CN103175723B - 激光共聚焦扫描显微镜高分子纤维可视化的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种激光共聚焦扫描显微镜高分子纤维可视化的制备方法，其特征在于包括如下步骤：高分子材料溶解在有机溶剂中，加入荧光染料，进行静电纺丝的制备，得到包裹了荧光染料的高分子纤维；将制备的高分子纤维浸泡在水中，洗去表面残余的荧光染料；进行紫外灭菌；接种上细胞，将细胞用荧光染料标记后，用激光共聚焦显微镜观察。与单纯的细胞激光共聚焦图片对比，有高分子纤维的承托，图像更有空间感、画面得更加真实。运用此方法，可以在同一时间，通过激光共聚焦显微镜直接观察活细胞在高分子纤维上的数量、分布和形态；也可以利用激光共聚焦显微镜配套的活细胞培养舱，在同一位置，连续地直接观察活细胞在高分子纤维上的数量、分布和形态成为可能。
Description
技术领域
本发明涉及一种高分子纤维可视化的制备方法，特别是涉及一种激光共聚焦扫描显微镜高分子纤维可视化的制备方法，用于直接观察细胞和高分子纤维相互作用，属于激光共聚焦显微镜成像领域。
背景技术
激光共聚焦显微镜是在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置，利用计算机进行图像处理，在光学成像的基础上将分辨率提高了30-40％，扩大了传统荧光显微镜的运用范围，成为形态学，分子生物学，神经科学，药理学，遗传学等领域中新一代强有力的研究工具。
目前为止，在组织工程领域，激光共聚焦显微镜主要用于观察：(1)各种细胞活细胞群体的数量、分布和形态；(2)细胞及组织的内部微细结构的荧光图像或亚细胞结构的的荧光图像；(3)细胞内部活细胞间的信号传递，如亚细胞水平上观察诸如Ca2+、pH值，膜电位等生理信号；。(4)断层扫描与三维重建等模拟成像能力。
组织工程领域中，往往需要将细胞种植在生物材料基质(如高分子纤维)上，通过荧光染色后，再传统的进行激光共聚焦扫描显微镜观察的观察。在观察中，只有细胞能通过荧光染料显现出，而生物材料基质无法显示，细胞在高分子纤维上生长，只是单纯的将细胞染色，直接观察细胞在高分子纤维上的数量、分布及形态。这种忽视了生物材料基质(如高分子纤维)在激光共聚焦扫描显微镜中显现的观察方法，使的其得到的荧光图片缺乏高分子纤维的承托，图像缺乏空间感。
现在的研究中，没有刻意将生物材料基质在激光共聚焦显微镜中可视化便于观察的报道。以高分子纤维作为生物材料基质为例，通常会采用下面两种方法表示：
(1)高分子纤维用激光共聚焦显微镜的光学明场显示。由于高分子纤维不喊任何荧光物质，在常规的激光共聚焦显微镜设定激光的激发下均无荧光图像的采集，只能用明场表示(Mo等，2004)。明场图片以白色为底色，荧光图片以黑色为底色，二者重叠后，图像更模糊，所以少有报道将两种图片重叠；同时，激光共聚焦显微镜的明场成像特点要求材料的透光性必须较好，透光性越好，成像效果越清晰，透光性越差，成像效果越模糊，直至最终完全没有成像效果。这导致了较厚的高分子纤维和其他生物材料基质无法观察。
