CN203999584U - 复合式丛枝菌根真菌分室培养装置 - Google Patents

Abstract

本实用新型涉及一种复合式丛枝菌根真菌分室培养装置，包括由支架固定的敞口的圆柱形有机玻璃容器。圆柱形有机玻璃容器自上而下依次通过嵌套的尼龙网Ⅰ、尼龙网Ⅱ、尼龙网Ⅲ分为植物生长室、菌根共生体生长室、菌丝生长室、生理检测室；圆柱形有机玻璃容器的底部设有回收孔；植物生长室所处的圆柱形有机玻璃容器内填充有蛭石，其器壁上设有注水孔Ⅰ；菌根共生体生长室所处的圆柱形有机玻璃容器内填充有粗河砂，其器壁上设有注水孔Ⅱ；菌丝生长室所处的圆柱形有机玻璃容器内填充有玻璃珠，其器壁上设有注水孔Ⅲ；生理检测室所处的圆柱形有机玻璃容器器壁上设有注水孔Ⅳ。本实用新型可用于研究AM真菌培养和生理机制。

Description

复合式丛枝菌根真菌分室培养装置

技术领域

本实用新型涉及特殊微生物的培养技术领域，尤其涉及复合式丛枝菌根真菌分室培养装置。

背景技术

自1842年Nägeli首次对丛枝菌根（arbuscular mycorrhizae，AM）进行描述以来，菌根学家已经对AM真菌的分类、形态结构、生理特征、生态分布、功能多样性等进行了广泛研究。目前，围绕丛枝菌根的研究已经在以下几个方面得到证实：地球上80%的陆生高等植物根系可以与AM真菌共生形成丛枝菌根共生体。参与形成丛枝菌根结构的真菌是一类起源、演化相对独立的特殊真菌。AM真菌可以促进宿主植物提高对矿质营养和水分的吸收，促进植物体的生长和提高植物体的生物量，改进产品品质，增强对生物胁迫和非生物胁迫的抗性和耐受能力，如干旱、盐渍、重金属污染、病害、虫害等，从而有利于植物的生长发育。参与形成丛枝菌根的AM真菌与宿主植物之间没有严格的宿主专一性，同一种AM真菌可以通过延伸到土壤中的根外菌丝在同种或异种植物的根系之间形成“菌丝桥”结构，通过该结构，可以在同种或异种植物之间进行物质和信息的传递，因而AM真菌在植物群落的结构、组成、演替和生态系统稳定性等方面具有重要的功能。但是，由于AM真菌是一类专性活体营养微生物，虽然可以进行无性繁殖或有性繁殖，但迄今为止尚不能在离体条件下进行纯培养，AM真菌离开宿主植物即无法正常生长、发育，不能独立完成其生活史，只能依赖与活体宿主植物共生完成其繁殖过程。因此，AM真菌的纯培养已经成为AM真菌研究的瓶颈，对AM真菌的分类鉴定、菌剂生产和应用推广是一个重要的限制因素。

