CN103168036A - 温和的阳离子线粒体解偶联剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物学和医学，并且尤其可在医学上用于制备用于线粒体特异性自调节解偶联的药物组合物。本发明可用于治疗与细胞代谢失调相关的疾病和病症，用于治疗肥胖(包括其病理形式)，并且还用于治疗与自由基和活性氧簇形成增多相关的疾病。

Description

温和的阳离子线粒体解偶联剂

技术领域

本发明涉及药理学、生物学和医学，并且涉及一类化合物的制备和应用，所述化合物可用于药物(制剂)的药物组合物，其用于预防和治疗人和动物中伴有线粒体中三磷酸腺苷合成水平升高以及内源性氧化应激的多种疾病和病理状况。

背景技术

大多数真核细胞包含专门化的细胞器——线粒体。线粒体通常被称为细胞的发电厂，因为其主要功能是合成通用的能量载体分子三磷酸腺苷(ATP)，其有助于几乎所有的细胞功能。ATP的生物合成通过氧化磷酸化而发生。该过程的本质是沿线粒体电子传递链从NADH分子转移电子至分子氧，导致水分子的形成和电化学质子梯度的建立，后者被ATP合成酶用于合成ATP。在恒温动物中，以电化学质子梯度形式储存的一部分能量用于维持恒定的体温，而不与ATP的合成相偶联。使氧化磷酸化与ATP合成解偶联，是以位于细胞质中的游离脂肪酸为代价而发生的。在线粒体膜的外表面，脂肪酸阴离子(RCOO^-)与通过呼吸链酶从线粒体泵出的H⁺离子结合。所产生的脂肪酸的中性质子化形式(RCOOH)穿过膜，并在其内表面解离产生RCOO^-和H⁺。后者补偿线粒体内通过呼吸链从中移除而缺乏的H⁺离子。所产生的RCOO^-阴离子通过线粒体蛋白质阴离子转运蛋白回到外部，所述阴离子转运蛋白尤其是ATP/ADP逆向转运蛋白或被称为UCP(解偶联蛋白质)的特殊解偶联蛋白。通常，温血动物总代谢的20～25％直接用于维持恒定的体温，且产热机制与以提高质子传导性为代价的ATP合成中呼吸的解偶联相关联。质子传导性的提高或“温和解偶联”均可用于因糖类和脂质代谢的刺激而引起的生热作用和体重控制。

解偶联的天然机制不总是应对其功能。已描述了许多病理症状，其中伴有线粒体中活性氧簇(аκтивных форм кислорода(АФК)，reactiveоxygen species(ROS))水平升高的线粒体超极化发生，导致整体细胞功能退化。此情况发生于肥胖、受损的糖代谢，并且还发生于与发生氧化应激相关的病理状况：缺血性组织损伤、帕金森病、阿尔茨海默病、自身免疫病。

使用能够将线粒体质子传导性可调节性升高的解偶联剂可消除由所述病理状况(尤其是通过控制由线粒体产生的ROS水平)引起的负面作用(Korshunov SS，Skulachev VP，Starkov AA，High protonic potentialactuates a mechanism of production of reactive oxygen species inmitochondria.FEBS Lett1997；416；15-18.)。

阴离子解偶联剂2，4-二硝基苯酚(2，4-динитрофенола(ДНФ)，2，4-dinitrophenol(DNP))的临床作用已在肥胖的人中显示。(Parasc和olaJ，Dinitrophenol和bioenergetics：a historical perspective.Mol CellBiochem1974；5：69-77.)。截至1934年，用DNP治疗了超过十万例患者。治疗后，事实上所有患者都有有效程度不同的体重减轻，但是他们中许多显示了严重的副作用。小的过量给药引起患者肌无力、高烧，在一些情况中导致死亡。另外，在许多患者中，制剂的长期施用导致发生白内障和视力丧失。在1938年，所有这些事实导致严格禁止该制剂用于治疗任何疾病。然而，用DNP治疗实际上引起患者体重减轻的事实表明该方法的确定性。

因此，开发增强线粒体膜质子传导性的无毒制剂是创建新种类药物和组合物的有前景的途径。为避免质子载体(протонофоры，protonophore)具有毒性作用以及当细胞需要合成ATP时仍有活性的情况，所述质子载体的活性必需依赖于线粒体的功能状态，例如，依赖于跨内膜的电位。在超极化状态，质子载体仅应释放过量的电位而不应使其过度降低(这可不可避免地引起呼吸抑制)。理想的质子载体即使在相对高浓度下也不应抑制线粒体呼吸。进行了合成可具有“温和”线粒体解偶联剂性质之物质的早期尝试，但它们都失败了(Blaikie FH，Brown SE，Samuelsson LM，Br和MD，Smith RA，Murphy MP，Targeting dinitroph enol to mitoch ondria：limitations to the development of a self-limiting mitochondrial protonophore.Biosci Rep.2006；26；231-43.)。

包括DNP的绝大多数质子载体是带负电的分子、阴离子，并且其解偶联的机制与脂肪酸阴离子(RCOO^-)的机制相似。阴离子质子载体的质子化产生中性化合物，其穿透进入线粒体(无论线粒体电位如何)，而“温和解偶联剂”应优选地仅穿透进入超极化的线粒体。

上述所有对于使用引起线粒体温和解偶联的化合物来说有远大的前景。但是，直到现在仍没能获得具有所述性质的化合物。

定义：

在以下详细描述本发明之前，应理解本发明不限于在此描述的具体方法、方案和试剂，因为其是可变的。另外，应理解的是，在本发明中，术语仅用于描述具体的实施方案，并不限制本发明的范围，其仅受所附权利要求的限制。除非另有指明，在此使用的所有技术和科学术语具有与本领域技术人员可理解的相同含义。

质子载体是能够跨线粒体内膜电致运输质子的、导致膜电位降低以及氧化与磷酸化解偶联的化合物。

解偶联剂是引起线粒体中呼吸与氧化磷酸化解偶联的化合物。

解偶联的机制与由化合物的质子载体活性或诱导膜的内源性质子传导性引起的线粒体膜电位降低相关。

自调节解偶联剂是其解偶联能力取决于线粒体膜电位值的化合物。

温和解偶联或适度解偶联是线粒体膜电位的可逆性降低，其不引起抑制呼吸、破坏呼吸链组分或妨碍线粒体膜的物理化学性质。

线粒体靶向性质子载体是靶向性地在线粒体中积聚并提高线粒体内膜之质子传导性的化合物(即降低跨该膜的质子电化学电位)。

在对本发明的通篇描述中，引用了多个文件。每个在此引用的上述或下述文件(包括所有专利、专利申请、科学出版物、说明书和生产商的使用说明)通过引用整体引入在本发明。

其他术语的定义：取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环基、饱和或部分不饱和的多环体系。在说明书的其余部分中每个使用实例的这些术语可具有相应定义的含义和优选的含义。然而，在对本发明的整个描述中使用它们的一些实例中给出了这些术语的优选含义。

术语“取代或未取代的烷基”是指取代或未取代的饱和或不饱和的直链、支链或环状碳链。优选地，该链含有1至14个(即，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个)碳原子，例如，甲基、乙基甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十二烷基、十八烷基。另外，本发明中的术语“取代或未取代的烷基”还包括杂烷基，其是饱和或不饱和的直链或支链的碳链。优选地，该链含有被相同或不同的杂原子插入一次或数次(例如，1、2、3、4、5次)的1至14个(即，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个)碳原子，例如，甲基、乙基甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十二烷基、十八烷基。优选地，所述杂原子选自O、S和N，例如CH₂-O-CH₃、CH₂-O-C₂H₅、C₂H₄-O-CH₃、C₂H₄-O-C₂H₅等。

术语“取代或未取代的芳基”优选地指含6个碳原子的芳香单环、含10个碳原子的芳香双环体系或含14个碳原子的芳香环的三环体系。实例为苯基、萘基或蒽基。另外，本发明中的术语“取代或未取代的芳基”还包括取代或未取代的芳烷基。术语“取代或未取代的芳烷基”是指被芳基取代的烷基部分，且烷基和芳基如上文所定义。实例是苯基。优选地，在本上下文中，烷基链含有1至8个(即，1、2、3、4、5、6、7或8个)碳原子，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁烯基、叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基。芳基烷基任选地在烷基和/或芳基部分取代。优选地，与烷基相连的芳基是苯基、萘基和蒽基。

