CN110063160A - 一种利于园林植物生长的丛枝菌根真菌筛选方法 - Google Patents

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赵海虹
胡莉
王偲博
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Abstract

本发明是一种利于园林植物生长的丛枝菌根真菌筛选方法，属微生物技术领域。本发明提供了一种园林植物、丛枝菌根真菌、培养基质之间最佳协作方式，包括以下步骤：（1）制备园林植物和丛枝菌根真菌共生所需要的培养基质；（2）园林植物催芽、育种以及移栽种植；（3）丛枝菌根真菌接种与培养；（4）测量菌根侵染率、孢子密度、根系活力性状，分析并筛选出最佳种植方式。本发明的筛选方法操作方便准确，培养周期短，适用性范围广泛，并且能为规模化园林植物种植提供技术支持。

Description

一种利于园林植物生长的丛枝菌根真菌筛选方法
技术领域
本项发明主要涉及微生物技术领域，具体涉及一种利于园林植物生长的丛枝菌根真菌筛选方法。
背景技术
丛枝菌根真菌(Arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)是一类能与陆地上约 80%的植物形成互惠共生体的土壤微生物。植物与真菌的共生关系表现在菌根真菌依赖于寄主植物的光合产物及其它营养物质来维持自身的生长和繁殖，同时提供植物所需的矿质养分和水分。在这个共生体中，菌根真菌提供给植物的不仅是水和矿物元素，还有许多能刺激植物生长的有机物质，这些物质对植物的生长发育和增产是不可替代的。菌根的重要性，已经在林业、园艺作物、农作物以及某些兰科植物的栽培上得到证实。
研究表明，不同 AMF 对丛枝菌根的生长发育影响是不同的。选择合适的AMF，有利于提高丛枝菌根的效应，不同寄主植物对AMF的生长发育影响也是不同的，最直观的反映因素是侵染率。科学家研究发现，AMF在5个成龄梨树(Pyrus pashia)品种根系上的丛枝定殖率、根上菌丝着生位点数等均存在显著差异。同时发现AMF孢子密度和菌根侵染率在甘蓝(Brassica oleracea)和大麦(Hordeumsativum)的根际土中存在差异。此外，不同理化性质的培养基质对AMF生长发育的影响也不同，研究发现AMF侵染率会受土壤耕作的影响，土壤中有些微生物能促进 AMF与植物的共生。还有研究表明，AMF与巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilens)混合接种寄主植物，A．brasitens促进了丛枝菌根的形成，增加了寄主植物根际AMF孢子数量。现阶段，还没有丛枝菌根真菌菌剂接种园林植物的合理搭配方式及筛选方法相关专利，此专利方法可提升丛枝菌根真菌使用效率，方便不同园林植物菌剂施用，全面提高园林植物生长速度，为园林种植业提供高效高产、生态环保的生物肥料应用方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种园林植物、丛枝菌根真菌、培养基质之间最佳协作方式，是一种提高园林植物的生长水平、提升丛枝菌根真菌的使用价值、利于规模化使用的筛选方法。该方法操作方便准确，培养周期短，适用性范围广泛，可以有效的为规模化园林植物丛枝菌根真菌应用提供技术保障。
本发明所述的一种利于园林植物生长的丛枝菌根真菌筛选方法的具体操作步骤如下：