(2)小分子物质自组装，导致高分子纤维间接成像。存在一大类高分子纤维间接成像的报道，将一些小分子物质，如有利于细胞粘附的精氨酸(R)-甘氨酸(G)-天冬氨酸(D)(RGD)序列，通过自组装的形式粘附在高分子纤维表面加强生物相容性。为了观察RGD序列是否粘附，常常用荧光物质标记上述小分子。当RGD序列大量粘附于高分子纤维表面，高分子纤维在激光共聚焦显微镜下观察为明显的荧光成像(Grafahrend等，2010)。虽然本方法可以间接直接使高分子纤维成像。但其初衷并非是将高分子纤维可视化便于激光共聚焦显微镜观察，而是用于判断小分子自组装能力；同时，高分子纤维是通过小分子与细胞间接地相互作用，并非高分子纤维直接与细胞直接作用，不利于直接判定高分子纤维对细胞的数量、分布和形态等的影响。
无论是哪种方法都不能真正地清晰地在激光共聚焦显微镜下直接观察生物材料基质与细胞。所以，为了增强激光共聚焦显微镜图片的空间感，解决上述问题，需要一种能普遍地将生物材料基质(如高分子纤维)在激光共聚焦显微镜下可视化的制备方法，用于观察细胞的同时，直接观察生物材料基质。
发明内容
本发明的目的是提供一种在激光共聚焦显微镜下高分子纤维的可视化的方法，可直接用激光共聚焦显微镜观察生物材料，及同时观察细胞在生物材料上生长情况。
本方法的目的在于实现4种可能：(1)将高分子纤维染上颜色，可以再在激光共聚焦显微镜下直接观察高分子纤维的形貌成为可能；(2)在同一时间，在材料高分子纤维可视化的同时，通过激光共聚焦显微镜直接观察固定后的细胞在高分子纤维上的数量、分布和形态成为可能；(3)在同一时间，在材料高分子纤维可视化的同时，通过激光共聚焦显微镜直接观察活细胞在高分子纤维上的数量、分布和形态成为可能；(4)利用激光共聚焦显微镜配套的活细胞培养舱，在同一位置，在材料高分子纤维可视化的同时，通过激光共聚焦显微镜，连续地直接观察活细胞在高分子纤维上的数量、分布和形态成为可能。
为达到以上目的，本发明采用了如下的方法：
一种激光共聚焦扫描显微镜高分子纤维可视化的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)高分子材料溶解在有机溶剂中，加热并冷凝回流至共聚物完全溶解，形成溶液I；
(2)溶液I中加入荧光染料A，搅拌溶解至完全溶解，形成溶液II；
(3)溶液II装入到喷雾装置中的玻璃注射器中，进行静电纺丝的制备，得到包裹了荧光染料A的高分子纤维；
(4)所制备的高分子纤维浸泡在水中，常温下恒温摇床摇晃3～7天，以洗去高分子纤维表面残余的荧光染料A；
(5)将处理后的高分子纤维进行紫外灭菌处理1～2小时；
(6)将灭菌处理的高分子纤维接种上细胞，37℃，5.0％二氧化碳的细胞培养箱中培养；
(7)将细胞用荧光染料标记后，用激光共聚焦显微镜观察，可以选择如下方法中的一种：
a)将细胞用多聚甲醛或甲醛固定后，用荧光染料B将细胞进行标记，即可通过激光共聚焦显微镜直接观察到高分子纤维及其表面生长的细胞；
b)将细胞直接用荧光染料C进行活细胞标记，即可通过激光共聚焦显微镜直接观察到高分子纤维及其表面生长的活细胞；
c)将细胞直接用荧光染料D进行活细胞标记，在激光共聚焦显微镜配套的活细胞培养舱中继续培养，即可通过激光共聚焦显微镜时时动态观察高分子纤维及其表面生长的细胞。
步骤(1)所述有机溶剂为氯仿，二氯甲烷，N，N-二甲基甲酰胺，乙酸乙酯中的一种或其组合。