除非另作说明，术语“取代或未取代的杂环基”单独或与其他术语组合分别代表环状形式的“烷基”和“杂烷基”，优选地具有3、4、5、6、7、8、9或10个成环原子，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基等。这表明术语“环烷基”和“杂环烷基”还包括其双环、三环和多环形式。如果形成双环、三环或多环，优选相应的环通过两个相邻的碳原子连接在一起，但作为替代，两个环可通过同一碳原子连接，即，它们形成螺环体系或它们形成“桥”环体系。术语“取代或未取代的杂环基”优选地指含有5个原子的饱和环，其中至少一个是N、O或S原子，并且其任选地包含一个额外的O原子或一个额外的N原子；含6个原子的饱和环，其中至少一个是N、O或S原子，并且其任选地包含一个额外的O原子或一个额外的N原子或两个额外的N原子；或者含9或10个原子的饱和双环，其中至少一个是N、O或S原子，并且其任选地包含一个、两个或三个额外的N原子。“环烷基”和“杂环烷基”任选地被取代。另外对于杂环烷基，杂原子可在杂环与分子的其余部分相连接的位置上。优选的环烷基的实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基、螺[3，3]庚基、螺[3，4]辛基、螺[4，3]辛基、螺[3，5]壬基、螺[5，3]壬基、螺[3，6]癸基、螺[6，3]癸基、螺[4，5]癸基、螺[5，4]癸基、双环[2.2.1]庚基、双环[2.2.2]辛基、金刚烷基等等。杂环烷基的实例包括1-(1，2，5，6-四氢吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、1，8-二氮杂螺-[4，5]癸基、1，7-二氮杂螺[4，5]癸基、1，6-二氮杂螺[4，5]癸基、2，8-二氮杂螺[4，5]癸基、2，7-二氮杂螺[4，5]癸基、2，6-二氮杂螺[4，5]癸基、1，8-二氮杂螺[5，4]癸基、1，7-二氮杂螺[5，4]癸基、2，8-二氮杂螺-[5，4]癸基、2，7-二氮杂螺[5，4]癸基、3，8-二氮杂螺[5，4]癸基、3，7-二氮杂螺[5，4]癸基、l-氮杂-7，11-二氧代-螺[5，5]十一烷基、1，4-二氮杂双环[2.2.2]辛-2-基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等等。

术语“多环体系”是指包含至少一个双键和/或三键的双环、三环或多环环烷基或杂环烷基变体。然而，脂环体系不是芳香性的或杂芳性的，即没有共轭双键系统或自由电子对。因此，在脂环体系中双键和/或三键的最大数目取决于环上原子数，例如，在含有最多5个原子的环体系中，脂环体系包含一个双键，在含有6个原子环体系中，脂环体系含有最多两个双键。因此，以下定义的术语“环烯基”是脂环体系的优选实施方案。脂环体系任选地被取代。

术语“取代或未取代的杂芳基”优选地指5或6元芳香单环，其中碳原子中的至少一个被1、2或3个(对于5元环)或1、2、3或4个(对于6元环)相同或不同的优选地选自O、N和S的杂原子替代；芳香双环体系，其中8、9、10、11或12个碳原子中的1、2、3、4、5或6个被同一或不同的优选地选自O、N和S的杂原子替代；或者三环芳香环体系，其中13、14、15或16个碳原子中的1、2、3、4、5或6个被相同或不同的优选地选自O、N和S的杂原子替代。实例包括呋喃基、噻吩基、

唑基、异唑基、1，2，5-

二唑基、1，2，3-

二唑基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、1，2，3-三唑基、噻唑基、异噻唑基、1，2，3-噻二唑基、1，2，5-噻二唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、1，2，3-三嗪基、1，2，4-三嗪基、1，3，5-三嗪基、1-苯并呋喃基、2-苯并呋喃基、吲哚基、异吲哚基、苯并噻吩基、2-苯并噻吩基、1H-吲唑基、苯并咪唑基、苯并唑基、吲哚

嗪基、2，1-苯并异唑基、苯并噻唑基、1，2-苯并异噻唑基、2，1-苯并异噻唑基、苯并三唑基、喹啉基、异喹啉基、2，3-苯并二嗪基、喹喔啉基、喹唑啉基、1，2，3-苯并三嗪基或1，2，4-苯并三嗪基。另外，本发明中术语“取代或未取代的杂芳基”还包括取代或未取代的杂芳烷基。术语“杂芳烷基”是指被杂芳基取代的烷基部分，其中术语烷基和杂芳基如上文所定义。一个实例是(2-吡啶基)乙基、(3-吡啶基)乙基或(2-吡啶基)甲基。本上下文中优选的烷基链包含1至8个(即，1、2、3、4、5、6、7或8个)碳原子，例如甲基、乙基甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁烯基、叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基。杂芳烷基任选地在烷基和/或杂芳基部分中取代。优选地，与烷基部分相连的杂芳基是

唑基、异

唑基、1，2，5-二唑基、1，2，3-

二唑基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、1，2，3-三唑基、噻唑基、异噻唑基、1，2，3-噻二唑基、1，2，5-噻二唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、1，2，3-三嗪基、1，2，4-三嗪基、1，3，5-三嗪基、1-苯并呋喃基、2-苯并呋喃基、吲哚基、异吲哚基、苯并噻吩基、2-苯并噻吩基、1H-吲唑基、苯并咪唑基、苯并

唑基、吲哚

嗪基、2，1-苯并异

唑基、苯并噻唑基、1，2-苯并异噻唑基、2，1-苯并异噻唑基、苯并三唑基、2，3-苯并二嗪基、喹啉基、异喹啉基、喹喔啉基、喹唑啉基、1，2，3-苯并三嗪基或1，2，4-苯并三嗪基。

一些实施方案包括基团：烷氧基、环烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、烯氧基、环烯氧基、炔氧基、烷硫基、环烷硫基、芳硫基、芳烷硫基、烯基巯基、环烯硫基、炔硫基、烷氨基、环烷氨基、芳氨基、芳烷氨基、烯氨基、环烯氨基、炔氨基。

另一些实施方案包括基团：羟基烷基、羟基环烷基、羟基芳基、羟基芳烷基、羟基烯基、羟基环烯基、羟基炔基、巯基烷基、巯基环烷基、巯基芳基、巯基芳烷基、巯基烯基、巯基环烯基、巯基炔基、氨基烷基、氨基环烷基、氨基芳基、氨基芳烷基、氨基烯基、氨基环烯基、氨基炔基。

在另一个实施方案中，烷基、环烷基、芳基、芳烷基、烯基、环烯基、炔基基团中的氢原子可彼此独立地被一个或更多个卤素原子取代。所述基团之一是三氟甲基。

如果可彼此独立地选择两个或更多个基团，那么术语“独立地”表示这些基团可相同或不同。

术语“可药用盐”是指本发明化合物的盐。本发明化合物的合适的可药用盐包括酸加成盐，其可例如通过将本发明化合物的溶液与可药用酸的溶液混合而得到，所述酸如盐酸、硫酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、醋酸、苯甲酸、柠檬酸、酒石酸、碳酸或磷酸。另外，当根据本发明的化合物具有酸部分时，其合适的可药用盐可包括碱金属盐(例如，钠盐或钾盐)；碱土金属盐(例如，钙盐或镁盐)；以及与合适的有机配体形成的盐(例如，使用反离子形成的铵、季铵和胺阳离子，例如，卤化物、氢氧化物、羧酸盐、硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐、烷基磺酸盐和芳基磺酸盐)。可药用盐的示例性实例包括(但不限于)：醋酸盐、己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、碳酸氢盐、硫酸氢盐、酒石酸氢盐、硼酸盐、溴化物、丁酸盐、乙二胺四乙酸的钙盐(乙二胺四乙酸盐)、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐(камфорсульфонат，cаmphorsulfonate)、樟脑磺酸盐(камсилат，camsilate)、碳酸盐、氯化物、柠檬酸盐、克拉维酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡萄糖酸盐、二盐酸盐、十二烷基磺酸盐、乙二胺四乙酸盐、乙二磺酸盐、丙酸酯月桂硫酸盐(эстолат，estolate)、乙磺酸盐(эсилат，esilate)、乙磺酸盐(этансульфонат，ethanesulfonate)、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐(глюоцелтат，gluceptate)、葡庚糖酸盐(глюκогептонат，glucoheptonate)、葡糖酸盐、谷氨酸盐、甘油磷酸盐、羟乙酰基对氨基苯肿酸盐(гликолиларсанилат，glycolylarsanilate)、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、己基间苯二酚盐、海巴明盐(гидрабамин，hydrobamine)、氢溴酸盐、盐酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、羟基萘甲酸盐、碘化物、异硫代硫酸盐、乳酸盐、乳糖醛酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐(мезилат，mesylate)、甲磺酸盐(тетансульфонат，methanesulfonate)、甲基硫酸盐、粘酸盐(мукат，mucate)、2-萘磺酸盐、萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、N-甲葡胺铵盐、油酸盐、草酸盐、扑酸盐(双羟萘酸盐)、棕榈酸盐、泛酸盐、果冻酸盐(пектинат，pectinate)、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐/二磷酸盐、苦味酸盐、三甲基乙酸盐(пивалат，pivalate)、聚半乳糖醛酸盐、丙酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、硫酸盐、次醋酸盐、琥珀酸盐、鞣酸盐、酒石酸盐、茶氯酸盐(теоκлат，theoclate)、甲苯磺酸盐、三乙基碘化物、十一烷酸盐、戊酸盐等(例如，参见文章Berge S.M.等，“Pharmaceutical salts”，Journal of Pharmaceutical Science，1977，v.66，p.1-19)。本发明一些具体的化合物包含碱性和酸性官能团，其允许将这些化合物转化为碱加成盐或酸加成盐。

