CN103189377B - N1/n2-内酰胺乙酰辅酶a羧化酶抑制剂 - Google Patents

N1/n2-内酰胺乙酰辅酶a羧化酶抑制剂 Download PDF

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Abstract

本发明提供了式(I)的化合物，或其药学上可接受的盐；其中G为式(II)、式(III)、式(IV)或式(V)；R1、R2和R3如说明书所述；其药物组合物；及其用于治疗动物中的通过抑制乙酰辅酶A羧化酶而调节的疾病、病况或病症的用途。

Description

N1/N2-内酰胺乙酰辅酶A羧化酶抑制剂
发明领域
本发明涉及用作乙酰辅酶A羧化酶抑制剂的经取代的吡唑并螺酮化合物，及其用于治疗通过抑制乙酰辅酶A羧化酶而调节的疾病、病况或病症的用途。
发明背景
乙酰辅酶A羧化酶(ACC)为在大多数物种中发现的酶家族，且与经由催化从乙酰辅酶A产生丙二酰基-CoA的脂肪酸合成和代谢有关。在哺乳动物中，已确定2种ACC酶的同种型。ACC1(其以高水平表达于脂质合成组织(例如脂肪和肝脏)中)控制长链脂肪酸的生物合成中的第一关键步骤。如果乙酰辅酶A不被羧化以形成丙二酰基-CoA时，则其通过柠檬酸循环(Krebs cycle)进行代谢。ACC2(肝脏ACC的次要组分，但在心脏和骨骼肌中的主要同种型)催化在线粒体的胞质表面产生丙二酰基-CoA，且通过抑制肉碱棕榈酰基转移酶，调节用于β-氧化的脂肪酸的量。因此，通过增加脂肪酸利用和通过阻止从头脂肪酸合成的增加，ACC抑制剂(ACC-I)的慢性施用也可在消费高或低脂饮食的肥胖者体内消耗肝脏和脂肪组织甘油三酯(TG)储存，从而导致身体脂肪的选择性损耗。
Abu-Etheiga等人进行的研究显示，ACC2在控制脂肪酸氧化中扮演不可或缺的角色，且由此，其在抗肥胖和肥胖相关疾病(例如2型糖尿病)的治疗中提供靶标。参见Abu-Etheiga,L.等人，“Acetyl-CoAcarboxylase 2 mutant mice are protected against obesity anddiabetes induced by high-fat/high-carbohydrate diets” PNAS，100(18) 10207-10212 (2003)。也参见Choi, C.S., 等人，“Continuousfat oxidation in acetyl-CoA carboxylase 2 knockout miceincreases total energy expenditure, reduces fat mass, andimproves insulin sensitivity” PNAS，104(42) 16480-16485(2007)。
肝脂质累积引起肝脏胰岛素抗性且导致2型糖尿病的发病愈趋明确。Salvage等人证明，ACC1和ACC2两者都参与调节肝细胞中的脂肪氧化，而ACC1(大鼠肝脏中的主要同种型)为脂肪酸合成的唯一调节剂。此外，在其模型中，需要二种同种型的组合减少以显著地降低肝脏的丙二酰基-CoA水平、增加喂食状态的脂肪氧化、减少脂质累积和改良胰岛素体内作用。因此，显示肝脏ACC1和ACC2抑制剂可用于治疗非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)和肝脏胰岛素抗性。参见，Savage,D.B.,等人，“Reversal of diet-induced hepatic steatosis andhepatic insulin resistance by antisense oligonucleotideinhibitors of acetyl-CoA carboxylases 1 and 2”J Clin Investdoi：10.1172/JCI27300。也参见，Oh,W.,等人，“Glucose and fatmetabolism in adipose tissue of acetyl-CoA carboxylase 2knockout mice”PNAS，102(5)1384-1389(2005)。
因此，需要包含ACC1和/或ACC2抑制剂的药物以通过抑制脂肪酸合成和通过增加脂肪酸氧化来治疗肥胖和肥胖相关疾病(例如，NAFLD和2型糖尿病)。
发明概述
本发明涉及具有式(I)结构的化合物
其中G为
R1为(C1-C6)烷基或(C3-C5)环烷基；R2为苯基、萘基、5至12员杂芳基或8至12员稠合杂环芳基；其中各R2基任选地经一至三个独立地选自(C1-C3)烷基、(C1-C3)烷氧基、卤素和CONH2的取代基取代；及R3为氢或(C1-C3)烷基；或其药学上可接受的盐。
本发明的优选实施方案为式(I)的化合物，其中R1为异丙基或叔丁基；或其药学上可接受的盐。
本发明另一优选实施方案为式(I)的化合物，其中R2为苯并咪唑基、吡咯并吡啶基、吡唑并吡啶基、吲唑基、喹啉基或异喹啉基，该R2任选地经一至二个独立地选自(C1-C3)烷基、(C1-C3)烷氧基及卤素的取代基单或二取代；或其药学上可接受的盐。本发明另一优选实施方案为式(I)的化合物，其中R2为吲唑基、苯并咪唑基或1H-吡咯并[3,2-b]吡啶基，该R2任选地经一至二个甲基、甲氧基或氯取代；或其药学上可接受的盐。
本发明另一优选实施方案为选自1'-异丙基-1-(2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-5-羰基)-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(1'H)-酮；1'-异丙基-1-(2-甲基-2H-吲唑-5-羰基)-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(1'H)-酮；1'-异丙基-1-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-羰基)-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(1'H)-酮；及1'-异丙基-1-(1H-吡咯并[3,2-b]吡啶-6-羰基)-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(1'H)-酮的化合物；或其药学上可接受的盐。
本发明另一优选实施方案为选自1'-异丙基-1-(1-甲基-1H-吲唑-5-羰基)-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(1'H)-酮；1-(4,8-二甲氧基喹啉-2-羰基)-1'-异丙基-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(1'H)-酮；1'-异丙基-1-(1H-吡咯并[3,2-b]吡啶-2-羰基)-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(1'H)-酮；及1'-异丙基-1-(1H-吡唑并[4,3-b]吡啶-6-羰基)-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(1'H)-酮的化合物；或其药学上可接受的盐。
本发明另一优选实施方案为选自1-(3,7-二甲基-1H-吲唑-5-羰基)-1'-异丙基-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(1'H)-酮；1'-异丙基-1-(7-甲基-1H-吲唑-5-羰基)-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(1'H)-酮；1-(1H-吲唑-5-羰基)-1'-异丙基-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(1'H)-酮；1'-叔丁基-1-(1H-吲唑-5-羰基)-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(1'H)-酮；1'-叔丁基-1-(7-甲基-1H-吲唑-5-羰基)-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(1'H)-酮；及1'-叔丁基-1-(3,7-二甲基-1H-吲唑-5-羰基)-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(1'H)-酮的化合物；或其药学上可接受的盐。
本发明另一优选实施方案为选自1-(7-氯-1H-吲唑-5-羰基)-1'-异丙基-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(1'H)-酮；1'-异丙基-1-(4-甲氧基-1H-吲唑-6-羰基)-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(1'H)-酮；1-(7-乙基-1H-吲唑-5-羰基)-1'-异丙基-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(1'H)-酮；1-(3-乙基-1H-吲唑-5-羰基)-1'-异丙基-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(1'H)-酮；及1'-异丙基-1-(3-甲基-1H-吲唑-5-羰基)-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(1'H)-酮的化合物；或其药学上可接受的盐。
本发明另一优选实施方案为选自1-(1H-吲唑-5-羰基)-2'-异丙基-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(2'H)-酮；2'-叔丁基-1-(1H-吲唑-5-羰基)-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(2'H)-酮；2'-异丙基-1-(7-甲基-1H-吲唑-5-羰基)-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(2'H)-酮；1-(3,7-二甲基-1H-吲唑-5-羰基)-2'-异丙基-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(2'H)-酮；2'-叔丁基-1-(7-甲基-1H-吲唑-5-羰基)-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(2'H)-酮；2'-叔丁基-1-(3,7-二甲基-1H-吲唑-5-羰基)-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(2'H)-酮；及2'-异丙基-1-(2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-5-羰基)-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(2'H)-酮的化合物；或其药学上可接受的盐。
本发明另一优选实施方案为选自1'-异丙基-1-(喹啉-3-羰基)-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(1'H)-酮；1'-异丙基-1-(喹啉-6-羰基)-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(1'H)-酮；1'-异丙基-1-(异喹啉-6-羰基)-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(1'H)-酮；1'-异丙基-1-(异喹啉-7-羰基)-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(1'H)-酮；及1'-异丙基-1-(喹啉-7-羰基)-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(1'H)-酮的化合物；或其药学上可接受的盐。
本发明另一实施方案为式(I)的化合物，
或其药学上可接受的盐；其中
G为
R1为(C1-C6)烷基或(C3-C5)环烷基；R2为苯基；萘基；5至12员杂芳基或8至12员稠合杂环芳基；其中各R2基任选地经一至三个独立地选自(C1-C6)烷基、(C3-C7)环烷基、(C1-C6)烷氧基、卤素、氰基、CONR4R5、NR4R5或3至7员杂环基的取代基取代，其中所述(C1-C6)烷基、(C3-C7)环烷基或(C1-C6)烷氧基任选地经1至5个氟取代；R3为氢或(C1-C3)烷基；及R4和R5在每次出现时是独立地选自氢、(C1-C6)烷基、(C3-C7)环烷基、(C1-C3)烷氧基-(C1-C6)烷基或3至7员杂环基；其中所述(C1-C6)烷基、(C3-C7)环烷基或(C1-C3)烷氧基-(C1-C6)烷基任选地经1至5个氟取代。
本发明另一实施方案为式(I)的化合物，其中G为
R1为异丙基或叔丁基；或其药学上可接受的盐。
本发明另一实施方案为式(I)的化合物，其中R2为苯并咪唑基、苯并三唑基、吡咯并吡啶基、吡唑并吡啶基、吲哚基、吲唑基、喹啉基或异喹啉基，所述R2任选地经一至二个独立地选自(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、卤素或NR4R5的取代基取代，其中所述(C1-C6)烷基或(C1-C6)烷氧基任选地经1至5个氟取代；或其药学上可接受的盐。
本发明另一实施方案为式(I)的化合物，其中R2为吲唑基、吲哚基、苯并咪唑基或1H-吡咯并[3,2-b]吡啶基，该R2任选地独立地经一至二个甲基、甲氧基、NH2、NHCH3或氯取代；或其药学上可接受的盐。
本发明另一优选实施方案为式(I)的化合物，其中R2为喹啉基或异喹啉基，该R2任选地独立地经一至二个甲基、甲氧基、NH2、NHCH3、NHCH2CH3、NHCH2CF3或氯取代；或其药学上可接受的盐。
本发明一优选实施方案为选自下述的化合物：1-(3,7-二甲基-1H-吲唑-5-羰基)-1'-异丙基-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(1'H)-酮；1-(3,7-二甲基-1H-吲唑-5-羰基)-1'-叔丁基-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(1'H)-酮；1-(3,7-二甲基-1H-吲唑-5-羰基)-2'-异丙基-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(1'H)-酮；1-(6-甲氧基喹啉-3-羰基)-2'-叔丁基-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(1'H)-酮；1-(1-甲氧基异喹啉-7-羰基)-2'-叔丁基-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(1'H)-酮；1-(3-氯-7-甲基-1H-吲唑-5-羰基)-2'-叔丁基-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(1'H)-酮；1-(2-甲氧基喹啉-7-羰基)-2'-叔丁基-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(1'H)-酮；1-(2-氨基喹啉-7-羰基)-2'-叔丁基-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(1'H)-酮；1-(5-甲氧基喹啉-3-羰基)-2'-叔丁基-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(1'H)-酮；1-(2-氨基-1H-苯并[d]咪唑-5-羰基)-2'-叔丁基-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(1'H)-酮；1-(2-(甲氨基)喹啉-7-羰基)-2'-叔丁基-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(1'H)-酮；1-(1-(甲氨基)异喹啉-7-羰基)-2'-叔丁基-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(1'H)-酮；1-(3-氯-1H-吲哚-6-羰基)-2'-叔丁基-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(1'H)-酮；1-(3-氯-1H-吡咯并[3,2-b]吡啶-6-羰基)-2'-叔丁基-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(1'H)-酮；1-(2-(甲氨基)喹啉-7-羰基)-1'-异丙基-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(1'H)-酮；1-(1-(2,2,2-三氟乙氨基)喹啉-7-羰基)-2'-叔丁基-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(1'H)-酮；及1-(1-(乙氨基)异喹啉-7-羰基)-2'-叔丁基-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(1'H)-酮；或其药学上可接受的盐。
本发明另一方面为一种药物组合物，其包含一定量的任一实施方案中所述的式(I)化合物；或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。优选地，组合物包含治疗有效量的本发明化合物。组合物也可包含至少一种额外药剂。优选药剂包括抗糖尿病剂和/或抗肥胖剂。
本发明另一方面为一种治疗哺乳动物中通过抑制乙酰辅酶A羧化酶而介导的疾病、病况或病症的方法，其包括将治疗有效量的本发明化合物或其药学上可接受的盐或其组合物施用至需要该治疗的哺乳动物(优选为人类)的步骤。
由乙酰辅酶A羧化酶抑制剂介导的疾病、病症或病况包括II型糖尿病和糖尿病相关疾病，例如非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)、肝脏胰岛素抗性、高血糖症、代谢综合征、葡萄糖耐受受损、糖尿病神经病变、糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变、肥胖、血脂异常、高血压、高胰岛素血症和胰岛素抗性综合征。优选疾病、病症或病况包括II型糖尿病、非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)、肝脏胰岛素抗性、高血糖症、葡萄糖耐受受损、肥胖和胰岛素抗性综合征。更优选为II型糖尿病、非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)、肝脏胰岛素抗性、高血糖症、和肥胖。最优选为II型糖尿病。
一优选实施方案为一种治疗(例如延迟进展或发作)动物的2型糖尿病和糖尿病相关病症的方法，其包括将治疗有效量的本发明化合物或其药学上可接受的盐或其组合物施用至需要该治疗的动物的步骤。
另一优选实施方案为一种治疗动物的肥胖和肥胖相关病症的方法，其包括将治疗有效量的本发明化合物或其药学上可接受的盐或其组合物施用至需要该治疗的动物的步骤。
另一优选实施方案为一种治疗动物的非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)或肝脏胰岛素抗性的方法，其包括将治疗有效量的本发明化合物或其药学上可接受的盐或其组合物施用至需要该治疗的动物的步骤。
本发明的化合物可与其他药剂(特别是，下文中所述的抗肥胖和抗糖尿病剂)组合施用。组合治疗可以下列施用：(a)单一药物组合物，其包含本发明的化合物、至少一种本文中所述的另外药剂和药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体；或(b)二种分开的药物组合物，其包含(i)第一种组合物，其包含本发明化合物和药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体、和(ii)第二种组合物，其包含至少一种本文中所述的另外药剂和药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。药物组合物可同时地或连续地且以任何顺序施用。
发明详述
定义
表述“治疗有效量”表示本发明化合物或其药学上可接受的盐的量，该量：(i)治疗或预防特定疾病、病况或病症，(ii)减轻、改善或消除特定疾病、病况或病症中的一种或多种症状，或(iii)预防或延迟本文中所述的特定疾病、病况或病症中的一种或多种症状的发作。
术语“动物”是指人类(男性或女性)、伴侣动物(例如，狗、猫和马)、食物来源动物、动物园动物、海洋动物、鸟类及其他类似的动物物种。“食用动物”是指食物来源动物，例如牛、猪、羊及家禽。
表述“药学上可接受的”是指，物质或组合物必须与其他成分(包括制剂)和/或欲用其治疗的哺乳动物在化学上和/或毒理学上相容。
术语“治疗(treating、treat或treatment)”包含预防性(即防治性)及缓解性治疗二者。
术语“调节(modulated或modulating或modulate(s))”，如本文中使用的，除非另有说明，否则是指，以本发明化合物抑制乙酰辅酶A羧化酶(ACC)。
术语“介导(mediated或mediating或mediate(s))”，如本文中使用的，除非另有说明，否则是指，通过抑制乙酰辅酶A羧化酶(ACC)来(i)治疗或预防特定疾病、病况或病症，(ii)减轻、改善或消除特定疾病、病况或病症的一种或多种症状，或(iii)预防或延迟本文中所述的特定疾病、病况或病症的一种或多种症状的发作。
术语“本发明化合物”(除非另有具体指明)是指，式(I)化合物及该化合物的任何药学上可接受的盐，以及所有的立体异构体(包括非对映异构体和对映异构体)、互变异构体、构象异构体及同位素标记的化合物。本发明化合物的水合物及溶剂化物被认为是本发明的组成，其中化合物分别与水或溶剂结合。
术语“(C1-C6)烷基”和“(C1-C3)烷基”为指定碳数的烷基基团，分别地，一至六个或一至三个碳原子，其可为直链或支链。例如，术语“(C1-C3)烷基”具有一至三个碳且由甲基、乙基、正丙基和异丙基组成。
术语“(C3-C7)环烷基”表示具有三至七个碳原子的环烷基基团且由环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环庚基组成。术语“卤素”表示氟、氯、溴或碘。术语“(C6-C10)芳基”表示由六至十个碳原子组成的芳族碳环基团例如苯基或萘基。
术语“5至12员杂芳基”表示包含至少一个选自氮、氧和硫的杂原子的五至十二员芳族基团。如本文中使用的，“5至12员杂芳基”基团的连接点是在基团的碳原子上。“5至12员杂芳基”基团可为双环。双环杂芳基的优选实施方案包括但不限于，下列环系统的基团：
术语“8至12员稠合杂环芳基”表示8至12员环系统，其中非芳族杂环稠合至芳基环。如本文中使用的，“8至12员稠合杂环芳基”基团的连接点是在该基团的碳原子上。术语“3至7员杂环基”表示三至七员饱和环，其中一至三个原子为独立地选自氮、氧及硫的杂原子。“3至7员杂环基”基团的例子包括但不限制于，基团例如氮丙啶基、氮杂环丁基、吡咯烷基、哌啶基、环氧乙烷基、氧杂环丁基、四氢呋喃基、四氢-2H-吡喃基、四氢-2H-噻喃基、哌嗪基、吗啉基及硫代吗啉基。对于特定基团，若适当的话，“3至7员杂环基”的连接点可在碳或氮原子上。
在一个实施方案中，式I化合物为具有下列结构的N1内酰胺ACC抑制剂化合物：
其中R1为(C1-C6)烷基或(C3-C5)环烷基；R2为苯基、萘基、5至12员杂芳基或8至12员稠合杂环芳基；其中各R2基任选地经一至三个独立地选自(C1-C3)烷基、(C1-C3)烷氧基、卤素和CONH2的取代基取代；及R3为氢或(C1-C3)烷基；或其药学上可接受的盐。
在一实施方案中，式I化合物为具有下列结构的N2内酰胺ACC抑制剂化合物：
其中R1为(C1-C6)烷基或(C3-C5)环烷基；R2为苯基；萘基；5至12员杂芳基或8至12员稠合杂环芳基；其中各R2团任选地经一至三个独立地选自(C1-C3)烷基、(C1-C3)烷氧基、卤素和CONH2的取代基取代；和R3为氢或(C1-C3)烷基；或其药学上可接受的盐。
本发明化合物可以通过包括与化学领域中熟知的方法类似的方法的合成途径合成(特别是在本说明书的教导下)。起始原料通常可获自商业来源，例如Aldrich Chemicals(Milwaukee，WI)或使用本领域技术人员熟知的方法容易地制得(例如，通过一般描述于Louis F.Fieser and Mary Fieser,Reagents for Organic Synthesis,v.1-19，Wiley，New York(1967-1999 ed.)，或Beilsteins Handbuch derorganischen Chemie.4，Aufl.ed.Springer-Verlag，Berlin，包括附录(还可经由Beilstein在线数据库获得)中的方法制得)。
例如，下述反应流程提供了用于合成本发明化合物以及关键中间体的可能途径。关于个别反应步骤的更详细说明，参见下述实施例。本领域技术人员理解，可使用其他的合成途径来合成本发明化合物。虽然特定起始原料及试剂描述于流程中且论述于下文中，但是可容易地用其他起始原料及试剂取代，以提供各种衍生物和/或反应条件。此外，在本公开内容的教导下，以下述方法制得的许多化合物可使用本领域技术人员熟知的常规化学法进行进一步修饰。
在本发明化合物的制备中，可能需要保护中间体的远程官能性(例如，伯胺或仲胺)。对于此类保护作用的需求将视远程官能性的性质及制备方法的条件而改变。适当的氨基-保护基(NH-Pg)包括乙酰基、三氟乙酰基、叔丁氧羰基(BOC)、苯甲氧羰基(CBz)及9-芴基亚甲氧羰基(Fmoc)。同样地，“羟基-保护基”是指阻断或保护羟基官能性的羟基的取代基。适当的羟基保护基(O-Pg)包括(例如)烯丙基、乙酰基、硅烷基、苯甲基、对-甲氧基苯甲基、三苯甲基等等。对于此类保护作用的需求可由本领域技术人员容易地决定。关于保护基及其用途的一般说明，参见T.W.Greene,Protective Groups in Organic Synthesis,John Wiley & Sons,New York,1991。
下列反应流程(反应流程I至反应流程V)提供用于制备式(I)化合物的代表性步骤。应了解，这些反应流程被解释为非限制性的，且所述方法的合理变化可用于制备式(I)的化合物。
反应流程I概述了可用于提供具有式Ia的本发明N1内酰胺ACC抑制剂化合物的一般步骤，其中R1为(C1-C6)烷基或(C3-C5)环烷基和R2为苯基、萘基、5至12员杂芳基或8至12员稠合杂环芳基；其中各R2基任选地经一至三个独立地选自(C1-C3)烷基、(C1-C3)烷氧基、卤素和CONH2的取代基取代。
反应流程I
根据流程I，式XIa的化合物可通过使2-氰基-3-乙氧基丙烯酸甲酯与适当烷肼(R1NHNH2)在碱(例如碳酸钾)及溶剂存在下反应而形成。例如，式XIa的化合物可通过使2-氰基-3-乙氧基丙烯酸甲酯与适当烷肼(R1NHNH2)在碱(“K2CO3”)存在下、在回流乙醇中、于约20℃至约80℃的温度下反应约2至24小时而形成，以提供所要环化化合物。
式Xa的化合物可通过使用亚硝酸盐/酯例如异戊基亚硝酸酯、亚硝酸钠或亚硝酸叔丁酯及溴化物来源例如在乙腈中的溴化铜(II)、于约20℃至约80℃的温度下经约2至约18小时将式XIa的芳基胺转化成芳基溴化物，以提供式Xa的化合物。
然后，式IXa的化合物可通过用还原剂例如氢化二异丁基铝(“DIBAL”)或氢化锂铝(“LAH”)在非质子溶剂例如四氢呋喃(“THF”)、甲苯或二乙基醚中、于约0℃至约80℃的温度下处理式Xa的酯约1至约12小时而制得。
式VIa的化合物可通过下列形成：首先使式IXa的化合物与溴化剂(例如三溴化磷(“PBr3”)、或四溴化碳和三苯膦的混合物)、于约-20℃至约60℃的温度下反应约30至约120分钟而形成式VIIIa的化合物。然后使式VIIIa的化合物与式VIIa的经保护的哌啶衍生化合物在强碱例如双(三甲基硅基)氨基锂(“LiHMDS”)或二异丙基氨基锂(“LDA”)存在下、在非质子溶剂(例如THF、甲苯或二乙基醚)中、于约-78℃至约20℃的温度下反应约1至约18小时。Pg基团表示适当胺保护基团且优选为N-叔丁氧羰基(“BOC”)或苯甲氧羰基(“Cbz”)。
然后，式VIa的化合物接着通过用强水性碱(例如氢氧化锂或氢氧化钠)于约0℃至约100℃的温度下水解酯基团约1至约18小时而脱保护，形成包含羧酸的式Va的化合物。
然后，式IVa的异氰酸酯化合物可通过使式Va的羧酸与叠氮磷酸二苯酯(“DPPA”)在碱(例如三乙胺(“Et3N”)或二异丙基乙基胺)存在下、于约60℃至约120℃的温度下反应约1至约12小时而形成。然后，式IIIa的内酰胺化合物可通过使用烷基锂(例如正丁基锂(“n-BuLi”)或叔丁基锂(“t-BuLi”)于约-78℃至约0℃的温度下经约5至约120分钟的异氰酸酯(式IVa)的环化作用而形成。
式(IIIa)的内酰胺化合物然后可使用取决于已经使用的保护基Pg的标准方法脱保护以提供式(IIa)的游离螺哌啶衍生物。例如，当Pg表示BOC时，则可使用标准强酸脱保护条件(例如在二恶烷中的4N盐酸或在适当溶剂例如二氯甲烷中的三氟乙酸)以除去BOC基团。当Pg表示Cbz时，在乙醇中的钯碳上的氢化或在钯碳存在下于乙醇或乙酸乙酯中用氢来源(例如甲酸铵或1-甲基-1,4-环己二烯)的处理可用于进行脱保护。