溶液I中所述高分子材料的浓度为1～15％(g/100ml)；溶液II中所述高分子材料的浓度为1～15％(g/100ml)，荧光染料A的浓度为0.05～0.5％(g/100ml)。
所述静电纺丝的制备具体操作如下：注射速率为0.1～0.6ml/小时，针尖正极与基片负极间产生5000～12000伏的高压，针尖到接收装置之间的距离为10～30mm，用玻璃片收集经过静电纺丝喷出高分子纤维，收集时间为15～120分钟。
所述荧光染料A为罗丹明B，异或硫氰罗丹明B，或其他对细胞没有刺激作用的荧光染料，优先选择异硫氰罗丹明B。
所述荧光染料B为标记多聚甲醛或甲醛固定后细胞的荧光染料，为钙黄绿素，或鬼笔环肽，优先选择鬼笔环肽。
所述荧光染料C为标记活细胞的荧光染料，为钙黄绿素乙酰甲酯，或二乙酸荧光素，优先选择二乙酸荧光素。
所述荧光染料D为长时间标记活细胞的荧光染料，为钙黄绿素乙酰甲酯，或二乙酸荧光素，优先选择钙黄绿素乙酰甲酯。
所述高分子材料为聚乳酸，聚3-羟基丁酸酯，聚乳酸-乙醇酸，聚己内酯，聚(乳酸-乙烯酸)中的一种或其组合。
所述高分子纤维的平均直径为0.9～4.0μm。
本发明涉及一种在激光共聚焦显微镜下高分子纤维的可视化的制备方法，可直接用激光共聚焦显微镜观察高分子纤维及表面种植的细胞的生长情况情况。高分子纤维包裹了荧光染料，可以通过激光共聚焦显微镜成像，与单纯的细胞激光共聚焦图片对比，有高分子纤维的承托，图像更有空间感、画面得更加真实。运用此方法，可以在同一时间，通过激光共聚焦显微镜直接观察活细胞在高分子纤维上的数量、分布和形态；也可以利用激光共聚焦显微镜配套的活细胞培养舱，在同一位置，连续地直接观察活细胞在高分子纤维上的数量、分布和形态成为可能。
附图说明
图1为包裹了异硫氰罗丹明B的纳米纤维膜表面种植细胞的激光共聚焦显微镜图。
A为明场；B为细胞；C为纳米纤维膜；D为图A、B和C的重叠图。
具体实施方式
实施例1：
称聚乳酸0.2g，将其置入20ml二氯甲烷溶剂中，加热并冷凝回流溶解1小时，直至共聚物完全溶解，溶液呈无色透明状。在上述溶液中加入10mg的红色染料异硫氰罗丹明B，搅拌溶解至红色透明液体。装入到喷雾装置中的玻璃注射器中，使得其注射速率为0.3ml/小时，针尖正极与基片负极间产生10000伏的高压，针尖到接收装置之间的距离为30mm，用玻璃片收集经过静电纺丝喷出的包裹了异硫氰罗丹明B的聚乳酸纤维，收集时间为15分钟。将上述包裹了异硫氰罗丹明B的聚乳酸纳米纤维浸泡在200ml纯水中，常温下恒温摇床摇晃3天，以洗去纳米纤维表面残余的异硫氰罗丹明B。将处理后的聚乳酸纳米纤维进行紫外灭菌2小时。
将灭菌处理的聚乳酸纳米纤维膜片剪切成一定大小的纤维膜片，分别接种上5.0×105个细胞/cm2。37℃，5.0％二氧化碳的细胞培养箱中分别培养6小时和24小时。用荧光染料荧光素双醋酸酯将细胞标记上绿色，调整发射波长和滤光片，即可通过激光共聚焦显微镜观察到红色的聚乳酸纳米纤维对绿色荧光的活细胞的粘附能力。结果表明，观察到的红色的聚乳酸纳米纤维之间距离较疏松，培养6小时和24小时的样品中均只有少量的发绿色荧光的细胞粘附在红色的聚乳酸纳米纤维表面。红色的聚乳酸纳米纤维的平均直径见表1。粘附在红色的聚乳酸纳米纤维的细胞数量见表2。