可通过使盐与碱或酸相接触来回收化合物的中性形式，通过传统方法释放原化合物。原形式的化合物在某些物理性质方面与多种盐不同，例如在极性溶剂中的溶解度，但在另一些方面，对于本发明的目的而言，这些盐与原形式的化合物等同。

除了盐的形式之外，本发明提供前药形式的化合物。所述化合物的前药形式是这样的化合物，其在生理条件下很容易发生化学变化以形成结构(I)的化合物。前药是药理学活性的或无活性化合物，在给患者施用前药后，其被体内生理作用(例如，水解、代谢等)化学修饰以形成本发明的化合物。另外，前药可通过化学或生化方法体外转化为本发明的化合物。例如，在位于贮库型透皮贴剂中各酶的影响下，前药可缓慢地转化为本发明的化合物。在获得和使用前药中所应用的方法和技术的适用性是本领域技术人员公知的。对包含酯的前药的综合考虑在综述Svensson和Tunek，Drug Metabolism Reviews16.5(1988)和书籍Bundgaard，Design ofProdrugs，Elsevier(1985)中给出。

可使用本领域技术人员所已知的传统方法和技术(即，如以下文献所述(例如，在传统著作中，如Houben-Weyl，Methoden der organischenChemie[Methods of Organic Chemistry]，Georg-Thieme-Verlag，Stuttgart))，在本领域技术人员已知的并且适合于这些反应的反应条件下合成根据本发明的化合物以及用于其生产的原材料。另外，在本发明中，可使用在此没有更详提及述的任何其他变化形式。

本发明的一些化合物可以非溶剂化形式以及溶剂化形式(包括水化形式)存在。通常来说，溶剂化形式等同于非溶剂化形式，并且认为它们在本发明的范围内。本发明的一些化合物可以多种晶体或无定形形式存在。通常在本发明的预期用途中，所有物理形式是等同的，并且认为它们在本发明的范围内。

本发明的一些化合物含有不对称碳原子(光学中心)或双键。认为所有外消旋体、对映体、非对映体、几何异构体和个体异构体在本发明的范围内。因此，本发明的化合物包含立体异构体的混合物，尤其是对映体的混合物，以及纯化的立体异构体，尤其是纯化的对映体或立体异构体富集的混合物，尤其是对映体富集的混合物。另外，本发明的范围包括以下式(1)至(5)所示化合物的个体异构体，及其任何全部或部分平衡的混合物。另外，本发明包含通过以下式所示化合物的个体异构体，作为与其异构体(其中一个或更多个手性中心反转)的混合物。另外，应理解的是，式(1)～(5)化合物的所有互变异构体以及互变异构体的混合物在式(1)～(5)化合物的范围内，并且优选地与满足该目标的式和部分式相匹配。得到的外消旋体可通过基本上已知的机械或化学方法拆分为异构体。非对映体优选地由外消旋体混合物通过与光学活性拆分剂相互作用而形成。通过使用填充有光学活性拆分剂的柱来拆分对映体也是有利的。

另外，可通过使用标准纯化方法(例如色谱法或分级结晶)来实现对非对映体的拆分。

对于作为这种化合物之一部分的一种或更多种原子，本发明的化合物还可具有非天然的原子同位素比例。例如，可用放射性同位素(例如，氚(³H)、碘-125(¹²⁵I)或碳-14(¹⁴C))标记这些化合物。认为本发明化合物的所有同位素变体(放射性或非放射性)都在本发明的保护范围内。

发明内容

开发了能够使线粒体温和解偶联的通用结构(I)所描述的若干化合物。本发明基于以下原理：以电化学电位能量为代价，在活细胞的线粒体中自调节靶向递送生物学活性化合物。所提出的自调节机制如下：在细胞的细胞质中结构(I)的化合物与质子相互作用并带有了正电。由于该电荷以及这些化合物的亲脂性，它们被递送至带有负电的线粒体，在其中它们根据能斯特方程(уравнению Нернста，Nernst equation)积聚。重要的是要注意线粒体的功能状态(即，其电位)将决定结构(I)化合物的浓度。化合物的所述性质决定其温和的解偶联活性，其提供对仅带有高膜电位的线粒体的有效解偶联。穿透线粒体内膜后，所述化合物提高了线粒体内膜的质子传导性，这刺激了线粒体膜电位的下降。在线粒体基质中，所述化合物被去质子化，并且解偶联剂的中性形式从线粒体扩散回到细胞质。

偶然地，当用结构(I)的化合物进行实验时，发现它们具有适度解偶联活性(参见实验实施例)。我们实验的结果表明，所观察到的解偶联过程取决于线粒体电位，而不取决于脂肪酸阴离子(RCOO^-，位于线粒体外表面的解偶联过程的潜在参与者)的存在。

结构(I)的化合物与其他种类的阳离子解偶联剂化合物相似。但是，目前已知的阳离子解偶联剂引起线粒体膜通透性非特异性地升高，这导致线粒体肿胀、细胞和整个生物体的功能破坏(Shinohara Y，B和ou S，KoraS，Kitamura S，Inazumi S，Terada H.(1998)，FEBS Lett.428，89-92.)。请求保护的结构的出乎意料的和根本性的差异是其温和解偶联作用取决于线粒体电化学电位，并且显著地胜过去污剂作用或其他不期望的副作用。

化合物(I)的通式如下：

(X-Z)ⁿ⁺(A)^n-

结构(I)

和/或其还原形式，其中

《X》-基团，其包含长度为最多20个碳原子的取代或未取代的烃链，任选地包含双键或三键、杂原子如-S-、-N-、-O-，或任选地包含-C(O)O-、-C(O)-和/或-C(O)N(H)-基团；

《Z》-基团，其可在生理pH值下质子化，并且能够提供整个化合物向线粒体中的靶向递送；

《A》-反离子

《n》-1至3的整数，

和/或其互变异构形式、溶剂化物、盐、异构体或前药形式，以及可药用载体。

前提是在一个化合物中的X与Z的组合应当：

a)具有在典型的细胞质pH值下质子化的能力，并且具有4至11的pK；

b)具有足够的亲脂性，从而以质子化形式穿透线粒体；

c)提供在线粒体中电化学电位依赖性的穿透；

d)具有在典型的线粒体基质弱碱性pH条件下去质子化的能力；

e)具有以去质子化形式从线粒体基质离开的能力。

一种优选的通式(I)化合物是以下组的结构(II)化合物和/或其还原形式：

结构(II)