式(IIa)的螺哌啶衍生物然后可通过使用标准方法酰化以提供式(Ia)的化合物。例如，然后可使用与期望的羧酸(R2CO2H)的标准肽偶联反应形成化合物(Ia)。例如，螺哌啶中间体(IIa)和羧酸(R2CO2H)可通过下述而偶联：形成活化的羧酸酯，例如通过使羧酸(R2CO2H)与肽偶联试剂例如O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(“HATU”)或1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(“EDC·HCl”)、在活化剂(例如羟基苯并三唑(“HOBt”)存在或不存在下及在适当碱(例如N,N-二异丙基乙胺(“DIEA”)、三乙胺或N-甲基吗啉(“NMM”))存在下、在适当溶剂(例如THF和/或DMF、二甲基乙酰胺(“DMA”)或二氯甲烷)中接触，且然后使活化的羧酸酯与螺哌啶衍生物(IIa)接触而形成式(Ia)的化合物。
反应流程II概述了可用于提供具有式Ib的本发明N2内酰胺ACC抑制剂化合物的一般步骤，其中R1为(C1-C6)烷基或(C3-C5)环烷基和R2为苯基、萘基、5至12员杂芳基或8至12员稠合杂环芳基；其中各R2基任选地经一至三个独立地选自(C1-C3)烷基、(C1-C3)烷氧基、卤素和CONH2的取代基取代。
反应流程II
根据流程II，可在碱例如碳酸铯(“Cs2CO3”)或碳酸钾(“K2CO3”)及溶剂例如二甲基甲酰胺(“DMF”)存在下、于约20℃至约100℃的温度下，使用伯烷基或仲烷基卤化物(例如碘甲烷、碘乙烷、1-溴丙烷、1-碘丙烷、2-溴丙烷、2-碘丙烷、1-碘丁烷、2-碘丁烷、1-碘-2-甲基丙烷或1-(溴甲基)环丙烷)，将式XIb的吡唑化合物烷基化为式X的化合物，进行约1至约12小时。
然后，式IXb的化合物可通过在非质子溶剂(例如THF、甲苯或二乙基醚)中、于约-78℃至约60℃的温度下用还原剂(例如DIBAL或LAH)处理式Xb约1至约12小时而制备。
式VIb的化合物可通过下列形成：首先使式IXb的化合物与溴化剂(例如PBr3或四溴化碳和三苯膦的混合物)、于约-20℃至约60℃的温度下反应约30至约120分钟而形成式VIIIb的化合物。然后使用强碱例如双(三甲基硅基)氨基锂(“LiHMDS”)或二异丙基氨基锂(“LDA”)使式VIIIb的化合物与式VIIb的经保护的哌啶衍生化合物在非质子溶剂(例如THF、甲苯或二乙基醚)中、于约-78℃至约20℃的温度下反应约1至约18小时。Pg基团表示适当胺保护基团且优选为BOC或Cbz。
然后，式VIb的化合物通过用强水性碱(例如氢氧化锂或氢氧化钠)于约0℃至约100℃的温度下水解酯基团约1至约18小时而脱保护，形成包含羧酸的式Vb的化合物。式IVb的异氰酸酯化合物然后可通过使式Vb的羧酸与DPPA在碱(例如Et3N或二异丙基乙基胺)存在下、于约60℃至约120℃的温度下反应约1至约12小时而形成。
式IIIb的内酰胺化合物然后可通过使用烷基锂(例如n-BuLi或t-BuLi)于约-78℃至约0℃的温度下经约5至约120分钟的异氰酸酯(式IVb)的环化作用而形成。
式(IIIb)的内酰胺化合物然后可使用取决于已经使用的保护基Pg的标准方法脱保护，以提供式(IIb)的游离螺哌啶衍生物。例如，当Pg表示BOC时，则可使用标准强酸脱保护条件(例如在二恶烷中的4N盐酸或在适当溶剂例如二氯甲烷中的三氟乙酸)以除去BOC基团。当Pg表示Cbz时，在乙醇中的钯碳上的氢化或在钯碳存在下于乙醇或乙酸乙酯中用氢来源(例如甲酸铵或1-甲基-1,4-环己二烯)的处理可用于进行脱保护。
式(IIb)的螺哌啶衍生物然后可通过使用标准方法酰化以提供式(Ib)的化合物。例如，然后，可使用与期望的羧酸(R2CO2H)的标准肽偶联反应形成化合物(Ib)。例如，螺哌啶中间体(IIb)和羧酸(R2CO2H)可通过下述而偶联：形成活化的羧酸酯，例如通过使羧酸(R2CO2H)与肽偶联试剂(例如HATU或EDC·HCl)、在活化剂(例如HOBt)存在或不存在下及在适当碱(例如DIEA或NMM)存在下、在适当溶剂(例如THF和/或DMF、DMA或二氯甲烷)中接触，且然后使活化的羧酸酯与螺哌啶衍生物(IIb)接触而形成式(Ib)的化合物。
反应流程III概述了可用于提供具有式Ic的本发明N2内酰胺ACC抑制剂化合物的一般步骤，其中R1为(C1-C6)烷基或(C3-C5)环烷基和R2为苯基、萘基、5至12员杂芳基或8至12员稠合杂环芳基；其中各R2基任选地经一至三个独立地选自(C1-C3)烷基、(C1-C3)烷氧基、卤素和CONH2的取代基取代。
反应流程III
式IVc的内酰胺化合物可通过使用强碱(例如2,2,6,6-四甲基哌啶锂(“LTMP”)或2,2,6,6-四甲基哌啶镁)、于约-78℃至约0℃的温度下经约30分钟至约6小时的异氰酸酯(式IVa)的环化作用而形成。
式(IVc)的内酰胺化合物，当Pg表示BOC时，则可通过在碱(例如Et3N)存在下、利用钯碳、在乙醇中的氢化作用或在碱(例如Et3N)及钯碳存在下、在乙醇或乙酸乙酯中、于约20℃至约100℃的温度下用氢来源(例如甲酸铵或1-甲基-1,4-环己二烯)处理经约30分钟至约6小时而脱卤素，以提供式(IIIc)的内酰胺化合物。
式(IIIc)的内酰胺化合物，当Pg表示BOC时，则可使用标准强酸脱保护条件(例如在二恶烷中的4N盐酸或在适当溶剂例如二氯甲烷中的三氟乙酸)脱保护而除去BOC基团，以提供式(IIc)的游离螺哌啶衍生物。
式(IVc)的内酰胺化合物，当Pg表示Cbz时，可通过在乙醇中利用钯碳的氢化作用或在钯碳存在下于乙醇或乙酸乙酯中用氢来源(例如甲酸铵或1-甲基-1,4-环己二烯)的处理同时地脱卤素或脱保护。
式(IIc)的螺哌啶衍生物然后可通过使用标准方法酰化，以提供式(Ic)的化合物。例如，接着可使用与所要羧酸(R2CO2H)的标准肽偶联反应形成化合物(Ic)。例如，螺哌啶中间体(IIc)和羧酸(R2CO2H)可通过下述而偶联：形成活化的羧酸酯，例如通过使羧酸(R2CO2H)与肽偶联试剂(例如HATU或EDC·HCl)、在活化剂(例如HOBt)存在下或不存在下及在适当碱(例如DIEA、三乙胺或NMM)存在下、在适当溶剂(例如THF和/或DMF、DMA或二氯甲烷)中接触，且然后使活化的羧酸酯与螺哌啶衍生物(IIc)接触而形成式(Ic)的化合物。
反应流程IV概述了可用于提供具有式Id的本发明N2内酰胺ACC抑制剂化合物的一般步骤，其中R1为(C1-C6)烷基或(C3-C5)环烷基和R2为苯基、萘基、5至12员杂芳基或8至12员稠合杂环芳基；其中各R2基任选地经一至三个独立地选自(C1-C3)烷基、(C1-C3)烷氧基、卤素和CONH2的取代基取代。
反应流程IV
式IIId的内酰胺化合物可通过式IVc的溴化物与烷基或烯基三丁基锡烷(例如甲基三-正丁基锡烷或乙烯基三-正丁基锡烷或烯丙基三-正丁基锡烷)或三烷基硼氧六环(例如三甲基硼氧六环或三乙烯基硼氧六环)在钯催化剂例如四(三苯膦)钯(0)或前催化剂(precatalyst)及配位体组合例如乙酸钯(II)及2-二环己基膦基-2',6'-二甲氧基联苯(“SPhos”)存在下及在碱(例如碳酸钾)存在下或不存在下、在质子溶剂(例如乙醇或叔戊醇)或非质子溶剂(例如四氢呋喃或二甲基甲酰胺)中、于约20℃至约100℃的温度下经约2小时至约18小时或在微波加热下、于约100℃至约150℃的温度下经约5分钟至约60分钟的钯催化的交叉偶联而形成。若使用烯基三烷基锡烷或烯基硼氧六环来安装R3基团，则所产生的烯烃的还原可通过在乙醇中利用钯碳的氢化作用或在钯碳存在下、在乙醇或乙酸乙酯中用氢来源(例如甲酸铵或1-甲基-1,4-环己二烯)的处理而实现。
然后可使用视已经使用的保护基Pg而定的标准方法，将式(IIId)的内酰胺化合物脱保护以提供式(IId)的游离螺哌啶衍生物。例如，当Pg表示BOC时，标准强酸脱保护条件(例如在二恶烷中的4N盐酸或在适当溶剂例如二氯甲烷中的三氟乙酸)可用于除去BOC基团。当Pg表示Cbz时，在乙醇中利用钯碳的氢化作用或在钯碳存在下、于乙醇或乙酸乙酯中用氢来源(例如甲酸铵或1-甲基-1,4-环己二烯)的处理可用于进行脱保护。
式(IId)的螺哌啶衍生物然后可通过使用标准方法酰化，以提供式(Id)的化合物。例如，接着可使用与所要羧酸(R2CO2H)的标准肽偶联反应形成化合物(Id)。例如，螺哌啶中间体(IId)和羧酸(R2CO2H)可通过下述而偶联：形成活化的羧酸酯，例如通过使羧酸(R2CO2H)与肽偶联试剂(例如HATU或EDC·HCl)在活化剂(例如HOBt)存在下或不存在下及在适当碱(例如DIEA、三乙胺或NMM)存在下、在适当溶剂(例如THF和/或DMF、DMA或二氯甲烷)中接触，且然后使活化的羧酸酯与螺哌啶衍生物(IId)接触而形成式(Id)的化合物。
反应流程V概述了可用于提供具有式Id的本发明N2内酰胺ACC抑制剂化合物的一般步骤，其中R1为(C1-C6)烷基或(C3-C5)环烷基；及R2为苯基、萘基、5至12员杂芳基或8至12员稠合杂环芳基；其中各R2基任选地经一至三个独立地选自(C1-C3)烷基、(C1-C3)烷氧基、卤素和CONH2的取代基取代。
反应流程V
根据流程V，式XIe的化合物可通过式XIIIe的酮基酯化合物与适当的式XIIe烷肼盐酸盐(例如叔丁肼盐酸盐)在叔胺碱(例如三乙胺或N,N-二异丙基乙基胺)存在下、在极性质子溶剂(例如乙醇)中、于约20℃至约100℃的温度下经约1至约12小时的缩合作用而制备。
式Xe的化合物可通过用(氯亚甲基)二甲基氯化铵(Vilsmeier盐，Sigma-Aidrich，cat#280909)在非质子溶剂(例如二甲基甲酰胺或甲苯或1,2-二氯乙烷)中、于约0℃至约120℃的温度下处理式XIe的化合物约1至12小时而制备。
式IXe的化合物可通过在质子溶剂(例如甲醇或乙醇)中于约0℃至约60℃的温度下用还原剂(例如硼氢化钠)处理式Xe的醛约1至约6小时而制备。
式VIe的化合物可通过下列形成：首先使IXe的化合物与溴化剂(例如三溴化磷(“PBr3”)或四溴化碳和三苯膦的混合物)于约-20℃至约60℃的温度下反应约30至约120分钟而形成式VIIIe的化合物。然后使式VIIIe的化合物与式VIIa的经保护的4-氰基哌啶衍生化合物在强碱例如双(三甲基硅基)氨基锂(“LiHMDS”)或二异丙基氨基锂(“LDA”)存在下、在非质子溶剂(例如四氢呋喃(“THF”)、甲苯或二乙基醚)中、于约-78℃至约20℃的温度下反应约1至约18小时。Pg基团表示适当的胺保护基团，且优选为N-叔丁氧羰基(“BOC”)或苯甲氧羰基(“Cbz”)。
式Ve的酰胺化合物可通过使式VIe的腈化合物经历水解条件(例如水性氢氧化物碱(例如氢氧化锂或氢氧化钠)及溶剂(例如甲醇或乙醇或四氢呋喃)于约20℃至约100℃的温度下经约1至12小时)而制备。或者，可使用过氧化物配合物(例如尿素-过氧化氢)与水性氢氧化物碱(例如氢氧化钠)的组合在溶剂(例如甲醇或乙醇)中、于约0℃至约60℃的温度下进行约1至12小时。
式Ve的酰胺化合物至式IVe的异氰酸酯化合物的重排可通过用试剂例如(双(三氟乙酰氧)碘)苯在无机碱(例如碳酸氢钠)存在下、在溶剂(例如乙腈)中、于约20℃至约60℃的温度下处理约1至6小时来进行。
式IVe的异氰酸酯化合物至式IIIe的内酰胺化合物的转化可通过下述来进行：首先在水性氢氧化物碱(例如氢氧化钠或氢氧化锂)中、在溶剂(例如甲醇或四氢呋喃)中水解异氰酸酯。所产生的胺然后可用酰胺偶联剂例如1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺或2-(7-氮杂-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐与烷基胺碱例如三乙胺或N,N-二异丙基乙胺、在溶剂(例如二氯甲烷或二甲基甲酰胺)中、于约0℃至约60℃的温度下处理经1至24小时，以产生化合物式IIIe的内酰胺。
然后，可使用取决于已经使用的保护基Pg的标准方法将(IIIe)的内酰胺化合物脱保护，以提供式(IIe)的游离螺哌啶衍生物。例如，当Pg表示叔丁氧羰基(BOC)时，标准强酸脱保护条件(例如在二恶烷中的4N盐酸或在适当溶剂例如二氯甲烷中的三氟乙酸)可用于除去BOC基团。当Pg表示苯甲氧羰基(Cbz)时，在乙醇中利用钯碳的氢化作用或在钯碳存在下、于乙醇或乙酸乙酯中用氢来源例如甲酸铵或1-甲基-1,4-环己二烯的处理可用于进行脱保护。
式(IIe)的螺哌啶衍生物然后可通过使用标准方法酰化，以提供式(Ie)的化合物。例如，接着可使用与所要羧酸(R2CO2H)的标准肽偶联反应形成化合物(Ie)。例如，螺哌啶中间体(IIe)和羧酸(R2CO2H)可通过下述而偶联：形成活化的羧酸酯，例如通过使羧酸(R2CO2H)与肽偶联试剂(例如HATU或EDC·HCl)、在活化剂(例如HOBt)存在下或不存在下及在适当碱(例如DIEA、NMM)存在下、在适当溶剂(例如THF和/或DMF、DMA或二氯甲烷)中接触，且然后使活化的羧酸酯与螺哌啶衍生物(IIe)接触而形成式(Ie)的化合物。
本发明化合物可以以本身或以其药学可接受的盐的形式被分离和使用。根据本发明，具有多个碱性氮原子的化合物可与改变当量数("eq.")的酸形成盐。技术人员理解，所有此类盐在本发明的范围内。
与本发明化合物相关的药学上可接受的盐，如本文中使用的，包括化合物的药学上可接受的无机和有机盐。这些盐可在化合物的最后分离和纯化期间原位制得，或可通过单独地使其化合物与适当有机或无机酸反应及分离出所形成的盐而制得。代表性的盐包括但不限于，氢溴酸盐、盐酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、硝酸盐、乙酸盐、三氟乙酸盐、草酸盐、苯磺酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、丙二酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、苹果酸盐、硼酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、六氟磷酸盐、苯磺酸盐、甲苯磺酸盐、甲酸盐、柠檬酸盐、顺丁烯二酸盐、反丁烯二酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘酸盐、甲磺酸盐、葡庚糖酸盐、乳糖酸盐(lactobionate)和月桂基磺酸盐等等。其还可包括基于碱金属和碱土金属的阳离子，例如钠、锂、钾、钙、镁等等，以及无毒性的铵、季铵和胺阳离子，包括但不限于，铵、四甲铵、四乙铵、甲基铵、二甲基铵、三甲基铵、三乙基铵、乙基铵等等。对于另外的例子，参见例如Berge等人，J.Pharm.Sci.，66，1-19(1977)。
本发明化合物可以一种以上的晶形存在。式(I)化合物及其盐(包括溶剂化物和水合物)的多形体(polymorphs)构成本发明的部份，且可通过在不同条件下结晶本发明化合物而制得。例如，针对再结晶使用不同溶剂或不同溶剂的混合物；在不同温度下结晶；各种冷却模式，从结晶期间非常快的到非常慢的冷却。多形体也可通过加热或熔化本发明的化合物，接着逐渐或快速的冷却而获得。多形体的存在可以通过固态探针核磁共振(NMR)光谱法、红外(IR)光谱法、差示扫描量热法、粉末X-射线衍射或此类其他技术来测定。
本发明还包括经同位素标记的化合物，其与式(I)描述的化合物相同，除了一个或多个原子被其原子量或质量数与自然中通常发现的原子量或质量数不同的原子置换。可并入本发明化合物的同位素的例子包括，氢、碳、氮、氧、硫和氟的同位素，分别例如2H、3H、13C、14C、15N、18O、17O、35S、36Cl、125I、129I、和18F。某些经同位素标记的本发明化合物(例如，其中并入放射性同位素例如3H和14C的那些)可用于药物和/或基质组织分布分析。氚(即3H)及碳-14(即14C)同位素是特别优选的，因为它们易于制备和检测。此外，使用较重的同位素(例如氘，即2H)的取代可提供由较大的代谢稳定性所产生的某些治疗优势(例如，增加的体内半衰期或减少的剂量需求)，并且因此，在一些状况中是优选的。经同位素标记的本发明化合物通常可通过用经同位素标记的试剂取代未经同位素标记的试剂来进行流程中和/或下述实施例中所公开的步骤而制得。
本发明化合物可包含手性中心。这些化合物可以以对映异构体的混合物或以纯对映异构体存在。在化合物包括手性中心的情况下，该化合物可通过本领域技术人员已知的方法解析成纯对映异构体，例如通过形成可被分离(例如，通过结晶)的非对映异构体盐；形成可被分离(例如，通过结晶、气液或液相层析)的立体异构体衍生物或配合物；一个对映异构体与对映异构体-特异性试剂的选择性反应，例如酶促酯化作用；或手性环境中的气-液或液相层析，例如在手性支持物例如具有结合的手性配体的硅石上或在手性溶剂存在下。应理解，当通过上述分离步骤之一，将期望的立体异构体转化成另一化学实体时，需要进一步的步骤以释出期望的对映异构体形式。或者，可通过使用光学活性起始原料、通过使用光学活性试剂、底物、催化剂或溶剂的不对称合成法、或通过不对称转变将一种立体异构体转化成另一种立体异构体，而合成特定立体异构体。
本发明化合物可以以可被分离的不同稳定构象形式存在。由于绕不对称单键的受限旋转而导致的扭转不对称，例如因为位阻或环张力，可允许不同构象异构体的分离。本发明化合物进一步包括式(I)的化合物的各种构象异构体及其混合物。
本发明化合物可用于治疗通过抑制乙酰辅酶A羧化酶(特别是ACC1和ACC2)而调节的疾病、病况和/或病症。本发明另一实施方案为一种药物组合物，其包含治疗有效量的本发明化合物及药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。本发明的化合物(包括文中所使用的组合物及方法)还可用于制造用于本文中所述的治疗应用的药物。
典型的制剂通过混合本发明化合物与载体、稀释剂或赋形剂而制得。适当的载体、稀释剂及赋形剂是本领域技术人员众所周知的且包括材料例如，碳水化合物、蜡、水溶性和/或溶胀性聚合物、亲水性或疏水性材料、明胶、油、溶剂、水等等。所使用的特定载体、稀释剂或赋形剂将视欲施用本发明化合物的方式及目的而定。溶剂通常根据本领域技术人员认为对欲施用的哺乳动物是安全的溶剂(GRAS)而予以选择。通常，安全溶剂为无毒水性溶剂(例如水)及其他可溶于水或与水可混溶的无毒溶剂。适当水性溶剂包括水、乙醇、丙二醇、聚乙二醇(例如，PEG400、PEG300)等及其混合物。制剂还可包括一种或多种缓冲剂、稳定剂、表面活性剂、湿润剂、润滑剂、乳化剂、混悬剂、防腐剂、抗氧化剂、不透明剂、助滑剂、加工助剂、着色剂、甜味剂、香料、调味剂及提供药物(即本发明化合物或其药物组合物)精美外观或有助于制造药物产品(即用于制备药物)的其他已知添加剂。
制剂可使用常规溶解和混合步骤制备。例如，在一种或多种上述赋形剂的存在下，将大量药物(即本发明化合物或该化合物的稳定形式(即，与环糊精衍生物或其他已知配合剂的配合物))溶于适当溶剂中。水溶性差的化合物的溶解率可通过使用喷雾干燥分散来提高，例如Takeuchi,H.,等人描述于“Enhancement of the dissolution rateof a poorly water-soluble drug (tolbutamide)by a spray-dryingsolvent deposition method and disintegrants”J.Pharm.Pharmacol.，39，769-773(1987)；和EP0901786B1(US2002/009494)中的那些，上述文献以引用方式并入本文。通常将本发明化合物配制成药物剂型，以提供易于控制的药物剂量并为患者提供精美且易于处理的产品。
药物组合物还可包括本发明化合物的溶剂合物及水合物。术语“溶剂合物”是指，式(I)表示的化合物(包括其药学上可接受的盐)与一个或多个溶剂分子的分子复合物。此类溶剂分子为常用于药物领域的那些，已知其对接受者无害，例如水、乙醇、乙二醇等等。术语“水合物”是指其中溶剂分子为水的复合物。溶剂化物和/或水合物优选地以结晶形式存在。其他溶剂可用作中间溶剂化物用于制备更希望的溶剂化物，例如甲醇、甲基叔丁醚、乙酸乙酯、乙酸甲酯、(S)-丙二醇、(R)-丙二醇、1,4-丁炔二醇等等。
用于施予的药物组合物(或制剂)可视施用药物的方法而以各种方式包装。通常，用于分配的物品包括，药物制剂以适当形式存放于其中的容器。适当的容器是本领域技术人员公知的，且包括例如瓶子(塑料和玻璃)、药囊、安瓿、塑料袋、金属筒等等。容器亦可包括防篡改组件(tamper-proof assemblage)，以防止轻率获取包装内容物。另外，说明容器内容物的标签存放在容器上。标签亦可包括适当警语。
本发明进一步提供一种治疗动物的通过抑制乙酰辅酶A羧化酶而调节的疾病、病况和/或病症的方法，其包括将治疗有效量的本发明化合物或包含有效量的本发明化合物及药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体的药物组合物施用至需要此类治疗的动物。该方法特别地可用于治疗从抑制乙酰辅酶A羧化酶获利的疾病、病况和/或病症。
本发明一方面是，肥胖及肥胖相关病症(例如，过重、体重增加或体重维持)的治疗。
肥胖及过重通常由身体质量指数(BMI)来定义，其与总身体脂肪量有关且估计疾病的相关风险。BMI以体重(千克)除以身高(米)的平方(kg/m2)来计算。过重典型地定义为25-29.9kg/m2的BMI，而肥胖典型地定义为30kg/m2的BMI。参见例如National Heart,Lung,andBlood Institute,Clinical Guidelines on the Identification,Evaluation,and Treatment of Overweight and Obesity in Adults,The Evidence Report,Washington,DC：U.S.Department of Healthand Human Services,NIH publication no.98-4083(1998)。
本发明另一方面是，糖尿病或糖尿病相关病症，包括1型(胰岛素依赖性糖尿病，亦称为“IDDM”)和2型(非胰岛素依赖性糖尿病，亦称为“NIDDM”)糖尿病、葡萄糖耐受受损、胰岛素抗性、高血糖症及糖尿病并发症(例如动脉粥样硬化、冠心病、中风、外周血管病、肾病、高血压、神经病变及视网膜病变)的治疗(例如延迟进展或发作)。
本发明另一方面为，肥胖共病例如代谢综合征的治疗。代谢综合征包括，例如血脂异常、高血压、胰岛素抗性、糖尿病(例如，2型糖尿病)、冠状动脉疾病及心力衰竭的疾病、病况或病症。关于代谢综合征的更详细资料，参见例如Zimmet,P.Z.等人，“The MetabolicSyndrome：Perhaps an Etiologic Mystery but Far From a Myth-WhereDose the International Diabetes Federation Stand?,”Diabetes&Endocrinology,7(2).(2005)；及Alberti,K.G.等人，“TheMetabolic Syndrome-A New Worldwide Definition”,Lancet,366,1059-62(2005)。优选地，相较于不含药物的媒介物对照组，本发明化合物的施用提供，至少一种心血管疾病风险因子的统计学上显著的(p＜0.05)减低，例如降低血浆瘦素、C-反应性蛋白质(CRP)和/或胆固醇。本发明化合物的施用亦可提供，葡萄糖血清水平的统计学上显著的(p＜0.05)减低。
本发明的另一方面为，非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)和肝脏胰岛素抗性的治疗。
对于具有约100千克体重的正常成人，约0.001毫克至约10毫克/千克体重的剂量通常是足够的，优选约0.01毫克/千克至约5.0毫克/千克，更优选约0.01毫克/千克至约1毫克/千克。然而，根据被治疗的个体的年龄与体重、所欲施用的途径、被施用的特定化合物等等，可能需要在一般剂量范围内的一些变动性。对特定患者的剂量范围与最适宜剂量的测定完全在本领域技术人员的能力范围内。还应指出的是，本发明化合物可被用于持续释放、控制释放及延迟释放制剂中，此类形式也是本领域技术人员所熟知的。
本发明化合物也可与其它药剂结合使用，用于治疗本文中所述的疾病、病况和/或病症。因此，也提供治疗方法，其包括施用与其它药剂组合的本发明化合物。可与本发明化合物组合使用的适当药剂包括，抗肥胖剂(包括食欲抑制剂)、抗糖尿病剂、抗高血糖症剂、降脂剂及抗高血压剂。
可与本发明化合物组合的适当降脂剂包括(例如)，WO2011005611的第30页第20行至第31页第30行中所述的那些。此类降脂剂包括胆汁酸螯合剂、HMG-CoA还原酶抑制剂、HMG-辅酶A合酶抑制剂、胆固醇吸收抑制剂、酰基辅酶A-胆固醇酰基转化酶(ACAT)抑制剂、CETP抑制剂、鲨烯合成酶抑制剂、PPARα激动剂、FXR受体调节剂、LXR受体调节剂、脂蛋白合成抑制剂、肾素血管紧张素(angiotensisn)系统抑制剂、PPARδ部分激动剂、胆汁酸再吸收抑制剂、PPARγ激动剂、甘油三酯合成抑制剂、微粒体甘油三酯转运抑制剂、转录调节剂、鲨烯环氧酶抑制剂、低密度脂蛋白受体诱导剂、血小板聚集抑制剂、5-LO或FLAP抑制剂、烟碱酸铬(niacin bound chromium)和其他影响脂质组成的药剂。
可与本发明化合物组合的适当抗高血压剂包括例如，WO2011005611的第31页第31行至第32页第18行中所述的那些。抗高血压剂包括利尿剂、β-肾上腺素阻断剂、钙通道阻断剂、血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂、中性内切肽酶抑制剂、内皮素拮抗剂、血管舒张剂、血管紧张素II受体拮抗剂、α/β肾上腺素阻断剂、α1阻断剂、α2激动剂、醛固酮抑制剂、盐皮质激素受体抑制剂、肾素抑制剂和血管生成素-2-结合剂。
适当的抗糖尿病剂包括乙酰辅酶A羧化酶-(ACC)抑制剂，例如WO2009144554、WO2003072197、WO2009144555及WO2008065508中所述的那些、二酰基甘油O-酰基转移酶1(DGAT-1)抑制剂，例如WO09016462或WO2010086820中所述的那些、AZD7687或LCQ908、二酰基甘油O-酰基转移酶2(DGAT-2)抑制剂、单酰基甘油O-酰基转移酶抑制剂、磷酸二酯酶(PDE)-10抑制剂、AMPK活化剂、磺酰脲(例如，醋酸己脲、氯磺丙脲、特泌胰(diabinese)、格列苯脲(glibenclamide)、格列吡嗪(glipizide)、格列本脲(glyburide)、格列美脲(glimepiride)、格列齐特(gliclazide)、格列戊脲(glipentide)、格列喹酮(gliquidone)、格列索脲(glisolamide)、妥拉磺脲(tolazamide)及甲苯磺丁脲(tolbutamide))、美格列奈(meglitinide)、α-淀粉酶抑制剂(例如，淀粉酶抑肽(tendamistat)、萃他丁(trestatin)及AL-3688)、α-葡萄糖苷水解酶抑制剂(例如，阿卡波糖(acarbose))、α-葡萄糖苷酶抑制剂(例如，脂解素(adiposine)、卡格列波糖(camiglibose)、乙格列酯(emiglitate)、米格列醇(miglitol)、伏格列波糖(voglibose)、普拉米星-Q(pradimicin-Q)、和沙司他丁(salbostatin))、PPARγ激动剂(例如，巴格列酮(balaglitazone)、环格列酮(ciglitazone)、达格列酮(darglitazone)、恩格列酮(englitazone)、伊格列酮(isaglitazone)、吡格列酮(pioglitazone)、罗格列酮(rosiglitazone)和曲格列酮(troglitazone))、PPARα/γ激动剂(例如CLX-0940、GW-1536、GW-1929、GW-2433、KRP-297、L-796449、LR-90、MK-0767及SB-219994)、双胍(例如二甲双胍(metformin))、胰高血糖素样肽1(GLP-1)调节剂例如激动剂(例如，艾生丁(exendin)-3和艾生丁-4)、利拉糖肽(liraglutide)、阿必鲁肽(albiglutide)、艾塞那肽(exenatide)阿必鲁肽(albiglutide)、塔司普鲁肽(taspoglutide)、利西那肽(lixisenatide)、达拉鲁肽(dulaglutide)、司美鲁肽(semaglutide)、NN-9924、TTP-054、蛋白质酪氨酸磷酸酶-1B(PTP-1B)抑制剂(例如曲度奎明(trodusquemine)、西替欧醛(hyrtiosal)萃取物及由Zhang，S.等人，Drug Discovery Today，12(9/10)，373-381(2007)所公开的化合物)、SIRT-1抑制剂(例如白蔾芦醇(resveratrol)、GSK2245840或GSK184072)、二肽基肽酶IV(DPP-IV)抑制剂(例如WO2005116014中的那些、西他列汀(sitagliptin)、维达列汀(vildagliptin)、阿格列汀(alogliptin)、度格列汀(dutogliptin)、利拉利汀(linagliptin)和沙克列汀(saxagliptin))、胰岛素促分泌素、脂肪酸氧化抑制剂、A2拮抗剂、c-jun氨基-端激酶(JNK)抑制剂、葡萄糖激酶活化剂(GKa)(例如WO2010103437、WO2010103438、WO2010013161、WO2007122482中所述的那些)、TTP-399、TTP-355、TTP-547、AZD1656、ARRY403、MK-0599、TAK-329、AZD5658或GKM-001、胰岛素、胰岛素模拟物、糖原磷酸化酶抑制剂(例如GSK1362885)、VPAC2受体激动剂、SGLT2抑制剂，例如E.C.Chao等人，Nature Reviews Drug Discovery9，551-559(2010年7月)中所述的那些，包括多巴弗井(dapagliflozin)、肯那弗井(canagliflozin)、BI-10733、托否弗井(tofogliflozin)(CSG452)、ASP-1941、THR1474、TS-071、ISIS388626及LX4211以及WO2010023594中所述的那些，胰高血糖素受体调节剂例如Demong,D.E.等人Annual Reports在Medicinal Chemistry2008，43，119-137中所述的那些、GPR119调节剂，特别是激动剂，例如WO2010140092、WO2010128425、WO2010128414、WO2010106457、Jones,R.M.等人在Medicinal Chemistry2009，44，149-170中所述的那些(例如，MBX-2982、GSK1292263、APD597及PSN821)、FGF21衍生物或类似物例如Kharitonenkov,A.等人，Current Opinion in InvestigationalDrugs2009，10(4)359-364中所述的那些、TGR5(也称为GPBAR1)受体调节剂，特别是激动剂，例如Zhong,M.,Current Topics inMedicinal Chemistry，2010，10(4)，386-396中所述的那些及INT777，GPR40激动剂，例如Medina,J.C.,Annual Reports in MedicinalChemistry，2008，43，75-85中所述的那些，包括但不限制于TAK-875、GPR120调节剂，特别是激动剂、高亲和性烟碱酸受体(HM74A)活化剂、及SGLT1抑制剂，例如GSK1614235。可与本发明化合物组合的抗糖尿病剂的进一步代表性名单可见于例如WO2011005611的第28页第35行至第30页第19行。优选的抗糖尿病剂为二甲双胍和DPP-IV抑制剂(例如西他列汀、维达列汀、阿格列汀、度格列汀、利拉利汀和沙克列汀)。其他抗糖尿病剂可以包括，肉碱棕榈酰转移酶酶的抑制剂或调节剂、果糖1,6-二磷酸酶的抑制剂、醛醣还原酶的抑制剂、盐皮质激素受体抑制剂、TORC2的抑制剂、CCR2和/或CCR5的抑制剂、PKC异构体(例如PKCα、PKCβ、PKCγ)的抑制剂、脂肪酸合成酶的抑制剂、丝氨酸棕榈酰转移酶的抑制剂；GPR81、GPR39、GPR43、GPR41、GPR105、Kv1.3的调节剂、视黄醇结合蛋白质4、糖皮质激素受体、生长抑素(somatostain)受体(例如SSTR1、SSTR2、SSTR3和SSTR5)、PDHK2或PDHK4的抑制剂或调节剂、MAP4K4的抑制剂、包括IL1β的IL1家族的调节剂、RXRα的调节剂。此外，适当的抗糖尿病剂包括Carpino,P.A.,Goodwin,B.Expert Opin.Ther.Pat，2010，20(12)，1627-51所列的机制。