（1）培养基质的配置：选用沙、土、蛭石、有机土、草炭混合物或其中几种的混合物作为培养基质，混合物中各类基质的体积比为1:1，将培养基质填至盆钵中，填置高度为盆钵高度的4/5处，备用；
（2）催芽：挑选饱满的园林植物种子用0.025mol/L高锰酸钾浸泡6min，无菌水冲洗3次，置于铺有纱布的托盘中，在28℃培养箱中催芽；
（3）接种：催芽完成后，选择高度一致的幼苗移栽到装好培养基的盆钵中，将丛枝菌根菌剂接种在幼苗根系附近；
（4）光照培养：接种后，将植物幼苗置于恒温光照培养箱内培养，培养温度25-35℃，湿度40%-80%，光照时间12-14 h/d，第1个月每天浇水，之后每3天补充一次水分，每周浇一次营养液；
（5）取生长3个月的寄主植物新鲜根样，测量菌根侵染率；取风干后的定量根系周围土壤，计算孢子密度；剪取植物根系，用蒸馏水洗净并用滤纸擦干后，测定根系活力。
优选的是，所述步骤（1）的培养基质制作之前需经121℃、0.1Mpa高温高压蒸汽灭菌2h，烘干冷却至室温。
优选的是，所述步骤（1）的盆钵使用前通过喷施75%酒精溶液、紫外线照射24h进行灭菌处理。
优选的是，所述步骤（3）的接种是在塑料温室大棚内的防虫网中进行，温室定期喷施酒精消毒，丛枝菌根菌剂接种剂量为每盆8-10 g，使盆内孢子数达到500-600个。
优选的是，所述步骤（3）的丛枝菌根菌剂有摩西球囊霉(G.mosseae)、地表球囊霉(Geosiphon versiforme)和根内球囊霉(G.irregularis)等。
优选的是，所述步骤（4）的营养液为稀释10倍的标准Hoagland's营养液，每盆喷施25mL；植物补充水分为纯净水，每次每盆补充水分为300-500mL。
优选的是，所述步骤（5）的根系侵染率通过曲利苯蓝染色-十字交叉法测量，孢子密度通过湿筛倾析法选出孢子，用显微镜观测计数，根系活力测定用氯化三苯基四氮唑还原法。
具体实施方式
以下结合具体的实例对本发明作进一步阐述，以便于更好地理解本发明，但并不限制本发明。
实施例1：
步骤1：
园林植物种子：三叶草、芍药、大丽菊、月季、百合种子。
菌剂：摩西球囊霉(G.mosseae)和地表球囊霉(Geosiphon versiforme)真菌菌剂。
培养基质的灭菌与筛选：选择纯土基质、沙土混合基质及沙土蛭石混合基质作为本实施例的3组培养基质，其中土壤和河沙的体积比为1:1，土壤、河沙和蛭石的体积比为1:1:1。土壤取自生态苗木园区表层（0-30cm），所用沙采自钱塘江河沙，所用土壤和沙符合《土壤环境质量标准》（GB15618-1995）的一级标准，土壤和河沙分别过直径2mm的筛；制作培养基质之前将蛭石和过筛的土、沙经121℃、0.1Mpa高温高压蒸汽灭菌2h，烘干冷却至室温；最后将这3组培养基质根据实验设计方案分别填至盆钵中，填置高度为盆钵高度的4/5处，备用。
营养液：稀释10倍的标准Hoagland's营养液（硝酸钙 945mg/L、硝酸钾 607mg/L、磷酸铵 115mg/L、硫酸镁 493mg/L、铁盐溶液 2.5ml/L、微量元素 5ml/L，pH=6.0）。
植物培育盆钵：选用规格为200mm（长）×200mm（宽）×150mm（高）的黑色盆钵，使用前分别通过喷施75%酒精溶液、紫外线照射24h进行灭菌处理。
种子的催芽和移栽：挑选饱满的园林植物种子用0.025mol/L高锰酸钾浸泡6min，然后用无菌水冲洗3次后，置于铺有纱布的托盘中，在28℃恒温培养箱中进行催芽，催芽后，选择高度约为5cm的植物幼苗移栽到装有培养基质的盆钵中。
步骤2：