其中：

R1和R3-氢原子，R2和R4彼此独立-氢原子或取代或未取代的C1-C4烷基；R2，与R5相连接；或R4与R6相连接，从而形成取代或未取代的1，3-亚丙基；

R5、R6、R7和R8-彼此独立地是氢原子或甲基；

《A》-可药用阴离子；

《n》-1至3的整数。

最优选的通式(I)化合物是式(1)-C10R19和式(2)-C12R19的化合物和/或其还原形式：

前提是除了Br^-之外还可选择任何其他可药用阴离子(例如，Cl^-、SO₄ ^2-等)作为阴离子；

本发明的一个主要方面是包含有效量的线粒体靶向性质子载体(与结构(I)化合物相同)的、旨在用于在人和动物中预防或治疗某些疾病的药物组合物，其中线粒体的温和解偶联是有效的。应注意的是，组合物的医学目的(供使用的适应症)是组合物最主要的方面，主要限定其内含物、剂量和施用方式等。

本发明的另一方面是线粒体靶向性质子载体用于制备药物组合物的用途，所述药物组合物旨在预防或治疗这样的疾病，其中刺激细胞代谢(包括脂质代谢)是有效的。

本发明的另一方面是线粒体靶向性质子载体用于制备药物制剂的用途，所述药物制剂旨在预防或治疗心血管病理状况(包括动脉粥样硬化、心律失常、缺血性心脏病、心肌梗死)、肾缺血或梗死、脑卒中以及由血液循环或向组织和器官供氧障碍引起的多种疾病和病理状况。

本发明的另一些方面是：

-线粒体靶向性质子载体用于治疗病理状况的应用，所述病理状况是非缺血性障碍的结果，包括由血管破坏或其通透性受损引起的出血性低血容量症的结果以及由血管扩张剂引起的低血容量症的结果；

-线粒体靶向性质子载体用于治疗病理状况的应用，所述病理状况是非缺血性循环障碍的结果，所述障碍包括由通过皮肤、肺、胃肠道或肾失水引起的低血容量症(包括由利尿剂诱发的低血容量症)；

-线粒体靶向性质子载体用于治疗由动脉血中缺乏氧气引起的血氧不足性缺氧(包括由所吸入空气中缺乏氧气引起的缺氧)之结果的应用；

-线粒体靶向性质子载体用于治疗贫血性缺氧之结果的应用，所述贫血性缺氧由血氧容量降低(由于血液中血红蛋白量下降或血红蛋白状态改变)引起；

-线粒体靶向性质子载体用于治疗细胞、组织或器官中不期望的变化或预防其发生的应用，向所述细胞、组织或器官的天然血流或氧气供应在医学干预期间(包括清血法(афереза，apheresis)期间)被限制或终止，降低或清除向细胞、组织或器官的血流旨在对其进行进一步的保存和/或移植以及多种外科手术；

-线粒体靶向性质子载体用于延长人或动物预期寿命以及用于与衰老和氧化应激增强相关疾病的的应用；

-线粒体靶向性质子载体对抗眼疾病的应用，所述眼疾病与氧化应激和/或视网膜细胞或参与提供视觉之过程的其他类型细胞大量丧失相关；

-线粒体靶向性质子载体用于治疗或预防疾病的应用，所述疾病与组织和器官中大量程序性细胞死亡相关和/或与引发程序性细胞死亡的受影响组织中的信号分布相关；

-线粒体靶向性质子载体用于预防和/或治疗心血管疾病的应用，对于所述疾病，程序性细胞死亡、凋亡或坏死显示了重要作用；

-线粒体靶向性质子载体在移植中对抗组织排斥和保存移植材料的应用；

-线粒体靶向性质子载体在美容术中克服烧伤作用、改善伤口愈合以及外科缝合的应用；

-线粒体靶向性质子载体在生物技术中提高用于研究和技术需要的动物细胞培养物或人细胞培养物活力的应用；

-线粒体靶向性质子载体提高动物、人、植物或真菌细胞培养物(当用于生产药物制剂、蛋白质、抗体时)之生产力的应用；

-线粒体靶向性质子载体提高整个植物(当用于生产药物制剂：蛋白质、抗体)之生产力的应用；

-线粒体靶向性质子载体用于治疗和预防精神和心理障碍(包括临床的抑郁和精神病)的应用；

-线粒体靶向性质子载体用于在人和动物中治疗寄生虫病的应用，所述寄生虫病由真菌、锥虫、利什曼虫、蠕虫和另一些寄生虫引起；

-线粒体靶向性质子载体用于抑制精子发生和用作男性避孕剂的应用；

与细胞代谢紊乱相关的疾病是指：胰岛素依赖型糖尿病、伴有昏迷的胰岛素依赖型糖尿病、伴有酮症酸中毒的胰岛素依赖型糖尿病、伴有肾病的胰岛素依赖型糖尿病、伴有眼损伤的胰岛素依赖型糖尿病、伴有神经性并发症的胰岛素依赖型糖尿病、伴有外周循环障碍的胰岛素依赖型糖尿病、伴有多重并发症的胰岛素依赖型糖尿病、无并发症的胰岛素依赖型糖尿病、非胰岛素依赖型糖尿病、伴有昏迷的非胰岛素依赖型糖尿病、伴有酮症酸中毒的非胰岛素依赖型糖尿病、伴有肾病的非胰岛素依赖型糖尿病、伴有眼损伤的非胰岛素依赖型糖尿病、伴有神经性并发症的非胰岛素依赖型糖尿病、伴有外周循环障碍的非胰岛素依赖型糖尿病、营养不良相关糖尿病、局部脂肪沉积、肥胖、过度能量摄入引起的肥胖、服用药物引起的肥胖、伴有肺泡通气不足的极度肥胖、维生素A过多症、高胡萝卜素血症、维生素B6过量综合征、维生素D过多症、过量食物供应作用、芳香族氨基酸代谢紊乱、典型性苯丙酮酸尿、其他种类的高苯丙氨酸血症、酪氨酸代谢紊乱、白化病、其他芳香族氨基酸代谢紊乱、支链氨基酸代谢和脂肪酸代谢紊乱、枫糖尿病、氨基酸转运障碍、含硫氨基酸代谢紊乱、尿素循环紊乱、赖氨酸和羟赖氨酸代谢紊乱、鸟氨酸代谢紊乱、甘氨酸代谢紊乱、乳糖不耐症、先天性乳糖缺乏症(врожденнаянедостаточностьлактозы，inborn lactose deficency)、继发性乳糖酶缺乏症(вторичнаянедостаточностьлактазы，secondary lactase deficiency)、糖原贮积症、果糖代谢紊乱、半乳糖代谢紊乱、丙酮酸代谢和糖异生紊乱、鞘脂代谢紊乱及其他脂贮积症、GM2-神经节苷脂贮积症、鞘脂贮积症、神经细胞蜡样质脂褐素病、糖胺聚糖代谢紊乱、粘多糖贮积症I型、粘多糖贮积症II型、糖蛋白代谢紊乱、翻译后修饰缺陷、糖蛋白降解紊乱、单纯性高胆固醇血症、单纯性高甘油酯血症、混合性高脂血症、高乳糜微粒血症、脂蛋白缺乏症、嘌呤和嘧啶代谢紊乱、无炎性和痛风性关节炎迹象的高尿酸血症、莱-尼综合征(синдромЛеmа-Нихена，Lesch-Nyhan syndrome)、卟啉和胆红素代谢紊乱、遗传性红细胞生成性卟啉病、迟发性皮肤卟啉症、过氧化氢酶和过氧化物酶缺陷症、吉尔伯综合征(синдромЖильберта，Gilbert’s syndrome)、克-纳综合征(синдромКриглера-Наяйяра，Crigler-Najjar syndrome)、矿质代谢紊乱、囊性纤维化、淀粉样变、容积渗摩尔浓度过高和高钠血症、容积渗摩尔浓度过低和低钠血症、酸中毒、碱中毒、营养失调和其他疾病中的代谢紊乱。

缺血性心脏病是指：心绞痛(стенокардия[грудная жаба]，angina[angina pectoris]、不稳定型心绞痛、伴有高血压的不稳定型心绞痛、伴有证实性痉挛的心绞痛、伴有高血压的伴有证实性痉挛的心绞痛、急性心肌梗死、急性透壁性前壁心肌梗死、伴有高血压的急性透壁性前壁心肌梗死、急性透壁性下壁心肌梗死、伴有高血压的急性透壁性下壁心肌梗死、急性心内膜下心肌梗死、伴有高血压的急性心内膜下心肌梗死、复发性心肌梗死、复发性下壁心肌梗死、急性心肌梗死后的一些当前并发症、急性心肌梗死后的心包积血作为当前并发症、急性心肌梗死后的房间隔缺损作为当前并发症、急性心肌梗死后的室间隔缺损作为当前并发症、急性心肌梗死后的心房、心耳和心室血栓形成作为当前并发症、急性缺血性心脏病的其他形式、不导致心肌梗死的冠状动脉血栓形成、德雷斯勒综合征(синдром Дрессдера，Dressler’s syndrome)、伴有高血压的德雷斯勒综合征、慢性缺血性心脏病、动脉粥样硬化性心血管疾病、陈旧性心肌梗死、心动脉瘤、伴有高血压的心动脉瘤、冠状动脉瘤、伴有高血压的冠状动脉瘤、缺血性心肌病、无症状型心肌缺血；