适当抗肥胖剂(一些抗肥胖剂也可充当抗糖尿病剂)包括11β-羟基类固醇脱氢酶-1(11β-HSD1型)抑制剂、硬脂酰基-辅酶A去饱和酶-1(SCD-1)抑制剂、MCR-4激动剂、胆囊收缩素-A(CCK-A)激动剂、单胺再摄取抑制剂(例如西布曲明(sibutramine))、拟交感剂、β3肾上腺素激动剂、多巴胺激动剂(例如溴隐亭(bromocriptine))、促黑激素类似物、5HT2c激动剂、黑色素浓集激素拮抗剂、瘦素(OB蛋白质)、瘦素类似物、瘦素激动剂、甘丙肽拮抗剂、脂肪酶抑制剂(例如四氢利泼斯汀(tetrahydrolipstatin)，即奥利司他(orlistat))、减食欲剂(例如铃蟾素(bombesin)激动剂)、神经肽-Y拮抗剂(例如NPY Y5拮抗剂例如韦利贝特(velneperit))、PYY3-36(包括其类似物)、BRS3调节剂、阿片样受体亚型的混合拮抗剂、拟甲状腺剂、脱氢表雄酮或其类似物、糖皮质激素激动剂或拮抗剂、食欲素拮抗剂、胰高血糖素样肽-1激动剂、睫状神经营养因子(例如AxokineTM，可得自RegeneronPharmaceuticals,Inc.,Tarrytown,NY和Procter&Gamble Company,Cincinnati,OH)、人类刺鼠相关蛋白质(AGRP)抑制剂、组胺3拮抗剂或逆激动剂、神经介素U激动剂、MTP/ApoB抑制剂(例如肠-选择性MTP抑制剂，例如地洛他派(dirlotapide)、JTT130、优斯他派(Usistapide)、SLx4090)、阿片类拮抗剂、mu阿片类受体调节剂，包括但不限于GSK1521498、MetAp2抑制剂，包括但不限制于ZGN-433、对胰高血糖素、GIP和GLP1受体的2或多个具有混合调节活性的药剂(例如MAR-701或ZP2929)、去甲肾上腺素转运抑制剂、大麻素-1-受体拮抗剂/逆激动剂、胃促生长素激动剂/拮抗剂、胃泌酸调节素(oxyntomodulin)和类似物、单胺吸收抑制剂(例如但不限制于特索芬辛(tesofensine))、食欲素拮抗剂、组合剂(例如安非他酮(bupropion)加唑尼沙胺(zonisamide)、普兰林肽(pramlintide)加美曲普汀(metreleptin)、安非他酮加纳曲酮(naltrexone)、芬特明(phentermine)加托吡酯(topiramate))等等。
用于本发明组合方面的优选抗肥胖剂包括，肠选择性MTP抑制剂(例如地洛他派、米瑞他匹(mitratapide)和英普他派(implitapide)、R56918(CAS号403987)和CAS号913541-47-6)、CCKa激动剂(例如，PCT公开案WO2005/116034或US公开案2005-0267100A1中所述的N-苯甲基-2-[4-(1H-吲哚-3-基甲基)-5-氧-1-苯基-4,5-二氢-2,3,6,10b-四氮杂-苯并[e]薁-6-基]-N-异丙基-乙酰胺)、5HT2c激动剂(例如，洛卡色林(lorcaserin))、MCR4激动剂(例如，US6,818,658中所述的化合物)、脂肪酶抑制剂(例如，西替利司他(Cetilistat))、PYY3-36(如在本文中使用的，“PYY3-36”包括类似物(例如聚乙二醇化的PYY3-36，例如US公开案2006/0178501中所述的那些)、阿片类拮抗剂(例如纳曲酮)、油酰雌酮(oleoy1-estrone)(CAS号180003-17-2)、奥尼匹肽(obinepitide)(TM30338)、普兰林肽、特索芬辛(NS2330)、瘦素、溴隐亭、奥利司他、AOD-9604(CAS号221231-10-3)和西布曲明。优选地，本发明化合物及组合疗法可与运动及合理的饮食联合施用。
所有列举的美国专利和公开案(包括实施例中所引用的所有技术通报)以其全文通过引用合并入本文中。
本文中的下述实施例只用于说明目的。本文中所反映的组合物、方法和各种参数仅意欲例示本发明的各种方面和实施方案，且不意欲以任何方式限制本发明的范围。
下述制备法用于合成下列实施例中所举例说明的化合物。
使用下列商业上可得的起始原料制备下述实施例中所述的化合物：3-碘-1H-吲唑-5-甲酸甲酯(Anichem LLC，North Brunswick，NJ)、(1R,5S)-8-(叔丁氧羰基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-甲酸(AstaTech,Inc.，Bristol，PA)、6-溴异喹啉-3-胺(Ark Pharm,Inc.，Libertyville，IL)、3-羟基-1H-吲唑-5-甲酸(Aces Pharma,Inc.，Branford，CT)、喹啉-7-甲酸乙酯(ASW MedChem,Inc.，New Brunswick，NJ)、7-溴异喹啉-1(2H)-酮(Alfa Aesar，Ward Hill，MA)、3-氧-2,3-二氢-1H-吲唑-6-甲酸(ASW MedChem,Inc.，New Brunswick，NJ)、5-溴-3-(三氟甲基)-1H-吲唑(J&W PharmLab LLC，Levittown，PA)、6-溴异喹啉-1(2H)-酮(Anichem LLC，North Brunswick，NJ)、1H-吡咯并[3,2-b]吡啶-6-甲酸甲酯(ACS Scientific Inc.，Metuchen，NJ)、4-溴-2-氟-N-甲基苯甲酰胺(Oakwood Products,Inc.，WestColumbia，SC)、7-溴-3-氯异喹啉(Allichem LLC,Baltimore，MD)、7-溴异喹啉-3-胺(Allichem LLC，Baltimore，MD)、6-溴异喹啉-3-醇(Ark Pharm,Inc.，Libertyville，IL)、1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-甲酸(ASDI Inc.，Newark，DE)、1-氯异喹啉-7-甲酸(AmericanCustom Chemicals Corp.，San Diego，CA)、3,7-二甲基-1H-吲唑-5-甲酸(Annker Organics Co.Ltd.，Wuhan，China)、7-甲基-1H-吲唑-5-甲酸(J&W PharmLab LLC，Levittown，PA)、2-甲基-2H-吲唑-5-甲酸(Bepharm Ltd.，Shanghai，China)、1H-吡咯并[3,2-b]吡啶-6-甲酸(Sinova Inc.，Bethesda，MD)、7-氯-1H-吲唑-5-甲酸(AnnkerOrganics Co.Ltd.，Wuhan，China)、4-甲氧基-1H-吲唑-6-甲酸(ASWMedChem Inc.，New Brunswick，NJ)、1-甲基-1H-吲唑-5-甲酸(J&WPharmLab LLC，Levittown，PA)、7-乙基-1H-吲唑-5-甲酸(AnnkerOrganics Co，Ltd.，Wuhan，China)、3-乙基-1H-吲唑-5-甲酸(AllichemLLC，Baltimore，MD)、3-甲基-1H-吲唑-5-甲酸(Ark Pharm Inc.，Libertyville，IL)、1H-吡咯并[3,2-b]吡啶-2-甲酸(Aces PharmaInc.，Branford，CT)、喹啉-3-甲酸(Beta Pharma Inc.，Branford，CT)、喹啉-7-甲酸(Ark Pharm Inc.，Libertyville，IL)、异喹啉-6-甲酸(Ark Pharm Inc.，Libertyville，IL)、异喹啉-7-甲酸(indofineChemical Company Inc.，Hillsborough，NJ)、6-甲氧基喹啉-3-甲酸(Princeton Biomolecular Research Inc.，Monmouth Junction，NJ)、4-甲氧基-7-甲基-1H-吲哚-2-甲酸(Aurora Fine Chemicals LLC，San Diego，CA)、2-氨基喹啉-6-甲酸(Princeton BiomolecularResearch Inc.，Monmouth Junction，NJ)、8-甲氧基喹啉-3-甲酸(BioBlocks Inc.，San Diego，CA)、2-氨基喹啉-7-甲酸(PrincetonBiomolecular Research Inc.，Monmouth Junction，NJ)、2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-5-甲酸(Acros Organics，Geel，Belgium)、1H-吲唑-5-甲酸(Sigma Aldrich，St.Louis，MO)、喹啉-6-甲酸(Acros Organics，Geel，Belgium)、6-甲氧基-2-萘甲酸(Sigma Aldrich，St.Louis，MO)、1H-吲唑-6-甲酸(Sigma Aldrich，St.Louis，MO)、1H-苯并[d][1,2,3]三唑-5-甲酸(Sigma Aldrich，St.Louis，MO)、3,4-二氨基-5-氯苯甲酸(Princeton BioMolecular Research，Inc.，Monmouth Junction，NJ)、7-溴-1-氯异喹啉(Alfa Aesar，Ward Hill，MA)、7-溴喹啉(Anichem LLC，North Brunswick，NJ)。
通过先前公开的方法制备下列羧酸(其用于制备下述实施例中所述的化合物)：3,7-二甲基-1H-吲唑-5-甲酸(PCT公开号WO2009144554)、7-甲基-1H-吲唑-5-甲酸(PCT公开号WO2009144554)、7-甲氧基-2-萘甲酸(PCT公开号WO2003018586)、5-甲氧基-2-萘甲酸(PCT公开号WO2003072578)、4,8-二甲氧基喹啉-2-甲酸(PCT公开号WO2007011809)、3-氯-7-甲基-1H-吲唑-5-甲酸(PCT公开号WO2009144554)、3-氯-1H-吲唑-5-甲酸(PCT公开号WO2009144554)、8-甲氧基-2-萘甲酸(PCT公开号WO2003072578)、3-氯-1H-吲哚-5-甲酸(PCT公开号WO2008065508)、3-氯-1H-吲哚-6-甲酸(PCT公开号WO2008065508)、7-甲氧基-3-甲基-1H-吲唑-5-甲酸(WO2009144554)、4,8-二甲氧基喹啉-2-甲酸(PCT公开号WO2007011809)。
实施例
下述化合物和中间体使用Chemdraw Ultra所提供的命名规则(11.0.1版，CambridgeSoft Corp.,Cambridge Massachusetts)命名。Chemdraw Ultra提供的命名规则(11.0.1版)是本领域技术人员公知的且据信，Chemdraw Ultra提供的命名规则(11.0.1版)一般与IUPAC(International Union for Pure and Applied Chemistry)推荐的有机化学命名法和CAS索引规则相称。除非另有说明，否则所有反应试剂是商业购得的。下文中提及的所有参考资料以引用的方式并入本文。
快速层析根据Still等人所述的方法(J.Org.Chem.，1978，43，2923)实施。
本文中论述的所有纯化使用包含KP-SIL硅石(40-63微米，60埃)的SNAP管柱(Biotage AB；Uppsala，Sweden)实施。
本文中论述的所有纯化利用填充硅石管柱，使用Companion系统(Teledyne Isco；Lincoln,Nebraska)实施。
在Waters(Waters Corp.；Milford,MA)Micromass Platform II光谱仪上记录质谱。除非另有说明，否则质谱记录于Waters(Milford，MA)Micromass Platform II光谱仪。
质子NMR化学位移以距四甲基硅烷的低磁场的每百万份的份数给出，且记录于Varian Unity300、400或500MHz(兆赫)光谱仪(VarianInc.；Palo Alto，CA)。NMR化学位移以距四甲基硅烷(用于质子)或氟三氯甲烷(用于氟)的低磁场的每百万份的份数给出。
使用下列方法测量HPLC滞留时间：方法A：管柱：Waters AtlantisdC184.6x50毫米，5微米；流动相A：在水中的0.05%TFA(v/v)；流动相B：在乙腈中的0.05%TFA(v/v)；梯度：在4.0分钟内95%A/5%B线性至5%A/95%B，固定于5%A/95%B至5.0分钟；流速：2.0毫升/分钟。方法B：管柱：Waters XBridge C184.6x50毫米，5微米；流动相A：在水中的0.03%NH4OH(v/v)；流动相B：在乙腈中的0.03%NH4OH(v/v)；梯度：在4.0分钟内95%A/5%B线性至5%A/95%B，固定于5%A/95%B至5.0分钟；流速：2.0毫升/分钟。
下述制备法用于合成下列实施例中所例示的化合物。
中间体及起始原料的制备
羧酸中间体是商业上购得的、如下所述制备的、如PCT公开号WO2009/144554中所述制备的、使用本领域技术人员公知的制法制备的或以与上述用于其他羧酸中间体的路径类似的方式制备的。
中间体1；
1'-叔丁基-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(1'H)-酮盐酸盐
步骤1.5-溴-1-叔丁基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯
将溴化铜(II)(720mg，3.19mmol)及异戊基亚硝酸酯(0.56mL，4.15mmol)加至5-氨基-1-叔丁基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯(674mg，3.19mmol，Li等，J.Heterocycl.Chem,2007，44，749)在乙腈(20mL)中的溶液。将金色悬浮液在45℃下加热2小时，然后冷却至室温，用乙酸乙酯(100mL)稀释并用饱和碳酸氢钠水溶液(50mL)、水(50mL)及盐水(50mL)洗涤。将有机相经过硫酸钠干燥，过滤和在减压下浓缩。通过快速层析法(5-40%乙酸乙酯/庚烷，10g硅凝胶)纯化所产生的残余物以产生685mg的呈透明油质的5-溴-1-叔丁基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯。+APCI(M+H)275.0；1H NMR(400MHz,CDCl3,δ)：7.87(s,1H)，4.32(q,J=7.0Hz,2H)，1.77(s,9H)，1.36(t,J=7.1Hz,3H)。
步骤2：(5-溴-1-叔丁基-1H-吡唑-4-基)甲醇
将5-溴-1-叔丁基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯(685mg，2.49mmol)在THF(20mL)中的溶液冷却至-78℃并用氢化二异丁基铝(7.47mL，7.47mmol，1M THF)逐滴处理。将混合物在-78℃下搅拌30分钟，然后加热至室温经18小时。将混合物用乙酸乙酯(10mL)终止反应并搅拌15分钟。然后将混合物用饱和Rochelle’s盐水溶液(25mL)处理并在室温下搅拌1小时。将混合物用乙酸乙酯稀释(100mL)并用水(100mL)洗涤。将有机层经过硫酸钠干燥，过滤和浓缩。通过快速层析法(10-80%乙酸乙酯/庚烷梯度，25g硅凝胶)纯化残余物以产生460mg的呈透明油质的(5-溴-1-叔丁基-1H-吡唑-4-基)甲醇。+APCI(M+H)233.1,(M+2+H)235.1;1H NMR(400MHz,CDCl3,δ):7.51(s,1H),4.53(d,2H),1.74(s,9H),1.55(t,J=5.8Hz,1H)。
步骤3：5-溴-4-(溴甲基)-1-叔丁基-1H-吡唑
将(5-溴-1-叔丁基-1H-吡唑-4-基)甲醇(460mg，1.97mmol)在二氯甲烷(25mL)中的溶液冷却至0℃及然后用溴化磷(III)(0.37mL，3.46mmol)逐滴处理5分钟。将混合物在0℃下搅拌30分钟，然后在室温下搅拌1小时。将混合物用水(50mL)缓慢终止反应，搅拌30分钟，然后用乙酸乙酯(2×50mL)萃取。将有机相用饱和碳酸氢钠水溶液(50mL)洗涤，经过硫酸钠干燥，过滤和浓缩以产生362mg的呈透明油质的5-溴-4-(溴甲基)-1-叔丁基-1H-吡唑。1H NMR(400MHz,CDCl3,δ):7.54(s,1H),4.39(s,2H),1.74(s,9H)。
步骤4：4-((5-溴-1-叔丁基-1H-吡唑-4-基)甲基)哌啶-1,4-二甲酸1-叔丁酯4-乙酯
将哌啶-1,4-二甲酸1-叔丁酯4-乙酯(0.37mL，1.47mmol)在THF(15mL)中的溶液冷却至-78℃，然后用双(三甲基硅基)氨基锂(1.48mL，1.48mmol，1M甲苯)逐滴处理。将反应在-78℃下搅拌15分钟，加热至0℃经30分钟，然后冷却回至-78℃。添加5-溴-4-(溴甲基)-1-叔丁基-1H-吡唑(335mg，1.13mmol)在THF(10mL)中的溶液，将混合物在-78℃下搅拌1小时，然后在室温下搅拌18小时。将反应用饱和氯化铵水溶液(20mL)终止，在室温下搅拌30分钟，用水(50mL)稀释并用乙酸乙酯(2×50mL)萃取。将有机层合并，经过硫酸钠干燥，过滤和浓缩。通过快速层析法(5-40%乙酸乙酯/庚烷，25g硅凝胶)纯化所产生的残余物，以产生256mg的呈透明油质的4-((5-溴-1-叔丁基-1H-吡唑-4-基)甲基)哌啶-1,4-二甲酸1-叔丁酯4-乙酯。+ESI(M+H)474.2,(M+2+H)476.2;1H NMR(400MHz,CDCl3,δ):7.20(s,1H),4.16(q,J=7.2Hz,2H),3.93(br.s.,2H),2.84(m,2H),2.66(s,2H),2.10(d,J=12.5Hz,2H),1.72(s,9H),1.45(m,11H),1.25(t,J=7.1Hz,3H)。
步骤5：4-((5-溴-1-叔丁基-1H-吡唑-4-基)甲基)-1-(叔丁氧羰基)哌啶-4-甲酸
将2.5M NaOH水溶液(5mL)加至4-((5-溴-1-叔丁基-1H-吡唑-4-基)甲基)哌啶-1,4-二甲酸1-叔丁酯4-乙酯(256mg，0.54mmol)在甲醇(15mL)中的溶液，并将所产生的混合物在回流下加热18小时。将混合物冷却至室温并在减压下除去甲醇。将所产生的浆料溶解在25mL水中，用1N HCl水溶液酸化，然后用乙酸乙酯(2×50mL)萃取。将合并的有机物经过硫酸钠干燥，过滤和浓缩以产生241mg的呈无色固体的4-((5-溴-1-叔丁基-1H-吡唑-4-基)甲基)-1-(叔丁氧羰基)哌啶-4-甲酸。+APCI(M+H)444.2,(M+2+H)446.2;1H NMR(400MHz,CDCl3,δ):7.35(s,1H),3.95(br.s.,2H),2.92(br.s.,2H),2.71(s,2H),2.08(d,J=12.9Hz,2H),1.73(s,9H),1.50(m,11H)。
步骤6：4-((5-溴-1-叔丁基-1H-吡唑-4-基)甲基)-4-异氰酸基哌啶-1-甲酸叔丁酯
将三乙胺(91μL，0.65mmol)及叠氮磷酸二苯酯(0.14mL，0.65mmol)加至4-((5-溴-1-叔丁基-1H-吡唑-4-基)甲基)-1-(叔丁氧羰基)哌啶-4-甲酸(241mg，0.54mmol)在甲苯(10mL)中的溶液。将混合物在120℃下加热3小时，将反应冷却并在减压下除去挥发物。通过快速层析法(25g硅石，7-60%乙酸乙酯/庚烷梯度)纯化所产生的油以产生225mg的呈透明油质的4-((5-溴-1-叔丁基-1H-吡唑-4-基)甲基)-4-异氰酸基哌啶-1-甲酸叔丁酯。+APCI(M+H)385.1;1H NMR(400MHz,CDCl3,δ):7.40(s,1H),4.03(br.s.,2H),2.97(br.t,J=12.3,12.3Hz,2H),2.70(s,2H),1.74(s,9H),1.67(m,2H),1.62(m,2H),1.46(s,9H)。
步骤7：1'-叔丁基-7'-氧-1',4',6',7'-四氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-1-甲酸叔丁酯
将4-((5-溴-1-叔丁基-1H-吡唑-4-基)甲基)-4-异氰酸基哌啶-1-甲酸叔丁酯(225mg，0.51mmol)在THF(10mL)中的溶液冷却至-78℃并经2分钟逐滴添加叔丁基锂(0.6mL，在戊烷中的1.7M)。将混合物在-78℃下搅拌30分钟，加热至0℃，然后用饱和NH4Cl水溶液(20mL)终止反应。将混合物在室温下搅拌30分钟，用水(25mL)稀释、然后用乙酸乙酯(2×50mL)萃取。将合并的有机物经过硫酸钠干燥，过滤和浓缩。通过快速层析法(12-100%乙酸乙酯/庚烷，10g硅凝胶)纯化残余物以产生137mg的呈无色固体的1'-叔丁基-7'-氧-1',4',6',7'-四氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-1-甲酸叔丁酯。+ESI(M-tBu)307.2;1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δ):7.74(s,1H),7.30(s,1H),3.51(m,2H),3.20(m,2H),2.79(s,2H),1.64(s,9H),1.56(t,J=5.8Hz,4H),1.38(s,9H)。
步骤8；1'-叔丁基-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(1'H)-酮盐酸盐
将在二恶烷中的4N HCl(2mL)加至1'-叔丁基-7'-氧-1',4',6',7'-四氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-1-甲酸叔丁酯(137mg，0.39mmol)在乙酸乙酯(4mL)中的溶液。在室温下搅拌1小时之后，在减压下除去挥发物，从庚烷(10mL)磨碎所产生的无色固体以产生112mg的呈无色固体的标题化合物。+APCI(M+H)263.3;1HNMR(400MHz,DMSO-d6,δ):8.84(m,2H),8.00(s,1H),7.29(s,1H),3.13(d,J=6.1Hz,2H),3.03(br.s.,2H),2.78(s,2H),1.76(m,4H),1.60(s,9H)。
中间体2：如下制备1'-异丙基-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(1'H)-酮。
步骤1：5-氨基-1-异丙基-1H-吡唑-4-甲酸酯
将2-氰基-3-乙氧基丙烯酸乙酯(84.4g，0.50mol)、异丙肼盐酸盐(55.2g，0.50mol)及碳酸钾(68.8g，0.50mol)在90%乙醇/甲醇(1.5升)中的混合物在回流下加热16小时。然后在真空中除去溶剂并添加水及乙酸乙酯。将混合物分离且将有机层经过硫酸镁干燥，过滤及在真空中除去溶剂以产生5-氨基-1-异丙基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯(92.4g，94%)。+ESI(M+H)198.1;1H NMR(400MHz,CDCl3,δ):7.63(s,1H),4.97(br.s.,2H),4.28(q,2H),4.18(m,1H),1.45(d,6H),1.31(t,3H)。
步骤2：5-氨基-1-异丙基-1H-吡唑-4-甲酸酯
在氩气下于室温将溴化铜(II)(182.6g，0.82mol)加至5-氨基-1-异丙基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯(107.5g，0.55mol)在乙腈(1L)中的混合物。将混合物加热至50℃及逐滴添加亚硝酸异戊酯(109.8mL，0.82mol)(观察到放热且温度升高到65℃)。将反应在50℃下搅拌2小时，然后将混合物冷却至室温并倒进2M HCl中，搅拌15分钟，然后用乙酸乙酯萃取二次。将有机层合并，用盐水及然后饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，经过硫酸镁干燥，过滤及在真空中除去溶剂以产生5-溴-1-异丙基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯(163g，定量的)，其用于下个步骤中而没有进一步纯化。1H NMR(400MHz,CDCl3,δ)：7.97(s,1H)，4.77(m,1H)，4.28(q,2H)，1.35(t,3H)，0.90(d,6H)。
步骤3：(5-溴-1-异丙基-1H-吡唑-4-基)甲醇
在氩气下于0℃将硼烷-DMS(140mL，1.50mol)加至5-溴-1-异丙基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯(163g，0.50mol)在2-甲基四氢呋喃(400mL)中的溶液(加入50mL后泡腾停止)。将混合物在室温下搅拌30分钟，然后加热至70℃经2小时，然后回流17小时。添加额外部分的硼烷DMS(40mL)且将混合物在回流下搅拌另3小时。将混合物冷却至室温，然后逐渐加到冰冷甲醇(500mL)并搅拌，经30分钟期间。将混合物在室温下搅拌30分钟，然后添加2M氢氧化钠水溶液(1.5L)。分离层并用乙酸乙酯(2×500mL)萃取水层。将有机层合并，用盐水(500mL)洗涤，经过硫酸镁干燥，过滤及在真空中除去溶剂。通过干式快速层析法(在庚烷中的0-50%乙酸乙酯)纯化粗制产物以产生(5-溴-1-异丙基-1H-吡唑-4-基)甲醇(70.8g，65%，经历二个步骤)。+ESI(M+H)220.9;1H NMR(400MHz,CDCl3,δ):7.52(s,1H),4.67(m,1H),4.47(s,2H),2.59(br.s.,1H),1.41(s,6H)。
步骤4：5-溴-4-(溴甲基)-1-异丙基-1H-吡唑
在0℃下将PBr3(6.5mL，68.5mmol)加至(5-溴-1-异丙基-1H-吡唑-4-基)甲醇(10.0g，45.7mmol)在二氯甲烷(200mL)中的搅拌溶液。添加完成之后，使混合物加热至室温并搅拌3小时。将混合物倒进冰冷却的水(300mL)、振动、分离，且然后用冰冷却水(2×100mL)及然后盐水(100mL)洗涤二次，用硫酸钠干燥，过滤及在真空中除去溶剂以产生5-溴-4-(溴甲基)-1-异丙基-1H-吡唑(12.2g，95%)。1H NMR(300MHz,CDCl3,δ)：7.58(s,1H)，4.64(m,1H)，4.35(s,2H)，1.43(d,6H)。
步骤5：4-((5-溴-1-异丙基-1H-吡唑-4-基)甲基)哌啶-1,4-二甲酸1-叔丁酯4-乙酯