另将灭菌处理的聚乳酸纳米纤维膜片剪切成一定大小的纤维膜片，分别接种上5.0×104个细胞/cm2。37℃，5.0％二氧化碳的细胞培养箱中分别培养24小时。用荧光染料钙黄绿素乙酰甲酯将细胞标记上绿色，在激光共聚焦显微镜配套的活细胞培养舱中继续培养48小时。继续在调整发射波长和滤光片，即可通过激光共聚焦显微镜及时动态观察绿色荧光的活细胞在红色的聚乳酸纳米纤维的增殖和移动。粘附在红色的聚乳酸纳米纤维的细胞数量见表3。
实施例2：
称聚乳酸1g，将其置入18ml二氯甲烷和2mlN，N-二甲基甲酰胺的混合溶剂中，加热并冷凝回流溶解1小时，直至共聚物完全溶解，溶液呈无色透明状。在上述溶液中加入20mg的红色染料异硫氰罗丹明B，搅拌溶解至红色透明液体。装入到喷雾装置中的玻璃注射器中，使得其注射速率为0.3ml/小时，针尖正极与基片负极间产生5000伏的高压，针尖到接收装置之间的距离为20mm，用玻璃片收集经过静电纺丝喷出的包裹了异硫氰罗丹明B的聚乳酸纤维，收集时间为120分钟。将上述包裹了异硫氰罗丹明B的聚乳酸纳米纤维浸泡在400ml纯水中，常温下恒温摇床摇晃4天，以洗去纳米纤维表面残余的异硫氰罗丹明B。将处理后的聚乳酸纳米纤维进行紫外灭菌2小时。
将灭菌处理的聚乳酸纳米纤维膜片剪切成一定大小的纤维膜片，分别接种上5.0×105个细胞/cm2。37℃，5.0％二氧化碳的细胞培养箱中分别培养6小时和24小时。用荧光染料荧光素双醋酸酯将细胞标记上绿色，调整发射波长和滤光片，即可通过激光共聚焦显微镜观察到红色的聚乳酸纳米纤维对绿色荧光的活细胞的粘附能力。结果表明，观察到的红色的聚乳酸纳米纤维之间距离较疏松，培养6小时和24小时的样品中均只有少量的发绿色荧光的细胞粘附在红色的聚乳酸纳米纤维表面。红色的聚乳酸纳米纤维的平均直径见表1。粘附在红色的聚乳酸纳米纤维的细胞数量见表2。
另将灭菌处理的聚乳酸纳米纤维膜片剪切成一定大小的纤维膜片，分别接种上5.0×104个细胞/cm2。37℃，5.0％二氧化碳的细胞培养箱中分别培养24小时。用荧光染料钙黄绿素乙酰甲酯将细胞标记上绿色，在激光共聚焦显微镜配套的活细胞培养舱中继续培养48小时。继续在调整发射波长和滤光片，即可通过激光共聚焦显微镜及时动态观察绿色荧光的活细胞在红色的聚乳酸纳米纤维的增殖和移动。粘附在红色的聚乳酸纳米纤维的细胞数量见表3。
实施例3：
称1g聚乳酸和1g聚己内酯，将其置入20ml二氯甲烷溶剂中，加热并冷凝回流溶解1小时，直至共聚物完全溶解，溶液呈无色透明状。在上述溶液中加入100mg的红色染料异硫氰罗丹明B，搅拌溶解至红色透明液体。装入到喷雾装置中的玻璃注射器中，使得其注射速率为0.1ml/小时，针尖正极与基片负极间产生5000伏的高压，针尖到接收装置之间的距离为15mm，用玻璃片收集经过静电纺丝喷出的包裹了异硫氰罗丹明B的聚乳酸纤维，收集时间为30分钟。将上述包裹了异硫氰罗丹明B的聚乳酸纳米纤维浸泡在200ml纯水中，常温下恒温摇床摇晃3天，以洗去纳米纤维表面残余的异硫氰罗丹明B。将处理后的聚乳酸纳米纤维进行紫外灭菌2小时。
将灭菌处理的聚乳酸纳米纤维膜片剪切成一定大小的纤维膜片，分别接种上5.0×105个细胞/cm2。37℃，5.0％二氧化碳的细胞培养箱中分别培养6小时和24小时。用荧光染料荧光素双醋酸酯将细胞标记上绿色，调整发射波长和滤光片，即可通过激光共聚焦显微镜观察到红色的聚乳酸纳米纤维对绿色荧光的活细胞的粘附能力。结果表明，观察到的红色的聚乳酸纳米纤维之间距离较疏松，培养6小时和24小时的样品中均只有少量的发绿色荧光的细胞粘附在红色的聚乳酸纳米纤维表面。红色的聚乳酸纳米纤维的平均直径见表1。粘附在红色的聚乳酸纳米纤维的细胞数量见表2。
