CN108753575A - Am共生体培养装置及其制备方法、使用方法 - Google Patents

Am共生体培养装置及其制备方法、使用方法 Download PDF

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Abstract

一种AM共生体培养装置及其制备方法、使用方法，该培养装置的制备方法包括：在一透明容器内放置固体培养基，上表面与水平成一夹角，在其顶部播种萌发无菌植物种子；待根系生长至底部时，加入无菌水或吲哚乙酸溶液促进侧根生长；待根系布满培养基表面，将萌发的丛枝菌根真菌孢子接种在根表面；待AM共生体建立后，根据实验目的不同，向透明容器内添加含有不同目标外源物质的营养液。本发明设计合理，操作简单，成本低廉，可在无菌环境下建立AM真菌与完整植株的共生体系，在完全排除外源微生物干扰的情况下研究AM共生体对外源物质添加的响应及其挥发气体的组分。

Description

AM共生体培养装置及其制备方法、使用方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种AM共生体培养装置及其制备方法、使用方法。
背景技术
丛枝菌根(Arbuscular mycorrhiza，AM)真菌是土壤中广泛存在的一类内生真菌，能够与绝大多数高等植物形成共生关系。AM真菌能够改善植物对水分和养分的吸收能力，提高植物对多种逆境的抗性，具有十分重要的应用价值。目前对AM真菌响应逆境胁迫(如干旱、养分缺乏、重金属污染等)的研究受到越来越多的关注。然而，由于AM真菌是一种植物活体营养专性共生菌，无法进行纯培养，严重影响了对其生理生化特征等方面的研究。利用AM真菌与发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)诱导植物形成的毛状根建立的双重无菌培养体系是近年来被广泛应用的研究AM真菌生理代谢的方法。然而，该技术通过向培养基中添加碳源维持共生体系，无法培养完整植株，故无法研究物质在真菌与整株植物之间的传递等，与实际情况具有很大偏差。为解决这一局限，在培养皿盖上连接试管供植物地上部生长或直接使用土培、沙培等技术是解决这一局限的常用方法。但是，前者虽保证了整株植物与AM真菌建立共生体，但培养皿深度有限，植物根系无法正常进行纵向生长，且该装置培养的植物生物量较小，在研究AM共生体对痕量元素的迁移转化时有一定难度；土培、沙培虽能保证AM真菌与整株植物建立功能完整的共生体系，但该方法中外源微生物的干扰无法排除，故不能单独研究AM真菌与植物之间的直接相互作用。此外，上述体系亦无法对AM共生体产生的挥发性物质进行收集、检测。
因此，发明一种既能在无菌环境下建立整株植物与AM真菌的共生体系，同时能够研究其对外源物质添加的响应，并对共生体产生的挥发态物质进行收集检测的培养体系及方法显得尤为重要。
发明内容
有鉴于此，本发明的主要目的在于提出一种AM共生体培养装置及其制备方法、应用，以期至少部分地解决上述技术问题中的至少之一。
为了实现上述目的，作为本发明的一个方面，提出了一种AM共生体培养装置的制备方法，包括以下步骤：
准备一透明容器，在所述透明容器内放置固体培养基，并使所述固体培养基的上表面与水平面成一夹角，在固体培养基的顶部播种萌发的无菌植物种子；
待所述无菌植物种子的根系生长至透明容器底部，加入无菌水或吲哚乙酸溶液促进侧根生长；
待所述无菌植物种子的根系布满所述固体培养基的表面，将萌发的丛枝菌根真菌孢子接种在所述无菌植物种子的根表面；
待AM共生体，即丛枝菌根真菌与一无菌植物形成的共生体建立后，根据实验目的不同，向透明容器内添加含有不同目标外源物质的营养液，在透明容器上方密封连接两导气管，其中一导气管作为进气管，其另一端连接微孔滤膜和气泵，另一导气管作为出气管，其另一端连接气体收集装置。
作为本发明的另一个方面，还提出了一种通过如上所述的制备方法制备得到的AM共生体培养装置。
作为本发明的再一个方面，还提出了一种采用如上所述的AM共生体培养装置进行的研究方法，其特征在于，包括如下步骤：
制备和调设所述AM共生体培养装置；
达到实验要求的处理时间后，对植物的生理生化指标进行检测，和/或对营养液、收集的气体的组分进行检测。