其他心脏疾病是指：急性心包炎、急性非特异性特发性心包炎、传染性心包炎、慢性粘连性心包炎、慢性缩窄性心包炎、心包积液(非炎性)、急性和亚急性心内膜炎、急性和亚急性感染性心内膜炎、非风湿性二尖瓣病变、二尖瓣关闭不全、二尖瓣脱垂、非风湿性二尖瓣狭窄、非风湿性主动脉瓣病变、主动脉瓣狭窄、主动脉瓣关闭不全、非风湿性三尖瓣病变、非风湿性三尖瓣狭窄、非风湿性三尖瓣关闭不全、肺动脉瓣病变、肺动脉瓣狭窄、肺动脉瓣关闭不全、伴有关闭不全的肺动脉瓣狭窄、急性心肌炎、感染性心肌炎、孤立性心肌炎、心肌病、扩张型心肌病、梗阻性肥厚型心肌病、嗜伊红心肌内膜病、心内膜纤维弹性组织增生、酒精性心肌病、药物和其他外部因素影响引起的心肌病、房室传导阻滞和左束支(希斯束)传导阻滞、第一度房室传导阻滞、第二度房室传导阻滞、第三度房室传导阻滞(完全性心传导阻滞)、预激综合征、心脏骤停、成功恢复心脏活动的心脏骤停、阵发性心动过速、复发性室性心律失常、室上性心动过速、室性心博过速、心房纤颤和心房扑动、心室纤颤和心室扑动、心房过早去极化、心室过早去极化、病态窦房结综合征、心力衰竭、充血性心力衰竭、左心室衰竭、心肌变性。

卒中是指出血性和缺血性脑卒中两者及其症状。

肾缺血或梗死是指：结节性动脉外膜炎、韦格纳氏肉芽肿病(гранулематоз Bегенера，Wegener’s granulomatosis)、溶血性尿毒症综合征、特发性血小板减少性紫癜、弥漫性血管内凝血(дВС-синдром，DIC)综合征、肾动脉缺血或肾动脉梗死(肾外部分)、肾动脉粥样硬化、先天性肾狭窄、戈德布拉特肾(почка Γольдблатта，Goldblatt kidney)、急性肾炎综合征、轻微肾小球病变、局灶性和节段性肾小球病变、弥漫性膜性肾小球肾炎、弥漫性系膜增生性肾小球肾炎、弥漫性毛细血管内增生性肾小球肾炎、弥漫性肾小球膜毛细血管性肾小球肾炎、致密沉积物病、弥漫性新月体性肾小球肾炎、急进性肾炎综合征、复发性和持久性血尿、慢性肾炎综合征、肾病综合征、肾炎综合征。

不同的眼部病理状况是指不同形式的黄斑变性(макулярнойдегенерации，macular dеgeneration，MD)和另一些相关症状，例如：萎缩性(干)MD、渗出性(湿)MD、年龄相关性黄斑部病变(возрастноймакулонатией，age-related maculopathy，ARM)、脉络膜新生血管、视网膜色素上皮细胞脱离(отслоением пигментного эпителия cетчатκи，detached pigment retinal epithelium，PED)、视网膜色素上皮细胞(пигментного эпителия сетчатки，pigment retinal epithelium，RPE)萎缩。术语“黄斑变性(MD)”还包含与人体中年龄相关变化无关的所有眼部疾病，例如贝斯特卵黄状变性、斯达加特病(болезнь Штаргардта，Stargardt′s disease)、幼年期黄斑营养不良、贝尔病(болезнь ъера，Behr’sdisease)、索斯比营养不良(болезнь Сорсби，Sorsby dystrophy)、多因蜂窝状视网膜营养不良(ячеистая дистрофия или болезнь дойна，Doyne honeycomb retinal distrophy)。黄斑变性相关症状是指：白黄斑点包围的玻璃膜疣、黄斑下盘状瘢痕组织、脉络膜新生血管、视网膜色素上皮细胞脱离(PED)、视网膜色素上皮细胞(RPE)萎缩、脉络膜血管的异常扩张、模糊或干扰的视觉区域、中央死点(центральная метрвойточкой，central dead point)、色素异常、位于布鲁赫膜(мембраны ъруха，bruch’s membrane)内侧上的细颗粒混合层、布鲁赫膜增厚和通透性降低。

黄斑变性的原因包括但不限于：遗传性和物理性创伤、疾病(例如糖尿病)或感染(尤其是细菌性)。

伤口和其他表面损伤是指与以下损伤相关的伤口：皮肤上皮，角膜上皮，胃肠道表面，肺上皮以及肝血管、血管、子宫、阴道、尿道或呼吸道的内表面，并且还指与长期上皮缺陷和复发性上皮侵蚀相关的伤口和其他表面损伤，例如：手术创伤、切除伤口、水疱、溃疡、其他损害、擦伤、侵蚀、撕裂、切口、化脓伤口、疖以及热或化学烧伤。伤口可由机械损伤引起，还由其他疾病引起，例如：糖尿病、角膜营养不良、尿毒症、营养不良、维生素缺乏症、肥胖、感染、免疫缺陷或者与系统性使用甾体、放射治疗、非甾体抗炎药和抗癌药物相关的并发症。

精神和心理障碍是指(在International Classification of Diseases第10修订版中详细地描述)临床上定义的一组症状或行为特征，其在大多情况下引起痛苦并干扰个人功能，例如临床抑郁、精神分裂症、分裂型障碍和妄想性障碍、神经症性症状和行为症状、人格障碍和情绪障碍。

寄生虫病指由原生动物(阿米巴虫、利什曼虫、兰伯鞭毛虫、疟原虫、锥虫、小袋纤毛虫、肺孢子虫、弓形虫等)、寄生蠕虫(蠕虫)、节肢动物(昆虫和螨)、病原微生物(细菌、螺旋体、立克次体、病原真菌和病毒)引起的传染性疾病。

本发明涉及的药物组合物的应用可以是全身的和局部的这二者。施用过程包括经肠，例如经口、舌下和经直肠；局部，例如经皮、皮内和经眼皮肤；和肠胃外。适合的肠胃外施用过程包含注射，例如静脉内、肌内、皮下、腹膜内、动脉内和其他注射，和非注射操作，例如阴道内或经鼻，以及作为血管形成支架涂层的药物组合物的施用过程。优选地，本发明涉及的化合物和药物组合物用于腹膜内、静脉内、动脉内、肠胃外或经口施用。尤其是，施用可以注射剂或片剂、颗粒剂、胶囊剂的形式或其他经压制或经压缩的形式给予。

当结构(I)化合物作为药物组合物施用时，结构(I)化合物应当根据处方与合适量的可药用溶剂或载体相混合，以便得到用于向患者施用的适当形式。术语“溶剂(разбавитель，solvent)”是指与结构(I)化合物混合用于向患者施用的稀释剂、辅助药用物质、填充剂或载体。液体，例如水以及油(包括从石油中提炼的油、动物油、植物油和合成油，例如花生油、大豆油、矿物油和另一些类似的油)可用作所述药物载体。生理盐水溶液、阿拉伯树胶、明胶、淀粉、滑石粉、角蛋白、胶体银、尿素等可充当所述药物溶剂。

所述组合物还可包含辅助物质、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂。

本发明涉及的化合物和组合物可以以如下形式施用：胶囊剂、片剂、丸剂、小丸剂、颗粒剂、糖浆剂、酏剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、栓剂或延迟释放物质或适于向患者施用的任何其他形式。本发明的一个方面是溶液剂形式的结构(I)化合物和组合物用于经口和腹膜内、动脉内和静脉内施用的应用。