目前，由于化学肥料和杀真菌剂的广泛使用，在园林、苗圃等人工干扰强烈的土壤中，AM真菌的生态学功能受到了广泛抑制。菌根生物技术在农业、园艺和林业中至今没有得到普遍应用，AM真菌在生物多样性保护、受损生态系统恢复及可持续发展中的功能没有得到充分发挥，究其原因是由于缺乏大规模生产AM 真菌接种剂的方法。因此，无论是环境保护，还是生态治理的要求，获得纯种AM真菌孢子及其根外菌丝都具有极其重要的生态学意义。因为AM真菌的分类与鉴定、生物多样性、生理特征、分子生态学、系统学及种内、种间关系等方面的研究工作均依赖于获得纯化的真菌菌株，且生产商业化的接种剂需要高密度和高纯度的真菌繁殖体。目前，世界各国都在积极开展AM真菌无菌培养方法的研究，已经设计完成以下7种培养方法开展相关研究工作：⑴AM真菌繁殖体以孢子、根外菌丝体、分离的泡囊、菌根根段或被侵染根系等多种形式存在，而盆栽培养法获得的是这些繁殖体的混合菌剂。迄今为止，来自AM真菌——植物盆栽培养的根段和孢子仍然是最广泛和最可靠的菌剂。对于盆栽培养方法，盆栽基质是繁殖菌种和培养宿主植物的载体，是盆栽培养能否成功最关键的影响因素之一。其次是盆栽基质颗粒的大小、基质的酸碱度等。盆栽培养法最大的缺点是在开展接种剂的生产时，需要足够的空间和较长的时间，而且生产出来的接种剂繁殖体数量少、容积大、笨重、不便于携带或运输。随着研究的深入，虽然AM真菌的扩繁技术在不断的改进，但盆栽培养法仍然不能满足科研和商业生产的需要，因为盆栽培养法采用敞开式培养，很容易受到污染。基于此，目前围绕AM真菌的无菌人工培养基培养方法已经成为关注的热点之一。⑵1962年，Mosse最早在无菌条件下的人工培养基上建立了AM真菌的培养体系。1975年，Mosse & Hepper又采用不同的宿主植物重复了上述试验。但是，培养基培养法只能获得少量纯度较高的接种物，只能用于菌根生理生化、分子生物学等方法的科学研究，缺乏大规模生产的可行性。⑶1981年，Crush & Hay设计了静止营养液培养法，利用白车轴草（Trifolium repens）在灭菌的营养液中培养珠状巨胞囊霉（Gigaspora margarita）。但这种方法需要特定的培养装置，成本较高，实际应用中具有较大的局限性。后来，又设计出一种近于半水培的静止营养液培养法，此方法在以烟草为宿主植物的条件下，在侵染率、产孢量、节省培育时间和空间等方面都优于盆栽法，但是，由于宿主植物生长在透气保水的灭菌河沙中，培养的接种剂虽然质量较高，但产量较低，仅可用于科研或生产上小面积的应用。⑷1984年，Elmes & Mosse、Mosse & Thompson分别以玉米和菜豆等作为宿主植物，研究AM真菌菌剂的营养液流动培养技术。该方法可以用于工厂化生产AM 真菌菌剂，尽管没有了土壤微生物的污染，但由于根系长期浸泡在液体中，因而不利于根系和真菌的呼吸，对菌剂的繁殖速度和质量仍然有一定的影响。⑸1988年，Hung & Sylvia设计了工厂化生产AM 真菌菌剂的汽雾培养系统，将预接种5%~10%的宿主植物架设在空中，再用架设在根系周围的喷头每隔数秒钟对根系进行喷雾营养液，保持根系100%的湿度，以满足根系对水分和营养的需求。总体而言，雾化培养系统对营养液要求的参数较多，尤其是对P和pH值的控制十分严格，操作复杂，成本较高。⑹AM真菌的离体双重无菌培养技术，这是一种比较前沿且最接近于纯培养的AM真菌培养技术。该培养技术又可以分为：AM真菌与普通植物根器官双重培养技术和AM真菌与Ri T-DNA转型根的双重单胞无菌培养技术。其中，AM真菌与普通植物根器官双重培养技术，目前已经采用苜蓿（Medicago sativa）离体根、红车轴草（Trifolium pratense）离体根、番茄（Lycopersicon esculentum）离体根、白车轴草（Trifolium repens）离体根、绿豆（Phaseolus aureus）离体根，发现以上所有离体根器官可以与AM真菌建立双重培养体系，而且获得了新一代的孢子，但并不可以连续的继代培养。此后，随着分子生物学的迅猛发展，人们又建立了AM真菌与转型Ri T-DNA胡萝卜根器官双重培养体系，该培养方法中菌根共生体由Ri T-DNA转型的宿主植物根器官和菌根真菌在培养基中建立。丛枝菌根由开放式培养体系转入实验室的培养皿中，从而尽可能地避免外源污染，此方法也可以连续继代培养产生孢子和菌根根段。但研究表明第3代孢子和菌根根段的侵染率均明显下降，说明在无菌条件下，培养AM真菌是可能的，但是其后代将逐渐丧失侵染性。⑺1995年Redecker et al.利用北葱（Allium schoenoprasum）和根内球囊霉（Glomus intraradices）建立了AM共生体，设计了AM真菌的玻璃珠分室培养法，获得了AM真菌纯净体，可用于PCR和RFLP研究，没有发现污染迹象。玻璃珠分室培养法的最大优点就是真菌和基质易于分离，可以培养出大量纯净的AM真菌，特殊的培养装置可以有效免除生长基质对真菌的污染，收获的菌剂生物量大，菌剂较纯净，该方法也为AM真菌分子生物学、生理生化、遗传学等研究提供了一条简便易行的获得少量AM真菌纯净菌剂的途径。而且在专利号为CN1354252A的“以玻璃珠为培养基质的AM真菌的培养”中，主要涉及一种使用特定培养装置及培养介质的AM真菌的培养方法，该方法表明对于产孢能力强的AM真菌地表球囊霉（Glomus versiforme）在真菌生长室中可以获得多至20 mg干重的菌体，每盆获得的孢子数以万计。但是该培养系统技术含量高，操作复杂，仅可用于科学研究和小规模接种剂的生产使用，而且菌根和分支菌丝均为向地性生长，所以该装置会限制菌根和分支菌丝的生长。