另将灭菌处理的聚乳酸纳米纤维膜片剪切成一定大小的纤维膜片，分别接种上5.0×104个细胞/cm2。37℃，5.0％二氧化碳的细胞培养箱中分别培养24小时。用荧光染料钙黄绿素乙酰甲酯将细胞标记上绿色，在激光共聚焦显微镜配套的活细胞培养舱中继续培养48小时。继续在调整发射波长和滤光片，即可通过激光共聚焦显微镜及时动态观察绿色荧光的活细胞在红色的聚乳酸纳米纤维的增殖和移动。粘附在红色的聚乳酸纳米纤维的细胞数量见表3。
实施例4：
称1g聚乳酸和1g聚己内酯，将其置入20ml氯仿溶剂中，加热并冷凝回流溶解1小时，直至共聚物完全溶解，溶液呈无色透明状。在上述溶液中加入20mg的红色染料异硫氰罗丹明B，搅拌溶解至红色透明液体。装入到喷雾装置中的玻璃注射器中，使得其注射速率为0.6ml/小时，针尖正极与基片负极间产生12000伏的高压，针尖到接收装置之间的距离为15mm，用玻璃片收集经过静电纺丝喷出的包裹了异硫氰罗丹明B的聚乳酸纤维，收集时间为45分钟。将上述包裹了异硫氰罗丹明B的聚乳酸纳米纤维浸泡在200ml纯水中，常温下恒温摇床摇晃3天，以洗去纳米纤维表面残余的异硫氰罗丹明B。将处理后的聚乳酸纳米纤维进行紫外灭菌2小时。
将灭菌处理的聚乳酸纳米纤维膜片剪切成一定大小的纤维膜片，分别接种上5.0×105个细胞/cm2。37℃，5.0％二氧化碳的细胞培养箱中分别培养6小时和24小时。用荧光染料荧光素双醋酸酯将细胞标记上绿色，调整发射波长和滤光片，即可通过激光共聚焦显微镜观察到红色的聚乳酸纳米纤维对绿色荧光的活细胞的粘附能力。结果表明，观察到的红色的聚乳酸纳米纤维之间距离较疏松，培养6小时和24小时的样品中均只有少量的发绿色荧光的细胞粘附在红色的聚乳酸纳米纤维表面。红色的聚乳酸纳米纤维的平均直径见表1。粘附在红色的聚乳酸纳米纤维的细胞数量见表2。
另将灭菌处理的聚乳酸纳米纤维膜片剪切成一定大小的纤维膜片，分别接种上5.0×104个细胞/cm2。37℃，5.0％二氧化碳的细胞培养箱中分别培养24小时。用荧光染料钙黄绿素乙酰甲酯将细胞标记上绿色，在激光共聚焦显微镜配套的活细胞培养舱中继续培养48小时。继续在调整发射波长和滤光片，即可通过激光共聚焦显微镜及时动态观察绿色荧光的活细胞在红色的聚乳酸纳米纤维的增殖和移动。粘附在红色的聚乳酸纳米纤维的细胞数量见表3。
实施例5：
称1g聚乳酸和0.5g聚3-羟基丁酸酯，将其置入20ml氯仿溶剂中，加热并冷凝回流溶解1小时，直至共聚物完全溶解，溶液呈无色透明状。在上述溶液中加入20mg的红色染料异硫氰罗丹明B，搅拌溶解至红色透明液体。装入到喷雾装置中的玻璃注射器中，使得其注射速率为0.6ml/小时，针尖正极与基片负极间产生12000伏的高压，针尖到接收装置之间的距离为10mm，用玻璃片收集经过静电纺丝喷出的包裹了异硫氰罗丹明B的聚乳酸纤维，收集时间为30分钟。将上述包裹了异硫氰罗丹明B的聚乳酸纳米纤维浸泡在200ml纯水中，常温下恒温摇床摇晃3天，以洗去纳米纤维表面残余的异硫氰罗丹明B。将处理后的聚乳酸纳米纤维进行紫外灭菌2小时。