由此可见，本发明可在无菌环境下建立AM真菌与完整植株的共生体系，设计合理，操作简单，使用方便，成本低廉，同时实现了在完全排除外源微生物干扰的情况下研究AM共生体对外源物质添加的响应及其挥发气体的组分，为深入研究AM共生体对逆境胁迫的响应机理提供了一条实用、有效的途径。
附图说明
图1是本发明实施例所述AM共生体培养装置结构示意图；
图2是本发明实施例所述AM真菌侵染紫花苜蓿根系显微照片(200×)；
图3是本发明实施例所述添加无机砷酸盐后在气体收集管中检测到的挥发态三甲基砷；
图4是本发明实施例所述添加无机砷酸盐后在营养液中检测到的二甲基砷。
上述附图中，附图标记含义如下：
1-平底玻璃试管，2-固体培养基，3-双孔橡皮塞，4-L形玻璃导气管进气管，5-L形玻璃导气管出气管，6-微孔滤膜，7-定速气泵，8-通气软管，9-气体收集装置，10-含目标外源物质的营养液，11-植物地上部，12-植物根系，13-根外菌丝。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
本发明公开了一种AM共生体培养装置的制备方法，包括以下步骤：
准备一透明容器，在所述透明容器内放置固体培养基，其上表面与水平面成一夹角，其顶端播种萌发的无菌植物种子；
待所述无菌植物种子的根系生长至透明容器底部，例如根系末端离透明容器底部小于2cm，优选小于1cm时，加入无菌水或吲哚乙酸溶液促进侧根生长；
待所述无菌植物种子的根系布满所述固体培养基的表面，将萌发的AM真菌(丛枝菌根真菌)孢子接种在所述无菌植物种子的根表面；
待AM共生体(丛枝菌根真菌与一植物形成的共生体)建立后，根据实验目的不同，向透明容器内添加含有不同目标外源物质的营养液，透明容器上方密封连接两导气管，其中一导气管作为进气管，其另一端连接微孔滤膜和气泵，其中另一导气管作为出气管，其另一端连接气体收集装置。气体收集装置例如可以是集气袋或气体收集管等。
其中，该透明容器可以为一试管、烧瓶、锥形瓶或玻璃柱。
其中，该两导气管通过双孔橡皮塞与该透明容器密封连接。
其中，该固体培养基的pH值为5～8，固化剂含量为0.5wt％～2wt％，该固体培养基为低磷培养基，该固体培养基上表面与水平面所成夹角为45°～85°。
其中，该两支导气管的内径为3～10mm，其中，进气管与该透明容器连接的一端可延长至容器底部，出气管与该透明容器连接的一端约与密封口部平齐。
其中，该微孔滤膜为除菌滤膜，孔径优选为0.1～0.3μm，优选为标准的0.22μm。
其中，该气泵为定速气泵，气体流速可调。
本发明还公开了一种通过如上的AM共生体培养装置的制备方法制备得到的AM共生体培养装置。
以及，本发明还公开了一种采用如上的AM共生体培养装置的研究方法，包括如下步骤：
采用如上的方法制备AM共生体培养装置；
达到实验要求的处理时间后，对植物的生理生化指标进行检测，同时对营养液及收集的气体的组分进行检测。
其中，还可以通过外源物质的添加，来研究整个装置对外源物质的响应，及其生理反应。其中，目标外源物质例如可以是聚乙二醇(模拟干旱)、氯化钠(盐胁迫)、砷(重金属污染)、、持久性有机污染物、抗生素或植物激素等。
其中，在植物培养过程中用锡箔纸包裹该透明容器底部及下部，以进行遮光处理。
下面结合附图，通过优选实施例进一步详细描述本发明。应当理解的是，这里例举的优选实施例仅为了说明本发明，而不是为了限制本发明的保护范围。
如图1，在内径为50mm、高为300mm的平底玻璃试管1内盛有1.2g琼脂粉及100mL 1/2霍格兰营养液，其中磷元素含量为原营养液的1/5。经121℃高压灭菌20min后将试管1倾斜，使液面顶端恰好位于试管1上方150mm处。待培养基冷却凝固后直立试管1，此时固体培养基2表面与水平面所成夹角为75°。将萌发的无菌紫花苜蓿种子接种在固体培养基2顶端，用透气封瓶膜封口，待根系12生长至试管1底部，向试管1底部加入2mL无菌水促进侧根生长。将离体的AM真菌Rhizophagusirregularis孢子在水琼脂表面萌发一周，待根系12布满培养基2表面，将萌发的孢子接种在根表12，用透气封瓶膜封口。培养60天后检测菌根侵染率(图2)。在试管1中添加100mL含一定浓度目标外源物质的1/2霍格兰营养液10，试管1上方加盖双孔橡皮塞3并连接两支L型玻璃导气管，L型玻璃导气管进气管4另一端连接0.22μm孔径微孔滤膜6、通气软管8和定速气泵7，L型玻璃导气管出气管5另一端连接气体收集装置9。气体流速为50mL/min。15天后对AM共生体的生理生化指标进行检测，同时对外源物质处理的营养液10及气体收集装置9中的气体组分进行检测。