综上所述，以上所有培养方法仅可以纯培养AM真菌繁殖体，不可以同时用于研究AM真菌的生理机制，如水分胁迫、根外菌丝产生的球囊霉素、营养元素传输等。

实用新型内容

本实用新型所要解决的技术问题是提供一种可用于研究AM真菌培养和生理机制的复合式丛枝菌根真菌分室培养装置。

为解决上述问题，本实用新型所述的复合式丛枝菌根真菌分室培养装置，包括由支架固定的敞口的圆柱形有机玻璃容器，其特征在于：所述圆柱形有机玻璃容器自上而下依次通过嵌套的尼龙网Ⅰ、尼龙网Ⅱ、尼龙网Ⅲ分为植物生长室、菌根共生体生长室、菌丝生长室、生理检测室；所述圆柱形有机玻璃容器的底部设有回收孔；所述植物生长室所处的所述圆柱形有机玻璃容器内填充有蛭石，其器壁上设有注水孔Ⅰ；所述菌根共生体生长室所处的所述圆柱形有机玻璃容器内填充有粗河砂，其器壁上设有注水孔Ⅱ；所述菌丝生长室所处的所述圆柱形有机玻璃容器内填充有玻璃珠，其器壁上设有注水孔Ⅲ；所述生理检测室所处的所述圆柱形有机玻璃容器器壁上设有注水孔Ⅳ。

所述尼龙网Ⅰ和所述尼龙网Ⅲ的孔径均为1000 μm。

所述尼龙网Ⅱ的孔径为30 μm。

所述注水孔Ⅰ、注水孔Ⅱ、注水孔Ⅲ、注水孔Ⅳ上均设有螺旋盖。

所述圆柱形有机玻璃容器的厚度为3~4 mm。

所述蛭石的直径为2~3 mm。

所述粗河砂的粒径为1~3 mm。

所述玻璃珠的粒径为3~4 mm。

本实用新型与现有技术相比具有以下优点：

1、本实用新型在四个分室的边侧均设计注水孔，这样可以根据实验的不同、生理生化等指标而在不同分室中加水以开展相关研究。

2、本实用新型由4个可分离的特定孔径的尼龙网培养室相互嵌套构成，区隔宿主植物和AM真菌的生长空间，因此，可以有效免除植物生长基质以及外源物质对真菌的潜在污染，且在菌根共生体建立之后，可以用于研究AM真菌根外菌丝的特征及其生理功能；同时，易于拆卸，方便收集纯净的AM真菌繁殖体。

3、本实用新型植物生长室中填充蛭石，菌根共生体生长室中填充粗河砂，可以有效促进菌根共生体的生长，从而使更多的根外菌丝到达生理检测室，同时也免除外源污染物可能造成的潜在污染。

4、本实用新型菌丝体生长室中的玻璃珠具有表面光滑、比重相对较重的特性，易于和AM真菌根外菌丝分离。

5、本实用新型将AM真菌的传统基质培养与无土培养完美结合，具有培养周期短、易于操作，不仅大大提高培养效率，也可进一步探讨AM真菌的生理机制。

6、本实用新型单独安装于支架上，不仅节省了试验场地面积，同时还能使研究人员根据实验的具体目标展开相关研究，减少试验成本，而且支架的使用无需移动培养装置即可方便快捷的回收多余水分。

7、本实用新型装置所使用的材料价格便宜，可以多次使用，达到节约环保的目的。

8、本实用新型具备了玻璃珠分室培养系统最显著的优点，即真菌易于和培养基质分离，同时，可以培养大量纯净的AM真菌繁殖体，将外源污染可能性降低到最小。

9、采用本实用新型获得的纯净的菌剂可以用于AM真菌的分类和鉴定，开展现代分子生物学研究，同时扩展延伸至生理检测室中的根外菌丝可以用于研究根外菌丝的生理机制，从而使丛枝菌根生物技术在农业、林业和园艺中得到广泛应用，以及AM真菌在生物多样性保护和园艺、农业和林业的持续发展中所起的作用和由此产生的生态效益和经济效益得到充分的发挥。

