentos (0,28 NA) durante 10 min seguido inmediatamente de la fijación para análisis posteriores.

Ensayos de validación de señalización

[0065] Se transfectaron células HEK293FT (Invitrogen) usando Lipofectamina 2000 (Invitrogen) en placas de 24 pocillos y se cambiaron a un medio sin suero 4-6 horas después de la transfección. Para la formación de imágenes de Ca+, las células colocadas en placas sobre cubreobjetos recubiertos con matrigel se cargaron con 5 !g/ml de fura-2 AM en F-127 Pluronic/DMSO (Sondas) en Tyrode que contenía 1 !M de ATR, a 37 ºC y CO2 atmosférico al 5% durante 20-25 minutos. Después de la carga, los cubreobjetos se formaron en imágenes en 340 nm/380 nm en un Olympus BX51W usando Metafluor (Axon Instruments) que controla un Lambda DG-4 de 300 W (Sutter). Para los inmunoensayos, 18-24 horas después de la transfección, se añadió 1 !M de ATR y LiCl 50 mM (para impedir la degradación del IP1) y las placas se transfirieron a un microscopio controlado ambientalmente (Leica DMI6000; 37 ºC, CO2 atmosférico al 5%). Las 5 regiones/pocillos se estimularon ópticamente durante 1 min cada una (Lambda DG-4 de 300 W Sutter; filtro de paso de banda 504/12 nm Semrock; objetivo 10X 0,30 HA); 3 pocillos/condición. Después de la incubación (cAMP/cGMP: 20 minutos; IP1: 1 hora), las células se lisaron y se analizaron por HTRF (CisBio) y un lector Biotek Synergy4.

Análisis inmunohistoquimico y confocal

[0066] Después de la estimulación in vivo, los ratones se perfundieron por vía transcardial con paraformaldehído al 4% enfriado con hielo (PFA) en PBS (pH 7,4) 90 minutos después de la finalización de la estimulación. Los cerebros se extrajeron y se fijaron durante una noche en PFA al 4% y después se equilibraron en sacarosa al 30% en PBS. Las secciones de 40 !m de grosor coronales se cortaron sobre un micrótomo de congelación y se almacenaron en crioprotector a 4 ºC hasta que se procesaron para la inmunohistoquímica. Las secciones flotantes libres se lavaron en PBS y después se incubaron durante 30 min en Tx100 al 0,3% y suero de burro normal al 3% (NDS). Para los experimentos de rebanada aguda, inmediatamente después de la estimulación, las rebanadas de 275 !m de grosor se fijaron durante 1 h en PFA al 4% enfriado con hielo y se incubaron con Tx100 al 0,5% y NDS al 3%. Para los ensayos de MAPK, inmediatamente después de la estimulación de las células HEK293, los cubreobjetos se fijaron durante 15 min, se incubaron con H2O2 al 0,6% y después se permeabilizaron con Tx100 al 0,1% en NDS al 3%. Las incubaciones de anticuerpos primarios se realizaron durante una noche en Tx100 al 0,01% y NDS al 3% para anti-GAD67 de ratón 1:500, Millipore, Billerica, MA; anti-cfos de conejo 1:500, Calbiochem, San Diego, CA; anti-fosfo-CREB Ser133 de conejo 1:500, Millipore. Las secciones se lavaron y se incubaron con anticuerpos secundarios (1:1000) conjugados con FITC o Cy5 (Jackson Laboratories, West Grove, PA) durante 3 h a temperatura ambiente. Después de 20 minutos de incubación con DAPI (1:50.000), las secciones se lavaron y se montaron sobre portaobjetos de microscopio con PVD-DABCO. Las incubaciones de anticuerpos primarios durante la noche restantes (anti-fosfoErk1/2 de conejo; anti-fosfo-MAPK p38 1:500, Promega, Madison, WI; receptor de anti-dopamina C1 monoclonal de ratón 1:50, Chemicon; receptor de anti-dopamina D2 policlonal de conejo 1:50, Millipore; anti-colina-acetiltransferasa policlonal de cabra 1:200, Millipore) se siguieron de la incubación con un anticuerpo secundario biotinilado (1:500, Jackson Laboratories), tratamiento con avidina-biotina-peroxidasa de rábano rusticano (ABC kit, Vector Labs, Burlingame, CA) y detección de TSA (Perkin Elmer, Shelton, CT) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

[0067] Las imágenes de fluorescencia confocales se adquirieron en un microscopio láser de exploración Leica TCS SP5 usando un objetivo de inmersión en aceite 20X/0,70NA o 40X/1,25NA. Se adquirieron cuatro imágenes de apilamiento en serie por condición dentro de una región de 500 !m bajo el tracto de la cánula. Se usó tinción DAPI para delinear los núcleos para la determinación de la intensidad de píxeles media de cfos o la inmunorreactividad pCREB usando el software Volocity (Improvision). Se identificaron células positivas o activas para pCREB por el umbral de intensidad, y la adquisición de imágenes y el análisis se realizaron en modo ciego con respecto a las condiciones experimentales.

