CN104744486A - 新型温敏荧光化合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

新型温敏荧光化合物及其应用。本发明提供了式I所示化合物，其中R9是1-22个碳原子的烃基或2-3个碳原子的酯基取代的1-3个碳原子的烷基，R5、R6、R7、R8均为烃基或H，和R1、R2、R3、R4均为H或低级烃基；或者，R9是2-22个碳原子的烃基或2-3个碳原子的酯基取代的1-3个碳原子的烷基，和R5与R1，R6与R2，R7与R3，R8与R4相连成六元环。本发明化合物具有温敏特性且能进入胞内，从而获得高时空分辨率的细胞内温度分布图像；本发明化合物还能对温敏荧光化合物作分布校准。本发明还提供了测量活细胞内温度分布的方法以及相应的检测试剂盒。该方法满足小尺寸测量和迅速测量的要求，从而实现空间和时间上的高分辨率。

Description

新型温敏荧光化合物及其应用
技术领域
本发明涉及细胞检测领域。具体地说，本发明涉及新型的荧光染料以及利用此类新型荧光染料检测活细胞内的温度分布。
背景技术
在诸如新陈代谢、酶反应、细胞分裂、基因表达等细胞活动时，细胞的温度会发生一定变化。这些细胞活动一般都伴随着ATP中化学能的释放，并产生热量使得温度上升。此外，细胞在外界药物或信号刺激的情况下，其新陈代谢活性会发生迅速变化，从而导致胞内温度的剧烈波动。然而由于胞外环境的热交换影响，这些胞内温度变化通常都较为局部，并且呈瞬态特性，因此用传统的温度测量方法较难以测量这种胞内的温度变化。
据报道，红外热成像的方法被用来研究UCP2在活细胞中的产热作用。红外热成像的原理是基于所有物体都会发射一定量与温度相关的黑体辐射，也就是说，用红外热成像的方法，无法区分细胞的温度与其生存环境(培养基)的温度。此外，红外相机工作波长一般是14μm，根据光学分辨率的瑞利准则，工作在该波长的红外相机无法分辨出单个细胞。因此红外热成像的方法不适用于胞内温度的探测。热电偶常常作为温度测量设备的探头来测量目标的温度变化，扫描热成像显微镜是将隧道扫描显微镜或原子力显微镜的探针用热电偶替换而发展来的。由于热电偶探头较为坚硬，该方法通常仅在电子工业中使用，以便得到两维的微米或者纳米尺寸的热像图。最近报道中有学者设计了一种新型的热电偶材料用来测量单个细胞的实时温度，该方法可以获得较高时间分辨率的温度曲线，但这只是单点的测量，要得到两维的热像图其时间分辨率就大打折扣，并且这种接触式的测量，很可能破坏细胞膜。因此基于热电偶的温度测量方案无法方便的对细胞进行热成像。
近年来，有学者报道了温敏荧光纳米材料可用于细胞温度变化的探测[1]，在药物刺激前后，整个细胞平均温度的变化可以用平均荧光强度的变化来显示。然而这种温敏荧光纳米材料需通过注射的方法导入细胞，造成了对细胞的干扰和破坏；并且从报道的荧光图像上可以看出，该纳米材料在细胞上的分布非常不均匀，只能看到一些小亮点[1]，而温敏荧光材料的荧光强度除了与温度有关，与其浓度分布也有关系，简单的将整个细胞上的荧光强度进行平均来反映该细胞的温度可能存在一定问题。
综上所述，本领域急需开发新的荧光染料，从而能满足测量胞内温度所需的小尺寸测量和迅速测量的要求，达到空间和时间上的高分辨率，进而获得高时空分辨率的细胞内温度分布图像。
发明内容
本发明的主旨在于提供一种能够定位于细胞膜或穿透细胞膜进入细胞的温敏荧光染料，从而能够准确、方便、迅速地测量胞内温度。
本发明的主旨还在于提供一种利用温敏荧光化合物测量活细胞内温度分布时的温敏荧光化合物分布校准的方法以及用于所述校准方法的化合物。
在第一方面，本发明提供式I所示化合物， 
其中，
R9是1-22个碳原子的烃基或2-3个碳原子的酯基取代的1-3个碳原子的烷基，
R5、R6、R7、R8均为烃基或H，和
R1、R2、R3、R4均为H或低级烃基； 
或者
R9是2-22个碳原子的烃基或2-3个碳原子的酯基取代的1-3个碳原子的烷基，和
R5与R1，R6与R2，R7与R3，R8与R4相连成六元环。