附图说明

下面结合附图对本实用新型的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1为本实用新型的结构示意图。其中：黑色粗线代表植物根系，灰色细线代表根外菌丝。

图中：1—植物生长室 2—尼龙网Ⅰ 3—菌根共生体生长室 4—尼龙网Ⅱ 5—菌丝生长室 6—尼龙网Ⅲ 7—支架 8—蛭石 9—粗河砂 10—玻璃珠 11—生理检测室 12—回收孔 13—注水孔Ⅰ 14—注水孔Ⅱ 15—注水孔Ⅲ 16—注水孔Ⅳ。

具体实施方式

如图1所示，复合式丛枝菌根真菌分室培养装置，包括由支架7固定的敞口的圆柱形有机玻璃容器。圆柱形有机玻璃容器的厚度为3~4 mm。

圆柱形有机玻璃容器自上而下依次通过嵌套的尼龙网Ⅰ2、尼龙网Ⅱ4、尼龙网Ⅲ6分为植物生长室1、菌根共生体生长室3、菌丝生长室5、生理检测室11。圆柱形有机玻璃容器的底部设有回收孔12；植物生长室1所处的圆柱形有机玻璃容器内填充有直径为2~3 mm的蛭石8，其器壁上设有注水孔Ⅰ13；菌根共生体生长室3所处的圆柱形有机玻璃容器内填充有粒径为1~3 mm的粗河砂9，其器壁上设有注水孔Ⅱ14；菌丝生长室5所处的圆柱形有机玻璃容器内填充有粒径为3~4 mm的玻璃珠10，其器壁上设有注水孔Ⅲ15；生理检测室11所处的圆柱形有机玻璃容器器壁上设有注水孔Ⅳ16。

其中：注水孔Ⅰ13、注水孔Ⅱ14、注水孔Ⅲ15、注水孔Ⅳ16上均设有螺旋盖。

尼龙网Ⅱ4的孔径为30 μm。尼龙网Ⅰ2和尼龙网Ⅲ6的孔径均为1000 μm。

以玉米为实施例说明本实用新型的主要培养程序：

⑴基本材料准备：

A、宿主植物为玉米，选用品种为金穗3号，由白银金穗种业有限公司提供，一年生禾本科草本植物，单子叶C4植物，须根系。本实用新型选择玉米作为宿主植物，是基于其根系发达、生物量大，可与多种AM真菌共生，进而获取大量的侵染根段、孢子等繁殖体，是良好的宿主植物。菌根接种剂为内含AM真菌地表球囊霉的孢子、根外菌丝及含被侵染根段的沙土混合物，每10 g接种菌剂内含（80±5）个健康有活力的孢子，本菌根接种剂购买自北京市农科院植物营养与资源研究所菌根学研究课题组（北京市海淀区板井曙光花园中路9号，邮编：100097）。

B、直径10.5 cm、高28 cm的圆柱形有机玻璃容器。

C、培养基质：蛭石、粗河砂、玻璃珠。

D、植物种子采用10%（v/v）H₂O₂灭菌5 min，然后用无菌蒸馏水冲洗干净，培养在28℃的恒温箱中预发芽；圆柱形有机玻璃容器采用84消毒液灭菌，所有培养基质均需在121℃下高压蒸汽灭菌30 min。

⑵培养系统的建立：

分别将蛭石、粗河砂、玻璃珠装入植物生长室1、菌根共生体生长室3、菌丝体生长室5。自植物生长室1浇水（使植物生长室中含水量在15%左右）待水分渗透均匀后，将菌根接种剂（接种剂量为10~20 g）接种在移植幼苗根旁，然后再次浇水（含水量达20%左右）。过多的水分可以通过生理检测室11底部回收孔12回收。

⑶培养过程：

在能够控制光照和温度的温室中进行培养。生理检测室11中添加无菌水时，需注意的是添加完备后应立即拧紧螺旋盖，以便尽可能减少外源污染。培养期间采用黑色塑料薄膜密封植物生长室1，植物地上部保持在外部，这样可以防止水分过度蒸发和藻类植物生长。当植物出现缺素症状是，向植物生长室浇1/4改良Hoagland营养液。

其中：Hoagland营养液是指将118.075 mg硝酸钙、505.5 mg硝酸钾、115 mg磷酸二氢氨、123.24 mg硫酸镁、2 mL 500倍的铁盐母液和1 mL 1000倍的微量元素母液溶于蒸馏水并定容至1000mL后，采用质量浓度为1%的HCl调节其pH值至6.0所得的溶液。