用于治疗特定疾病或症状所要求的结构(I)化合物的的治疗有效量取决于疾病或症状的性质和施用过程，并且应当向负责医生咨询来确定。用于经口施用的可接受剂量为0.025至120000微克/kg患者体重，更优选25微克/kg患者体重，并且最优选50微克/kg患者体重。用于静脉内施用的可接受剂量为0.1至10000微克/kg患者体重，更优选25微克/kg患者体重，并且最优选125微克/kg患者体重。

对于细胞、组织和器官的最佳保护，在缺血性暴露前6～48小时(24小时最佳)施用作为药物组合物的结构(I)化合物。

用于经口施用的可接受药物组合物的实施例：

药物组合物-1-明胶胶囊：

成分	量(mg/胶囊)
		结构(I)化合物	0.0015-1000
淀粉	0-650
		淀粉粉末	0-650
液态硅酮	0-15

药物组合物-2-片剂：

成分	量(mg/胶囊)
		结构(I)化合物	0.0015-1000
微晶纤维素	200-650
		二氧化硅粉末	10-650
硬脂酸	5-15

药物组合物-3-片剂：

成分	量(mg/胶囊)
		结构(I)化合物	0.0015-1000
淀粉	45
		微晶纤维素	35
聚乙烯吡咯烷酮(10％水溶液)	4
		羧甲基纤维素，钠盐	4.5
滑石粉	1
		硬脂酸镁	0.5

药物组合物-4-混悬剂：

成分	量(mg/5ml)
		结构(I)化合物	0.0015-1000
糖浆	1.25
		苯甲酸溶液	0.10
羧甲基纤维素，钠盐	50
		矫味剂	根据需要
着色剂	根据需要
		蒸馏水	加至5ml

用于腹膜内、动脉内和静脉内施用的以溶液剂形式的可接受药物组合物的一个实施例(pH6.5)：

成分	量
		结构(I)化合物	5mg
等渗溶液	1000ml

用于以气雾剂形式施用的可接受药物组合物的一个实施例：

成分	量(重量百分比)
		结构(I)化合物	0.0025
乙醇	25.75
		二氟一氯甲烷	70

用于以栓剂形式施用的可接受药物组合物的一个实施例：

成分	量(mg/栓剂)
		结构(I)化合物	1
饱和脂肪酸的甘油酯	2000

附图简述

图1A.C12R19(而非C12RB)诱导形成跨越由DPhPC制备的平面脂质双层膜的质子扩散电位。C12R19和C12RB的浓度为1μM。pH_顺＝7，pH_反＝8。B.在相同pH(pH＝7)下在两侧产生穿透阳离子C12RB和C12R19(在顺侧为1μM)的梯度后形成电位。

图2A.由C12R19和C12RB诱导的负载pyranine(пиранином)之脂质体膜中pH梯度的消散。根据455nm与505nm(410nm激发)的荧光强度比值来评估脂质体内pH。在550秒时添加1μM的尼日利亚菌素用于最后的pH调节。对照曲线含C12R19，但不含缬氨霉素。浓度：C12R19(150nM)、C12RB(150nM)、缬氨霉素(10nM)、脂质(75μM)。B.对烷基尾部长度作用的依赖。对照曲线对应于添加10nm缬氨霉素，而无质子载体。使用含10mM MES、10mM MOPS、10mM TRICINE和0.1M KCl(pH8)的缓冲液。

图3.根据整体酵母(酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))细胞消耗氧的相对速率(A)和酵母生长速率(B)比较C12R19和C12RB的性质特性。V/V₀对应于添加解偶联剂之后和之前的氧消耗速率的比值。生长速率定义为在指定浓度的罗丹明衍生物的存在下孵育2小时的细胞悬浮培养物中CFU(菌落形成单位)(КОE(колония образующих единиц)，CFU(colony forming unit))的数目。

图4.比较对呼吸的刺激和对生长的抑制：生长在非可发酵基质(甘油)中的酵母(酿酒酵母)细胞中(A)阳离子(C12R19)和(B)阴离子(FCCP)解偶联剂。根据在解偶联剂存在下的氧消耗速率(V)相对于初始速率(V₀)的比值来评估对呼吸作用的刺激。通过给定时间间隔中细胞数目的增长对生长速率进行评估。将不存在解偶联剂下的生长速率作为100％。

图5.在不同浓度的阴离子(FCCP)和阳离子(C12R19)解偶联剂存在下比较酵母细胞对80μM胺碘酮的抗性。

图6.具有诱导的横纹肌溶解的大鼠血液中的肌酸酐水平。直方图“对照”条表示对照组动物中的肌酸酐的水平；“横纹肌溶解”-具有横纹肌溶解的动物中的肌酸酐水平；“横纹肌溶解+C12-R19”-具有横纹肌溶解并且用C12R19治疗的动物中的肌酸酐水平。所有数据表示为测量平均值±标准误差。

图7.在缺血诱导之前及之后第一天大鼠中行为测试的结果。“基线”条表示手术前动物的最终得分；“SО(ЛО)”-假手术动物的得分；“缺血+盐水”-无处理、用盐水溶液代替制剂的缺血动物的得分；“缺血+C12R190.1μM”和“缺血+C12R192μM”-用指定浓度的C12R19制剂处理的缺血动物的得分。在用C12R19处理的大鼠中神经功能缺损的严重程度在统计学上显著地降低(p＜0.01)，表示为“＊＊”。

具体实施方案

以下非限制性实施例举例说明了结构(I)化合物的制备和用途，但这不应被理解为限制本发明，因为对材料和方法的修改对技术人员来说是显而易见的。以下实施例不应被解释为限制本公开内容的范围。

实验实施例

1)结构(I)C12R19和C10R19的化合物的合成

罗丹明19十二烷基酯(C12R19，1)和罗丹明19癸基酯(C10R19，2)分别通过对十二烷基溴(3)或癸基溴(4)进行酰化而制备，之前由罗丹明19(5)获得其铯盐(6)。(方案1)

方法

2-[(3E)-6-(乙基氨基)-3-(乙基亚氨基)-2，7-二甲基-3H-氧杂蒽-9-基]苯甲酸癸酯溴化物(C10R19)

或

罗丹明19癸基酯溴化物(C10R19)

罗丹明19的Cs盐。向6mL甲醇中的罗丹明19(240mg，0.53mmol)溶液添加1ml的2N碳酸铯水溶液，将溶液加热至沸腾，然后冷却至4℃并在该温度保持12小时。滤出沉淀，用冷甲醇洗涤并在60℃下在真空下干燥。以暗紫色固体物质的形式获得罗丹明19的铯盐(238mg，0.435mmol，82％收率)。

将1mL DMF中的罗丹明19的铯盐(137mg，0.25mmol)与1-溴癸烷(78μl，83mg，0.375mmol)的混合物在密封管中在60℃下保持72小时。在真空下除去溶剂，将残余物通过柱色谱用氯仿：甲醇(4∶1，v/v)在硅胶柱上纯化。以暗红色固体物质(135mg，0.243mmol，97.2％)的形式获得严物。TLC：R_f(CH₃Cl-iProOH-CH₃OH-AcOH-H₂O，80∶15∶8∶3∶1)0.25；R_f(CH₂Cl₂-CH₃OH，9∶1)0.32；HPLC：t_R＝5.195分钟(70-95％B，11分钟；A：0.05％TFA水溶液；B：MeCN中的0.05％TFA；ESI MS：m/z(MH+)以C₃₆H₄₆N₂O₃计算：554.35，实测：555.39；UV(C₂H₅OH)：λ_max248，348，528nm(ε＝76000cm^-1＊M^-1)；荧光(CH₃OH)：λ_EX528nm，λ_EM547nm。

NMR¹H(400.13MHz，CDCl₃，ppm)：0.9(t，3H，38-CH₃)；1.3(m，22H，1.17，30-37-2CH₃，8CH₂)；2.37(s，6H，6和19-2CH₃)；3.64(m，4H，2和16-2CH₂)；4.0(t，2H，29-CH₂)；6.69(s，2H，7和20-2CH)；6.79(s，2H，13和10-2CH)；7.45(m，2H，3和15-2NH)；7.8(m，2H，24和25-2CH)；8.37(d，1H，26-CH)。