在氩气下于-78℃将在四氢呋喃中的1M LiHMDS(57mL，56.3mmol)逐滴加至哌啶-1,4-二甲酸1-叔丁酯4-乙酯(14.5g，56.3mmol)在2-甲基四氢呋喃(120mL)中的搅拌溶液。20分钟之后，添加在2-甲基四氢呋喃(10mL)中的5-溴-4-(溴甲基)-1-异丙基-1H-吡唑(12.2g，43.3mmol)。使混合物加热至室温并搅拌18小时。用水(200mL)稀释混合物且分离混合物。将有机相用10%柠檬酸溶液(2×100mL)、然后盐水(100mL)洗涤、经过硫酸钠干燥，过滤及在真空中除去溶剂。通过快速管柱层析(在庚烷中的10-30%乙酸乙酯)纯化粗制产物以产生4-((5-溴-1-异丙基-1H-吡唑-4-基)甲基)哌啶-1,4-二甲酸1-叔丁酯4-乙酯(9.3g)。也从管柱分离的是7.1g起始酯与所要产物的混合级分。其与1当量的氢氧化钠在90%乙醇/甲醇中于室温下一起搅拌2小时。在真空中除去溶剂及添加乙酸乙酯(100mL)。将混合物用2N氢氧化钠(2×50mL)及然后盐水(100mL)洗涤、经过硫酸钠干燥，过滤及在真空中除去溶剂以产生4-((5-溴-1-异丙基-1H-吡唑-4-基)甲基)哌啶-1,4-二甲酸1-叔丁酯4-乙酯的第二收获物(5.1g)。合并产率为14.4g(72%)。+ESI(M+H)404.0;1H NMR(400MHz,CDCl3,δ):4.62(m,1H),4.12(q,2H),3.90(br.s.,2H),2.82(m,2H),2.63(s,2H),2.08(d,2H),1.66(m,2H),1.42(s,9H),1.21(t,3H)。
步骤6：4-((5-溴-1-异丙基-1H-吡唑-4-基)甲基)-1-(叔丁氧羰基)哌啶-4-甲酸
将氢氧化锂(1.52g，36.2mmol)加至4-((5-溴-1-异丙基-1H-吡唑-4-基)甲基)哌啶-1,4-二甲酸1-叔丁酯4-乙酯(14.5g，31.6mmol)在甲醇(50mL)中的溶液且将混合物在80℃下搅拌18小时。添加另一部分的氢氧化锂(2.55g，63.3mmol)且将混合物在剧烈回流下加热3小时，冷却至室温，在真空中除去溶剂。将残余物用乙酸乙酯洗涤，过滤，及保存滤液。将固体溶解在2N氢氧化钠水溶液(40mL)中，然后用10%柠檬酸溶液酸化至pH5。将水溶液用乙酸乙酯(3×40mL)萃取，将有机层合并，经过硫酸镁干燥，过滤且然后与原滤液组合。在减压下从滤液除去溶剂及通过快速管柱层析(乙酸乙酯/庚烷)纯化所产生的残余物以提供呈无色固体的4-((5-溴-1-异丙基-1H-吡唑-4-基)甲基)-1-(叔丁氧羰基)哌啶-4-甲酸(10.1g，74%)。+ESI(M+H)429.9;1H NMR(300MHz,CDCl3,δ):7.41(s,1H),4.64(m,1H),3.94(m,2H),2.95(m,2H),2.68(m,2H),2.09(m,2H),1.47(m,17H)。
步骤7：4-((5-溴-1-异丙基-1H-吡唑-4-基)甲基)-4-异氰酸基哌啶-1-甲酸叔丁酯
将4-((5-溴-1-异丙基-1H-吡唑-4-基)甲基)-1-(叔丁氧羰基)哌啶-4-甲酸(2.54g，5.9mmol)、叠氮磷酸二苯酯(1.79g，6.5mmol)及三乙胺(0.91mL，6.5mmol)在甲苯(15mL)中的混合物在回流下加热3小时。然后将混合物冷却至室温及在真空中除去溶剂。通过管柱层析纯化粗制产物以产生4-((5-溴-1-异丙基-1H-吡唑-4-基)甲基)-4-异氰酸基哌啶-1-甲酸叔丁酯(2.8g，100%)。1H NMR(300MHz,CDCl3,δ)：7.47(s,1H)，4.68(m,1H)，3.99(m,2H)，2.95(m,2H)，2.67(s,2H)，1.62(m,4H)，1.45(m,15H)。
步骤8：1'-异丙基-7'-氧-1',4',6',7'-四氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-1-甲酸叔丁酯
在氩气下于-78℃将叔丁基锂(在己烷中的1.7M，4.3mL，7.2mmol)加至4-((5-溴-1-异丙基-1H-吡唑-4-基)甲基)-4-异氰酸基哌啶-1-甲酸叔丁酯(1.4g，3.3mmol)在2-甲基四氢呋喃(10mL)中的混合物。添加完成之后，使混合物加热至室温并搅拌18小时。将混合物用水(10mL)终止反应，然后用乙酸乙酯(20mL)稀释。分离层且将有机层用盐水(10mL)洗涤，经过硫酸钠干燥，过滤及在真空中除去溶剂。通过快速管柱层析纯化粗制产物以产生1'-异丙基-7'-氧-1',4',6',7'-四氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-1-甲酸叔丁酯(0.77g，67%)。+ESI(M+H)374.1;1H NMR(300MHz,CDCl3,δ):7.34(s,1H),6.35(s,1H),5.45(m,1H),3.57(m,2H),3.42(m,2H),2.79(s,2H),1.70(m,4H),1.45(m,15H)。
步骤9：1'-异丙基-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(1'H)-酮
将在二恶烷中的4N HCl(2mL)加至1'-异丙基-7'-氧-1',4',6',7'-四氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-1-甲酸叔丁酯(100mg，0.29mmol)在4mL乙酸乙酯中的溶液。在室温下搅拌30分钟之后，添加甲醇(1mL)且将所产生的溶液在室温下搅拌5小时。在减压下除去挥发物，所产生的无色固体与1：1乙腈/二氯甲烷一起研磨以产生71mg的呈无色固体的标题化合物。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δ):8.72(br.s.,2H),8.05(s,1H),7.37(s,1H),5.36(m,1H),3.15(m,2H),3.05(m,2H),2.78(s,2H),1.78(m,4H),1.33(d,J=6.6Hz,6H)。
中间体3：如下制备2'-异丙基-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(2'H)-酮盐酸盐。
步骤1：3-碘-1-异丙基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯
将碳酸铯(3.87g，11.9mmol)及2-碘丙烷(0.89mL，8.90mmol)加至3-碘吡唑-4-甲酸乙酯(1.58g，5.94mmol，Truong；等人Bioorg.Med Chem.Lett，19，4920(2009))在20mL N,N-二甲基甲酰胺中的溶液。将混合物在60℃下搅拌2小时，然后冷却至周围温度。将反应混合物用150mL水稀释并用2×100mL二乙基醚萃取。将合并的有机物用50mL盐水洗涤，经过硫酸钠干燥，过滤和浓缩。通过快速层析法(7-60%乙酸乙酯/庚烷梯度，50g硅石)纯化所产生的油以产生340mg的呈透明油质的5-碘-1-异丙基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯(其在静置时结晶)及740mg的呈透明油质的3-碘-1-异丙基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯。5-碘-1-异丙基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯：+APCI(M+H)309.0;1H NMR(400MHz,CDCl3,δ):8.05(s,1H)4.82(spt,J=6.6Hz,1H)4.33(q,J=7.2Hz,2H)1.50(d,J=6.6Hz,6H)1.37(t,J=7.1Hz,3H)。3-碘-1-异丙基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯：+APCI(M+H)309.0;1H NMR(400MHz,CDCl3,δ):7.84(s,1H)4.52(spt,J=6.7Hz,1H)4.32(q,J=7.1Hz,2H)1.52(d,J=6.6Hz,6H)1.37(t,J=7.1Hz,3H)。
步骤2：(3-碘-1-异丙基-1H-吡唑-4-基)甲醇
将3-碘-1-异丙基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯(740mg，2.40mmol)在四氢呋喃(20mL)中的溶液冷却至-78℃并用氢化二异丁基铝(在甲苯中的1.5M，0.8mL，7.21mmol)逐滴处理。将混合物在-78℃下搅拌1小时，然后加热至室温经2小时。用10mL乙酸乙酯将混合物终止反应，搅拌15分钟，及然后用25mL Rochelle's盐饱和水溶液处理。在室温下搅拌另外1小时之后，将混合物用50mL乙酸乙酯稀释并用100mL水洗涤。用另外50mL乙酸乙酯萃取水层。将合并的有机层经过硫酸钠干燥，过滤和浓缩。然后通过快速层析法(12-100%乙酸乙酯/庚烷，25g硅凝胶)纯化残余物以产生630mg的呈透明油质的(3-碘-1-异丙基-1H-吡唑-4-基)甲醇。+APCI(M+H)266.8;1H NMR(400MHz,CDCl3,δ):7.37(s,1H),4.49(m,3H),1.67(t,J=5.9Hz,1H),1.50(s,6H)。
步骤3：4-(溴甲基)-3-碘-1-异丙基-1H-吡唑
将(3-碘-1-异丙基-1H-吡唑-4-基)甲醇(0.63g，2.37mmol)在20mL二氯甲烷中的溶液冷却至0℃。将溴化磷(III)(0.67mL，7.10mmol)加至该溶液且将混合物在0℃下搅拌30分钟，在室温下搅拌1小时，及然后用50mL水终止反应并在室温下搅拌15分钟。将混合物用饱和碳酸氢钠水溶液处理并用乙酸乙酯(2×50mL)萃取。将合并的有机层用盐水(50mL)洗涤，经过硫酸钠干燥，过滤和浓缩。通过快速层析法(10-80%乙酸乙酯/庚烷，25g硅凝胶)纯化残余物以产生400mg的呈无色固体的4-(溴甲基)-3-碘-1-异丙基-1H-吡唑。+APCI(M+H)329.0;1H NMR(400MHz,CDCl3,δ):7.42(s,1H),4.47(spt,J=6.7Hz,1H),4.35(s,2H),1.50(d,J=6.6Hz,6H)。
步骤4：4-((3-碘-1-异丙基-1H-吡唑-4-基)甲基)哌啶-1,4-二甲酸1-叔丁酯4-乙酯
在干燥100mL圆底烧瓶中在氮气下将哌啶-1,4-二甲酸1-叔丁酯4-乙酯(0.54mL，2.11mmol)在四氢呋喃(15mL)中的溶液冷却至-78℃，然后用双(三甲基硅基)氨基锂(1M甲苯，2.13mL，2.13mmol)处理。在-78℃下搅拌45分钟之后，添加呈在10mL四氢呋喃中的悬浮液的4-(溴甲基)-3-碘-1-异丙基-1H-吡唑(535mg，1.63mmol)。将混合物在-78℃下搅拌1小时，然后在室温下搅拌18小时。将反应混合物用20mL饱和氯化铵水溶液终止反应，在室温下搅拌30分钟，用50mL水稀释，然后用乙酸乙酯(2×50mL)萃取。将合并的有机物经过硫酸钠干燥，过滤和浓缩。通过快速层析法(10-80%乙酸乙酯/庚烷，25g硅凝胶)纯化残余物以产生呈透明油质的4-((3-碘-1-异丙基-1H-吡唑-4-基)甲基)哌啶-1,4-二甲酸1-叔丁酯4-乙酯(645mg)。+ESI(M-tBu)450.1;1H NMR(400MHz,CDCl3,δ):7.02(s,3H),4.44(spt,J=6.6Hz,1H),4.17(m,2H),3.92(m,2H),2.86(m,2H),2.62(s,2H),2.08(m,2H),1.46(m,17H),1.25(t,J=7.1Hz,3H)。
步骤5：1-(叔丁氧羰基)-4-((3-碘-1-异丙基-1H-吡唑-4-基)甲基)哌啶-4-甲酸
将2N NaOH(5mL)加至4-((3-碘-1-异丙基-1H-吡唑-4-基)甲基)哌啶-1,4-二甲酸1-叔丁酯4-乙酯(455mg，0.9mmol)在甲醇(20mL)中的溶液。在室温下搅拌18小时之后，在减压下除去甲醇及将所产生的浆料溶解在20mL水中，用2N HCl酸化并用乙酸乙酯(2×30mL)萃取。将合并的有机物经过硫酸钠干燥，过滤和浓缩以产生呈无色固体的1-(叔丁氧羰基)-4-((3-碘-1-异丙基-1H-吡唑-4-基)甲基)哌啶-4-甲酸(430mg)。-APCI(M-H)476.1;1H NMR(400MHz,CDCl3,δ):7.11(s,1H),4.45(dquin,J=13.4,6.7Hz,1H),3.95(br.s.,2H),2.91(m,2H),2.69(s,2H),2.08(m,2H),1.47(m,8H)。
步骤6：4-((3-碘-1-异丙基-1H-吡唑-4-基)甲基)-4-异氰酸基哌啶-1-甲酸叔丁酯
将三乙胺(0.15mL，1.08mmol)及叠氮磷酸二苯酯(0.24mL，1.08mmol)加至1-(叔丁氧羰基)-4-((3-碘-1-异丙基-1H-吡唑-4-基)甲基)哌啶-4-甲酸(430mg，0.90mmol)在甲苯(10mL)中的溶液。将混合物在120℃下加热3小时，在减压下除去挥发物及通过快速层析法(7-60%乙酸乙酯/庚烷，25g硅凝胶)纯化所产生的油以产生呈透明油质的4-((3-碘-1-异丙基-1H-吡唑-4-基)甲基)-4-异氰酸基哌啶-1-甲酸叔丁酯(280mg)。FT-IR(cm-1):2253;1H NMR(400MHz,CDCl3,δ):7.27(s,1H),4.50(m,1H),4.03(br.s.,2H),2.97(br.s.,2H),2.65(s,2H),1.65(m,4H),1.50(s,6H),1.47(s,9H)。
步骤7：2'-异丙基-7'-氧-2',4',6',7'-四氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-1-甲酸叔丁酯
将叔丁基锂(0.7mL，在戊烷中的1.7M)逐滴加至4-((3-碘-1-异丙基-1H-吡唑-4-基)甲基)-4-异氰酸基哌啶-1-甲酸叔丁酯(280mg，0.59mmol)在四氢呋喃(10mL)中的-78℃溶液，在-78℃下搅拌30分钟之后，将混合物加热至0℃，用20mL饱和氯化铵水溶液终止反应，并在室温下搅拌另外30分钟。将反应混合物用25mL水稀释并用乙酸乙酯(2×50mL)萃取。将合并的有机物经过硫酸钠干燥，过滤和浓缩。然后通过快速层析法(12-100%乙酸乙酯/庚烷，10g硅凝胶)纯化残余物以产生呈无色固体的2'-异丙基-7'-氧-2',4',6',7'-四氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-1-甲酸叔丁酯(130mg)。+ESI(M+H)349.1;1H NMR(500MHz,CDCl3,δ):7.28(s,1H),5.78(s,1H),4.57(spt,J=6.6Hz,1H),3.59(m,2H),3.37(m,2H),2.82(s,2H),1.74(m,4H),1.55(d,J=6.6Hz,6H),1.47(s,9H)。
步骤8：2'-异丙基-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(2'H)-酮盐酸盐
将在1,4-二恶烷中的4M盐酸(2mL)加至2'-异丙基-7'-氧-2',4',6',7'-四氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-1-甲酸叔丁酯(130mg，0.37mmol)在乙酸乙酯(5mL)中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌3小时，在减压下除去挥发物，将所产生的残余物与10mL庚烷一起研磨。在减压下干燥固体以产生呈灰白色固体的2'-异丙基-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(2'H)-酮盐酸盐(105mg)。+ESI(M+H)249.1;1H NMR(500MHz,DMSO-d6,δ):7.91(s,1H)7.69(s,1H)4.48-4.62(m,1H)3.02-3.28(m,4H)2.78(s,2H)1.74-1.89(m,4H)1.41(d,J=6.59Hz,6H)。
中间体4：如下制备2'-叔丁基-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(2'H)-酮盐酸盐。
步骤1；
2-(2-叔丁基亚肼基)丙酸(E)-乙酯
将叔丁肼盐酸盐(21.7g，174mmol)及N,N-二异丙基乙胺(33.4mL，192mmol)加至丙酮酸乙酯(20.22g，174.1mmol)在乙醇(150mL)中的溶液。在回流下搅拌18小时之后，将反应冷却并在减压下除去挥发物。将所产生的金色油质溶解在300mL乙酸乙酯中并用200mL水及300mL饱和碳酸氢钠水溶液洗涤。将有机层经过硫酸钠干燥，过滤和浓缩以产生呈透明淡黄色油质的2-(2-叔丁基亚肼基)丙酸(E)-乙酯(23.1g)。+APCI(M+H)187.3;1H NMR(400MHz,CDCl3,δ):5.51(br.s.,1H),4.25(q,J=7.2Hz,2H),1.89(s,3H),1.32(t,J=7.1Hz,3H),1.28(s,9H)。
步骤2：1-叔丁基-4-甲酰基-1H-吡唑-3-甲酸乙酯
将(氯亚甲基)二甲基氯化铵(Vilsmeier盐，34.0g，252mmol)以单一部分加至2-(2-叔丁基亚肼基)丙酸(E)-乙酯(22.9g，123mmol)在甲苯(300mL)中的黄橙色溶液。将悬浮液在室温下搅拌3小时，慢慢地变成甲苯在浓橙色油质上的二相混合物。将反应混合物冷却至0℃并用饱和碳酸氢钠水溶液慢慢地中和。分离层并用另外的乙酸乙酯(2×200mL)萃取水层。将有机层合并，用200mL盐水洗涤，经过硫酸钠干燥，过滤和浓缩以产生呈棕橙色油的1-叔丁基-4-甲酰基-1H-吡唑-3-甲酸乙酯(18.6g)，其在静置时固化。+APCI(M+H)225.1;1HNMR(400MHz,CDCl3,δ):10.37(s,1H),8.14(s,1H),4.48(q,J=7.0Hz,2H),1.65(s,9H),1.44(t,3H)。
步骤3：1-叔丁基-4-(羟甲基)-1H-吡唑-3-甲酸乙酯
将硼氢化钠(0.97g，25.6mmol)以单个部分加至1-叔丁基-4-甲酰基-1H-吡唑-3-甲酸乙酯(2.87g，12.8mmol)在乙醇(50mL)中的溶液。在室温下搅拌30分钟之后，将混合物用1N盐酸水溶液(100mL)终止反应，搅拌15分钟，然后用饱和碳酸氢钠水溶液中和。将混合物用乙酸乙酯(2×150mL)萃取，然后将合并的有机物经过硫酸钠干燥，过滤和浓缩以产生呈透明油质的1-叔丁基-4-(羟甲基)-1H-吡唑-3-甲酸乙酯(2.57g)。+APCI(M+Na)249.2;1H NMR(400MHz,CDCl3,δ):7.49(s,1H),4.65(d,J=6.8Hz,2H),4.43(q,J=7.2Hz,2H),3.62(t,J=6.9Hz,1H),1.59(s,9H),1.41(t,J=7.1Hz,3H)。
步骤4：4-(溴甲基)-1-叔丁基-1H-吡唑-3-甲酸乙酯
将三溴化磷(4.91mL，51.7mmol)加至1-叔丁基-4-(羟甲基)-1H-吡唑-3-甲酸乙酯(3.9g，17.24mmol)在二氯甲烷(120mL)中的0℃溶液，及将所产生的混合物在0℃下搅拌30分钟，然后在室温下搅拌1小时。将混合物用50mL水终止反应，用饱和碳酸氢钠水溶液中和，搅拌30分钟，及然后用二氯甲烷(2×150mL)萃取。将合并的有机物用100mL盐水洗涤，经过硫酸钠干燥，过滤和浓缩。通过快速层析法(7-60%乙酸乙酯/庚烷，50g硅凝胶)纯化所产生的残余物，以产生呈透明油质的4-(溴甲基)-1-叔丁基-1H-吡唑-3-甲酸乙酯(4.12g)。+APCI(M+H)289.1;1H NMR(400MHz,CDCl3,δ):7.61(s,1H),4.70(s,2H),4.41(q,J=7.2Hz,2H),1.60(s,9H),1.40(t,3H)。
步骤5：4-((1-叔丁基-3-(乙氧羰基)-1H-吡唑-4-基)甲基)-4-氰基哌啶-1-甲酸叔丁酯
将双(三甲基硅基)氨基锂(4.76mL，在四氢呋喃中的1M)加至4-氰基哌啶-1-甲酸酯哌啶叔丁酯(1.0g，4.76mmol)在四氢呋喃(20mL)的-78℃溶液。将混合物在-78℃下搅拌30分钟，加热至0℃经30分钟，然后冷却至-78℃。然后逐滴添加4-(溴甲基)-1-叔丁基-1H-吡唑-3-甲酸乙酯(1.38g，4.76mmol)在四氢呋喃中的溶液。在-78℃下搅拌30分钟之后，使混合物加热至室温并搅拌另外18小时。用饱和氯化铵水溶液(50mL)终止反应混合物，搅拌30分钟，用水(50mL)稀释及然后用乙酸乙酯(2×50mL)萃取。将有机层合并，经过硫酸钠干燥，过滤和浓缩。通过快速层析法(7-60%乙酸乙酯/庚烷，100g硅凝胶)纯化残余物以产生呈透明油质的4-((1-叔丁基-3-(乙氧羰基)-1H-吡唑-4-基)甲基)-4-氰基哌啶-1-甲酸叔丁酯(455mg)。+APCI(M+H)419.3;1H NMR(500MHz,CDCl3,δ):7.68(s,1H),4.40(q,J=7.2Hz,2H),4.13(br.s.,2H),3.17(s,2H),2.97(br.s.,2H),1.81(d,J=13.2Hz,2H),1.63(s,9H),1.56(m,2H),1.46(s,9H),1.41(t,J=7.2Hz,3H)。
步骤6：4-((1-(叔丁氧羰基)-4-氨甲酰基哌啶-4-基)甲基)-1-叔丁基-1H-吡唑-3-甲酸
将尿素-过氧化氢(1.05g，10.9mmol)在1M氢氧化钠水溶液(10.9mL)中的溶液逐滴加至4-((1-叔丁基-3-(乙氧羰基)-1H-吡唑-4-基)甲基)-4-氰基哌啶-1-甲酸叔丁酯(455mg，1.09mmol在甲醇(11mL)中)的0℃溶液。在室温下搅拌18小时之后，在减压下除去挥发物，将所产生的浆料溶解在水(50mL)中、用2N盐酸水溶液酸化并用乙酸乙酯(2×50mL)萃取。将合并的有机物经过硫酸钠干燥，过滤和浓缩以产生呈无色固体的4-((1-(叔丁氧羰基)-4-氨甲酰基哌啶-4-基)甲基)-1-叔丁基-1H-吡唑-3-甲酸(418mg)。-APCI(M-H)407.3;1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δ):12.33(br.s.,1H),7.47(s,1H),7.11(br.s.,1H),6.99(s,1H),3.59(d,J=13.3Hz,2H),2.89(s,2H),2.77(m,2H),1.84(m,2H),1.44(s,9H),1.31(s,9H),1.16(m,2H)。
步骤7：4-((1-(叔丁氧羰基)-4-异氰酸基哌啶-4-基)甲基)-1-叔丁基-1H-吡唑-3-甲酸
将碳酸氢钠(319mg，3.80mmol)及双(三氟乙酰氧基)碘氧苯(632mg，1.42mmol)加至4-((1-(叔丁氧羰基)-4-氨甲酰基哌啶-4-基)甲基)-1-叔丁基-1H-吡唑-3-甲酸(388mg，0.95mmol)在乙腈(20mL)中的悬浮液。将混合物在室温下搅拌90分钟，用50mL水稀释，用1N盐酸水溶液酸化，然后用乙酸乙酯(2×50mL)萃取。将合并的有机物经过硫酸钠干燥，过滤和浓缩。通过快速层析法(1-10%甲醇/二氯甲烷，25g硅凝胶)纯化所产生的残余物以产生呈无色固体的4-((1-(叔丁氧羰基)-4-异氰酸基哌啶-4-基)甲基)-1-叔丁基-1H-吡唑-3-甲酸(172mg)。-APCI(M-H)405.4;1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δ):12.52(br.s.,1H),7.82(s,1H),3.83(br.s.,2H),3.03(s,2H),2.82(br.s.,2H),1.49(m,13H),1.36(m,9H)。
步骤8：2'-叔丁基-7'-氧-2',4',6',7'-四氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-1-甲酸叔丁酯
将4-((1-(叔丁氧羰基)-4-异氰酸基哌啶-4-基)甲基)-1-叔丁基-1H-吡唑-3-甲酸(180mg，0.44mmol)在四氢呋喃(5mL)中的溶液用2N氢氧化钠水溶液(0.664mL，1.33mmol)处理。将混合物在室温下搅拌3小时，在旋转蒸发器上除去四氢呋喃和水并将所产生的无色固体成浆于乙腈(10mL)中，然后浓缩至干。从乙腈(10mL)的研磨重复另外二次。将所产生的无色固体溶解在二氯甲烷(10mL)中并用(3-(二甲氨基)丙基)乙基碳二亚胺盐酸盐(170mg，0.89mmol)处理。将混合物在室温下搅拌18小时，然后用二氯甲烷(50mL)稀释并用水(30mL)洗涤。将有机相经硫酸钠干燥，过滤和浓缩。然后通过快速层析法(30-100%乙酸乙酯/庚烷，10g硅凝胶)纯化残余物以产生呈无色固体的2'-叔丁基-7'-氧-2',4',6',7'-四氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-1-甲酸叔丁酯(70mg)。+ESI(M+H)363.3;1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δ):7.68(s,1H),7.57(s,1H),3.47(m,2H),3.20(m,2H),2.73(s,2H),1.53(t,J=5.7Hz,4H),1.49(s,9H),1.36(s,9H)。
步骤9：标题化合物，2'-叔丁基-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(2'H)-酮盐酸盐
将在1,4-二恶烷中的4M盐酸(2mL)加至2'-叔丁基-7'-氧-2',4',6',7'-四氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-1-甲酸叔丁酯(70mg，0.19mmol)在乙酸乙酯(5mL)中的溶液且将混合物在室温下搅拌3小时。在减压下除去挥发物，从庚烷(10mL)磨碎所产生的无色固体并在减压下干燥以产生呈灰白色固体的2'-叔丁基-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(2'H)-酮盐酸盐(56mg)。+ESI(M+H)263.1;1H NMR(500MHz,DMSO-d6,δ):8.72(m,2H),7.92(s,1H),7.75(s,1H),3.20(br.s,2H),3.09(br.s.,2H),2.78(s,2H),1.79(m,4H),1.48(s,9H)。
中间体5：如下制备2'-叔戊基-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(2'H)-酮：
步骤1：3-溴-1H-吡唑-4-甲酸乙酯
将亚硝酸异戊酯(12mL，86mmol)缓慢加至3-氨基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯(5.0g，32mmol)和溴化铜(II)(7.2g，32mmol)在乙腈(65mL)中的0℃溶液。将反应加热至50℃并搅拌过夜。将反应冷却至室温并用1N盐酸水溶液(150mL)终止反应。用乙酸乙酯(3×100mL)萃取混合物。将合并的有机物用水洗涤，经过硫酸钠干燥，过滤，和浓缩以产生呈棕色油质的标题化合物，其在真空下过夜部分固化(7.1g，100%)。1H NMR(400MHz,CDCl3,δ)：9.78(br.s.,1H)，8.10(br.s.,1H)，4.33(q,J=7.22Hz,2H)，1.36(m,3H)。
步骤2：(3-溴-1-叔戊基-1H-吡唑-4-基)甲醇
将浓硫酸(0.45mL，4.8mmol)加至3-溴-1H-吡唑-4-甲酸乙酯(1.0g，4.6mmol)及叔戊醇(3.0mL，27mmol)的混合物。将反应加热至100℃经2.5小时。然后将反应冷却至室温并搅拌过夜。将反应用乙酸乙酯稀释并用水洗涤。将有机层经过硫酸钠干燥，过滤，和浓缩以产生呈粗制棕色油的3-溴-1-叔戊基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯(1.3g)。
将此粗制产物(1.3g)溶解在四氢呋喃(24mL)中并冷却至-78℃。缓慢添加氢化二异丁基铝的溶液(在甲苯中的1.5M，9.0mL，160mmol)，且将反应在-78℃下搅拌1小时。然后使反应加热至室温并搅拌另外2小时。用乙酸乙酯(20mL)及Rochelle’s盐饱和水溶液(20mL)稀释反应。将混合物在室温下搅拌过夜。分离层并用乙酸乙酯萃取水层。将合并的有机物用盐水洗涤，经过硫酸钠干燥，过滤，和浓缩。通过快速管柱层析(0-100%乙酸乙酯/庚烷)的纯化产生呈淡黄色油质的标题化合物(685mg，62%)。1H NMR(400MHz,CDCl3,δ)：7.45(s,1H)，4.51(s,2H)，1.86(q,J=7.41Hz,2H)，1.66(s,1H)，1.51(s,6H)，0.69(m,3H)。
步骤3：3-溴-4-(氯甲基)-1-叔戊基-1H-吡唑
将(3-溴-1-叔戊基-1H-吡唑-4-基)甲醇(675mg，2.73mmol)在二氯甲烷(10mL)中的溶液冷却至0℃。添加三乙胺(0.53mL，3.8mmol)及甲磺酰氯(0.28mL，3.6mmol)。将反应在0℃下搅拌15分钟，然后加热至室温并搅拌1.5小时。将反应用乙酸乙酯稀释，用水及盐水洗涤，经过硫酸钠干燥，过滤，和浓缩以产生呈透明油质的标题化合物(725mg，100%)。1H NMR(400MHz,CDCl3,δ)：7.48(s,1H)，4.47(s,2H)，1.86(q,J=7.48Hz,2H)，1.52(s,6H)，0.69(m,3H)。
步骤4：3-溴-4-(碘甲基)-1-叔戊基-1H-吡唑
将碘化钠(4.09g，27.3mmol)加至3-溴-4-(氯甲基)-1-叔戊基-1H-吡唑(725mg，2.73mmol)在丙酮(25mL)中的溶液。将反应在回流下加热2小时，然后冷却至室温并搅拌过夜。在真空中除去溶剂并将残余物分溶在乙酸乙酯及水之间。将有机层用饱和硫代硫酸钠水溶液及盐水洗涤。将有机物经过硫酸钠干燥，过滤，和浓缩以产生呈棕色油质的标题化合物(824mg，85%)。1H NMR(400MHz,CDCl3,δ)：7.47(s,1H)，4.26(s,2H)，1.83(q,J=7.41Hz,2H)，1.50(s,6H)，0.67(t,J=7.51Hz,3H)。
步骤5：2'-叔戊基-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(2'H)-酮