Tabla S1

Intensidades pCREB numéricas sin procesar (au) para los datos representados en la figura 3B. Media y SEM en negrita para cada subgrupo; valores de p para una prueba t de dos colas del subgrupo frente al control en cursiva

opto-c1AR: opto-12AR

mCherry: - + - +

Media: 65,326 97,95309 63,6385 82,83284

SEM: 3,758281 7,199024 3,847409 6,907057

valor de p frente a mCherry-: 0,000272 0,019559

Tabla S2

Velocidades de disparo de referencia numéricas sin procesar (Hz) para datos presentados en la figura 4A. Media y SEM en negrita para cada subgrupo; valores de p para prueba t del subgrupo frente al control en cursiva.

XFP: oc1AR o12AR

Media: 2,596154 2,439357 2,687798

SEM: 0,436406 0,603845 0,346556

valor de p frente a XFP: 0,834496 0,869791

Tabla S3

Cambios numéricos sin procesar en la velocidad de disparo (Hz) para los datos presentados en la figura 4C calculados dentro de la propia línea basal ("Base") y entre la línea basal y los períodos de estimulación de luz ("Luz").

opto-12AR: Opto-c1AR

Media: 0,061788 -0,68113 -0,01287 3,816198

SEM: 0,134665 0,162402 0,336387 0,812251

valor de p frente a Base: 0,000861 0,000239

5 [0068] Por consiguiente, las realizaciones de la presente invención se refieren al control optogenético de la señalización intracelular y son útiles para la precisión temporal mientras que operan in vivo dentro del comportamiento de los mamíferos, mientras que exhiben actividad en la oscuridad extremadamente baja, y reclutan el tejido complejo de múltiples moléculas de señalización corriente abajo de los receptores nativos, unificando así en

10 una sola tecnología muchos de los aspectos positivos individuales de otros enfoques. Las realizaciones similares prueban directamente la importancia causal de las rutas de señalización dependientes de siete transmembranas desencadenadas por otros moduladores, que incluyen innumerables neurotransmisores y hormonas endocrinas. Otras realizaciones usan un enfoque optoXR en formas que se extienden más allá de las células excitables para capitalizarse tras la integración versátil de la profundidad de fibra óptica que se dirige con la fotosensibilidad

15 optogenéticamente dirigidas. Una realización de este tipo se refiere a probar la importancia causal de la señalización bioquímica temporalmente precisa en diversos tejidos no excitables.

[0069] Las realizaciones de la presente invención se refieren a consideraciones del fenómeno de la señalización predispuesta del ligando, donde los ligandos variados puedan estabilizar los estados conformacionales 20 de receptor de conjunto y en consecuencia predisponen la acción intracelular del receptor en el acoplamiento a las cascadas de transducción alternativas. Los optoXR se usan para inducir estas cascadas alternativas a niveles similares que con la manipulación farmacológica (por ejemplo, opto-12AR puede inducir cambios similares en la

activación de MAPK en comparación con el ligando nativo que actúa sobre el 12-AR de origen natural); sin embargo, se ha descubierto que los optoXR individuales no siempre permiten el control de todos los estados conformacionales que contribuyen a la señalización predispuesta del ligando. Las herramientas basadas en la retina pueden ser particularmente útiles debido a la presencia del cromóforo endógeno en los tejidos de mamífero, y la actividad extremadamente baja en la oscuridad. La optogenética puede tomar la forma de diversos efectores unidos a módulos de unión a la retina de un componente rápidos, que se capitalizan en la precisión temporal de la óptica.

[0070] Las realizaciones de la presente invención usan procedimientos optoXR para complementar las estrategias de opsina microbianas, proporcionando otra dimensión de control celular dirigible rápido operativo en el comportamiento de mamíferos.

[0071] Consistente con otra realización de la presente invención, se usan las versiones de longitud de onda desplazadas de los optoXR, en base a genes de opsina conocidos con diferentes espectros de acción. Dichos OptoXR pueden ser particularmente útiles para proporcionar canales separables de control bioquímico y eléctrico.

[0072] Las variantes de las secuencias de proteínas específicas analizadas en este documento son coherentes con las realizaciones de la presente invención. Algunas variantes tienen una homología mayor de aproximadamente el 75% con respecto a estas secuencias de proteínas, mientras que otras son mayores de aproximadamente el 80%, 85% o el 90%. En algunas realizaciones, la homología será tan alta como de aproximadamente el 93 a aproximadamente el 95 o aproximadamente el 98%. Las composiciones de la presente invención incluyen las secuencias de proteínas y ácidos nucleicos proporcionadas en este documento que incluyen variantes que tienen una homología de más de aproximadamente el 50% con respecto a la secuencia proporcionada hasta e incluyendo una homología del 100%.

[0073] Las diversas realizaciones analizadas en este documento podrían integrarse con tecnologías de lectura de circuito rápidas para la interrogación cada vez más sofisticada y la ingeniería inversa de los circuitos neuronales, ambos en la operación normal y en estados patológicos.