NMR¹³C(100.61MHz，CDCl₃，ppm)：13.94(1和17-2CH₃)，14.16(38-CH₃)；18.89(6和19-2CH₃)；22-32(30-37-8CH₂)；38.44(2和16-2CH₂)；65.82(29-CH₂)；93.68(7和20-2CH)；113.39(C₈和C₂₁)；126.29(C₅和C₁₈)；128.43(10和13-2CH)；130.07和130.14(23和24-2CH)；130.30(C₁₁)；131.37(26-CH)；132.78(25-CH)；133.99-(C₂₇)；155.96(C₄和C₁₄)；156.80(C₂₂)；157.10(C₉和C₁₂)；165.26(28-CO)。

2-[(3E)-6-(乙基氨基)-3-(乙基亚氨基)-2，7-二甲基-3H-氧杂蒽-9-基]苯甲酸十二烷基酯溴化物(C12R19)

或

基于在1.5mL DMF中的罗丹明19的铯盐(70mg，0.128mmol)和1-溴十二烷(46μl，48mg，0.192mmol)，根据对C10R19描述的方法获得罗丹明19十二烷基酯溴化物(C12R19)。将产物通过柱色谱用氯仿∶甲醇(9∶1，v/v)在硅胶柱上分离，获得暗红色固体物质(80mg，0.12mmol，94％)。TLC：Rf(CH₃Cl-iPrOH-CH₃OH-AcOH-H₂O，80∶15∶8∶3∶1)0.36；Rf(CH₂Cl₂-CH₃OH，9∶1)0.37；HPLC：tR＝7.159分钟(70-95％B，11分钟；A：0.05％TFA水溶液；B：MeCN中的0.05％TFA；ESI MS：m/z(MH+)以C₃₈H₅₀N₂O₃计算：582.38，实测：583.59；UV(C₂H₅OH)：λ_max248，348，528nm(ε＝76000cm^-1＊M^-1)；荧光(CH₃OH)：λ_EX528nm，λ_EM547nm。

NMR¹H(400.13MHz，CDCl₃，ppm)：0.85(t，3H，40-CH₃)；1.15(m，20H，30-39-10CH₂)；1.38(t，6H，1和17-2CH₃)；2.27(s，6H，6和19-2CH₃)；3.56(m，4H，2和16-2CH₂)；3.94(t，2H，29-CH₂)；6.66(s，2H，7和20-2CH)；6.75(m，4H，10，13和3和15-2CH和2NH)；7.25(d，1H-23CH)；7.77(m，2H-24和25-2CH)；8.22(d，1H，26-CH)。

NMR¹³C(100.61MHz，CDCl₃，ppm)：14.04(1和17-2CH₃)，14.13(40-CH₃)；19.04(6和19-2CH₃)；22-32(30-39-10CH₂)；38.48(2和16-2CH₂)；65.84(29-CH₂)；93.92(7和20-2CH)；113.61(C₈和C₂₁)；126.12(C₅和C₁₈)；128.61(10和13-2CH)；130.13和130.17(23和24-2CH)；130.17(C₁₁)；131.37(26-CH)；132.83(25-CH)；133.86-(C₂₇)；155.85(C₄和C₁₄)；157.43(C₂₂)；157.2(C₉和C₁₂)；165.20(28-CO)。

2)阳离子解偶联剂对黑膜(черной мембраны，black membrane)模型之质子载体活性的研究。

为测试线粒体靶向性结构(I)化合物的穿透能力，使用了基于离子沿浓度梯度移动穿过双层磷脂膜之能力的方法。盛有水溶液的两个室被双层膜隔开，将受试化合物添加至其中一个室。如果带电的化合物能够穿过双层膜，那么发生化合物从具有其高浓度之室向具有其低浓度之室的快速扩散，从而形成跨膜电位差异。对于带有一个电荷且能够被动穿过膜的离子，10倍浓度梯度允许在室温下产生60mV的电位和理想的通透性(根据能斯特方程)。

在多个对离子穿过双层脂质膜之能力的研究中使用了该方法，并在以下文章中详细地描述：Starkov AA，Bloch DA，Chernyak BV，DedukhovaVI，Mansurova SA，Symonyan RA，Vygodina TV， Skulachev VP，1997，Biochem.Biophys Acta，1318，159-172。用该方法测试C12-R19(结构(I)的化合物)。

图1显示在膜两侧在不同pH值下由脂质二植烷酰磷脂酰胆碱形成的脂质双层上扩散电位(ΔΨ)的测量结果。已知由于质子的流动将质子载体添加至这样的系统应当导致电位的形成。图1A显示C12R19(而非C12RB)可在这样的系统中产生电位。另外，对穿透阳离子本身的梯度产生之后的电位产生进行实验，并显示了添加之后C12RB在一侧诱导了电位(图1B)，而C12R19不诱导。这可解释为由于在C12R19存在下诱导质子传导性的电位分流。

3)阳离子解偶联剂诱导的负载pyranine的脂质体膜中pH梯度的消散。

图2A显示0.15μM C12R19或C12RB诱导的脂质体膜中pH梯度消散的动力学。该方法用在多种对质子载体活性的研究中，并在以下文章中详细地描述：ChenY，Schindler M，Simon SM(1999)J Biol Chem274：18364-18373。添加C12R19在以分钟计的时间刻度上导致脂质体内pH的显著改变，表现出了质子载体活性(图2A，曲线C12R19)。FCCP显示了显著更好的活性(未显示数据)。至关重要的是，C12RB在所述系统中实际上没有活性(图2A，曲线C12RB)。在缬氨霉素、K⁺离子载体存在下进行所述测量。在不存在缬氨霉素时，不发生pH变化，如图1“对照”曲线中C12R19之作用的实例所示。或许该作用与膜电位的形成有关，这阻止了无缬氨霉素时的质子转运。对照实验显示缬氨霉素本身不诱导脂质体上的质子流(未显示数据)。

图2B显示具有不同尾部长度的罗丹明19烷基衍生物的作用。10至12个碳原子的尾部长度是最佳的。

C12R19与C12RB之间的质子载体活性的差异，是由于所述两种罗丹明结构上的差异(分别是罗丹明19和B)。罗丹明19阳离子基团包含可质子化的氮原子，而罗丹明B不具有这样的原子。这显然解释了质子载体活性的差异。

因此，显示了C12R19有质子载体活性。

3)基于整体酵母细胞氧消耗速率比较C12R19和C12RB的解偶联特性。

整体酵母细胞的呼吸刺激反映了受试化合物的解偶联特性。图3A显示向细胞悬液添加C12RB，4μM的浓度时导致呼吸速率的提高，而浓度的进一步升高引起呼吸抑制。同时，添加C12R19高至15μM的浓度不降低呼吸速率。

在相似条件下，在给定浓度的解偶联剂存在下进行测定酵母生长速率的实验。图3B显示在5μM C12R19存在下未观察到酵母(酿酒酵母)生长速率的显著降低。

图4说明在系统中C12R19相对经典阴离子解偶联剂(FCCP)的优势：与FCCP(图4B)相比，宽范围浓度的C12R19提高呼吸速率，而不抑制酵母生长(图4A)。

因此，我们能够说明，对于C12R19存在某个浓度范围(包括5μM的浓度)，其中存在对整体酵母细胞的呼吸速率的显著刺激，因此，还存在跨线粒体内膜的跨膜电位的降低。根据文献，膜电位的降低与由线粒体形成活性氧簇之速率的下降有关。因此，我们得出的结论是微摩尔每升浓度的C12R19降低膜电位但不引起对氧化磷酸化的完全抑制，如从不存在细胞生长速率的降低推断出的那样。

4)阳离子解偶联剂C12R19阻止由胺碘酮引起的细胞死亡。

我们说明了(PozniakovskyAI，Knorre DA，Markova OV，Hyman AA，SkulachevVP，Severin FF.Role of mitochondria in the pheromone-andamiodarone-induced programmed death of yeast.J Cell Biol.2005；68(2)；257-69.)解偶联剂FCCP阻止由胺碘酮引起的酵母细胞死亡。显然这是因为线粒体膜电位的降低，结果，通过呼吸链形成活性氧簇的速率降低。我们推测阳离子解偶联剂(C12R19)在该系统中有效，并且与阴离子解偶联剂相比，它们起作用的浓度范围更高。为了测试这一点，我们对在1～10000nmol/L FCCP和C12R19存在下用80μM胺碘酮处理的酵母细胞的存活进行了比较。图5显示在1至1000nmol/L的浓度范围内，C12R19开始为细胞提供对抗胺碘酮的保护。同时，FCCP仅在2.5至100nmol/L的浓度范围内起作用。因此，在该系统中阳离子解偶联剂的浓度范围至少比FCCP的情况高一个数量级。应当考虑的是，如果根据整体酵母(酿酒酵母)细胞的氧消耗速率进行评估，那么FCCP的解偶联效率远高于C12R19的解偶联效率。