标题化合物通过与中间体3步骤4-8中所述的方法类似的方法，使用3-溴-4-(碘甲基)-1-叔戊基-1H-吡唑而制备。+ESI(M+H)277.3;1H NMR(400MHz,CD3OD,δ):7.67(s,1H),3.22-3.37(m,4H),2.93(s,2H),1.92(q,J=7.61Hz,2H),1.88-2.05(m,4H),1.57(s,6H),0.67(t,J=7.41Hz,3H)。
中间体6：如下制备2'-环丁基-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(2'H)-酮：
步骤1：3-溴-1-环丁基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯
将3-溴-1H-吡唑-4-甲酸乙酯(1.00g，4.56mmol)、溴环丁烷(0.65mL，6.9mmol)和碳酸铯(2.97g，9.13mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(10mL)中的混合物加热至60℃并搅拌过夜。将反应冷却至室温并分溶在1：1庚烷/乙酸乙酯及水之间。再次用1：1庚烷/乙酸乙酯萃取水层。将合并的有机物用盐水洗涤，经过硫酸钠干燥，过滤，和浓缩。通过快速管柱层析的纯化产生呈无色油质的二种区域异构体(regioisomer)产物。
5-溴-1-环丁基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯(230mg，18%)：+ESI(M+H+1)275.1;1H NMR(400MHz,CDCl3,δ):7.98(s,1H),4.98(m,1H),4.30(q,J=7.02Hz,2H),2.61-2.74(m,2H),2.43(m,2H),1.84-1.95(m,2H),1.34(m,3H)。
3-溴-1-环丁基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯(570mg，46%)：+ESI(M+H+1)275.1;1H NMR(400MHz,CDCl3,δ):7.87(s,1H),4.69(m,1H),4.29(q,J=7.22Hz,2H),2.41-2.61(m,4H),1.78-1.98(m,2H),1.34(m,3H)。
步骤2：(3-溴-1-环丁基-1H-吡唑-4-基)甲醇
将3-溴-1-环丁基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯(565mg，2.07mmol)在四氢呋喃(10mL)中的溶液冷却至-78℃。缓慢添加氢化二异丁基铝(4.13mL，6.02mmol，在甲苯中的1.5M)并将反应在-78℃下搅拌1小时。然后使反应加热至室温并搅拌另外2小时。用乙酸乙酯(20mL)及Rochelle's盐饱和水溶液(20mL)稀释反应。将混合物在室温下搅拌过夜。将混合物进一步用乙酸乙酯稀释且用水洗涤。用乙酸乙酯萃取水层且将合并的有机物经过硫酸钠干燥，过滤，和浓缩以产生呈无色油质的标题化合物(478mg，100%)。+APCI(M+H+1)233.1;1H NMR(400MHz,CDCl3,δ):7.40(s,1H),4.62-4.71(m,1H),4.51(s,2H),2.39-2.59(m,4H),1.74-1.92(m,3H)。
步骤3：2'-环丁基-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(2'H)-酮
标题化合物通过与中间体5步骤3-5中所述的方法类似的方法，使用(3-溴-1-环丁基-1H-吡唑-4-基)甲醇制备。+ESI(M+H)261.3;1HNMR(400MHz,CD3OD,δ):7.62(s,1H),4.84-4.92(m,1H),3.21-3.36(m,4H),2.93(s,2H),2.50-2.63(m,2H),2.40-2.50(m,2H),1.82-2.05(m,6H)。
中间体7：如下制备下示2'-叔丁基-4',6'-二氢-8-氮杂螺[双[3.2.1]辛烷-3,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(2'H)-酮盐酸盐：
步骤1：3-碘-1H-吡唑-4-甲酸乙酯
将3-氨基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯(860.0mg，5.54mmol)溶解在乙酸(5mL)及水(5mL)中。添加碘化钾(921mg，5.54mmol)并搅拌混合物直到所有固体溶解。然后逐滴添加亚硝酸钠(386mg，5.54mmol)在水(2mL)中的溶液。当搅拌由于沉淀的形成而受阻时，将反应在室温下搅拌2分钟。添加另外的水(5mL)并使反应搅拌过夜。在减压下除去乙酸。将棕色残余物溶解在饱和碳酸氢钠水溶液中并用乙酸乙酯(2×50mL)萃取。将合并的有机物用饱和硫代硫酸钠水溶液(50mL)洗涤、经过硫酸钠干燥，过滤，和浓缩。通过快速管柱层析(10-80%乙酸乙酯/庚烷)的纯化产生呈白色固体的标题化合物(863mg，59%)。+APCI(M+H)267.2;1H NMR(400MHz,CDCl3,δ):12.63(br.s.,1H),8.13(s,1H),4.34(q,J=7.0Hz,2H),1.38(t,J=7.2Hz,3H)。
步骤2：1-叔丁基-3-碘-1H-吡唑-4-甲酸乙酯
将硫酸(0.40mL，4.18mmol，18M)加至3-碘-1H-吡唑-4-甲酸乙酯(1.10g，3.91mmol)在叔丁醇(5mL)的溶液中。将反应加热至100℃并搅拌3小时。将反应冷却至室温并用乙酸乙酯(100mL)及水(25mL)稀释，用饱和碳酸氢钠水溶液将pH调整至8，分离层且将有机物经过硫酸钠干燥，过滤，和浓缩。通过快速管柱层析(7-60%乙酸乙酯/庚烷)的纯化产生2种区域异构体产物。
1-叔丁基-5-碘-1H-吡唑-4-甲酸乙酯：1H NMR(400MHz,CDCl3,δ)：7.91(s,1H)，4.32(q,J=7.2Hz,2H)，1.83(s,9H)，1.37(t,J=7.1Hz,3H)。
呈透明油质的1-叔丁基-3-碘-1H-吡唑-4-甲酸乙酯(976mg，73%)：+APCI(M+H)323.3;1H NMR(400MHz,CDCl3,δ):7.90(s,1H),4.31(q,J=7.0Hz,2H),1.59(s,9H),1.36(t,J=7.1Hz,3H)。
步骤3：1-叔丁基-3-碘-4-(碘甲基)-1H-吡唑
标题化合物通过与中间体5步骤2-4中所述的方法类似的方法，使用1-叔丁基-3-碘-1H-吡唑-4-甲酸乙酯制备。1H NMR(400MHz,CDCl3,δ)：7.49(s,1H)，4.25(s,2H)，1.56(s,9H)。
步骤4：8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3,8-二甲酸(1R,5S)-8-叔丁酯3-甲酯
将碳酸钾(541mg，3.92mmol)及碘甲烷(0.18mL，2.94mmol)加至(1R,5S)-8-(叔丁氧羰基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-甲酸(500mg，1.96mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(5mL)中的溶液。将反应在室温下搅拌18小时。将反应用乙酸乙酯(50mL)及庚烷(50mL)稀释、及然后用水(100mL)及盐水(50mL)洗涤。将有机物经过硫酸钠干燥，过滤，和浓缩。通过快速管柱层析的纯化产生呈透明油质的标题化合物(486mg，92%)。1H NMR(400MHz,CDCl3,δ):4.17-4.29(m,2H),3.65(s,3H),2.75-2.86(m,1H),1.93-2.01(m,2H),1.79-1.92(m,2H),1.67-1.76(m,2H),1.58-1.66(m,2H),1.45(s,9H)。
步骤5：2'-叔丁基-4',6'-二氢-8-氮杂螺[双环[3.2.1]辛烷-3,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(2'H)-酮盐酸盐
标题化合物通过与中间体3步骤4-8中所述的方法类似的方法，使用8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3,8-二甲酸(1R,5S)-8-叔丁酯3-甲酯及1-叔丁基-3-碘-4-(碘甲基)-1H-吡唑制备。+ESI(M+H)289.2;1HNMR(400MHz,CD3OD,δ):7.69(s,1H),4.03-4.10(m,2H),2.74(s,2H),2.39-2.46(m,2H),2.10-2.25(m,6H),1.59(s,9H)。
中间体8：如下制备下示1H-吡唑并[4,3-b]吡啶-6-甲酸：
步骤1：2-(5-溴-3-硝基吡啶-2-基)丙二酸二乙酯
在0℃下将丙二酸二乙酯(19.26mL，127mmol)加至氢化钠(5.08g，127mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(75mL)中的悬浮液。然后将溶液在周围温度下搅拌30分钟，并逐滴添加5-溴-2-氯-3-硝基吡啶(30g，127mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(75mL)中的溶液。将深棕色混合物在100℃下搅拌2小时，然后冷却至周围温度，并在0℃下用氯化铵的饱和溶液(500mL)终止反应。将混合物用乙酸乙酯(3×500mL)萃取，且将合并的有机物经过硫酸镁干燥及过滤。在真空中除去溶剂以产生深棕色油，其通过快速管柱层析(10%乙酸乙酯/己烷)纯化以提供呈棕色固体的2-(5-溴-3-硝基吡啶-2-基)丙二酸二乙酯(31.8g，69%)。1HNMR(400MHz,CDCl3,δ)：8.86(s,1H)，8.61(s,1H)，5.44(s,1H)，4.29(q,4H)，1.27(t,6H)。
步骤2：5-溴-2-甲基-3-硝基吡啶
将2-(5-溴-3-硝基吡啶-2-基)丙二酸二乙酯(31.8g，88mmol)在盐酸水溶液(6M，1.4L中)的混合物在回流下搅拌18小时。将反应混合物冷却至周围温度并在0℃下非常慢地加至碳酸氢钠水溶液的饱和水溶液(4L)。然后将混合物用二氯甲烷(7升)萃取，经过硫酸镁干燥及在真空中除去溶剂以产生呈橙色油的5-溴-2-甲基-3-硝基吡啶(13.8g，72%)，其在静置时固化。1HNMR(300MHz,CDCl3,δ)：8.78(s,1H)，8.43(s,1H)，2.79(s,3H)。
步骤3：5-溴-2-甲基吡啶-3-胺
在40℃下将铁粉(20g)(分批而避免倾倒)接着浓缩盐酸水溶液(5mL)加至5-溴-2-甲基-3-硝基吡啶(13.8g，63.9mmol)在工业甲醇酒精(330mL)中的溶液。将深棕色混合物在回流下剧烈搅拌2小时，然后冷却及经过过滤(其用1L工业甲醇酒精洗涤)。然后在真空中除去溶剂，将残余物溶解在乙酸乙酯(200mL)中并用碳酸氢钠的饱和水溶液(200mL)洗涤，经过硫酸镁干燥及在真空中除去溶剂以产生呈橙色固体的5-溴-2-甲基吡啶-3-胺(10.7g，90%)。1HNMR(400MHz,CDCl3，δ)：7.91(s,1H)，7.00(s,1H)，3.75(br.s.,2H)，2.25(s,3H)。
步骤4：N-(5-溴-2-甲基吡啶-3-基)乙酰胺
在0℃下将乙酐(12mL，126.5mmol)接着三乙胺(22mL，158mmol)加至5-溴-2-甲基吡啶-3-胺(10.7g，57.5mmol)在二氯甲烷(575mL)中的溶液。使混合物加热至周围温度并搅拌18小时，此时添加另一当量的乙酐(6mL，63mmol)。将混合物在周围温度下搅拌另外72小时。用碳酸氢钠(500mL)的饱和水溶液终止反应混合物，将有机相用饱和氯化钠水溶液(500mL)洗涤，经过硫酸镁干燥并在真空中浓缩以产生棕色固体。此固体与在己烷中的30%乙酸乙酯一起研磨以产生呈灰白色固体的N-(5-溴-2-甲基吡啶-3-基)乙酰胺(8.28g，63%)。1HNMR(400MHz,CD3OD,δ)：8.31(s,1H)，8.18(s,1H)，2.43(s,3H)，2.18(s,3H)。
步骤5：6-溴-1H-吡唑并[4,3-b]吡啶
将乙酸钾(4.32g，43.6mmol)、乙酸(2.5mL，43.6mmol)及接着乙酐(6.86mL，72.6mmol)在周围温度下加至N-(5-溴-2-甲基吡啶-3-基)乙酰胺(8.28g，36mmol)在氯仿(550mL)中的溶液。在加热至40℃之前将混合物在周围温度下搅拌15分钟。然后逐滴添加异戊基亚硝酸酯。然后将反应在60℃下搅拌48小时。将反应混合物在0℃下慢慢地倒进碳酸氢钠的饱和溶液(500mL)。保留有机相且用二氯甲烷(500mL)萃取水层。然后将合并的有机物浓缩至棕色油，将其溶解在甲醇(500mL)中。在0℃下添加氢氧化钠水溶液(2M，500mL)，且在真空中除去甲醇之前将混合物在周围温度下搅拌1小时。然后用乙酸乙酯萃取水性混合物(3×500mL)。将合并的有机物经过硫酸镁干燥，过滤，及在真空中除去溶剂以产生呈浅棕色固体的6-溴-1H-吡唑并[4,3-b]吡啶(5.5g，77%)。1HNMR(400MHz,CD3OD,δ)：8.55(s,1H)，8.24(s,1H)，8.21(s,1H)。
步骤6：1H-吡唑并[4,3-b]吡啶-6-甲酸甲酯
将三乙胺(22mL，156mmol)、2,2'-双(二苯膦基)-1,1'-联萘(1.98g，3.07mmol)及二氯化钯(1.23g，6.98mmol)加至6-溴-1H-吡唑并[4,3-b]吡啶(5.5g，27.9mmol)在甲醇(125mL)及乙腈(75mL)中的溶液。将混合物放在20巴的一氧化碳下，加热至100℃，并剧烈搅拌18小时。将反应混合物冷却至周围温度，且在真空中除去溶剂之前经过过滤以产生棕色油。然后通过快速管柱层析(50%乙酸乙酯/己烷)纯化此粗制油以产生呈淡黄色固体的1H-吡唑并[4,3-b]吡啶-6-甲酸甲酯(4.52g，92%)。1HNMR(400MHz,CDCl3,δ)：10.56(s,1H)，9.23(s,1H)，8.35(s,1H)，8.40(s,1H)，4.01(s,3H)。
步骤7：1H-吡唑并[4,3-b]吡啶-6-甲酸
在0℃下将氢氧化钠水溶液(2M，64mL，128mmol)逐滴加至1H-吡唑并[4,3-b]吡啶-6-甲酸甲酯(3.52g，20mmol)在甲醇(250mL)及水(190mL)中的溶液。然后使悬浮液加热至周围温度并搅拌18小时。然后在真空中除去甲醇并用乙酸乙酯(250mL)萃取水性混合物。用2N盐酸水溶液(70mL)酸化水层(至pH5-6)。然后过滤沉淀出来的乳状固体并在干燥器中干燥以产生标题化合物(0.675g，21%)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6,δ)：8.97(s,1H)，8.45(s,1H)，8.39(s,1H)。
中间体9：如下制备下示3-氨甲酰基-1H-吲唑-5-甲酸：
步骤1：3-氰基-1H-吲唑-5-甲酸甲酯
将3-碘-1H-吲唑-5-甲酸甲酯(30.7g，102mmol)、氰化锌(20.3g，173mmol)、锌粉(4.05g，61.9mmol)、[1,1'双(二苯膦基)二茂铁]-二氯化钯(II)(与二氯甲烷的配合物)(12g，15mmol)和碘化铜(I)(19.7g，103mmol)合并于1升圆底烧瓶中。添加N,N-二甲基乙酰胺(500mL)并用氮冲洗反应混合物10分钟。将反应加热至120℃经1小时。将反应冷却至室温并用乙酸乙酯(1升)稀释并搅拌20分钟。将反应混合物通过硅藻土塞过滤，用500mL乙酸乙酯冲洗。将滤液加至饱和氯化铵及浓氢氧化铵的溶液(2L)(通过将氢氧化铵加至氯化铵的饱和水溶液直到pH=8而制得)且将二相溶液剧烈搅拌1小时。所产生的乳液经过小硅藻土垫过滤。分离层及将水层用乙酸乙酯(1100mL)萃取另外二次，每次所产生的乳液经过硅藻土过滤。将合并的有机层用水(2×900mL)及盐水(900mL)洗涤、经过硫酸钠干燥，过滤和浓缩。将甲醇(100mL)加至粗制产物且将混合物搅拌20分钟。过滤出所产生的沉淀物并用甲醇(10mL)洗涤。浓缩滤液以产生呈固体的标题化合物(13.2g，65%)。-ESI(M-H)200.0;1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δ):8.43-8.45(m,1H),8.05(dd,J=8.8,1.6Hz,1H),7.85(dd,J=8.9,0.9Hz,1H),3.88(s,3H)。
步骤2：3-氨甲酰基-1H-吲唑-5-甲酸
将3-氰基-1H-吲唑-5-甲酸甲酯(50.0g，249mmol)在甲醇中(1L)的悬浮液冷却至10℃。逐滴添加过氧化氢脲(241g，2.49mol)在氢氧化钠(1L,2.5N)及水(100mL)中的溶液，保持内部温度低于25℃。当添加完成后，移除冰浴并使反应在室温下搅拌16小时。通过HPLC观察到小量的未反应的起始原料。将反应冷却至15℃及分批添加额外的过氧化氢脲(50g)。注意到剧烈起泡。将反应搅拌另外2小时。将粗制反应过滤以除去存在的固体并浓缩滤液以除去甲醇。在冰浴中冷却残留溶液且逐滴添加6N盐酸(420mL)以调整pH至4。将溶液搅拌20分钟并通过过滤收集所产生的棕褐色固体，干燥以产生57.2g的粗制产物。将乙腈(700mL)及二氯甲烷(700mL)加至粗制产物且将混合物在室温下搅拌1小时。通过过滤收集固体，用1：1乙腈：二氯甲烷(400mL)洗涤，干燥以产生呈棕褐色固体的标题化合物(39.5g，77%)。+ESI(M+H)206.1;1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δ):13.81(s,1H),12.85(br.s.,1H),8.82(d,J=0.8Hz,1H),7.93(dd,J=8.8,1.6Hz,1H),7.79-7.85(m,1H),7.64(d,J=8.6Hz,1H),7.44(s,1H)。
中间体10：如下制备下示3-氰基-1H-吲唑-5-甲酸：
将3-氰基-1H-吲唑-5-甲酸甲酯(500mg，2.5mmol)溶解在甲醇(12mL)中，添加2N氢氧化锂水溶液(3.7mL，7mmol)。将反应在室温下搅拌过夜。浓缩反应混合物以除去甲醇并用1N盐酸水溶液将残余物酸化至pH=4。通过过滤收集所产生的黄色沉淀物，用水洗涤，及在真空烘箱中干燥以提供标题化合物(445mg，96%)。-ESI(M-H)186.4;1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δ):13.17(br.s.,1H),8.42(s,1H),8.05(dd,J=8.8,1.6Hz,1H),7.83(d,1H)。
中间体11：如下制备下示3-氰基-1H-吲唑-6-甲酸：
步骤1：1H-吲唑-6-甲酸甲酯
将碳酸钠(2.06g，19.4mmol)、接着碘甲烷(2.75g，1.21mL，19.4mmol)逐滴加至1H-吲唑-6-甲酸(3.00g，18.5mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(46mL)中的溶液。将混合物在室温下搅拌过夜。将混合物倒进半饱和碳酸氢钠中并用乙酸乙酯萃取三次。将合并的有机层用盐水洗涤，经过硫酸钠干燥，过滤和在真空中浓缩以提供棕色油。通过快速管柱层析(12-100%乙酸乙酯/庚烷)纯化此残余物以提供呈黄色固体的1H-吲唑-6-甲酸甲酯(2.95g，90%)。1H NMR(400MHz,CDCl3,δ):10.40(br.s.,1H),8.26(s,1H),8.13(s,1H),7.84(d,J=8.4Hz,1H),7.79(d,J=8.4Hz,1H),3.96(s,3H)。
步骤2：3-碘-1H-吲唑-6-甲酸甲酯
将氢氧化钾(840mg，3.05mmol)接着碘(1.54g，5.9mmol)加至1H-吲唑-6-甲酸甲酯(865mg，4.91mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(12mL)中的溶液。将混合物在室温下搅拌3小时。添加硫酸氢钠(30mL的5%水溶液)且将混合物用乙酸乙酯萃取二次。将合并的有机层用盐水洗涤，经过硫酸钠干燥，过滤和在真空中浓缩。经由快速管柱层析(5-65%乙酸乙酯/庚烷)纯化残余物以提供呈无色固体的3-碘-1H-吲唑-6-甲酸甲酯(1.16g，78%)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δ):13.84(s,1H),8.13(s,1H),7.72(d,J=8.4Hz,1H),7.54(d,J=8.6Hz,1H),3.87(s,3H)。
步骤3：3-氰基-1H-吲唑-6-甲酸甲酯
用氮气将3-碘-1H-吲唑-6-甲酸甲酯(3.0g，9.9mmol)、锌粉(400mg，6.11mmol)、氰化锌(2.0g，17.0mmol)、[1,1'-双(二苯膦基)二茂铁]-二氯化钯(II)(与二氯甲烷的配合物)(1.15g，1.41mmol)和碘化铜(I)(1.90g，9.97mmol)在二甲基乙酰胺(55mL)中的混合物冲洗15分钟。将混合物在120℃下搅拌15小时。将反应混合物冷却，用乙酸乙酯(250mL)稀释、及经过硅藻土过滤，用乙酸乙酯(100mL)冲洗。将约400mL的氯化铵的饱和水溶液和浓氢氧化铵的溶液(通过将氢氧化铵加至氯化铵的饱和水溶液直到pH=8而制得)加至滤液。将混合物搅拌1小时。然后分离层。将有机层用水及盐水洗涤，经过硫酸钠干燥，过滤和在真空中浓缩。将甲醇(40mL)加至残余物且将混合物搅拌过夜。将混合物过滤，在真空中干燥固体以产生呈棕褐色固体的3-氰基-1H-吲唑-6-甲酸甲酯(1.47g，73%)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δ):13.40(br.s.,1H),8.25(s,1H),7.94(d,J=8.6Hz,1H),7.83(d,J=8.4Hz,1H),3.88(s,3H)。
步骤4：3-氰基-1H-吲唑-6-甲酸
将2N氢氧化锂水溶液(16mL，32mmol)加至3-氰基-1H-吲唑-6-甲酸甲酯(1.47g，7.31mmol)在甲醇(36mL)及四氢呋喃(20mL)中的溶液。将反应加热至50℃经72小时。将反应冷却至室温和浓缩。用水稀释残余物并用1N盐酸水溶液将pH调整至4。过滤出所产生的沉淀物，用水冲洗，及在真空下干燥以提供呈棕褐色固体的标题化合物(500mg，37%)。+ESI(M+H)188.2。
中间体12：如下制备下示1-甲氧基异喹啉-7-甲酸：
步骤1：7-溴-1-甲氧基异喹啉
将7-溴-1-氯异喹啉(570mg，2.4mmol)与甲醇(10mL)及甲醇钠(在甲醇中，25wt%，1.5mL，24mmol)合并在微波小瓶中。将小瓶密封及在微波炉中加热至130℃经3小时。浓缩反应。将粗制残余物溶解在乙酸乙酯中并用水及饱和碳酸氢钠水溶液洗涤。用热乙酸乙酯将水层萃取二次。将合并的有机物经过硫酸钠干燥，过滤，和浓缩以产生标题化合物(520mg，93%)。+ESI(M+H+1)240.0;1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δ):8.25-8.28(m,1H),8.04(d,J=5.9Hz,1H),7.86-7.89(m,2H),7.40(dd,J=6.0,0.9Hz,1H),4.03(s,3H)。
步骤2：1-甲氧基异喹啉-7-甲酸甲酯
将乙酸钠(517mg，6.30mmol)及[1,1'-双(二苯膦基)二茂铁]-二氯化钯(II)(与二氯甲烷的配合物)(257mg，0.315mmol)加至7-溴-1-甲氧基异喹啉(520mg，2.2mmol)在甲醇(30mL)中的溶液。将混合物抽真空并用氮气回填三次。然后将反应容器加压至25psi一氧化碳。将反应加热至70℃并搅拌20小时。将反应过滤，用甲醇冲洗。浓缩滤液。将所产生的残余物溶解在二氯甲烷中，过滤其余固体。浓缩滤液，通过快速管柱层析(0-100%乙酸乙酯/庚烷)纯化以产生呈白色固体的标题化合物(443mg，93%)。+ESI(M+H)218.1;1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δ):8.77(d,J=0.8Hz,1H),8.20(dd,J=8.6,1.8Hz,1H),8.13(d,J=5.9Hz,1H),8.00(d,J=8.6Hz,1H),7.46(d,J=5.9Hz,1H),4.08(s,3H),3.90(s,3H)。
步骤3：1-甲氧基异喹啉-7-甲酸
将2N氢氧化锂水溶液(20mL)加至1-甲氧基异喹啉-7-甲酸甲酯(443mg，2.04mmol)在甲醇(10mL)中的溶液。将反应在室温下搅拌24小时。用1N盐酸水溶液及乙酸乙酯稀释反应混合物。分离层并用乙酸乙酯将水层萃取二次以上。将合并的有机物用盐水洗涤，经过硫酸钠干燥，过滤，和浓缩以提供呈固体的标题化合物(414mg，100%)。+ESI(M+H)204.1;1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δ):13.24(s,1H),8.76(d,J=0.8Hz,1H),8.18(dd,J=8.6,1.8Hz,1H),8.11(d,J=5.9Hz,1H),7.97(d,J=8.4Hz,1H),7.45(d,J=5.9Hz,1H),4.07(s,3H)。
中间体13：如下制备下示3-氨基异喹啉-6-甲酸：
标题化合物通过与中间体12步骤2-3中所述的方法类似的方法，使用6-溴异喹啉-3-胺制备。+ESI(M+H)189.0;1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δ):13.15(br.s.,1H),8.94(s,1H),8.20(s,1H),7.91(m,1H),7.62-7.59(m,1H),6.78(s,1H),6.14(s,2H)。
中间体14：如下制备下示3-氨基-1H-吲唑-5-甲酸：
将肼水合物(0.89mL，17.8mmol)加至3-氰基-4-氟苯甲酸(980.0mg，5.94mmol)在乙醇(6mL)中的溶液。将反应在回流下加热3小时。将反应冷却至室温并在减压下除去乙醇。将所产生的黄色油溶解在水(50mL)中并用1N氢氧化钠水溶液(5mL)碱化。用乙酸乙酯(25mL)将溶液洗涤一次。用6N盐酸水溶液将水层酸化至pH=3并在室温下搅拌1小时。通过过滤收集所产生的沉淀物，在真空下干燥以产生呈粉红色固体的标题化合物(612mg，48%)。+ESI(M+H)178.1;1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δ):8.42-8.47(m,1H),7.76(dd,J=8.8,1.6Hz,1H),7.21(d,J=8.8Hz,1H)。
中间体15：如下制备下示3-氨基-1H-吲唑-6-甲酸：
将肼单水合物(0.5mL，10mmol)加至4-氰基-3-氟苯甲酸(500mg，3.0mmol)在正丁醇(9mL)中的溶液。将反应加热至110℃过夜。将反应冷却至室温，通过过滤收集沉淀物。然后将固体溶解在1N氢氧化钠水溶液(2mL)中并用乙酸乙酯萃取(2x)。用1N盐酸水溶液将水层酸化至pH=4。通过过滤收集所产生的沉淀物，在真空下干燥以提供呈红色固体的标题化合物(140mg，26%)。+ESI(M+H)178.2;1H NMR(400MHz,CD3OD,δ):7.99-8.01(m,1H),7.73(dd,J=8.4,0.8Hz,1H),7.61(dd,J=8.5,1.3Hz,1H)。
中间体16：如下制备下示2-甲基-3-氧-2,3-二氢-1H-吲唑-5-甲酸
步骤1：3-羟基-1H-吲唑-5-甲酸甲酯
将3-羟基-1H-吲唑-5-甲酸(1.5g，8.4mmol)悬浮在甲醇(17mL)中。添加浓盐酸(3.11mL，101mmol)且将反应加热至100℃经6小时。浓缩反应以提供标题化合物(1.60g，99%)。+ESI(M+H)193.1;1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δ):12.00(br.s.,1H),8.35(s,1H),7.83(dd,J=8.9,1.7Hz,1H),7.33(dd,J=8.9,0.7Hz,1H),3.82(s,3H)。
步骤2：3-羟基-1H-吲唑-1,5-二甲酸1-乙酯5-甲酯
将3-羟基-1H-吲唑-5-甲酸甲酯(1.60g，8.33mmol)悬浮在吡啶(10mL)中。慢慢地添加氯甲酸乙酯(0.90mL，9.3mmol)且将反应在室温下搅拌1小时。添加另外的氯甲酸乙酯(0.30mL，3.1mmol)且将反应另外搅拌30分钟。将反应倒进水(65mL)中且在冰箱中冷却3小时。通过过滤收集棕色固体，用水冲洗，及在真空下干燥以产生标题化合物(1.75g，80%)。+ESI(M+H)265.1;1H NMR(400MHz,CDCl3,δ):8.56(s,1H),8.29(d,J=7.8Hz,1H),8.13(br.s.,1H),4.59(q,J=7.0Hz,2H),3.97(s,3H),1.56(t,J=7.0Hz,3H)。
步骤3：2-甲基-3-氧-2,3-二氢-1H-吲唑-1,5-二甲酸1-乙酯5-甲酯
将3-羟基-1H-吲唑-1,5-二甲酸1-乙酯5-甲酯(1.75g，6.62mmol)悬浮在丙酮(85mL)中。添加碳酸铯(2.27g，6.95mmol)及碘甲烷(1.3mL，20mmol)且将反应在回流下搅拌22小时。将反应浓缩至干且将残余物分溶在二氯甲烷(60mL)及水(100mL)之间。分离层且再次用二氯甲烷(60mL)萃取水层。将合并的有机物经过硫酸镁干燥，过滤，和浓缩。通过快速管柱层析(7-60%乙酸乙酯/庚烷)的纯化产生二种区域异构体产物。