将灭菌处理的聚乳酸纳米纤维膜片剪切成一定大小的纤维膜片，分别接种上5.0×105个细胞/cm2。37℃，5.0％二氧化碳的细胞培养箱中分别培养6小时和24小时。用荧光染料荧光素双醋酸酯将细胞标记上绿色，调整发射波长和滤光片，即可通过激光共聚焦显微镜观察到红色的聚乳酸纳米纤维对绿色荧光的活细胞的粘附能力。结果表明，观察到的红色的聚乳酸纳米纤维之间距离较疏松，培养6小时和24小时的样品中均只有少量的发绿色荧光的细胞粘附在红色的聚乳酸纳米纤维表面。红色的聚乳酸纳米纤维的平均直径见表1。粘附在红色的聚乳酸纳米纤维的细胞数量见表2。
另将灭菌处理的聚乳酸纳米纤维膜片剪切成一定大小的纤维膜片，分别接种上5.0×104个细胞/cm2。37℃，5.0％二氧化碳的细胞培养箱中分别培养24小时。用荧光染料钙黄绿素乙酰甲酯将细胞标记上绿色，在激光共聚焦显微镜配套的活细胞培养舱中继续培养48小时。继续在调整发射波长和滤光片，即可通过激光共聚焦显微镜及时动态观察绿色荧光的活细胞在红色的聚乳酸纳米纤维的增殖和移动。粘附在红色的聚乳酸纳米纤维的细胞数量见表3。
实施例6：
称聚乳酸2g，将其置入20ml氯仿溶剂中，加热并冷凝回流溶解1小时，直至共聚物完全溶解，溶液呈无色透明状。在上述溶液中加入20mg的红色染料异硫氰罗丹明B，搅拌溶解至红色透明液体。装入到喷雾装置中的玻璃注射器中，使得其注射速率为0.6ml/小时，针尖正极与基片负极间产生12000伏的高压，针尖到接收装置之间的距离为10mm，用玻璃片收集经过静电纺丝喷出的包裹了异硫氰罗丹明B的聚乳酸纳米纤维，收集时间为15分钟。将上述包裹了异硫氰罗丹明B的聚乳酸纳米纤维浸泡在400ml纯水中，常温下恒温摇床摇晃3天，以洗去纳米纤维表面残余的异硫氰罗丹明B。将处理后的聚乳酸纳米纤维进行紫外灭菌2小时。
将灭菌处理的聚乳酸纳米纤维膜片剪切成一定大小的纤维膜片，分别接种上5.0×105个细胞/cm2。37℃，5.0％二氧化碳的细胞培养箱中分别培养6小时和24小时。用荧光染料荧光素双醋酸酯将细胞标记上绿色，调整发射波长和滤光片，即可通过激光共聚焦显微镜观察到红色的聚乳酸纳米纤维对绿色荧光的活细胞的粘附能力。结果表明，观察到的红色的聚乳酸纳米纤维之间距离较疏松，培养6小时和24小时的样品中均只有少量的发绿色荧光的细胞粘附在红色的聚乳酸纳米纤维表面。红色的聚乳酸纳米纤维的平均直径见表1。粘附在红色的聚乳酸纳米纤维的细胞数量见表2。
另将灭菌处理的聚乳酸纳米纤维膜片剪切成一定大小的纤维膜片，分别接种上5.0×104个细胞/cm2。37℃，5.0％二氧化碳的细胞培养箱中分别培养24小时。用荧光染料钙黄绿素乙酰甲酯将细胞标记上绿色，在激光共聚焦显微镜配套的活细胞培养舱中继续培养48小时。继续在调整发射波长和滤光片，即可通过激光共聚焦显微镜及时动态观察绿色荧光的活细胞在红色的聚乳酸纳米纤维的增殖和移动。粘附在红色的聚乳酸纳米纤维的细胞数量见表3。
表1通过激光共聚焦显微镜观察到的包裹了异硫氰罗丹明B的聚乳酸纳米纤维直径
表3在活细胞培养舱中继续培养48小时过程中粘附在红色的聚乳酸纳米纤维的细胞数量
Claims (8)