将移栽后的植物幼苗分别接种两种丛枝菌根真菌，按照每盆8-10g的剂量分别接种在幼苗根系附近，5种植物×2种菌剂×3组培养基质，共30个处理，每个处理10个重复，每个处理设一个对照组，对照组植物幼苗不接种菌剂。接种后使每盆孢子数达到500个，采用湿筛倾析法测量孢子数目。接种操作在塑料温室大棚内的防虫网中进行，温室定期喷施酒精消毒。
光照培养：在分别接种摩西球囊霉和地表球囊霉两种菌剂后，将所有园林植物幼苗在恒温光照培养箱内培养，培养温度25-35℃，湿度40%-80%，光照时间12-14h/d，总共培养3个月。培养的第1个月每天浇水，每次每盆补充纯净水为300-400mL。之后第2、3个月每3天补充一次水分，每次每盆补充纯净水为500mL。培养期间每周浇一次稀释10倍的标准Hoagland's营养液（25mL/盆）。
步骤3：
指标测定：
菌根侵染率：在植物培养3个月后，分别在每种处理中取5株重复处理的寄主植物新鲜根样，用纯净水冲洗根系，剪取1cm根段用FAA固定液固定24h，加入10% KOH在90℃水浴锅中染色30min，洗去碱液，加10%H2O2漂白15min，蒸馏水清洗3-5次后加入0.2mol/L HCl酸化2h。加入0.05%曲利苯蓝在90℃水浴锅中染色30min，用乳酸酚（乳酸100mL、甘油100mL、苯酚100mL、蒸馏水100mL）脱色24h，将根段放置在涂有封固剂（聚乙烯醇1.66g、甘油1mL、乳酸20mL、蒸馏水10mL）的载玻片上进行制片，盖上盖玻片，显微镜观察。
菌根侵染率=丛枝菌根侵染的根段长度/镜根段总长度×100%
两种丛枝菌根真菌在3种培养基质下侵染5种不同寄主植物的菌根侵染率差异不同（见表1）。
表1两种丛枝菌根真菌在不同基质中侵染寄主植物的菌根侵染率（%）
由表1可知，三叶草在纯土基质中摩西球囊霉菌根侵染率最高，芍药在纯土基质中地表球囊霉菌根侵染率最高，百合在沙土蛭石基质中地表球囊霉菌根侵染率最高，月季在沙土基质中摩西球囊霉菌根侵染率最高，大丽菊在沙土基质中地表球囊霉菌根侵染率最高。
孢子密度：丛枝菌根真菌菌剂与寄主园林植物共生3个月后侵染的孢子密度采用湿筛倾析法测量孢子数目，采集植物培养3个月后的根系周围土壤风干后5g，加入40mL的50%蔗糖溶液充分搅拌30min，依次过20、100、500目筛，按孔径由大到小的顺序依次叠放，最底层用一固体物垫着，使筛面稍微倾斜。倾倒时，尽量集中将土壤水溶液倒在筛面的一个点上，避免整个筛面都有土壤溶液，用蒸馏水冲洗500目上的残留物至培养皿上，在显微镜下观测孢子数量，然后计算出孢子密度。
孢子密度（个/g）=镜检孢子数量/测量土壤样品质量
供试的5种寄主植物均能在三种培养基上与摩西球囊霉和地表球囊霉正常共生。但不同真菌、不同培养基对不同寄主植物的影响差异不同（见表2）。
表2 两种丛枝菌根真菌在不同基质中侵染寄主植物的孢子密度（5g样品孢子个数）
由表2可知，沙土基质培养的月季接种摩西球囊霉真菌的孢子密度最大，沙土蛭石基质培养的芍药接种摩西球囊霉真菌的孢子密度最大，这表明这两种寄主植物-基质-真菌种类搭配方式最适合真菌扩繁。
根系活力：根系活力测定用氯化三苯基四氮唑（TTC）还原法，首先制备TTC标准曲线，取0.4%TTC溶液0.2mL放入10mL容量瓶中，再加少许Na2SO4粉末摇匀，溶液变红，加乙酸乙酯至10mL定容，然后分别取此液0.25mL、0.50mL、1.00mL、1.50mL、2.00mL置10mL容量瓶中用乙酸乙酯定容，即得到25ug、50ug、100ug、150ug、200ug的标准比色系列，以空白作为参比，在485nm波长下测吸光度，绘制标准曲线。