呈白色固体的3-甲氧基-1H-吲唑-1,5-二甲酸1-乙酯5-甲酯(590mg，32%)。1H NMR(400MHz,CDCl3,δ):8.41(dd,J=1.6,0.8Hz,1H),8.22(dd,J=9.2,3.5Hz,1H),8.14(d,J=9.2Hz,1H),4.57(q,J=7.1Hz,2H),4.20(s,3H),3.95(s,3H),1.51(t,J=7.1Hz,3H)。
呈黄色固体的2-甲基-3-氧-2,3-二氢-1H-吲唑-1,5-二甲酸1-乙酯5-甲酯(699mg，38%)。+ESI(M+H)279.1;1H NMR(400MHz,CDCl3,δ):8.56(dd,J=1.8,0.6Hz,1H),8.30(dd,J=8.8,1.8Hz,1H),7.93(d,J=8.8Hz,1H),4.50(q,J=7.0Hz,2H),3.94(s,3H),3.67(s,3H),1.48(t,J=7.1Hz,3H)。
步骤4：2-甲基-3-氧-2,3-二氢-1H-吲唑-5-甲酸
将2-甲基-3-氧-2,3-二氢-1H-吲唑-1,5-二甲酸1-乙酯5-甲酯(300mg，1.08mmol)溶解在乙醇(4mL)中。添加氢氧化钾(485mg，8.62mmol)且将反应在室温下搅拌1.5小时。LCMS显示反应不完全。然后添加氢氧化钾(10mL，10mmol，1.0M)的水溶液，且将反应加热至65℃经2小时。将反应冷却至室温和浓缩。将所产生的橙色固体溶解在水中并用1N盐酸水溶液酸化。通过过滤收集沉淀物，在真空下干燥以产生呈白色固体的标题化合物(158mg，76%)。+ESI(M+H)193.1;1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δ):12.75(br.s.,1H),11.06(s,1H),8.15(s,1H),7.99(dd,J=8.7,1.5Hz,1H),7.28(d,J=8.6Hz,1H),3.37(s,3H)。
中间体17：如下制备下示3-甲氧基-1H-吲唑-5-甲酸：
标题化合物通过与对于中间体16所述的方法类似的方法，使用3-甲氧基-1H-吲唑-1,5-二甲酸1-乙酯5-甲酯制备，在步骤3中形成区域异构体产物。+ESI(M+H)193.1;1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δ):12.65(br.s.,1H),12.26(s,1H),8.18(s,1H),7.86(dd,J=8.9,1.5Hz,1H),7.38(d,J=8.8Hz,1H),3.99(s,3H)。
中间体18：如下制备下示7-甲氧基-1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吲唑-5-甲酸：
步骤1：7-甲氧基-1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吲唑-5-甲酸乙酯
将碘甲烷(32μL，0.51mmol)加至7-羟基-1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吲唑-5-甲酸乙酯(WO2009144554)(100mg，0.34mmol)及碳酸钾(95.1mg，0.68mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(1mL)中的混合物。将反应在室温下搅拌过夜。将反应用水稀释并用乙酸乙酯(4x)萃取。将合并的有机层用水及盐水洗涤，用硫酸钠干燥，过滤，和浓缩以产生呈黄色油的标题化合物(105mg，100%)。+ESI(M+1-THP)221.2;1HNMR(400MHz,CDCl3,δ):8.07-8.10(m,2H),7.43(d,J=0.98Hz,1H),6.24(dd,J=10.24,2.44Hz,1H),4.38(q,J=7.15Hz,2H),4.08(dt,J=11.56,2.02Hz,1H),4.04(s,3H),3.70-3.78(m,1H),2.54-2.66(m,1H),2.09-2.19(m,1H),2.01-2.08(m,1H),1.71-1.83(m,2H),1.55-1.64(m,1H),1.41(t,J=7.12Hz,3H)。
步骤2：7-甲氧基-1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吲唑-5-甲酸
将1N氢氧化锂水溶液(0.67mL，0.67mmol)加至7-甲氧基-1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吲唑-5-甲酸乙酯(102mg，0.33mmol)在四氢呋喃(2mL)中的溶液。将反应在室温下搅拌过夜。LCMS显示反应不完全。添加另外的氢氧化锂(0.35mL，2M，0.7mmol)且将反应加热至40℃经1小时。然后将反应留置在室温下搅拌70小时。在真空中除去四氢呋喃并用1N盐酸水溶液将残余物酸化至pH=4。用乙酸乙酯萃取溶液(3x)。将合并的有机物用盐水洗涤，经过硫酸钠干燥，过滤，和浓缩以产生呈固体的标题化合物(84mg，91%)。(M+1-THP)193.2;1HNMR(400MHz,CDCl3,δ):8.18(d,J=1.37Hz,1H),8.12(s,1H),7.46(d,J=1.17Hz,1H),6.26(dd,J=10.15,2.54Hz,1H),4.07-4.12(m,1H),4.06(s,3H),3.65-3.81(m,1H),2.54-2.72(m,1H),2.10-2.22(m,1H),2.01-2.10(m1H),1.71-1.85(m,2H),1.57-1.67(m,1H)。
中间体19：如下制备下示2-甲氧基喹啉-7-甲酸：
步骤1：7-(乙氧羰基)喹啉1-氧化物
将过乙酸(2.13mL，10.1mmol，在乙酸中，32wt%)加至喹啉-7-甲酸乙酯(1.02g，5.05mmol)在二氯甲烷(20mL)中的溶液。将反应在室温下搅拌过夜。将反应分溶在水及二氯甲烷之间。分离层并用二氯甲烷(4x)萃取水层。将合并的有机物用水及盐水洗涤，经过硫酸钠干燥，过滤，和浓缩。从庚烷及乙酸乙酯浓缩固体数次，然后在真空下干燥以产生呈黄色固体的标题化合物(1.01g，92%)。+ESI(M+H)218.2;1H NMR(400MHz,CDCl3,δ):9.40(s,1H),8.65(d,J=6.05Hz,1H),8.27(dd,J=8.58,1.56Hz,1H),7.95(d,J=8.39Hz,1H),7.82(d,J=8.58Hz,1H),7.42(dd,J=8.49,6.15Hz,1H),4.47(q,J=7.02Hz,2H),1.45(t,J=7.1Hz,3H)。
步骤2：2-甲氧基喹啉-7-甲酸乙酯
将三乙胺(0.19mL，1.4mmol)加至7-(乙氧羰基)喹啉1-氧化物(150mg，0.69mmol)及甲苯-4-磺酰氯(171mg，0.89mmol)在甲醇(5mL)中的0℃溶液。将反应在室温下搅拌过夜。LCMS显示反应不完全。添加另外的三乙胺(0.05mL)且将反应搅拌另外4小时。浓缩反应，将残余物分溶在乙酸乙酯及饱和碳酸钠水溶液之间。分离层并用乙酸乙酯萃取水层二次以上。将合并的有机物用盐水洗涤，经过硫酸钠干燥，过滤，和浓缩。通过快速管柱层析(0-40%乙酸乙酯/庚烷)的纯化产生淡黄色固体标题化合物(130mg，81%)。+ESI(M+H)232.2;1H NMR(400MHz,CDCl3,δ):8.49-8.60(m,1H),7.95-8.05(m,2H),7.75(d,J=8.19Hz,1H),6.98(d,J=8.78Hz,1H),4.43(q,J=7.22Hz,2H),4.08(s,3H),1.43(t,J=7.12Hz,3H)。
步骤3：2-甲氧基喹啉-7-甲酸
将2N氢氧化锂水溶液(0.81mL，1.6mmol)加至2-甲氧基喹啉-7-甲酸乙酯(125mg，0.54mmol)在四氢呋喃(1.5mL)中的溶液。将反应在室温下搅拌65小时。在真空中除去四氢呋喃并用1N盐酸水溶液将残余物酸化至pH=4。将混合物用水稀释并通过过滤收集所产生的沉淀物，在真空下干燥以产生呈白色固体的标题化合物(106mg，96%)。+ESI(M+H)204.2;1H NMR(400MHz,CDCl3,δ):8.64(d,J=1.37Hz,1H),8.01-8.04(m,1H),8.01(s,1H),7.79(d,J=8.58Hz,1H),7.01(d,J=8.78Hz,1H),4.09(s,3H)。
中间体20：如下制备下示2-(甲氨基)喹啉-6-甲酸：
步骤1：喹啉-6-甲酸乙酯
将浓硫酸(2mL)加至喹啉-6-甲酸(2.8g，16mmol)在乙醇(100mL)中的溶液。将反应加热至回流过夜。蒸发溶剂以产生棕色残余物，将其溶解在乙酸乙酯(150mL)中。将混合物用水(2×30mL)、饱和碳酸氢钠水溶液(2×30mL)、及盐水(2×30mL)洗涤。将有机层经过硫酸钠干燥，过滤，和浓缩至油。通过快速管柱层析的纯化产生呈棕色固体的标题化合物(2.0g，81%)。
步骤2：6-(乙氧羰基)喹啉1-氧化物
将间-氯过氧苯甲酸(4.9g，0.024mol)分批加至在二氯甲烷(120mL)中的喹啉-6-甲酸乙酯(3.2g，16mmol)。将反应在室温下搅拌4小时。将反应用二氯甲烷稀释并用饱和碳酸钠水溶液(3×30mL)及盐水(2×40mL)洗涤。将有机层经过硫酸钠干燥，过滤，和浓缩。通过快速管柱层析的纯化产生呈棕色固体的标题化合物(2.45g，71%)。1HNMR(400MHz,CDCl3,δ):8.81-8.79(d,1H),8.62(s,2H),8.35-8.33(d,1H),7.87-7.85(d,1H),7.39(s,1H),4.49-4.44(q,2H),1.47-1.43(t,3H)。
步骤3：2-(甲氨基)喹啉-6-甲酸乙酯
将三氟甲磺酸酸酐(1.92mL，11.4mmol)逐滴加至6-(乙氧羰基)喹啉1-氧化物(2.25g，10.4mmol)在二氯甲烷(150mL)中的-70℃溶液。将混合物在-70℃下搅拌5分钟。然后逐滴添加甲胺在四氢呋喃中的溶液(31mL，62mmol，2M)。将混合物在-70℃下搅拌5分钟。用水(20mL)终止反应。分离层并用二氯甲烷(3×30mL)萃取水层。将合并的有机物用盐水洗涤，经过硫酸钠干燥，过滤，和浓缩。通过快速管柱层析的纯化产生呈黄色固体的标题化合物(850mg，35%)。1H NMR(400MHz,CDCl3,δ):8.33(d,1H),8.16-8.13(m,1H),7.90-7.87(d,1H),7.70-7.67(d,1H),6.68(d,1H),5.30(br.s.,1H),4.43-4.38(q,2H),3.13-3.12(d,3H),1.44-1.40(m,3H)。
步骤4：2-(甲氨基)异喹啉-6-甲酸
将氢氧化钠水溶液(4mL，8mmol，2N)加至2-(甲氨基)喹啉-6-甲酸乙酯(850mg，3.7mmol)在乙醇(10mL)中的溶液。将反应加热至50℃过夜。在真空中除去乙醇并用1N盐酸水溶液将残余物酸化至pH=5。通过过滤收集所产生的沉淀物并在真空下干燥以产生呈黄色固体的标题化合物(710mg，96%)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δ):8.26(d,1H),7.96-7.93(m,2H),7.50(d,1H),7.43(d,1H),6.81(d,1H),2.91(d,3H)。
中间体21：如下制备下示7-(三氟甲基)-1H-吲唑-5-甲酸：
步骤1：4-溴-2-甲基-6-(三氟甲基)苯胺
经30分钟将N-溴丁二酰亚胺(3.0g，17mmol)以小部分加至2-甲基-6-(三氟甲基)苯胺(3.0g，17mmol)在乙腈(85mL)中的室温溶液。将反应搅拌1小时。将反应倒进水/盐水混合物中并用乙酸乙酯萃取(3x)。将合并的有机物经过硫酸镁干燥，过滤，和浓缩。通过快速管柱层析(0-40%乙酸乙酯/庚烷)的纯化产生呈棕色油的标题化合物(4.13g，95%)。1H NMR(400MHz,CDCl3,δ):7.42(d,J=2.34Hz,1H),7.31(s,1H),2.17(s,3H)。
步骤2：5-溴-7-(三氟甲基)-1H-吲唑
将乙酸钾(10.2g，104mmol)分批加至4-溴-2-甲基-6-(三氟甲基)苯胺(3.3g，13mmol)在甲苯(65mL)和冰醋酸(11.2mL，195mmol)中的溶液。15分钟之后，形成大量沉淀物，妨碍反应的搅拌。用乙酸(10mL)稀释反应。然后逐滴添加亚硝酸异戊酯(1.92mL，14.3mmol)且将反应在室温下搅拌3小时。添加另外的亚硝酸异戊酯(0.5mL，3.7mmol)且将反应搅拌15小时。将反应用水(100mL)稀释并搅拌1.5小时。将溶液分溶在乙酸乙酯及饱和碳酸氢钠水溶液之间。分离层，将有机物用盐水洗涤，经过硫酸镁干燥，过滤，和浓缩。通过快速管柱层析(5-50%乙酸乙酯/庚烷)的纯化产生呈黄色粉末的标题化合物(1.78g，52%)。-ESI(M-H+1)264.9;1H NMR(400MHz,CDCl3,δ):8.13(s,1H),8.09-8.11(m,1H),7.76(dd,J=1.66,0.88Hz,1H)。
步骤3：7-(三氟甲基)-1H-吲唑-5-甲酸甲酯
将[1,1'-双(二苯膦基)二茂铁]-二氯化钯(II)(与二氯甲烷的配合物)(45.7mg，0.056mmol)、5-溴-7-(三氟甲基)-1H-吲唑(100mg，0.38mmol)、三乙胺(105μL，0.752mmol)及甲醇(2mL)加至密封管。将该管加盖和将一氧化碳通过5分钟。然后将反应加热至70℃经5小时。将反应冷却至室温并留置搅拌2天。将反应浓缩及通过快速管柱层析(0-50%乙酸乙酯/庚烷)纯化以产生呈白色粉末的标题化合物(64mg，69%)。-ESI(M-H)243.1;1H NMR(400MHz,CDCl3,δ):8.72(s,1H),8.37(s,1H),8.28(s,1H),3.98(s,3H)。
步骤4：7-(三氟甲基)-1H-吲唑-5-甲酸
将1N氢氧化锂水溶液(0.76mL，0.76mmol)加至7-(三氟甲基)-1H-吲唑-5-甲酸甲酯(62mg，0.25mmol)在甲醇(2mL)及四氢呋喃(2mL)中的溶液。将反应加热至60℃经17小时。将反应浓缩且将残余物用水稀释并用1N盐酸水溶液酸化至pH=3。用二氯甲烷萃取溶液(3x)。将合并的有机物用盐水洗涤，经过硫酸镁干燥，过滤，和浓缩以产生呈灰白色粉末的标题化合物(17mg，29%)。+ESI(M+H)231.1。
中间体22：如下制备下示3-(甲氨基)异喹啉-6-甲酸：
步骤1：6-溴-N-甲基异喹啉-3-胺
将N,N-二甲基甲酰胺二甲基乙醛(2mL)加至6-溴异喹啉-3-胺(50.0mg，2.6mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(10mL)中的溶液。将反应容器密封并在Biotage Smith合成器微波炉中加热至110℃经20分钟。然后将三乙酰氧基硼氢化钠(59mg，0.28mmol)加至反应混合物。将小瓶密封，再次在Biotage Smith合成器微波炉上加热至110℃经10分钟。浓缩反应。将残余物溶解在乙酸乙酯(50mL)中并用盐水洗涤(2×20mL)。将有机物经过硫酸钠干燥，过滤，和浓缩。通过快速管柱层析的纯化产生呈白色固体的标题化合物(23mg，43%)。1H NMR(400MHz,CDCl3,δ):8.76(s,1H),7.74(s,1H),7.61(d,1H),7.28(d,1H),6.40(s,1H),5.09-5.07(m,1H),2.97(s,3H)。
步骤2：3-(甲氨基)异喹啉-6-甲酸
3-(甲氨基)异喹啉-6-甲酸甲酯与中间体21的步骤3所述的方法类似的方法，使用6-溴-N-甲基异喹啉-3-胺制备。将水(5mL)、甲醇(5mL)及氢氧化锂单水合物(300mg，7mmol)加至粗制材料(580mg，2.7mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜。将反应浓缩且用1N盐酸水溶液将残余物酸化至pH=5。将产生的残余物在真空下干燥，通过逆向HPLC纯化以产生呈白色固体的标题化合物(512mg，89%)。1H NMR(400MHz,CD3OD,δ):8.81(s,1H),8.23(s,1H),7.80(d,1H),7.72(d,1H),6.70(s,1H),2.93(s,3H)。
中间体23：如下制备下示2-(甲氨基)喹啉-7-甲酸：
标题化合物通过与中间体20的步骤3-4中所述的方法类似的方法，使用7-(乙氧羰基)喹啉1-氧化物制备。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δ):8.08(s,1H),7.90(d,1H),7.71-7.62(m,2H),7.21(s,1H),6.84(d,1H),2.91(d,3H)。
中间体24：如下制备下示5-甲氧基喹啉-3-甲酸：
使用氢氧化锂水溶液将5-甲氧基喹啉-3-甲酸甲酯皂化(Organicand Biomolecular Chemistry,7(12),2612-2618;2009)。+ESI(M+H)203.9;1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δ):9.30(d,1H),9.03(d,1H),7.84-7.80(m,1H),7.66(d,1H),7.15(d,1H),4.04(s,3H)。
中间体25：如下制备下示2-(甲氨基)-1H-苯并[d]咪唑-5-甲酸：
步骤1：2-(甲氨基)-1H-苯并[d]咪唑-5-甲酸甲酯
将3,4-二氨基苯甲酸(15g，0.09mol)及异硫氰酸甲酯(6.6g，0.09mol)的混合物溶解在四氢呋喃(90mL)中。将反应在回流下加热3小时且然后浓缩。将残余物倒进冰水中。将所产生的沉淀物过滤，用水洗涤，及在真空下干燥以产生4-氨基-3-(3-甲基硫脲基)苯甲酸甲酯(12.0g，56%)。
将乙醇(200mL)、接着碘甲烷(35.5g，0.25mol)加至固体(12g，0.05mol)。将反应加热至回流并搅拌过夜。浓缩反应并用氢氧化铵碱化残余物。通过过滤收集固体并用水洗涤，通过管柱层析(9-25%乙酸乙酯/石油醚)的纯化产生呈黄色固体的标题化合物(2.9g，28%)。1HNMR(400MHz,CDCl3,δ):8.37(s,1H),7.92-7.96(m,1H),7.51(d,J=8.4Hz,1H),3.93(s,3H),2.81(s,3H)。
步骤2：2-(甲氨基)-1H-苯并[d]咪唑-5-甲酸
将3N盐酸水溶液(14mL，42mmol)加至2-(甲氨基)-1H-苯并[d]咪唑-5-甲酸甲酯(2.9g，14mmol)且将反应在回流下搅拌过夜。将反应浓缩以产生呈黄色固体的标题化合物(2.4g，90%)。1H NMR(400MHz,CD3OD,δ):7.96-8.00(m,2H),7.40(d,J=8.4Hz,1H),3.10(s,3H)。
中间体26：如下制备下示2-氨基-1H-苯并[d]咪唑-5-甲酸：
将溴化氰的溶液(5.0mL，在乙腈中，5M，25mmol)加至3,4-二氨基苯甲酸甲酯(3.0g，18mmol)在水(50mL)中的混合物。将反应在室温下搅拌过夜。将氨水(20mL)及乙酸乙酯(100mL)加至反应混合物及分离层。将有机物经过硫酸钠干燥，过滤，和浓缩。将2N盐酸水溶液(18mL，36.0mmol)加至粗制残余物且将混合物在回流下加热过夜。将反应浓缩以产生标题化合物(2.90g，97%)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δ):8.75(s,2H),7.84(s,1H),7.77(dd,J=1.2,8.4Hz,1H),7.38(d,J=8.4Hz,1H)。
中间体27：如下制备下示1-(4-甲氧基苯甲基氨基)异喹啉-7-甲酸：
步骤1：1-氧-1,2-二氢异喹啉-7-甲酸
将氰化铜(56g，0.63mol)加至7-溴异喹啉-1(2H)-酮(70g，0.31mol)在N,N-二甲基甲酰胺(1升)中的悬浮液。将反应加热至180℃经2小时。将反应冷却至室温并用水(1L)稀释。用乙酸乙酯萃取溶液(3x)。将有机物经过硫酸钠干燥，过滤，和浓缩以产生粗制1-氧-1,2-二氢异喹啉-7-甲腈(37g)。将此粗制材料溶解在乙醇(500mL)中并添加1N氢氧化钠水溶液(400mL)。将混合物加热至回流并搅拌2小时。将反应冷却至室温并用1N盐酸水溶液将pH调整至约2。通过过滤收集固体，用水冲洗，在真空下干燥以产生呈灰白色固体的标题化合物(35g，85%)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δ):13.15(br.s.,1H),11.49(s,1H),8.75(s,1H),8.17-8.14(m,1H),7.75(d,1H),7.34-7.29(m,1H),6.62(d,1H)。
步骤2：1-氯异喹啉-7-羰基氯
将氧氯化磷(74mL，793mmol)加至1-氧-1,2-二氢异喹啉-7-甲酸(3.0g，20mmol)。将反应加热至90℃经5小时。将反应浓缩至干。将材料溶解在二氯甲烷(250mL)及饱和碳酸氢钠水溶液(200mL)中。分离层并用二氯甲烷(100mL)萃取水层。将合并的有机物经过硫酸镁干燥，过滤，和浓缩以产生呈黄色固体的标题化合物(3.0g，80%)。+ESI(M+H)227.1;1H NMR(400MHz,CDCl3,δ):9.18-9.22(m,1H),8.44(d,J=5.7Hz,1H),8.32(dd,J=8.8,1.8Hz,1H),7.95(d,J=8.8Hz,1H),7.68(d,J=5.7Hz,1H)。
步骤3：1-氯异喹啉-7-甲酸乙酯
将1-氯异喹啉-7-羰基氯(3.02g，13.4mmol)溶解在四氢呋喃(135mL)中且冷却至0℃。添加乙醇(6.1mL，94mmol)及三乙胺(2.05mL，14.7mmol)。使反应加热至室温并搅拌2小时。将反应混合物分溶在乙酸乙酯(500mL)及饱和碳酸氢钠水溶液(250mL)之间。将有机层经过硫酸镁干燥，过滤和浓缩以产生呈黄色固体的标题化合物(3.0g，96%)。+ESI(M+H)236.1；1H NMR(400MHz,CDCl3,δ):9.06(s,1H),8.30-8.39(m,2H),7.89(d,J=8.6Hz,1H),7.63(d,J=5.7Hz,1H),4.48(q,J=7.1Hz,2H),1.46(t,J=7.1Hz,3H)。
步骤4：1-(4-甲氧基苯甲基氨基)异喹啉-7-甲酸乙酯
将4-甲氧基-苯甲胺(4.6mL，35mmol)及碳酸钾(5.14g，37.2mmol)加至1-氯异喹啉-7-甲酸乙酯(548mg，2.32mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(9.3mL)中的溶液。将反应加热至70℃并搅拌过夜。将反应冷却至室温并用乙酸乙酯和水稀释。分离层及将水层用乙酸乙酯萃取二次。将合并的有机物用水及盐水洗涤，经过硫酸镁干燥，过滤，和浓缩。通过快速管柱层析(0-35%乙酸乙酯/庚烷)的纯化产生呈绿色油的标题化合物(430mg，55%)。1H NMR(400MHz,CDCl3,δ):8.49(s,1H),8.16(dd,J=8.6,1.6Hz,1H),8.09(d,J=5.9Hz,1H),7.69(d,J=8.6Hz,1H),7.33-7.40(m,2H),6.96(d,J=5.9Hz,1H),6.87-6.93(m,2H),5.67(br.s.,1H),4.76(d,J=5.1Hz,2H),4.41(q,J=7.2Hz,2H),3.81(s,3H),1.37-1.43(m,3H)。
步骤5：1-(4-甲氧基苯甲基氨基)异喹啉-7-甲酸
将6N氢氧化钠水溶液(1.1mL，6.4mmol)加至1-(4-甲氧基苯甲基氨基)异喹啉-7-甲酸乙酯(430mg，1.28mmol)在甲醇(8.5mL)中的溶液。将反应在室温下搅拌过夜。浓缩反应。将残余物溶解在水中并用1N盐酸水溶液酸化直到沉淀物形成。通过过滤收集固体，在真空下干燥以产生呈黄色固体的标题化合物(328mg，83%)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δ):8.92(s,1H),8.30(t,J=5.8Hz,1H),8.06(dd,J=8.4,1.4Hz,1H),7.88(d,J=5.7Hz,1H),7.69(d,J=8.6Hz,1H),7.24-7.31(m,2H),6.88(d,J=5.7Hz,1H),6.79-6.85(m,2H),4.62(d,J=5.9Hz,2H),3.67(s,3H)。
中间体28：如下制备下示3-甲氧基-1H-吲唑-6-甲酸：
步骤1：3-羟基-1H-吲唑-6-甲酸甲酯
将3-氧-2,3-二氢-1H-吲唑-6-甲酸(1.5g，8.4mmol)悬浮在甲醇(17mL)中。添加浓盐酸(3.1mL，101mmol)且将反应加热至回流经24小时。将反应浓缩以产生标题化合物(1.6g，100%)。+ESI(M+H)193.1;1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δ):11.98(br.s.,1H),7.89(s,1H),7.72(d,J=8.6Hz,1H),7.50(dd,J=8.5,1.3Hz,1H),3.85(s,3H)。
步骤2：3-羟基-1H-吲唑-1,6-二甲酸1-乙酯6-甲酯
将3-羟基-1H-吲唑-6-甲酸甲酯(1.6g，8.3mmol)悬浮在吡啶(10mL)中。慢慢地添加氯甲酸乙酯(1.0mL，10mmol)且将反应在室温下搅拌2小时。将反应倒进水(65mL)中并在冰箱中冷却4小时。通过过滤收集所产生的棕色沉淀物，用水冲洗，在真空下干燥以产生呈米色固体的标题化合物(1.35g，61%)。+ESI(M+H)265.0;1H NMR(400MHz,CDCl3,δ):8.80(d,J=6.0Hz,1H),8.01(dd,J=8.2,1.2Hz,1H),7.88(d,J=8.6Hz,1H),4.60(q,J=7.0Hz,2H),3.98(s,3H),1.57(t,J=7.1Hz,3H)。
步骤3：3-甲氧基-1H-吲唑-1,6-二甲酸1-乙酯6-甲酯
将3-羟基-1H-吲唑-1,6-二甲酸1-乙酯6-甲酯(1.35g，5.11mmol)悬浮在丙酮(65mL)中。添加碳酸铯(1.75g，5.36mmol)及碘甲烷(1.0mL，15mmol)且将反应加热至回流经23小时。将反应浓缩至干。将残余物溶解在二氯甲烷(100mL)及水(100mL)中。分离层及再次用二氯甲烷萃取水层。将合并的有机物经过硫酸镁干燥，过滤，和浓缩。通过快速管柱层析的纯化产生二种区域异构体产物。
呈白色固体的3-甲氧基-1H-吲唑-1,6-二甲酸1-乙酯6-甲酯(444mg，31%)。1HNMR(400MHz,CDCl3,δ):8.78(s,1H),7.96(dd,J=8.2,1.4Hz,1H),7.70(dd,J=8.2,0.8Hz,1H),4.57(q,J=7.2Hz,2H),4.19(s,3H),3.96(s,3H),1.51(t,J=7.1Hz,3H)。
呈黄色固体的2-甲基-3-氧-2,3-二氢-1H-吲唑-1,6-二甲酸1-乙酯6-甲酯(514mg，36%)。1H NMR(400MHz,CDCl3,δ):8.56(s,1H),8.00(m,1H),7.92(d,J=8.6Hz,1H),4.49(q,J=7.2Hz,2H),3.97(s,3H),3.69(s,3H),1.49(t,J=7.1Hz,3H)。
步骤4：3-甲氧基-1H-吲唑-6-甲酸
将3-甲氧基-1H-吲唑-1,6-二甲酸1-乙酯6-甲酯(444mg，1.60mmol)悬浮在乙醇(5mL)中。添加氢氧化钾的水溶液(16mL，16mmol，1M)且将反应加热至65℃并搅拌1.5小时。将反应冷却至室温和浓缩。将残余物溶解在水中并用1N盐酸水溶液将溶液酸化直到沉淀物形成，通过过滤收集固体，用水冲洗，在真空下干燥以产生呈橙色固体的标题化合物(232mg，76%)。+ESI(M+H)193.2;1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δ):12.22(s,1H),7.90-7.94(m,1H),7.64(d,J=8.4Hz,1H),7.53(dd,J=8.4,1.4Hz,1H),3.99(s,3H)。
中间体29：如下制备下示3-(三氟甲基)-1H-吲唑-5-甲酸：
标题化合物通过与中间体21的步骤3-4中所述的方法类似的方法，使用5-溴-3-(三氟甲基)-1H-吲唑制备。+ESI(M+H)231.1。
中间体30：如下制备下示1-(4-甲氧基苯甲基氨基)异喹啉-6-甲酸：
步骤1：1-氧-1,2-二氢异喹啉-6-甲酸
用2MPa的一氧化碳加压6-溴异喹啉-1(2H)-酮(30g，0.134mol)、三乙胺(17.6g，0.174mol)、氯化钯(II)(0.24g，1.34mmol)及2,2'-双(二苯膦基)-1,1'-联萘(0.84g，1.34mmol)在甲醇(300mL)中的混合物。将反应加热至100℃并搅拌12小时。将反应混合物经过硅藻土过滤和浓缩。用水洗涤残余物并在真空下干燥固体以产生呈黄色固体的粗制1-氧-1,2-二氢异喹啉-6-甲酸甲酯(23.8g，95.2%)。用四氢呋喃(200mL)及水(200mL)稀释固体。将氢氧化锂(16.8g，0.4mol)加至此混合物且将反应在室温下搅拌4小时。用乙酸乙酯洗涤反应混合物(3x)并将这些洗涤液丢弃。用4N盐酸水溶液将水层酸化至pH=5。通过过滤收集所产生的沉淀物，在真空下干燥以产生呈黄色固体的标题化合物(11.3g，49%)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δ):11.48(s,1H),8.24(d,2H),7.93(d,1H),7.22(d,1H),6.68(d,1H)。
步骤2：1-(4-甲氧基苯甲基氨基)异喹啉-6-甲酸