5)使用C12R19对横纹肌溶解诱导之肾功能的改善。

根据标准方法，通过用50％甘油水溶液(ICN，美国)注射大鼠腿部肌肉进行对横纹肌溶解的诱导。在缺血后第二天，采集动物的血液样品。用CellTac血液分析仪(Nihon Kohben)测定血液中的肌酸酐浓度。对横纹肌溶解进行造模的实验用每组至少8只动物进行。所有数据表示为测量的平均值±标准误差。

发生横纹肌溶解诱导的急性肾衰竭的动力学研究显示，前2天中发生了严重的肾衰竭，其表现为氮代谢产物(包括肌酸酐)的血液浓度升高，肌酸酐在第二天时达到其峰值。使用以下C12R19施用方案用于处理：诱导横纹肌溶解1小时之后腹膜内注射制剂，然后每12小时以每次注射100nmol/kg的剂量注射三次。因此，动物接受了400nmol/kg C12R19的总剂量。图6显示根据所述方案用C12R19处理之后的结果：施用甘油之后48小时，与未处理的横纹肌溶解相比，血液中的肌酸酐水平降低。

6)在缺血大鼠中用SkQR1预处理对在脑和神经功能缺损的受影响面积大小的作用。

通过向大脑中动脉中插入包被硅酮的尼龙线在大鼠中诱导大脑缺血。血流的阻断保持60分钟，其后从血管移除所述线以恢复大脑中动脉的血流。手术期间及其后，将动物的体温保持在37℃。除了切割血管和插入线之外，对假手术动物进行同样的操作。在第一天测定脑梗死的量以研究制剂的神经保护作用。使用形态计量法分析通过磁共振断层显象(магнитно-рe3онансной томографии(MPT)，magnetic resonancetomography(MRT))获得的数字图像进行该评价。使用带有7T的磁场感应和105mT/m梯度的BioSpec70/30(Bruker，德国)进行所有MRT实验。在手术前1天和缺血诱导之后第一天进行行为测试。为评价由阻断大脑中动脉引起的神经障碍，使用了14分制评分(De Ryck M.，VanReemptsJ.，BorgersM.，WauquierA，Janssen PA.Photochemical strokemodel：flunarizine prevents sensorimotor deficits after neocortical infarcts inrats.Stroke1989；20；1383-1390.)。

总分是评估前腿和后腿对触觉和本体感受刺激之响应、某些条件反射之存在的7次测试的分数之和。为评价腿的功能缺损，使用了下述评分系统：2分-大鼠完全通过测试，1分-大鼠延迟2秒和/或不完全通过测试，0分-大鼠对腿的刺激不响应。

在诱导缺血之前24小时，腹腔内注射大鼠100nmol/kg剂量的C12R19。

手术后1天，在测试“腿刺激”中测定大鼠的神经功能缺损，并进行了磁共振成像。对通过T2加权的磁共振图像的缺血损伤的形态计量分析显示，用盐水处理的动物(100±8.6％)相比，施用C12R19引起缺血损伤的量降低至80.4±11.5％。此外，与具有2.0±0.2分的对照大鼠相比，得到5.3±1.1分的用C12R19处理的大鼠中发生了神经功能缺损之严重程度在统计学上显著地降低(p＜0.01)(图7)。

Claims (14)

1.组合物，其包含治疗有效量的式(I)化合物和/或其还原形式，和/或其互变异构形式、溶剂化物、盐、异构体或前药形式，用于提高生物膜的质子传导性：

(X-Z)ⁿ⁺(A)^n-

式(I)

其中

《X》-基团，其包含长度为最多20个碳原子的取代或未取代的烃链，任选地包含双键或三键、杂原子如-S-、-N-、-O-，或任选地包含-C(O)O-、-C(O)-和/或-C(O)N(H)-基团；

《Z》-基团，其可在生理pH值下质子化，并且能够提供整个化合物向线粒体中的靶向递送；

《A》-反离子

《n》-1至3的整数，

前提是X-Z组合应当：

a)具有在典型的细胞质pH值下质子化的能力，并且具有4至11的pK；

b)具有足够的亲脂性，从而以质子化形式穿透线粒体；

c)提供在线粒体中电化学电位依赖性的穿透；

d)具有在典型的线粒体基质弱碱性pH条件下去质子化的能力；

e)具有以去质子化形式从线粒体基质离开的能力，

另一前提是所述式(I)化合物不是C12R19：

2.权利要求1所述的组合物，其中结构(I)的化合物是式(II)化合物和/或其还原形式：

结构(II)

其中：

R1和R3-氢原子，R2和R4彼此独立-氢原子或取代或未取代的C1-C4烷基；R2与R5相连接；或R4与R6相连接，从而形成取代或未取代的1，3-亚丙基；

R5、R6、R7和R8-彼此独立地是氢原子或甲基；

《A》-可药用阴离子；

《n》-1至3的整数，

前提是所述式(I)化合物不是C12R19：

3.权利要求2所述的组合物，其中结构(II)的化合物是式(1)化合物和/或其还原形式：

(1)-C10R19

前提是除了Br^-之外还可选择任何其他可药用阴离子作为阴离子。

4.组合物，其包含治疗有效量的化合物C12R19和/或其还原形式：

前提是除了Br^-之外还可选择任何其他可药用阴离子作为阴离子。

5.权利要求1至4所述的组合物在制备用于降低细胞中自由基和活性氧簇之量的药物组合物中的应用。

6.权利要求1至4所述的组合物在制备用于刺激细胞代谢的药物组合物中的应用。

7.根据权利要求5至6的应用，当是正常细胞或癌细胞或干细胞的细胞是在人或其他哺乳动物中；是植物细胞和/或是在其任何发育阶段的植物的一部分，包括经基因修饰的那些；是在植物细胞或原生质体的培养物中；是真菌细胞和/或在真菌细胞的培养物中；所述应用包括提高生产制剂、可药用蛋白质、肽、抗体的细胞的生存力和/或生产力。

8.根据权利要求7的应用，其用于治疗肥胖包括其病理形式，并且还用于治疗与代谢紊乱相关的疾病。

9.根据权利要求7的应用，其用于治疗糖尿病、由糖尿病引起的并发症，并且还用于治疗与糖尿病相伴的疾病。

10.根据权利要求7的应用，其用于治疗疾病，在所述疾病中降低生物体中自由基和活性氧簇的量是有用的。

11.根据权利要求7的应用，其用于保护健康细胞以免在癌症的化学疗法、放射疗法或光动力学治疗期间、净化血液或包含健康细胞成分的其他物质期间被自由基、活性氧簇或形成它们的物质所损伤。

12.根据权利要求7的应用，其用于美容手术、手术缝合的愈合、手术期间防止对健康组织的损伤、治疗或预防烧伤组织损伤、对抗炎症，用于保存移植材料、对抗对移植组织和器官的排斥。

13.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物的应用，其用于延长生物体的寿命、对抗衰老；包括与激素治疗组合应用，尤其是与松果体激素、甲状腺激素，包括脱氢表雄酮或褪黑素组合应用。

14.通式(III)的化合物和/或其还原形式，和/或其互变异构形式、溶剂化物、盐、异构体或前药形式，

(X-Z)ⁿ⁺(A)^n-

式(III)

其中

《X》-基团，其包含长度为最多20个碳原子的取代或未取代的烃链，任选地包含双键或三键、杂原子如-S-、-N-、-O-，或任选地包含-C(O)O-、-C(O)-和/或-C(O)N(H)-基团；

《Z》-基团，其可在生理pH值下质子化，并且能够提供整个化合物向线粒体中的靶向递送；

《A》-反离子

《n》-1至3的整数，

前提是X-Z组合应当：

a)具有在典型的细胞质pH值下质子化的能力，并且具有4至11的pK；

b)具有足够的亲脂性，从而以质子化形式穿透线粒体；

c)提供在线粒体中电化学电位依赖性的穿透；

d)具有在典型的线粒体基质弱碱性pH条件下去质子化的能力；

e)具有以去质子化形式从线粒体基质离开的能力。

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