剪取植物根系根尖用蒸馏水洗净并用滤纸擦干后，称取0.2g于玻璃管试管中，放入5mL的0.4%TTC和5mL的1/15 mol/L pH 7.0的磷酸缓冲液，置于37℃恒温箱中暗浸提约1.5h。加入2mL 1mol/L的浓硫酸，用来终止反应。取出根，吸干表面水分，放入玻璃试管中，加入10mL甲醇，37℃恒温箱中保温8h，使根完全变白。以甲醇为空白，用此提取液在紫外可见分光光度计485nm下测定OD值。查标准曲线，计算出TTC还原量。
根系活力（ug·g-1·h-1）=TTC还原量/（根鲜重×恒温暗浸反应时间）
TTC还原量单位是ug，根鲜重单位是g，恒温暗浸反应时间单位是h。
两种丛枝菌根真菌在3种培养基质下侵染5种不同寄主植物后的根系活力差异不同（见表3）。
表3两种丛枝菌根真菌在不同基质中侵染寄主植物后植物根系活力（ug·g-1·h-1）
由表3可知，三叶草在纯土基质中经摩西球囊霉侵染后根系活力最强，芍药在纯土基质中经摩西球囊霉侵染后根系活力最强，百合在沙土基质中经摩西球囊霉侵染后根系活力最强，月季在沙土基质中经摩西球囊霉侵染后根系活力最强，大丽菊在沙土基质中经地表球囊霉侵染后根系活力最强。
表1-表3可知，大丽菊在沙土基质中用地表球囊霉真菌侵染效果最佳，月季在沙土基质中用摩西球囊霉真菌侵染效果最佳。
实施例2：
步骤1：
园林植物种子：山茶、紫金牛、杜鹃。
菌剂：根内球囊霉(G.irregularis)和地表球囊霉(Geosiphon versiforme)真菌菌剂。
培养基质的灭菌与筛选：选择纯土基质、草炭土基质及土-草炭土-蛭石混合基质作为本实施例的3组培养基质，其中土-草炭土-蛭石混合基质中土、草炭土、蛭石体积比为1:1:1。土壤取自生态苗木园区表层（0-30cm），所用土壤和草炭土符合《土壤环境质量标准》（GB15618-1995）的一级标准，土壤和草炭土分别过直径2mm的筛；制作培养基质之前将蛭石和过筛的纯土、草炭土经121℃、0.1Mpa高温高压蒸汽灭菌2h，烘干冷却至室温，按体积比1:1:1制作出土-草炭土-蛭石混合基质，最后将这3组培养基质根据实验设计方案分别填至盆钵中，填置高度为盆钵高度的4/5处，备用。
营养液：稀释10倍的标准Hoagland's营养液（硝酸钙 945mg/L、硝酸钾 607mg/L、磷酸铵 115mg/L、硫酸镁 493mg/L、铁盐溶液 2.5ml/L、微量元素 5ml/L，pH=6.0）。
盆钵：选用规格为200mm（长）×200mm（宽）×150mm（高）的黑色盆钵，使用前分别通过喷施75%酒精溶液、紫外线照射24h进行灭菌处理。
种子的催芽和移栽：挑选饱满的园林植物种子用0.025mol/L高锰酸钾浸泡6min，然后用无菌水冲洗3次后，置于铺有纱布的托盘中，在28℃恒温培养箱中进行催芽。催芽后，选择高度约为5cm的植物幼苗移栽到装有培养基质的植物盆钵中。
步骤2：
将移栽后的植物幼苗分别接种两种丛枝菌根真菌，按照每盆8-10g的剂量分别接种在幼苗根系附近，3种植物×2种菌剂×3组培养基质，共18个处理，每个处理10个重复，每个处理设一个对照组，对照组植物幼苗不接种菌剂。接种后使每盆孢子数达到500个，采用湿筛倾析法测量孢子数目。接种操作在塑料温室大棚内的防虫网中进行，温室定期喷施酒精消毒。