标题化合物通过与中间体27的步骤2-5中所述的方法类似的方法，使用1-氧-1,2-二氢异喹啉-6-甲酸制备。+ESI(M+H)309.2;1HNMR(400MHz,CD3OD,δ):8.37(d,J=1.56Hz,1H),8.34(d,J=8.78Hz,1H),8.12(dd,J=8.68,1.66Hz,1H),7.67(d,J=6.44Hz,1H),7.29-7.36(m,2H),7.15(d,J=6.24Hz,1H),6.86-6.93(m,2H),4.73(s,2H),3.76(s,3H)。
中间体31：如下制备下示1-(甲氨基)异喹啉-7-甲酸：
步骤1：1-(甲氨基)异喹啉-7-甲酸乙酯
将甲胺在四氢呋喃中的溶液(30mL，60mmol，2M)加至在密封管中的1-氯异喹啉-7-甲酸乙酯(在中间体27的步骤3中形成)(705mg，2.99mmol)。将反应加热至60℃并搅拌过夜。LCMS指示反应不完全。添加额外的甲胺(10mL，20mmol，在THF中，2M)且将反应加热至60℃经另外18小时。将反应冷却至室温和浓缩。将残余物分溶在水及二氯甲烷之间。将有机层经过硫酸镁干燥，过滤，和浓缩。通过快速管柱层析(25-65%乙酸乙酯/庚烷)的纯化产生呈黄色油的标题化合物(584mg，85%)，其在静置时固化。+ESI(M+H)231.1;1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δ):8.83-8.94(m,1H),8.07(dd,J=8.58,1.56Hz,1H),7.99(d,J=5.85Hz,1H),7.89(d,J=4.49Hz,1H),7.77(d,J=8.58Hz,1H),6.92(d,J=5.07Hz,1H),4.38(q,J=7.02Hz,2H),2.97(d,J=4.49Hz,3H),1.38(t,J=7.12Hz,3H)。
步骤2：1-(甲氨基)异喹啉-7-甲酸
标题化合物通过与中间体19的步骤3中所述的方法类似的方法，使用1-(甲氨基)异喹啉-7-甲酸乙酯制备。+ESI(M+H)203.1;1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δ):13.03(br.s.,1H),8.87(s,1H),8.06(dd,J=8.51,1.47Hz,1H),7.97(d,J=5.67Hz,1H),7.85(d,J=4.50Hz,1H),7.75(d,J=8.41Hz,1H),6.91(d,J=5.87Hz,1H),2.95(d,J=4.50Hz,3H)。
中间体32：如下制备下示3-(三氟甲基)-1H-吲唑-6-甲酸：
步骤1：1-(4-溴-2-氟苯基)-2,2,2-三氟乙醇
将三甲基甲硅烷基三氟甲烷(0.77mL，4.9mmol)经5分钟逐滴加至4-溴-2-氟苯甲醛(1.00g，4.93mmol)在四氢呋喃(50mL)中的0℃溶液。将反应在0℃下搅拌10分钟。然后缓慢添加四丁基氟化铵(0.49mL，0.49mmol，在四氢呋喃中，1M)且将反应逐渐加热至室温并搅拌3天。浓缩反应并将残余物溶解在二氯甲烷中。将溶液用1N盐酸水溶液洗涤一次并用盐水洗涤一次。将有机物经过硫酸镁干燥，过滤，和浓缩。通过管柱层析(0-50%乙酸乙酯/庚烷)的纯化产生呈透明油质的标题化合物(1.0g，75%)。1H NMR(400MHz,CDCl3,δ):7.48(d,J=7.61Hz,1H),7.39(d,J=1.76Hz,1H),7.29(dd,J=9.56,1.95Hz,1H),5.33-5.40(m,1H),2.70(d,J=5.46Hz,1H)。
步骤2：1-(4-溴-2-氟苯基)-2,2,2-三氟乙酮
将2-碘氧基苯甲酸(2.28g，7.97mmol)加至1-(4-溴-2-氟苯基)-2,2,2-三氟乙醇(1.09g，3.99mmol)在乙酸乙酯(30mL)中的溶液。将反应加热至回流过夜。将反应冷却至室温并用庚烷(30mL)稀释。将混合物经过硅藻土过滤并浓缩滤液以产生呈淡黄色油的标题化合物(1.03g，95%)。1H NMR(400MHz,CDCl3,δ):7.44(dd,J=10.15,1.56Hz,1H),7.48(m,1H),7.76(m,1H)。
步骤3：6-溴-3-(三氟甲基)-1H-吲唑
将肼水合物(3.5mL，45mmol)加至1-(4-溴-2-氟苯基)-2,2,2-三氟乙酮(1.00g，3.69mmol)在1-丁醇(15mL)中的溶液。将反应加热至回流经5小时，然后冷却至室温，留置搅拌过夜。将反应用水(50mL)稀释并用乙酸乙酯萃取(3x)。将合并的有机物用盐水洗涤，经过硫酸镁干燥，过滤，和浓缩。通过快速管柱层析(0-50%乙酸乙酯/庚烷)的纯化产生呈灰白色固体的标题化合物(310mg，32%)。1H NMR(400MHz,CDCl3,δ):7.42(dd,J=8.58,1.56Hz,1H),7.72(d,J=8.58Hz,1H),7.75(dd,J=1.56,0.78Hz,1H)。
步骤4：3-(三氟甲基)-1H-吲唑-6-甲酸
标题化合物通过与中间体21的步骤3-4中所述的方法类似的方法，使用6-溴-3-(三氟甲基)-1H-吲唑制备。-ESI(M-H)229.1。
中间体33：如下制备2-甲基-3-氧-2,3-二氢-1H-吲唑-6-甲酸：
将1N氢氧化钾水溶液(18.5mL，18.5mmol)加至2-甲基-3-氧-2,3-二氢-1H-吲唑-1,6-二甲酸1-乙酯6-甲酯(在中间体28的步骤3中形成)(514mg，1.85mmol)在乙醇(6mL)中的悬浮液。将反应加热至65℃经1.5小时。将反应冷却至室温和浓缩至干。将残余物溶解在水中并用1N盐酸水溶液酸化直到沉淀物形成。通过过滤收集固体及在真空下干燥以产生呈棕色固体的标题化合物(196mg，55%)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δ):13.12(br.s.,1H),10.61(br.s.,1H),7.76(s,1H),7.70(d,J=8.2Hz,1H),7.60(dd,J=8.2,1.2Hz,1H),3.38(s,3H)。
中间体34：如下制备下示3-氯-1H-吡咯并[3,2-b]吡啶-6-甲酸：
步骤1：3-氯-1H-吡咯并[3,2-b]吡啶-6-甲酸甲酯
将N-氯丁二酰亚胺(895mg，5.96mmol)加至1H-吡咯并[3,2-b]吡啶-6-甲酸甲酯(1.00g，5.68mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(15mL)中的0℃溶液。使反应逐步升温至室温并搅拌过夜。将反应用水(125mL)稀释并搅拌20分钟。通过过滤收集所产生的固体，用水洗涤，在真空下干燥以产生呈橙色粉末的标题化合物(1.11g，93%)。+ESI(M+H)211.0;1HNMR(400MHz,DMSO-d6,δ):11.99(br.s.,1H),8.92(d,J=2.0Hz,1H),8.31(d,J=1.8Hz,1H),8.08(d,J=3.1Hz,1H),3.88(s,3H)。
步骤2：3-氯-1H-吡咯并[3,2-b]吡啶-6-甲酸
将3-氯-1H-吡咯并[3,2-b]吡啶-6-甲酸甲酯(1.10g，5.22mmol)悬浮在1,4-二恶烷(25mL)中，添加6N盐酸水溶液(8.7mL)。将反应在室温下搅拌过夜。然后将反应浓缩以产生标题化合物(1.2g，100%)。+ESI(M+H)197.1;1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δ):12.50(br.s.,1H),8.92(d,J=1.6Hz,1H),8.46(br.s.,1H),8.19(br.s.,1H)。
中间体35：如下制备下示3-(甲氨基)-1H-吲唑-6-甲酸：
步骤1：4-溴-2-氟-N-甲基硫代苯甲酰胺
将4-溴-2-氟-N-甲基苯甲酰胺(500mg，2mmol)及劳森(Lawesson)试剂(872mg，2.16mmol)在甲苯(10mL)中的混合物加热至100℃并搅拌4小时。将反应冷却至室温，用甲苯稀释，并过滤。浓缩滤液，残余物通过快速管柱层析(0-20%乙酸乙酯/庚烷)的纯化产生呈黄色固体的标题化合物(520mg，97%)。+ESI(M+H+1)250.1;1H NMR(400MHz,CDCl3,δ):8.09(t,J=8.58Hz,1H),8.03(br.s.,1H),7.35(dd,J=8.19,2.15Hz,1H),7.27(dd,J=11.41,1.85Hz,1H),3.36(dd,J=4.88,0.78Hz,3H)。
步骤2：6-溴-N-甲基-1H-吲唑-3-胺
将无水肼(0.25mL，8.1mmol)加至4-溴-2-氟-N-甲基硫代苯甲酰胺(200mg，0.8mmol)在二甲亚砜(2.5mL)中的溶液。将反应加热至100℃并搅拌2小时。将反应冷却至室温并用乙酸乙酯和水稀释。分离层并用乙酸乙酯萃取水层(3x)。将合并的有机物用饱和碳酸钠水溶液及盐水洗涤，经过硫酸钠干燥，过滤，和浓缩。通过快速管柱层析(20-100%乙酸乙酯/庚烷)的纯化产生呈白色固体的标题化合物(98mg，54%)。+ESI(M+H+1)228.0;1H NMR(400MHz,CD3OD,δ):7.52(d,J=8.58Hz,1H),7.43(s,1H),7.04(d,J=8.39Hz,1H),2.94(s,3H)。
步骤3：3-(甲氨基)-1H-吲唑-6-甲酸甲酯
标题化合物通过与中间体12的步骤2中所述的方法类似的方法，使用6-溴-N-甲基-1H-吲唑-3-胺制备。+ESI(M+H)206.2;1H NMR(400MHz,CD3OD,δ):7.95(t,J=1.17Hz,1H),7.67(dd,J=8.39,0.78Hz,1H),7.55(dd,J=8.49,1.27Hz,1H),3.90(s,3H),2.96(s,3H)。
步骤4：3-(甲氨基)-1H-吲唑-6-甲酸
将3N盐酸水溶液(0.2mL，0.6mmol)加至3-(甲氨基)-1H-吲唑-6-甲酸甲酯(30.0mg，0.15mmol)在1,4-二恶烷(0.2mL)中的溶液。将混合物加热至100℃经2小时。将反应浓缩并在真空下干燥以产生呈棕褐色固体的标题化合物(33mg，99%)。+ESI(M+H)192.1;1H NMR(400MHz,CD3OD,δ):8.09(s,1H),7.98(dd,J=8.58,0.78Hz,1H),7.85(dd,J=8.58,1.37Hz,1H),3.12(s,3H)。
中间体36：如下制备下示3-甲氧基异喹啉-7-甲酸：
步骤1：7-溴-3-甲氧基异喹啉
将7-溴-3-氯异喹啉(100mg，0.4mmol)及甲醇钠(113mg，2.1mmol)在二甘醇二甲醚(1mL)中的混合物加热至150℃经1小时。将反应冷却至室温并用甲苯和水稀释。分离层及用甲苯萃取水层(3x)。将合并的有机物用水及盐水洗涤，经过硫酸钠干燥，过滤，及浓缩至油。将该油在真空下干燥过夜以产生呈黄色固体的标题化合物(83mg，85%)。+ESI(M+H+1)240.1;1H NMR(400MHz,CDCl3,δ):8.87(s,1H),8.01-8.05(m,1H),7.58-7.64(m,1H),7.53-7.58(m,1H),6.97(s,1H),4.02(s,3H)。
步骤2：3-甲氧基异喹啉-7-甲酸
标题化合物通过与中间体21的步骤3-4中所述的方法类似的方法，使用7-溴-3-甲氧基异喹啉制备。+ESI(M+H)204.2;1H NMR(400MHz,CD3OD,δ):9.08(s,1H),8.71(s,1H),8.14(dd,J=8.78,1.56Hz,1H),7.83(d,J=8.78Hz,1H),7.17(s,1H),4.02(s,3H)。
中间体37：如下制备下示1-(甲氨基)异喹啉-6-甲酸：
步骤1：1-氯异喹啉-6-甲酸乙酯
标题化合物通过与中间体27的步骤1-3中所述的方法类似的方法，使用6-溴异喹啉-1(2H)-酮制备。1H NMR(400MHz,CDCl3,δ):8.56(d,J=1.6Hz,1H),8.38(d,J=8.8Hz,1H),8.34(d,J=5.7Hz,1H),8.25(dd,J=8.8,1.6Hz,1H),7.70(d,J=6.0Hz,1H),4.47(q,J=7.0Hz,2H),1.45(t,J=7.1Hz,3H)。
步骤2：1-(甲氨基)异喹啉-6-甲酸乙酯
标题化合物通过与中间体31的步骤1中所述的方法类似的方法，使用1-氯异喹啉-6-甲酸乙酯制备。+ESI(M+H)231.1;1H NMR(400MHz,CDCl3,δ):8.39(s,1H),8.06-8.14(m,2H),8.00(d,J=5.9Hz,1H),7.02(d,J=6.0Hz,1H),4.44(q,J=7.3Hz,2H),3.25(d,J=4.7Hz,3H),1.43(t,J=7.1Hz,3H)。
步骤3：1-(甲氨基)异喹啉-6-甲酸
将1N氢氧化钾水溶液(6.5mL，6.5mmol)加至1-(甲氨基)异喹啉-6-甲酸乙酯(150mg，0.65mmol)在乙醇中(2.5mL)的悬浮液。将反应加热至65℃经1.5小时。将反应冷却至室温且浓缩至干。将固体溶解在水中并将溶液用1N HCl酸化。将混合物浓缩。将固体溶解在水(50mL)中并用2-丁醇(50mL)萃取二次。将合并的有机物用盐水(20mL)洗涤，经过硫酸镁干燥，过滤，和浓缩以产生呈白色固体的标题化合物(95mg，72%)。+ESI(M+H)203.2;1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δ):13.07(br.s.,1H),10.25(d,J=4.9Hz,1H),8.74(d,J=8.8Hz,1H),8.51(s,1H),8.15(dd,J=8.6,1.8Hz,1H),7.67(d,J=6.8Hz,1H),7.35(d,J=7.0Hz,1H),3.15(d,J=4.7Hz,3H)。
中间体38：1-甲氧基异喹啉-6-甲酸
通过将钠金属(870mg，37mmol)慢慢加至甲醇(25mL)中并搅拌制备甲醇钠的溶液。全部钠金属已反应之后，将此溶液加至1-氯异喹啉-6-甲酸乙酯(440mg，1.9mmol)。将所产生的悬浮液加热至回流并搅拌3天。将反应混合物冷却至室温并浓缩。将残余物分溶在水及乙酸乙酯之间。分离层并将水层用1N盐酸水溶液酸化直到形成沉淀物。通过过滤收集固体，在真空下干燥以产生呈白色固体的标题化合物(294mg，78%)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δ):8.50(d,J=1.2Hz,1H),8.23(d,J=8.8Hz,1H),8.02-8.10(m,2H),7.54(d,J=6.0Hz,1H),4.05(s,3H)。
中间体39：如下制备下示3-(甲氨基)-1H-吲唑-5-甲酸：
步骤1：5-溴-2-氟-N-甲基苯甲酰胺
将草酰氯(0.16mL，1.8mmol)，接着1滴的N,N-二甲基甲酰胺加至5-溴-2-氟苯甲酸(200mg，0.91mmol)在二氯甲烷(5mL)中的混合物。将反应在室温下搅拌1.5小时。将反应浓缩并将所产生的残余物溶解在二氯甲烷(3mL)中且冷却至0℃。添加甲胺(2.3mL，5mmol，在四氢呋喃中，2M)且使反应在0℃下搅拌30分钟。用水终止反应且浓缩混合物。用水稀释残余物，过滤所产生的固体，用水冲洗，及在真空下干燥以产生呈白色固体的标题化合物(196.6mg，93%)。+ESI(M+H+1)234.1;1H NMR(400MHz,CDCl3,δ);8.22(dd,J=6.83,2.73Hz,1H),7.55(ddd,J=8.68,4.49,2.63Hz,1H),7.00(dd,J=11.32,8.58Hz,1H),6.67(br.s.,1H),3.02(dd,J=4.88,1.17Hz,3H)。
步骤2：5-溴-2-氟-N-甲基硫代苯甲酰胺
将5-溴-2-氟-N-甲基苯甲酰胺(500mg，2mmol)及劳森试剂(872mg，2.16mmol)在甲苯(10mL)中的混合物加热至100℃并搅拌3.5小时。将反应冷却至室温，用甲苯稀释，及过滤。浓缩滤液及通过快速管柱层析(0-20%乙酸乙酯/庚烷)纯化以产生呈黄色油的标题化合物(494mg，92%)，其在静置时固化。+ESI(M+H+1)250.1;1H NMR(400MHz,CDCl3,δ):8.20(dd,J=6.93,2.63Hz,1H),8.06(br.s.,1H),7.47(ddd,J=8.73,4.44,2.63Hz,1H),6.95(dd,J=11.12,8.78Hz,1H),3.32(dd,J=4.88,0.78Hz,3H)。
步骤3：5-溴-N-甲基-1H-吲唑-3-胺
将5-溴-2-氟-N-甲基硫代苯甲酰胺(480mg，1.9mmol)及无水肼(0.61mL，19mmol)在二甲亚砜(6mL)中的混合物加热至80℃并搅拌1小时。将温度增加至100℃且将反应搅拌40分钟。将温度进一步增加至130℃且将反应另外搅拌45分钟。将反应冷却至室温并用乙酸乙酯及盐水稀释。分离层并用乙酸乙酯萃取水层(4x)。将合并的有机物用水及盐水洗涤，用硫酸钠干燥，过滤，和浓缩。通过快速管柱层析(20-70%乙酸乙酯/庚烷)的纯化产生呈白色固体的标题化合物(103mg，23%)。+ESI(M+H+1)228.0;1H NMR(400MHz,CD3OD,δ):7.78(dd,J=1.85,0.68Hz,1H),7.29-7.40(m,1H),7.17(dd,J=8.88,0.68Hz,1H),2.94(s,3H)。
步骤4：3-(甲氨基)-1H-吲唑-5-甲酸甲酯
标题化合物通过与中间体21的步骤3中所述的方法类似的方法，使用5-溴-N-甲基-1H-吲唑-3-胺制备。+ESI(M+H)206.2;1H NMR(400MHz,CD3OD,δ):8.44(dd,J=1.56,0.78Hz,1H),7.92(dd,J=8.78,1.56Hz,1H),7.26(dd,J=8.78,0.78Hz,1H),3.88(s,3H),2.96(s,3H)。
步骤5：3-(甲氨基)-1H-吲唑-5-甲酸
将3-(甲氨基)-1H-吲唑-5-甲酸甲酯(60.0mg，0.29mmol)溶解在1,4-二恶烷(0.5mL)中。添加3N盐酸水溶液(0.3mL，0.9mmol)且将反应加热至100℃经11.5小时。移除热且将反应留置在室温下搅拌过夜。将反应浓缩以产生呈棕褐色固体的标题化合物(63mg，95%)。+ESI(M+H)192.1;1H NMR(400MHz,CD3OD,δ):8.61(d,J=0.78Hz,1H),8.19(dd,J=8.80,1.57Hz,1H),7.38(d,J=8.80Hz,1H),3.02(s,3H)。
中间体40：如下制备下示3-氨基异喹啉-7-甲酸：
标题化合物通过与中间体21的步骤3-4中所述的方法类似的方法，使用7-溴异喹啉-3-胺制备。+ESI(M+H)189.2;1H NMR(400MHz,CD3OD,δ):8.87(s,1H),8.52(d,J=0.78Hz,1H),7.98(dd,J=8.78,1.76Hz,1H),7.54(d,J=8.78Hz,1H),6.77(s,1H)。
中间体41：如下制备下示3-(甲氨基)异喹啉-7-甲酸：
步骤1：7-溴-N-甲基异喹啉-3-胺
将7-溴-3-氯异喹啉(100mg，0.4mmol)、甲胺盐酸盐(139mg，2.06mmol)及碳酸钾(456mg，3.30mmol)在1-甲氧基-2-(2-甲氧基乙氧基)乙烷(1mL)中的混合物加热至150℃并搅拌60小时。添加额外的甲胺盐酸盐(100mg，1.5mmol)及碳酸钾(200mg，1.4mmol)，继续加热另外40小时。将反应冷却至室温并用水稀释。将混合物搅拌30分钟。过滤出所产生的固体，用水冲洗及在真空下干燥。通过快速管柱层析(10-30%乙酸乙酯/庚烷)的纯化产生呈淡黄色固体的标题化合物(82mg)。-APCI(M-H+1)237.8;1H NMR(400MHz,CDCl3,δ):8.70(s,1H),7.84(d,J=1.95Hz,1H),7.48(dd,J=8.97,2.15Hz,1H),7.38(d,J=8.97Hz,1H),6.39(s,1H),2.92(s,3H)。
步骤2：3-(甲氨基)异喹啉-7-甲酸
标题化合物通过与中间体21的步骤3-4中所述的方法类似的方法，使用7-溴-N-甲基异喹啉-3-胺制备。+ESI(M+H)203.1;1H NMR(400MHz,CD3OD,δ):8.87(s,1H),8.51(s,1H),7.98(dd,J=8.88,1.66Hz,1H),7.58(d,J=8.78Hz,1H),6.60(s,1H),2.93(s,3H)。
中间体42：如下制备下示3-氯-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-甲酸：
将1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-甲酸(250mg，1.5mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(5mL)中的悬浮液加热至40℃。添加N-氯丁二酰亚胺(243mg，1.62mmol)且将混合物在55℃下搅拌5小时。将反应冷却至室温且留置搅拌2天。将混合物用水(20mL)稀释并搅拌过夜。通过过滤收集所产生的固体并干燥以产生标题化合物(161mg，55%)。+ESI(M+H)197.1;1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δ):13.08(br.s.,1H),12.39(br.s.,1H),8.86(d,J=1.8Hz,1H),8.40(d,J=1.2Hz,1H),7.84(d,J=2.5Hz,1H)。
中间体43：如下制备下示6-溴-3-甲氧基异喹啉：
将6-溴异喹啉-3-醇(606mg，2.70mmol)、碳酸银(1.5g，5.3mmol)、及N,N-二甲基甲酰胺(12mL)的混合物在室温下搅拌16分钟。添加碘甲烷(186μL，2.97mmol)且将反应留置搅拌18小时。将反应用甲醇稀释并经过硅藻土过滤。浓缩滤液，通过快速管柱层析纯化以产生标题化合物(90mg，14%)。+ESI(M+H+1)240.0;1H NMR(400MHz,CDCl3,δ):8.91(s,1H),7.86(d,J=1.8Hz,1H),7.73(d,J=8.8Hz,1H),7.43(dd,J=8.8,1.8Hz,1H),6.90(s,1H),4.02(s,3H)。
中间体44：如下制备下示2-氯喹啉-7-甲酸：
步骤1：2-氯喹啉-7-甲酸乙酯
将氧氯化磷(1.94mL，20.7mmol)加至7-(乙氧羰基)喹啉1-氧化物(450mg，2.07mmol)在二氯乙烷(15mL)中的溶液。将反应加热至50℃经3小时。然后将反应冷却至室温及缓慢地倒进200mL的水，并搅拌。使混合物搅拌1小时，然后用1N氢氧化钾水溶液中和。用二氯甲烷萃取混合物(3x)。将萃取物用盐水洗涤，经过硫酸镁干燥，过滤，和浓缩。通过管柱层析(0-20%乙酸乙酯/庚烷)的纯化产生呈白色固体的标题化合物(254mg，52%)。1H NMR(400MHz,CDCl3,δ):8.70-8.79(m,1H),8.13-8.18(m,2H),7.87(d,J=8.39Hz,1H),7.47(d,J=8.58Hz,1H),4.44(q,J=7.02Hz,2H),1.43(t,J=7.12Hz,3H)。
步骤2：2-氯喹啉-7-甲酸
将1N氢氧化锂水溶液(7mL，7mmol)加至2-氯喹啉-7-甲酸乙酯(800mg，3.4mmol)在四氢呋喃(10mL)中的溶液。将反应在室温下搅拌过夜。浓缩反应并将残余物用水稀释且用1N盐酸水溶液酸化。通过过滤收集所产生的沉淀物并在真空下干燥以产生呈白色粉末的标题化合物(648mg，92%)。+ESI(M+H)208.1;1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δ):13.43(s,1H),8.53(d,J=8.7Hz,1H),8.44-8.45(m,1H),8.14(d,J=8.4Hz,1H),8.07-8.11(m,1H),7.70(d,J=8.5Hz,1H)。
中间体44：如下制备下示2-((2,2,2-三氟乙基)氨基)喹啉-7-甲酸：
步骤1：喹啉-7-甲酸甲酯
标题化合物通过与中间体21的步骤3中所述的方法类似的方法，使用7-溴喹啉作为起始原料来制备。
步骤2：如下制备下示7-(甲氧羰基)喹啉1-氧化物：
将过乙酸(39.9mL，190mmol，在乙酸中，32%)加至喹啉-7-甲酸甲酯(17.8g，94.87mmol)在二氯甲烷中(315mL)的溶液。将反应在室温下搅拌过夜。添加过乙酸(10mL，48mmol，在乙酸中，32%)且将混合物搅拌5小时。用碳酸氢钠水溶液的饱和溶液稀释反应混合物。将水相萃取于二氯甲烷(2×1升)中。将萃取物合并，经过硫酸镁干燥，过滤和在减压下浓缩。通过快速层析法(在二氯甲烷中的2-15%甲醇)的纯化产生呈黄色固体的标题化合物(17.4g，90%)。1H NMR(400MHz,氯仿-d,δ):9.41(1H,s),8.56(1H,dd,J=6.0,0.8Hz),8.24(1H,dd,J=8.5,1.7Hz),7.93(1H,d,J=8.6Hz),7.75(1H,d,J=8.6Hz),7.39(1H,dd,J=8.6,6.0Hz),4.01(3H,s)。
步骤3：如下制备下示2-((2,2,2-三氟乙基)氨基)喹啉-7-甲酸甲酯：
经45分钟期间将4-甲基苯磺酸酐(964mg，2.95mmol)在0℃下分批加至7-(甲氧羰基)喹啉1-氧化物(200mg，0.984mmol)及2,2,2-三氟乙胺(292mg，0.295mmol)的溶液。使反应升温至室温并搅拌过夜。将反应用二氯甲烷稀释并用氯化铵的饱和溶液洗涤。将水层萃取于二氯甲烷(1x)中。将有机层合并，用盐水洗涤，经过硫酸镁干燥，过滤且在减压下浓缩。通过快速层析法的纯化产生标题化合物(172mg，62%)。+ESI(M+H)285.1。
步骤4：2-((2,2,2-三氟乙基)氨基)喹啉-7-甲酸
在室温下将氢氧化锂水溶液(1.82mL，1.82mmol，1M溶液)加至2-((2,2,2-三氟乙基)氨基)喹啉-7-甲酸甲酯(172mg，0.605mmol)在四氢呋喃(5mL)中的溶液。将反应搅拌2.5天。在减压下除去溶剂并用1N盐酸水溶液酸化残余物。将所产生的沉淀物过滤及干燥以产生标题化合物(65mg，40%)。+ESI(M+H)271.1,1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δ):4.31-4.41(m,2H)7.01(d,J=8.87Hz,1H)7.69-7.80(m,2H)8.06(d,J=8.66Hz,1H)8.14(s,1H)13.03(bs,1H)。
中间体45：如下制备下示2-((2,2-二氟丙基)氨基)喹啉-7-甲酸：
标题化合物通过与对于中间体44所述的方法类似的方法，使用2,2-二氟乙胺(而非2,2,2-三氟乙胺)制备。+ESI(M+H)267.2;1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δ):1.63(t,J=19.02Hz,3H)3.89-3.99(m,2H)6.97(d,J=8.97Hz,1H)7.54(t,1H)7.62-7.68(m,1H)7.71(d,J=8.19Hz,1H)7.96(d,J=9.10Hz,1H)8.06-8.09(m,1H)12.95(bs,1H)。
中间体46：如下制备下示7-氯-1H-苯并[d][1,2,3]三唑-5-甲酸：
在0℃下将水(2mL)加至3,4-二氨基-5-氯苯甲酸(125mg，0.67mmol)在浓硫酸(0.45mL)中的溶液。将反应混合物在0℃下搅拌1小时。将混合物留置搅拌过夜。将反应用水稀释，过滤所产生的沉淀物以产生呈棕色固体的标题化合物(124mg，94%)。+APCI(M+H)198.0;1H NMR(400MHz,甲醇-d4,δ):8.53(d,J=1.2Hz,1H),8.10(d,J=1.0Hz,1H)。
实施例1：1'-异丙基-1-(2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-5-羰基)-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(1'H)-酮
将1'-异丙基-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(1H)-酮盐酸盐(42mg，0.13mmol)、三乙胺(0.01mL，0.07mmol)及(1H-7-氮杂苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐(54.8mg，0.144mmol)加至2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-5-甲酸(42mg，0.13mmol)在二氯甲烷(2mL)中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌过夜。在真空中浓缩混合物，将所产生的固体溶解在乙酸乙酯中，用饱和碳酸氢钠洗涤，经过硫酸钠干燥，过滤，和在真空中浓缩。将残余物溶解在二甲亚砜(1mL)中，通过逆向HPLC纯化(管柱：Waters XBridge C1819x100，5μm；流动相A：在水中的0.03%NH4OH(v/v)；流动相B：
在乙腈中的0.03%NH4OH(v/v)；梯度：在8.5分钟内90%A/10%B线性至0%A/100%B，固定于0%A/100%B经10.0分钟；流速：25mL/分钟。+ESI(M+H)407.2；HPLC滞留时间1.74分钟(方法A)。
实施例2：1-(3,7-二甲基-1H-吲唑-5-羰基)-1'-异丙基-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(1'H)-酮