在优选的实施方式中，所述烃基可以是烷基、烯基或炔基；优选地，可以是直链或支链或环状烷基，例如，甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基、戊基、环戊基、环己基等等；优选直链烷基，例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基，等等；更优选甲基或十六烷基。
在优选的实施方式中，R5、R6、R7、R8是烷基、烯基或炔基；在进一步的优选实施方式中，R5、R6、R7、R8是低级烷基；优选地，R5、R6、R7、R8是1-8个碳原子的烷基；更优选地，R5、R6、R7、R8是1-3个碳原子的烷基；最优选地，R5、R6、R7、R8为乙基。
在优选的实施方式中，所述酯基取代的1-3个碳原子的烷基可以是甲基、乙基或丙基，优选甲基；所述2-3个碳原子的酯基可以是乙酯基、丙酯基。
在优选的实施方式中，所述低级烃基是1-8个碳原子的烷基、烯基或炔基；优选地，是1-3个碳原子的烷基；更优选地，是甲基、乙基或丙基。
在具体的实施方式中，所述化合物为下式所示化合物：
在第二方面，本发明提供式I所示化合物在测量活细胞内温度分布中的用途，
其中，
R9选自：1-22个碳原子的烃基，2-3个碳原子的酯基取代的1-3个碳原子的烷基，或芳基取代的1-3个碳原子的烷基
R5、R6、R7、R8独立选自烃基，和
R1、R2、R3、R4均为H或低级烃基； 
或者
R9选自：1-22个碳原子的烃基，2-3个碳原子的酯基取代的1-3个碳原子的烷基，或芳基取代的1-3个碳原子的烷基，和
R5与R1，R6与R2，R7与R3，R8与R4相连成六元环。
在优选的实施方式中，R5、R6、R7、R8独立选自烷基、烯基或炔基；在进一步的优选实施方式中，R5、R6、R7、R8独立选自低级烷基；优选地，R5、R6、R7、R8独立选自1-8个碳原子的烷基；更优选地，R5、R6、R7、R8独立选自1-3个碳原子的烷基；更优选地，R5、R6、R7、R8独立选自甲基或乙基；更优选地，R5、R6、R7、R8均为甲基或乙基；最优选地，R5、R6、R7、R8均为乙基。
在优选的实施方式中，所述低级烃基是1-8个碳原子的烷基、烯基或炔基；优选地，是1-3个碳原子的烷基；更优选地，是甲基、乙基或丙基。
在优选的实施方式中，1-22个碳原子的烃基可以是1-22个碳原子的烷基、烯基或炔基。优选地，可以是1-22个碳原子的直链或支链或环状烷基，例如，甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基、戊基、环戊基、环己基等等；优选直链烷基，例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基，等等；更优选甲基或十六烷基；所述1-3个碳原子的烷基可以是甲基、乙基或丙基，优选甲基；所述2-3个碳原子的酯基可以是乙酯基、丙酯基，优选乙酯基；所述芳基取代的1-3个碳原子的烷基是芳基取代的甲基、芳基取代的乙基或芳基取代的丙基，优选芳基取代的甲基，更优选式IX所示取代基取代的甲基
在具体的实施方式中，所述化合物是下式所示化合物：
在另一具体的实施方式中，所述活细胞内温度分布是亚细胞结构的温度分布；优选地，所述亚细胞结构是细胞膜、胞浆或线粒体。
在优选的实施方式中，所述用途是利用式II或式III所示化合物测量活细胞内胞浆温度分布。
在另一优选的实施方式中，所述用途是利用式IV或式V所示化合物测量活细胞内线粒体温度分布。
在另一优选的实施方式中，所述用途是利用式VI所示化合物测量活细胞细胞膜的温度分布。
在另一优选的实施方式中，所述用途是利用式VII、VIII所示化合物测量活细胞内线粒体的温度。
在优选的实施方式中，式II或式IV所示化合物用于反斯托克斯发光成像测温。
在另一优选的实施方式中，式III、式V、式VI、式VII或式VIII所示化合物用于斯托克斯发光成像测温。
在第三方面，本发明提供式I所示化合物或式2所示化合物在利用温敏荧光化合物测量活细胞内温度分布时的温敏荧光化合物分布校准中的用途，
其中，
R9是1-22个碳原子的烃基或2-3个碳原子的酯基取代的1-3个碳原子的烷基，
R5、R6、R7、R8均为H，和
R1、R2、R3、R4均为H或低级烃基； 