[0074] Las diversas realizaciones que se han descrito anteriormente se proporcionan únicamente a modo de ilustración y no se deben considerar para limitar la invención. En base al análisis e ilustraciones anteriores, los expertos en la técnica reconocerán fácilmente que pueden hacerse diversas modificaciones y cambios a la presente invención sin seguir estrictamente las realizaciones y aplicaciones ejemplares ilustradas y descritas en este documento. Por ejemplo, dichos cambios pueden incluir variaciones del mensajero secundario producido.

LISTA DE SECUENCIAS

[0075]

<110> Airan, Raag Deisseroth, Karl

<120> LÍNEA CELULAR, SISTEMA Y PROCEDIMIENTO PARA EL CONTROL ÓPTICO DE MENSAJEROS SECUNDARIOS

<130> STFD.195PCT

<150> US 61/057.108

<151> 29/05/2008

<160> 4

<170> PatentIn versión 3.5

<210> 1

<211> 1302

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> quimerismo de rodopsina/GPCR

<400> 1 <210> 2

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> quimerismo de rodopsina/GPCR 10

<400> 2

<210> 3

<211> 1485 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: quimerismo de rodopsina/GPCR 10

<400> 3

<210> 4

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: quimerismo de rodopsina/GPCR 10

<400> 4

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para generar mensajeros secundarios en una célula, comprendiendo el

procedimiento: modificar una secuencia nucleotídica para expresar una proteína de membrana basada en rodopsina sensible a la luz quimérica con una o más subunidades de receptor heterólogas; y

expresar la proteína de membrana sensible a la luz en una célula para producir un mensajero secundario en respuesta a la luz; expresar en la célula un canal catiónico dirigido al mensajero secundario que es sensible al mensajero secundario; y visualizar la actividad resultante usando tintes sensibles a cationes.
2.

El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la una o más subunidades de receptor heterólogas incluyen un receptor adrenérgico.
3.

El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la proteína de membrana basada en rodopsina sensible a la luz quimérica es una proteína de siete transmembranas.
4.

El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el mensajero secundario es uno de cAMP, monofosfato de guanosina cíclico (cGMP), trifosfato de inositol/1,4,5-trisfosfato de inositol/trifosfoinositol (IP3) y ácido araquidónico.
5.

El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la etapa de expresión se realiza in vivo.
6.

El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la etapa de expresión se realiza in vitro.
7.

El procedimiento de la reivindicación 1, que incluye adicionalmente la etapa de estimular ópticamente la proteína de membrana sensible a la luz expresada.
8.

Un procedimiento para evaluar la eficacia de un régimen de tratamiento putativo relacionado con

mensajeros intracelulares, comprendiendo el procedimiento: modificar una secuencia nucleotídica para expresar una proteína de membrana basada en rodopsina sensible a la luz quimérica con una o más subunidades de receptor heterólogas;

expresar la proteína de membrana sensible a la luz en una célula para producir un mensajero secundario en respuesta a la luz; expresar un canal catiónico dirigido al mensajero secundario en la célula que es sensible al mensajero secundario; exponer la proteína sensible a la luz a la luz; y evaluar los efectos del tratamiento visualizando la actividad resultante usando tintes sensibles a cationes.
9. Una célula adecuada para su uso en un procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7,

expresando la célula: a) una proteína de membrana basada en rodopsina sensible a la luz quimérica con una o más subunidades de receptor heterólogas, en la que la proteína quimérica produce un segundo mensajero;

y b) un canal catiónico dirigido al mensajero secundario que es sensible al segundo mensajero.
10.

La célula de la reivindicación 9, en la que la una o más subunidades de receptor heterólogas se selecciona entre un receptor adrenérgico alfa1 y un receptor adrenérgico beta-2.
11.

Un polinucleótido adecuado para su uso en un procedimiento de uno cualquiera de las reivindicaciones 1-7, comprendiendo el polinucleótido una secuencia nucleotídica para expresar una proteína basada en rodopsina de membrana sensible a la luz quimérica con una o más de las subunidades de receptor heterólogas del receptor adrenérgico alfa1, en el que la secuencia nucleotídica codifica una secuencia aminoacídica que tiene una homología de la secuencia aminoacídica de al menos el 90% con respecto a la secuencia aminoacídica de acuerdo con la SEQ ID. NO: 2 o la SEQ ID NO: 4.
12.

El polinucleótido de la reivindicación 11, en el que la secuencia nucleotídica está unida operativamente a un promotor específico del tipo celular.

5 13. El polinucleótido de la reivindicación 11, en el que la secuencia nucleotídica es la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3.
14. Una célula adecuada para su uso en un procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, expresando la célula un polipéptido que comprende una secuencia aminoacídica que tiene una homología de la

10 secuencia aminoacídica de al menos el 90% con respecto a la secuencia aminoacídica de acuerdo con la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4.
15. La célula de la reivindicación 14, en la que la secuencia aminoacídica es la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID

NO: 4. 15