1.一种激光共聚焦扫描显微镜高分子纤维可视化的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）高分子材料溶解在有机溶剂中，加热并冷凝回流至共聚物完全溶解，形成溶液I；
所述有机溶剂为氯仿，二氯甲烷，N，N-二甲基甲酰胺，乙酸乙酯中的一种或其组合；
所述高分子材料为聚乳酸，聚3-羟基丁酸酯，聚乳酸-乙醇酸，聚己内酯，聚(乳酸-乙烯酸)中的一种或其组合；
（2）溶液I中加入荧光染料A，搅拌溶解至完全溶解，形成溶液II；
所述荧光染料A为罗丹明B；
（3）溶液II装入到喷雾装置中的玻璃注射器中，进行静电纺丝的制备，得到包裹了荧光染料A的高分子纤维；
（4）所制备的高分子纤维浸泡在水中，常温下恒温摇床摇晃3～7天，以洗去高分子纤维表面残余的荧光染料A；
（5）将处理后的高分子纤维进行紫外灭菌处理1～2小时；
（6）将灭菌处理的高分子纤维接种上细胞，37℃，5.0%二氧化碳的细胞培养箱中培养；
（7）将细胞用荧光染料标记后，用激光共聚焦显微镜观察，可以选择如下方法中的一种：
a）将细胞用多聚甲醛或甲醛固定后，用荧光染料B将细胞进行标记，即可通过激光共聚焦显微镜直接观察到高分子纤维及其表面生长的细胞；
所述荧光染料B为标记多聚甲醛或甲醛固定后细胞的荧光染料，为钙黄绿素，或鬼笔环肽；
b）将细胞直接用荧光染料C进行活细胞标记，即可通过激光共聚焦显微镜直接观察到高分子纤维及其表面生长的活细胞；
所述荧光染料C为标记活细胞的荧光染料，为钙黄绿素乙酰甲酯，或二乙酸荧光素；
c）将细胞直接用荧光染料D进行活细胞标记，在激光共聚焦显微镜配套的活细胞培养舱中继续培养，即可通过激光共聚焦显微镜时时动态观察高分子纤维及其表面生长的细胞；
所述荧光染料D为长时间标记活细胞的荧光染料，为钙黄绿素乙酰甲酯，或二乙酸荧光素。
2.根据权利要求1所述激光共聚焦扫描显微镜高分子纤维可视化的制备方法，其特征在于，溶液I中所述高分子材料的浓度为1～15%(g/100ml)；溶液II中所述高分子材料的浓度为1～15%(g/100ml)，荧光染料A的浓度为0.05～0.5%(g/100ml)。
3.根据权利要求1所述激光共聚焦扫描显微镜高分子纤维可视化的制备方法，其特征在于，所述静电纺丝的制备具体操作如下：注射速率为0.1～0.6ml/小时，针尖正极与基片负极间产生5000～12000伏的高压，针尖到接收装置之间的距离为10～30mm，用玻璃片收集经过静电纺丝喷出高分子纤维，收集时间为15～120分钟。
4.根据权利要求1所述激光共聚焦扫描显微镜高分子纤维可视化的制备方法，其特征在于，所述荧光染料A，优先选择异硫氰罗丹明B。
5.根据权利要求1所述激光共聚焦扫描显微镜高分子纤维可视化的制备方法，其特征在于，所述荧光染料B，优先选择鬼笔环肽。
6.根据权利要求1所述激光共聚焦扫描显微镜高分子纤维可视化的制备方法，其特征在于，所述荧光染料C，优先选择二乙酸荧光素。
7.根据权利要求1所述激光共聚焦扫描显微镜高分子纤维可视化的制备方法，其特征在于，所述荧光染料D，优先选择钙黄绿素乙酰甲酯。
8.根据权利要求1所述激光共聚焦扫描显微镜高分子纤维可视化的制备方法，其特征在于，所述高分子纤维的平均直径为0.9-4.0μm。
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