500倍的铁盐母液是指将七水硫酸亚铁8.2g和乙二胺四乙酸二钠（EDTA）8.62g溶于蒸馏水并定容至1000 mL后，采用质量浓度为1%的HCl调节其pH值至5.5即得。

1000倍的微量元素母液是指将硼酸5.69g、氯化锰3.56g、硫酸锌0.46g、硫酸铜0.15g、钼酸铵0.86g溶于蒸馏水并定容至1000mL即得。

培养过程中可随时观察菌根穿过1000 μm尼龙网Ⅰ2伸展到菌根共生体生长室3，也可以观察根外菌丝穿过30 μm尼龙网Ⅱ4进入菌丝体生长室5，以及观察根外菌丝最后延伸到生理检测室11。在菌根共生体完全建立，并且菌丝穿过菌丝体生长室5和生理检测室11之间的尼龙网Ⅲ6后，停止在植物生长室1浇水。由回收孔12排空所有渗滤的溶液后，在生理检测室11内根据试验需要添加玻璃珠或蛭石等作为栽培基质，然后通过生理检测室11的注水孔Ⅳ16缓缓添加无菌水，结束后拧紧螺旋盖。由此开始相关的生理、生化等各类科学实验，如用于研究AM真菌菌丝促进水分和营养元素的吸收、增强宿主植物抵抗非生物胁迫（如干旱、盐渍、重金属毒害等）能力，以及AM真菌产生的球囊霉素等相关生理机制。最后，拆卸装置，取出菌丝体生长室5，将菌丝体生长室5内的真菌繁殖材料连同玻璃珠一起转移到150 μm网筛上，用蒸馏水小心冲洗，通过30 μm网筛回收AM真菌繁殖体。也可以直接将真菌繁殖材料连同玻璃珠慢慢倾倒在盛有蒸馏水的塑料杯中，因为玻璃珠较重所以会快速沉入杯底，而孢子和菌丝体都悬浮于水面，然后用30 μm的网筛回收纯净的真菌材料，连续重复3次即可把所有的菌丝体和孢子回收。

定期施加1/4改良Hoagland营养液，即可保证寄主植物和AM真菌的生长发育。

Claims (8)

1.复合式丛枝菌根真菌分室培养装置，包括由支架（7）固定的敞口的圆柱形有机玻璃容器，其特征在于：所述圆柱形有机玻璃容器自上而下依次通过嵌套的尼龙网Ⅰ（2）、尼龙网Ⅱ（4）、尼龙网Ⅲ（6）分为植物生长室（1）、菌根共生体生长室（3）、菌丝生长室（5）、生理检测室（11）；所述圆柱形有机玻璃容器的底部设有回收孔（12）；所述植物生长室（1）所处的所述圆柱形有机玻璃容器内填充有蛭石（8），其器壁上设有注水孔Ⅰ（13）；所述菌根共生体生长室（3）所处的所述圆柱形有机玻璃容器内填充有粗河砂（9），其器壁上设有注水孔Ⅱ（14）；所述菌丝生长室（5）所处的所述圆柱形有机玻璃容器内填充有玻璃珠（10），其器壁上设有注水孔Ⅲ（15）；所述生理检测室（11）所处的所述圆柱形有机玻璃容器器壁上设有注水孔Ⅳ（16）。

2.如权利要求1所述的复合式丛枝菌根真菌分室培养装置，其特征在于：所述尼龙网Ⅰ（2）和所述尼龙网Ⅲ（6）的孔径均为1000 μm。

3.如权利要求1所述的复合式丛枝菌根真菌分室培养装置，其特征在于：所述尼龙网Ⅱ（4）的孔径为30 μm。

4.如权利要求1所述的复合式丛枝菌根真菌分室培养装置，其特征在于：所述注水孔Ⅰ（13）、注水孔Ⅱ（14）、注水孔Ⅲ（15）、注水孔Ⅳ（16）上均设有螺旋盖。

5.如权利要求1所述的复合式丛枝菌根真菌分室培养装置，其特征在于：所述圆柱形有机玻璃容器的厚度为3~4 mm。

6.如权利要求1所述的复合式丛枝菌根真菌分室培养装置，其特征在于：所述蛭石的直径为2~3 mm。

7.如权利要求1所述的复合式丛枝菌根真菌分室培养装置，其特征在于：所述粗河砂的粒径为1~3 mm。

8.如权利要求1所述的复合式丛枝菌根真菌分室培养装置，其特征在于：所述玻璃珠的粒径为3~4 mm。