光照培养：接种根内球囊霉和地表球囊霉两种菌剂后，将所有园林植物幼苗在恒温光照培养箱内培养，培养温度25-35℃，湿度40%-80%，光照时间12-14h/d，总共培养3个月。培养的第1个月每天浇水，每次每盆补充纯净水为300-400mL。之后第2、3个月每3天补充一次水分，每次每盆补充纯净水为500mL。培养期间每周浇一次稀释10倍的标准Hoagland's营养液（25mL/盆）。
步骤3：
指标测定：
菌根侵染率：在植物培养3个月后，分别在每种处理中取5株重复处理的寄主植物新鲜根样，用纯净水冲洗根系，剪取1cm根段用FAA固定液固定24h，加入10% KOH在90℃水浴锅中染色30min，洗去碱液，加10%H2O2漂白15min，蒸馏水清洗3-5次后加入0.2mol/L HCl酸化2h。加入0.05%曲利苯蓝在90℃水浴锅中染色30min，用乳酸酚（乳酸100mL、甘油100mL、苯酚100mL、蒸馏水100mL）脱色24h，将根段放置在涂有封固剂（聚乙烯醇1.66g、甘油1mL、乳酸20mL、蒸馏水10mL）的载玻片上进行制片，盖上盖玻片，显微镜观察。
菌根侵染率=丛枝菌根侵染的根段长度/镜根段总长度×100%。
两种丛枝菌根真菌在3种培养基质下侵染3种不同寄主植物的菌根侵染率差异不同（见表4）。
表4两种丛枝菌根真菌在不同基质中侵染寄主植物的菌根侵染率（%）
由表4可知，山茶在土-草炭土-蛭石基质中地表球囊霉菌根侵染率最高，紫金牛在草炭土基质中根内球囊霉菌根侵染率最高，杜鹃在纯土基质中根内球囊霉菌根侵染率最高。
孢子密度：丛枝菌根真菌菌剂与寄主园林植物共生3个月后侵染的孢子密度采用湿筛倾析法测量孢子数目，采集植物培养3个月后的根系周围土壤风干后5g，加入40mL的50%蔗糖溶液充分搅拌30min，依次过20、100、500目筛，按孔径由大到小的顺序依次叠放，最底层用一固体物垫着，使筛面稍微倾斜。倾倒时，尽量集中将土壤水溶液倒在筛面的一个点上，避免整个筛面都有土壤溶液，用蒸馏水冲洗500目上的残留物至培养皿上，在显微镜下观测孢子数量，然后计算出孢子密度。
孢子密度（个/g）=镜检孢子数量/测量土壤样品质量。
供试的3种寄主植物均能在三种培养基上与根内球囊霉和地表球囊霉正常共生。但不同真菌、不同培养基对不同寄主植物的影响差异不同（见表5）。
表5 两种丛枝菌根真菌在不同基质中侵染寄主植物的孢子密度（5g样品孢子个数）
由表5可知，土-草炭土-蛭石基质培养的山茶接种地表球囊霉真菌的孢子密度最大，草炭土基质培养的紫金牛接种根内球囊霉真菌的孢子密度最大，纯土基质培养的杜鹃接种根内球囊霉真菌的孢子密度最大。
根系活力：根系活力测定用氯化三苯基四氮唑（TTC）还原法，首先制备TTC标准曲线，取0.4%TTC溶液0.2mL放入10mL容量瓶中，再加少许Na2SO4粉末摇匀，溶液变红，加乙酸乙酯至10mL定容，然后分别取此液0.25mL、0.50mL、1.00mL、1.50mL、2.00mL置10mL容量瓶中用乙酸乙酯定容，即得到25ug、50ug、100ug、150ug、200ug的标准比色系列，以空白作为参比，在485nm波长下测吸光度，绘制标准曲线。
剪取植物根系根尖用蒸馏水洗净并用滤纸擦干后，称取0.2g于玻璃管试管中，放入5mL的0.4%TTC和5mL的1/15 mol/L pH 7.0的磷酸缓冲液，置于37℃恒温箱中暗浸提约1.5h。加入2mL 1mol/L的浓硫酸，用来终止反应。取出根，吸干表面水分，放入玻璃试管中，加入10mL甲醇，37℃恒温箱中保温8h，使根完全变白。以甲醇为空白，用此提取液在紫外可见分光光度计485nm下测定OD值。查标准曲线，计算出TTC还原量。