整个培养装置在人工气候箱中培养，培养条件为：25℃光照培养16h，18℃黑暗培养8h，湿度为60％。培养条件可根据具体需要进行调整。培养基及培养液组成可根据不同植物的培养需要进行调整。目标外源物质分别选取聚乙二醇(模拟干旱)、氯化钠(盐胁迫)和砷(重金属污染)。气体收集装置选用集气袋或气体收集管。
结果表明(如图2、3和4所示)，紫花苜蓿与AM真菌R.irregularis能够形成共生，可在无菌环境下建立AM真菌与完整植株的共生体系；向试管中添加30μM的无机砷酸钠，处理15天后，收集到三甲基砷(TMAs)气体，检测质量为2.01ng；在营养液中检测到二甲基砷酸(DMA)，检测浓度为13.50μg/L；实现了在完全排除外源微生物干扰的情况下研究AM共生体对无机砷的甲基化和挥发过程，为深入研究AM共生体对外源物质无机砷的响应机理提供了一条实用、有效的途径。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种AM共生体培养装置的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
准备一透明容器，在所述透明容器内放置固体培养基，并使所述固体培养基的上表面与水平面成一夹角，在固体培养基的顶部播种萌发的无菌植物种子；
待所述无菌植物种子的根系生长至透明容器底部，加入无菌水或吲哚乙酸溶液促进侧根生长；
待所述无菌植物种子的根系布满所述固体培养基的表面，将萌发的丛枝菌根真菌孢子接种在所述无菌植物种子的根表面；
待AM共生体，即丛枝菌根真菌与一无菌植物形成的共生体建立后，根据实验目的不同，向透明容器内添加含有不同目标外源物质的营养液，在透明容器上方密封连接两导气管，其中一导气管作为进气管，其另一端连接微孔滤膜和气泵，另一导气管作为出气管，其另一端连接气体收集装置。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述透明容器为试管、烧瓶、锥形瓶或玻璃柱。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述两导气管通过双孔橡皮塞与该透明容器密封连接。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述固体培养基的pH值为5～8；
所述固体培养基中固化剂的含量优选为0.5wt％～2wt％；
所述固体培养基优选为低磷培养基；
所述固体培养基上表面与水平面所成夹角优选为45°～85°。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述两支导气管的内径为3～10mm；
作为优选，所述进气管与透明容器连接的一端延长至所述透明容器底部，所述出气管与透明容器连接的一端与密封口部平齐。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述微孔滤膜为除菌滤膜，孔径优选为0.1～0.3μm；
作为优选，所述气泵为定速气泵，气体流速可调；
作为优选，所述气体收集装置是集气袋或气体收集管。
7.一种通过如权利要求1～6任一项所述的制备方法制备得到的AM共生体培养装置。
8.一种采用如权利要求7所述的AM共生体培养装置进行的研究方法，其特征在于，包括如下步骤：
制备和调设所述AM共生体培养装置；
达到实验要求的处理时间后，对植物的生理生化指标进行检测，和/或对营养液、收集的气体的组分进行检测。
9.根据权利要求8所述的研究方法，其特征在于，所述外源物质为聚乙二醇、氯化钠、重金属、持久性有机污染物、抗生素或植物激素。
10.根据权利要求8所述的研究方法，其特征在于，在植物培养过程中用锡箔纸包裹所述透明容器底部及下部。
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