将三乙胺(0.75mL，5.4mmol)、4-二甲氨基吡啶(33mg，0.37mmol)及1-丙烷膦酸环酐(0.52mL，1.74mmol，在乙酸乙酯中，50%溶液)加至1'-异丙基-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(1'H)-酮盐酸盐(中间体2，430mg，1.3mmol)及3,7-二甲基-1H-吲唑-5-甲酸(306mg，1.6mmol)在二甲基甲酰胺(2mL)中的溶液，并将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物在真空中浓缩，溶解在乙酸乙酯中并用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤。将有机层经过硫酸钠干燥，过滤，和浓缩至固体。经由快速管柱层析(0-15%甲醇/二氯甲烷)纯化固体以提供玻璃状固体。将玻璃状固体在乙酸乙酯中搅拌16小时，通过真空过滤收集所产生的固体以提供呈白色固体的所要产物(138mg)。+ESI(M+H)421.0;1H NMR(400MHz,CD3OD,δ):7.65(s,1H)7.42(s,1H)7.21(s,1H)5.50(m,1H)3.95(br.s.,1H)3.50-3.62(br.s.,3H)2.97(s,2H)2.56(m,6H)1.83(br.s.,4H)1.44(d,6H)。
实施例3：1'-异丙基-1-(2-甲基-2H-吲唑-5-羰基)-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(1'H)-酮
将1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(37mg，0.19mmol)及1-羟基苯并三唑(26mg，0.19mmol)N,N-二异丙基乙胺(84μL，0.48mmol)加至2-甲基-2H-吲唑-5-甲酸(28mg，0.16mmol)在无水二甲基甲酰胺中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌10分钟，然后添加1'-异丙基-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(1'H)-酮盐酸盐(中间体2，30mg，0.12mmol)且将反应搅拌16小时。将混合物倒进冷却的水中，通过真空过滤收集所产生的沉淀物。从二乙基醚磨碎所得固体以提供1'-异丙基-1-(2-甲基-2H-吲唑-5-羰基)-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(1'H)-酮(25mg)。+ESI(M+H)407.3;1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δ):8.41(s,1H),7.85(s,1H),7.75(s,1H),7.63(d,1H),7.40(s,1H),7.20(s,1H),5.40(m,1H),4.18(s,3H),3.60(br.s.,4H),2.85(s,2H),1.70(br.s.,4H),1.35(d,6H)。
下表1中所列的化合物通过使用与上述用于合成实施例1-3的化合物的步骤类似的步骤，使用适当的起始原料(其是商业上可得的、使用本领域技术人员公知的制备法而制得的或以类似于上述用于其他中间体的路径的方式制得的)而制备。下列化合物被初步分离成游离碱，且可转化成用于测试的药学上可接受的盐。
表1
a=术语“iPr”用于指异丙基
b=术语“tBu”用于指叔丁基
下表2中所列的化合物通过使用与上述用于合成实施例1-3的化合物的步骤类似的步骤，使用适当的起始原料(其是商业上可得的、使用本领域技术人员公知的制备法而制得的或以类似于上述用于其他中间体的路径的方式制得的)而制备。下列化合物被初步分离成游离碱，且可转化成用于测试的药学上可接受的盐。
表2
a=术语“iPr”用于指异丙基
b=术语“tBu”用于指叔丁基
实施例99：2'-叔丁基-1-(7-甲氧基-1H-吲唑-5-羰基)-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(2'H)-酮
将三乙胺(0.05mL，0.37mmol)加至2'-叔丁基-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(2'H)-酮盐酸盐(中间体4，25mg，0.075mmol)及7-甲氧基-1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吲唑-5-甲酸(中间体18，25mg，0.090mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(0.4mL)中的混合物。将混合物搅拌5分钟。然后添加1-丙烷膦酸环酐(0.09mL，0.1mmol，在乙酸乙酯中的50%溶液)且将反应在室温下搅拌过夜。将反应用水稀释并用乙酸乙酯萃取(3x)。将合并的有机层用盐水洗涤，经过硫酸钠干燥，过滤，和浓缩至黄色胶状物。将盐酸(0.19mL，0.75mmol，在二恶烷中，4M)加至此粗制材料。将混合物在室温下搅拌过夜。浓缩反应。通过逆向HPLC的纯化产生标题化合物(3.4mg，10%)。+ESI(M+H)437.3；HPLC滞留时间2.12分钟(方法A)。
实施例100：1-(1-氨基异喹啉-7-羰基)-2'-叔丁基-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(2'H)-酮
步骤1：2'-叔丁基-1-(1-(4-甲氧基苯甲基氨基)异喹啉-7-羰基)-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(2'H)-酮
标题化合物通过与实施例3中所述的方法类似的方法，使用2'-叔丁基-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(2'H)-酮盐酸盐(中间体4)及1-(4-甲氧基苯甲基氨基)异喹啉-7-甲酸(中间体27)制备。+ESI(M+H)553.5。
步骤2：1-(1-氨基异喹啉-7-羰基)-2'-叔丁基-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(2'H)-酮
将苯甲醚(8.3μL，0.076mmol)加至2'-叔丁基-1-(1-(4-甲氧基苯甲基氨基)异喹啉-7-羰基)-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(2'H)-酮(28mg，0.051mmol)在三氟乙酸(0.51mL)中的溶液。将反应加热至65℃并搅拌19小时。浓缩反应。通过逆向HPLC的纯化产生标题化合物(7.1mg，32%)。+ESI(M+H)433.2；HPLC滞留时间1.79分钟(方法A)。
实施例101：1-(1-氨基异喹啉-6-羰基)-2'-叔丁基-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(2'H)-酮
标题化合物通过与实施例100中所述的方法类似的方法，在步骤1中使用1-(4-甲氧基苯甲氨基)异喹啉-6-甲酸(中间体30)而制备。+ESI(M+H)433.2；HPLC滞留时间1.82分钟(方法A)。
实施例102：2'-叔丁基-1-(3-甲氧基异喹啉-6-羰基)-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(2'H)-酮
将2'-叔丁基-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(2'H)-酮盐酸盐(中间体4，244mg，0.727mmol)及乙酸钠(130mg，1.5mmol)加至6-溴-3-甲氧基异喹啉(中间体43，89.9mg，0.378mmol)在1,4-二恶烷(6mL)中的溶液。将氮气气泡通过混合物经15分钟。然后添加[1,1'-双(二苯膦基)二茂铁]-二氯钯(II)(与二氯甲烷的配合物)(102mg，0.125mmol)，将反应容器加盖，通入一氧化碳气体经5分钟。然后将反应加热至80℃经18小时。将反应冷却至室温并用乙酸乙酯稀释。将混合物通过硅藻土过滤，浓缩滤液。通过逆向HPLC的纯化产生标题化合物。+ESI(M+H)448.1；HPLC滞留时间2.26分钟(方法A)。
实施例103：2'-叔丁基-1-(1-(二甲氨基)异喹啉-7-羰基)-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(2'H)-酮
步骤1：2'-叔丁基-1-(1-氯异喹啉-7-羰基)-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(2'H)-酮
标题化合物通过与实施例2所述的方法类似的方法，使用2'-叔丁基-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(2'H)-酮盐酸盐(中间体4)及1-氯异喹啉-7-甲酸，并省略4-二甲氨基吡啶而制备。+ESI(M+H)452.3;1H NMR(400MHz,CDCl3,δ):8.37(s,1H),8.32(d,J=5.7Hz,1H),7.89(d,J=8.4Hz,1H),7.75-7.79(m,1H),7.62(d,J=5.7Hz,1H),7.39(s,1H),6.42(s,1H),3.43-3.73(m,4H),2.87(s,2H),1.64-2.01(m,4H),1.61(s,9H)。
步骤2：2'-叔丁基-1-(1-(二甲氨基)异喹啉-7-羰基)-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(2'H)-酮
将二甲胺在甲醇中的溶液(1.75mL，3.50mmol，2M)加至2'-叔丁基-1-(1-氯异喹啉-7-羰基)-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(2'H)-酮(158mg，0.350mmol)。将反应密封且将混合物加热至60℃并搅拌65小时。将反应冷却至室温和浓缩。通过快速管柱层析(1-15%甲醇/二氯甲烷)的纯化产生呈白色固体的标题化合物(99mg，61%)。+APCI(M+H)461.4;1H NMR(400MHz,CDCl3,δ):8.16-8.20(m,1H),8.12(d,J=5.9Hz,1H),7.75(d,J=8.2Hz,1H),7.58-7.64(m,1H),7.37(s,1H),7.14(d,J=5.9Hz,1H),6.00(br.s.,1H),3.40-3.71(m,4H),3.10-3.28(m,6H),2.85(s,2H),1.64-1.99(m,4H),1.60(s,9H)。
实施例104：2'-叔丁基-1-(2-氯喹啉-7-羰基)-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(2'H)-酮
标题化合物通过与实施例3中所述的方法类似的方法，使用2'-叔丁基-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(2'H)-酮盐酸盐(中间体4)及2-氯喹啉-7-甲酸(中间体44)制备。+ESI(M+H)452.3;1H NMR(400MHz,CDCl3,δ):8.12(d,J=8.2Hz,1H),7.98(br.s.,1H),7.88(dd,J=8.4Hz,1H),7.61(dd,J=8.4,1.6Hz,1H),7.44(d,J=8.6Hz,1H),7.39(s,1H),5.91(br.s.,1H),4.06-4.22(m,1H),3.38-3.64(m,3H),2.85(br.s.,2H),1.67-1.97(m,4H),1.61(s,9H)。
实施例105：2'-叔丁基-1-(2-(二甲氨基)喹啉-7-羰基)-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(2'H)-酮
将二甲胺在四氢呋喃中的溶液(2.2mL，4.4mmol，2.0M)加至2'-叔丁基-1-(2-氯喹啉-7-羰基)-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(2'H)-酮(100mg，0.2mmol)。将反应容器密封且将混合物加热至70℃经15小时。将反应冷却至室温并浓缩。通过逆向HPLC的纯化产生标题化合物(25mg，25%)。+ESI(M+H)461.2；HPLC滞留时间1.96分钟(方法A)。
下表3中所列的化合物通过使用与上述用于合成实施例105的化合物的步骤类似的步骤，使用适当的起始原料(其是商业上可得的、使用本领域技术人员公知的制备法而制得的或以类似于上述用于其他中间体的路径的方式制得的)而制备。下列化合物被初步分离成游离碱，且可转化成用于测试的药学上可接受的盐。
表3
下表4中所列的化合物通过使用与上述用于合成实施例1-3的化合物的步骤类似的步骤，使用适当的起始原料(其是商业上可得的、使用本领域技术人员公知的制备法而制得的或以类似于上述用于其他中间体的路径的方式制得的)而制备。下列化合物被初步分离成游离碱，且可转化成用于测试的药学上可接受的盐。
表4
a=术语“tBu”用于指叔丁基
下表5中所列的化合物通过使用与上述用于合成实施例103的化合物的步骤类似的步骤，使用适当的起始原料(其是商业上可得的、使用本领域技术人员公知的制备法而制得的或以类似于上述用于其他中间体的路径的方式制得的)而制备。下列化合物被初步分离成游离碱，且可转化成用于测试的药学上可接受的盐。
表5
实施例123：2'-(叔丁基)-1-(1-(叔丁氨基)异喹啉-7-羰基)-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(2'H)-酮
步骤1：1-氯异喹啉-7-甲酸
将n-BuLi(3.96mL，9.9mmol，在己烷中，2.5M)加至7-溴-1-氯异喹啉(2.000g，8.247mmol)在THF(12mL)及二乙基醚(12mL)中的冷却至-78℃的悬浮液。搅拌五分钟，然后用针通入一氧化碳同时排气大约一分钟。将反应混合物加热至0℃及添加15mL的1N氢氧化钠水溶液。将混合物用二乙基醚稀释，搅拌18小时。将有机层及水层分离并用1N氢氧化钠水溶液及水洗涤有机物。合并水性部分且用1N盐酸水溶液酸化至pH4。通过过滤收集所产生的固体并干燥以产生标题化合物(1.252g，73%)。+ESI(M+H)208.11H NMR(400MHz,DMSO-d6)d ppm13.58(br.s.,1H)8.86(m,1H)8.43(d,J=5.67Hz,1H)8.33(dd,J=8.61,1.57Hz,1H)8.19(d,J=8.41Hz,1H)8.01(dd,1H)。
步骤2：2'-(叔丁基)-1-(1-(叔丁氨基)异喹啉-7-羰基)-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(2'H)-酮
将叔丁胺(0.254mL，2.41mmol)加至1-氯异喹啉-7-甲酸(100mg，0.482mmol)、RuPhos(6.5mg，0.014mmol)、BrettPhos(11.2mg，0.014mmol)及叔丁醇钠(70.2mg，0.723mmol)在二恶烷(0.5mL)中的悬浮液。密封容器，将混合物加热至110℃并搅拌过夜。将反应冷却至室温，添加双三甲基甲硅烷基基酰胺锂(0.136mL，0.723mmol)。将反应混合物加热至110℃且留置搅拌过夜。将反应混合物冷却至室温，通过硅藻土过滤并用甲醇冲洗。在减压下浓缩滤液且添加1N氢氧化钠水溶液(1mL)。在乙酸乙酯与水和1N氢氧化钠水溶液的混合物之间进行分溶。分离层并将水层酸化至pH4。将水层萃取于乙酸乙酯中。将萃取物经过硫酸镁干燥，过滤和在减压下浓缩以获得1-(叔丁氨基)异喹啉-7-甲酸。
将三乙胺(0.07mL，0.50mmol)加至1-(叔丁氨基)异喹啉-7-甲酸(24.7mg，0.101mmol)及2'-叔丁基-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(2'H)-酮盐酸盐(33.9mg，0.101mmol)在N,N-二甲基甲酰胺中(1mL)的悬浮液。将反应混合物在室温下搅拌10分钟。然后添加1-丙烷膦酸环酐(0.07mL，0.12mmol，在乙酸乙酯中的50%溶液)，将反应混合物在室温下搅拌过夜。在减压下除去N,N-二甲基甲酰胺，通过逆向HPLC纯化残余物以产生2'-(叔丁基)-1-(1-(叔丁氨基)异喹啉-7-羰基)-4',6'-二氢螺[哌啶-4,5'-吡唑并[3,4-c]吡啶]-7'(2'H)-酮(6.1mg，24%)。+ESI(m+H)489.3；HPLC滞留时间2.94分钟(方法B)。
下表6中所列的化合物通过使用与上述用于合成实施例1-3的化合物的步骤类似的步骤，使用适当的起始原料(其是商业上可得的、使用本领域技术人员公知的制备法而制得的或以类似于上述用于其他中间体的路径的方式制得的)而制备。下列化合物被初步分离成游离碱，且可转化成用于测试的药学上可接受的盐
表6
药理数据
生物学实验方案
本发明化合物用于治疗动物(特别是哺乳动物，例如人)的疾病(例如本文中描述的那些)的用途，可以通过其在本领域技术人员已知的常规测定(包括下述体外和体内测定)中的活性来证明。此类测定还提供了可将本发明化合物的活性与其他已知化合物的活性相比较的方法。
ACC1和ACC2的活性的直接抑制
通过基于标准步骤的方法来证明本发明化合物的ACC抑制活性。例如，使用重组人类ACC1(rhACC1)和重组人类ACC2(rhACC2)的制备物来测定式(1)化合物对ACC活性的直接抑制。可用于测定的重组人类ACC1和ACC2的代表性序列分别提供于图1(SEQ ID NO.1)和图2(SEQID NO.2)中。
[1]rhACC1的制备。将2L的用包含全长人类ACC1cDNA的重组杆状病毒感染的SF9细胞悬浮在冰冷却的裂解缓冲液(25mM Tris，pH7.5；150mM NaCl；10%甘油；5mM咪唑(EMD Bioscience；Gibbstown，NJ)；2mM TCEP(BioVectra；Charlottetown，加拿大)；Benzonase核酸酶(10000U/100g细胞沉淀；Novagen；Madison，WI)；无EDTA-蛋白酶抑制剂混合物(1片/50mL；Roche Diagnostics；Mannheim，德国)中。细胞通过3轮的冷冻-解冻进行裂解，且以40,000Xg离心40分钟(4℃)。将上清液直接装载入HisTrap FF粗制管柱(GEHealthcare；Piscataway，NJ)中并用高至0.5M的咪唑梯度用20倍管柱体积(CV)进行洗脱。混合包含ACC1的级分，且用25mM Tris，pH7.5，2mM TCEP，10%甘油以1：5稀释，且直接装载入CaptoQ(GEHealthcare)管柱且用NaCl梯度(高至1M)用20倍CV进行洗脱。通过用λ磷酸酶(100U/10μM目标蛋白质；New England Biolabs；Beverly，MA)在4℃下温育14小时，从经纯化的ACC1除去磷酸基团；添加冈田酸(okadaic acid)(1μM最终浓度；Roche Diagnostics)以抑制磷酸酶。通过在4℃下透析6小时将经纯化的ACC1交换至25mM Tris，pH7.5，2mM TCEP，10%甘油，0.5M NaCl中。制备等分试样且冷冻于-80℃。
[2]rhACC1抑制的测量。使用Transcreener ADP检测FP测定试剂盒(Bellbrook Labs，Madison，Wisconsin)，在Costar#3676(Costar，Cambridge，MA)384-孔板中，使用制造者所推荐的用于50μM ATP反应的条件测定hACC1。测定的最终条件为50mM HEPES、pH7.2、10mM MgCl2、7.5mM柠檬酸三钾、2mM DTT，0.1mg/mL BSA、30μM乙酰辅酶A、50μM ATP和10mM KHCO3。通常，10μL反应在25℃下进行120分钟，然后添加10μL Transcreener停止与检测缓冲剂且将组合物在室温下温育另外1小时。使用620激发Cy5FP一般双镜、620激发Cy5FP滤器、688发射(S)和688(P)发射滤器，在Envision荧光读数计(PerkinElmer)上获得数据。
[3]rhACC2的制备。使用经纯化的重组人类ACC2(hrACC2)测量人类ACC2抑制。简单地说，从Cambridge Bioscience Limited购得ACC2的全长Cytomax克隆，进行测序，并将其亚克隆到PCDNA5FRTTO-TOPO(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。通过四环素诱导将ACC2表达于CHO细胞中，并收获于5L的具有谷氨酰胺、生物素、潮霉素和杀稻瘟素(blasticidin)的DMEM/F12与1μg/mL四环素中(Invitrogen，Carlsbad，CA)。然后将包含ACC2的条件培养基应用至Softlink Soft Release Avidin管柱(Promega，Madison，Wisconsin)并用5mM生物素进行洗脱。以0.05mg/mL的浓度(通过A280测定)洗脱4mg的ACC2，其具有95%的估计的纯度(通过A280测定)。在50mM Tris、200mM NaCl、4mM DTT、2mM EDTA和5%甘油中透析经纯化的ACC2。将收集的蛋白质冷冻和储存于-80℃，且融解时没有活性损失。为了进行ACC2活性的测量和ACC2抑制的评估，将测试化合物溶解在DMSO中，并以具有1%的终DMSO浓度的5x储备液的形式添加至rhACC2酶。
[4]人类ACC2抑制的测量。使用Transcreener ADP检测FP测定试剂盒(Bellbrook Labs，Madison，Wisconsin)，在Costar#3676(Costar，Cambridge，MA)384-孔板中，使用制造者所推荐的用于50μM ATP反应的条件测定hACC2。测定的最终条件为50mM HEPES、pH7.2、5mM MgCl2、5mM柠檬酸三钾、2mM DTT，0.1mg/mL BSA、30μM乙酰辅酶A、50μM ATP和8mM KHCO3。通常，10μL反应在25℃下进行50分钟，然后添加10μL Transcreener停止与检测缓冲剂且将组合物在室温下温育另外1小时。使用620激发Cy5FP一般双镜、620激发Cy5FP滤器、688发射(S)和688(P)发射滤器，在Envision荧光读数计(PerkinElmer)上获得数据。
关于上述实施例中所例示的式(I)化合物，使用上述重组hACC1和重组hACC2Transcreener测定所获得的结果概述在下表中。
“n”用于指测定次数。
序列表1提供了可用于Transcreener体外测定的重组人类ACC1的序列(SEQ.ID NO.1)。
序列表2提供了可用于Transcreener体外测定的重组人类ACC2的序列(SEQ.ID NO.2)。
实验动物的ACC抑制的急性体内评估
可通过评估其减少来自处理的动物的肝脏和肌肉组织中的丙二酰基-辅酶A水平的能力，而体内证实本发明化合物的ACC抑制活性。
可使用下列方法测量实验动物中丙二酰基-辅酶A产生的抑制。
在该方法中，在研究之前，将维持于任意采食标准饲料和水的雄性Sprague-Dawley大鼠(225-275g)随机化。在实验开始之前，给动物喂食或禁食18小时。进入光周期2小时前，给动物口服施用5mL/kg(0.5%甲基纤维素；媒介物)或适当化合物(制备于媒介物中)。喂食媒介物对照用于测定丙二酰基-辅酶A的基线组织水平，而禁食动物用于测定禁食对丙二酰基-辅酶A水平的影响。施用化合物一小时之后，用CO2使动物窒息且取出组织。特别地，通过心脏穿刺收集血液，且将其置于包含EDTA的BD Microtainer管(BD Biosciences,NJ)中，混合并放在冰上。血浆用于测定药物暴露。取出肝脏和四头肌，立刻冻结夹紧，包装在箔纸中并储存在液氮中。
在液态N2下将组织粉末化以确保取样的均匀性。在FastPrepFP120(Thermo Scientific，速度=5.5；经45秒)中，用5倍体积的在Lysing Matrix A(MP Biomedicals,PN6910)中的10%三羧酸从组织(150-200mg)中提取丙二酰基-辅酶A。以15000xg离心30分钟(Eppendorf Centrifuge5402)之后，从细胞碎片中移出包含丙二酰基-辅酶A的上清液。将样品稳定冷冻在-80℃直到完成分析。
可使用下列方法评估分析肝脏和肌肉组织中的丙二酰基辅酶A水平。
该方法利用下列材料：丙二酰基-辅酶A四锂盐和丙二酰基-13C3-辅酶A三锂盐，其购自Isotec(Miamisburg，OH，USA)、过氯酸钠(Sigma，目录号410241)、三氯乙酸(ACROS，目录号42145)、磷酸(J.T.Baker，目录号0260-01)、甲酸铵(Fluka，目录号17843)、甲醇(HPLC等级，J.T.Baker，目录号9093-33)和水(HPLC等级，J.T.Baker，4218-03)用于制造所需的移动相。Strata-X在线固相萃取管柱，25μm,20mm x2.0mm I.D(目录号00M-S033-B0-CB)获自Phenomenex(Torrance，CA，USA)。SunFire C18逆相管柱，3.5μm,100mm x3.0mm I.D.(目录号186002543)购自Waters公司(Milford，MA，USA)。
该方法可利用下列设备进行。使用Agilent1100二元泵、Agilent1100四元泵和2个Valco Cheminert6-通道二位置阀的二维层析。样品经由具有保持于10℃的Peltier冷却堆栈和20μL取样回路的LEAPHTC PAL自动取样器引入。用于自动取样器的针洗液为用于洗涤1的10%三氯乙酸的水溶液(w/v)和用于洗涤2的90：10甲醇：水。使用MicroTech Scientific Micro-LC Column Oven将分析型管柱(Sunfire)维持在35℃。洗脱液在具有Turbo Ion Spray的ABI Sciex API3000三重四极杆质谱仪上进行分析。
使用用于在线固相萃取和逆相层析的不同梯度洗脱条件平行实施二维层析。该方法的一般设计为，第一维用于样品清除和目的分析物的捕获，接着用于从第一维洗脱至第二维的二个维度的简单偶联。随后，解偶联维度，以允许用于定量的来自第二维的分析物的梯度洗脱，同时按顺序制备用于下个样品的第一维。当二个维度简单偶联在一起时，移动相在第一维中的流动与第二维上的分析物洗脱逆向，从而允许获得最佳峰宽、峰形和洗脱时间。
HPLC系统的第一维利用Phenomenex strata-X在线固相萃取管柱，且移动相由用于溶剂A的100mM过氯酸钠/0.1%(v/v)磷酸和用于溶剂B的甲醇组成。
HPLC系统的第二维利用Waters SunFire C18逆相管柱，且移动相由用于溶剂A的100mM甲酸铵和用于溶剂B的甲醇组成。将梯度的初始条件维持2分钟，在此期间将分析物转移到分析管柱。重要的是，初始条件具有足够的强度，以从在线SPE管柱洗脱分析物，而将其保持在分析管柱上。然后，在洗涤和再平衡步骤之前，于4.5分钟内将梯度线性增加至74.5%A。
当与HPLC偶联时，质谱法是用于定量测量复杂基质中的分析物的高选择性和高敏感的方法，但其仍受到干扰和抑制。通过将二维HPLC与质谱仪偶联，这些干扰被显著减少。此外，通过利用三重四极杆质谱仪的多重反应监测(MRM)特征，信噪比被显著改良。
对于该测定，以2250V的TurboIonSpray电压、以正离子模式运行质谱仪。将雾化气体加热至450℃。将去簇电位(DP)、聚焦电位(FP)和碰撞能量(CE)分别设定为60、340和42V。四极杆1(Q1)分辨率设定为单位分辨率，且四极杆3(Q3)设定为低。CAD气体设定为8。监测的MRM转变，对于丙二酰基辅酶A为：854.1→347.0m/z(L.Gao等人(2007)J.Chromatogr.B853，303-313)；和对于丙二酰基-13C3-辅酶A为：857.1→350.0m/z，具有200ms的驻留时间。在分析物的预期洗脱时间附近将洗脱液转移到质谱仪，否则将其转移至废料以帮助保存来源和改善仪器的耐久性。使用Analyst软件(AppliedBiosystems)将所产生的层析图积分。从在三氯乙酸的10%水溶液中制得的标准曲线计算丙二酰基辅酶A的组织浓度。
包含用于定量组织提取物中的丙二酰基-辅酶A的标准曲线的样品制备于10%(w/v)三氯乙酸(TCA)中且范围为0.01至1pmol/μL。将丙二酰基-13C3-辅酶A(0.4pmol/μL的终浓度)加至各标准曲线成份且样品用作内标准物。
制备六个测定内质量对照；三个来自从禁食动物制备的混合提取物和三个来自从喂食动物制备的混合提取物。这些作为独立样品(掺入了0、0.1或0.3pmol/μL12C-丙二酰基-辅酶A以及丙二酰基-13C3-辅酶A(0.4pmol/μL))进行分析。各测定内质量对照包含85%的组织提取物水溶液，且其余部分由内标准物(0.4pmol/μL)和12C-丙二酰基-辅酶A构成。在各操作中包括测定间对照；它们由一个禁食的和一个喂食的四头肌(quadriceps)混合样品和/或一个禁食的和一个喂食的肝脏混合样品组成。所有此类对照掺入了丙二酰基-13C3-辅酶A(0.4pmol/μL)。
本申请中所列举的所有刊物(包括但不限制于授权的专利、专利申请、及期刊文章)各自以其全文通过引用并入本文中。
虽然已参考所公开的实施方案描述了本发明，但本领域技术人员将理解：所详述的具体试验只用于举例说明本发明。应理解，可进行各种修改，而不背离本发明的精神。因此，本发明只受限于下列权利要求。

Claims (2)

1.一种具有以下结构的化合物，
或其药学上可接受的盐。
2.一种药物组合物，其包含治疗有效量的权利要求1的化合物或其药学上可接受的盐，及药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
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