根系活力（ug·g-1·h-1）=TTC还原量/（根鲜重×恒温暗浸反应时间）
TTC还原量单位是ug，根鲜重单位是g，恒温暗浸反应时间单位是h。
两种丛枝菌根真菌在3种培养基质下侵染3种不同寄主植物后的根系活力差异不同（见表6）。
表6两种丛枝菌根真菌在不同基质中侵染寄主植物后植物根系活力（ug·g-1·h-1）
由表6可知，山茶在土-草炭土-蛭石基质中经地表球囊霉侵染后根系活力最强，紫金牛在草炭土基质中经根内球囊霉侵染后根系活力最强，杜鹃在纯土基质中经根内球囊霉侵染后根系活力最强。
表4-表6可知，山茶在土-草炭土-蛭石基质中用地表球囊霉真菌侵染效果最佳，紫金牛在草炭土基质中用根内球囊霉真菌侵染效果最佳，杜鹃在纯土基质中用根内球囊霉真菌侵染效果最佳。

Claims (7)

1.一种利于园林植物生长的丛枝菌根真菌筛选方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）培养基质的配置：选用沙、土、蛭石、有机土、草炭混合物或其中几种的混合物作为培养基质，混合物中各类基质的体积比为1:1，将培养基质填至盆钵中，填置高度为盆钵高度的4/5处，备用；
（2）催芽：挑选饱满的园林植物种子用0.025mol/L高锰酸钾浸泡6min，无菌水冲洗3次，置于铺有纱布的托盘中，在28℃培养箱中催芽；
（3）接种：催芽完成后，选择高度一致的幼苗移栽到装好培养基的盆钵中，将丛枝菌根菌剂接种在幼苗根系附近；
（4）光照培养：接种后，将植物幼苗置于恒温光照培养箱内培养，培养温度25-35℃，湿度40%-80%，光照时间12-14 h/d，第1个月每天浇水，之后每3天补充一次水分，每周浇一次营养液；
（5）取生长3个月的寄主植物新鲜根样，测量菌根侵染率；取风干后的定量根系周围土壤，计算孢子密度；剪取植物根系，用蒸馏水洗净并用滤纸擦干后，测定根系活力。
2.根据权利要求1所述的一种利于园林植物生长的丛枝菌根真菌筛选方法，其特征在于：所述步骤（1）的培养基质制作之前需经121℃、0.1Mpa高温高压蒸汽灭菌2h，烘干冷却至室温。
3.根据权利要求1所述的一种利于园林植物生长的丛枝菌根真菌筛选方法，其特征在于：所述步骤（1）的盆钵使用前通过喷施75%酒精溶液、紫外线照射24h进行灭菌处理。
4.根据权利要求1所述的一种利于园林植物生长的丛枝菌根真菌筛选方法，其特征在于：所述步骤（3）的接种是在塑料温室大棚内的防虫网中进行，温室定期喷施酒精消毒，丛枝菌根菌剂接种剂量为每盆8-10 g，使盆内孢子数达到500-600个。
5.根据权利要求1所述的一种利于园林植物生长的丛枝菌根真菌筛选方法，其特征在于：所述步骤（3）的丛枝菌根菌剂有摩西球囊霉(G.mosseae)、地表球囊霉(Geosiphon versiforme)和根内球囊霉(G.irregularis)等。
6.根据权利要求1所述的一种利于园林植物生长的丛枝菌根真菌筛选方法，其特征在于：所述步骤（4）的营养液为稀释10倍的标准Hoagland's营养液，每盆喷施25mL；植物补充水分为纯净水，每次每盆补充水分为300-500mL。
7.根据权利要求1所述的一种利于园林植物生长的丛枝菌根真菌筛选方法，其特征在于：所述步骤（5）的根系侵染率通过曲利苯蓝染色-十字交叉法测量，孢子密度通过湿筛倾析法选出孢子，用显微镜观测计数，根系活力测定用氯化三苯基四氮唑还原法。
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