或者
R9是1-22个碳原子的烃基或2-3个碳原子的酯基取代的1-3个碳原子的烷基，和
R5与R1，R6与R2，R7与R3，R8与R4相连成六元环。
在优选的实施方式中，所述烃基可以是烷基、烯基或炔基；优选地，可以是直链或支链或环状烷基，例如，甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基、戊基、环戊基、环己基等等；优选直链烷基，例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基，等等；更优选甲基或十六烷基。
在优选的实施方式中，所述酯基取代的1-3个碳原子的烷基可以是甲基、乙基或丙基，优选甲基；所述2-3个碳原子的酯基可以是乙酯基、丙酯基。
在优选的实施方式中，所述低级烃基是1-8个碳原子的烷基、烯基或炔基；优选地，是1-3个碳原子的烷基；更优选地，是甲基、乙基或丙基。
在具体的实施方式中，所述化合物是以下化合物：
在优选的实施方式中，所述用途是当利用式I所示化合物测量活细胞胞浆的温度分布时，利用式II或式X所示化合物作为式I所示化合物浓度分布的校准物质。
在另一优选的实施方式中，所述用途是当利用式I所示化合物测量活细胞细胞膜的温度分布时，利用式XI所示化合物作为式I所示化合物浓度分布的校准物质。
在另一优选的实施方式中，所述用途是当利用式I所示化合物测量活细胞线粒体的温度分布时，利用式2所示化合物作为式I所示化合物浓度分布的校准物质。
在另一优选的实施方式中，所述用途包括：
式II所示化合物的分布校准：使用式II所示化合物测量整个胞浆温度时用其自身的斯托克斯发光进行归一；
Rh101ME分布校准：利用激发的Rh800(式2)的斯托克斯发光图像对激发的Rh101ME所产生的反斯托克斯发光图像进行归一；
RhBAM分布校准：利用激发的Rh110AM(式X)的斯托克斯发光图像对激发的RhBAM的斯托克斯发光图像进行归一；
RhBME分布校准：利用激发的Rh800(式2)的斯托克斯发光图像对激发的RhBME的斯托克斯发光图像进行归一；
RhB-C16分布校准：利用激发的Rh110-C16(式XI)的斯托克斯发光图像对激发的RhB-C16的斯托克斯发光图像进行归一。
在第四方面，本发明提供一种测量活细胞内温度分布的方法，所述方法包括以下步骤：
当利用温敏荧光化合物的反斯托克斯发光成像测温时，
(1)利用式I所示化合物对活细胞进行染色；
其中，
R9选自：1-22个碳原子的烃基，2-3个碳原子的酯基取代的1-3个碳原子的烷基，或芳基取代的1-3个碳原子的烷基，
R5、R6、R7、R8独立选自烃基，和
R1、R2、R3、R4均为H或低级烃基； 
或者
R9选自：1-22个碳原子的烃基，2-3个碳原子的酯基取代的1-3个碳原子的烷基，或芳基取代的1-3个碳原子的烷基，和
R5与R1，R6与R2，R7与R3，R8与R4相连成六元环；
(2)在荧光显微镜下对步骤(1)所述染色的细胞进行成像；
(3)使用公式(1)对荧光图像进行计算：
相对荧光强度： RI = Ae - ΔE k B T , 公式(1)
其中kB是玻尔兹曼常数，T是绝对温度，ΔE是活化能，A是拟合常数，相对荧光强度是式I所示化合物的反斯托克斯发光用该化合物自身的斯托克斯发光归一化之后的比值，
预先测定相对荧光强度随温度变化的标准曲线，利用公式(1)进行计算，从而得到活细胞内温度的分布图像；
或者
当利用温敏荧光化合物的斯托克斯发光或反斯托克斯发光成像测量活细胞内温度分布时，
(1)利用式I所示化合物以及校准荧光化合物对活细胞进行同时染色；
其中，
R9选自：1-22个碳原子的烃基，2-3个碳原子的酯基取代的1-3个碳原子的烷基，或芳基取代的1-3个碳原子的烷基，
R5、R6、R7、R8独立选自烃基，和
R1、R2、R3、R4均为H或低级烃基； 
或者
R9选自：1-22个碳原子的烃基，2-3个碳原子的酯基取代的1-3个碳原子的烷基，或芳基取代的1-3个碳原子的烷基，和
R5与R1，R6与R2，R7与R3，R8与R4相连成六元环；
(2)在荧光显微镜下对步骤(1)所述染色的细胞进行成像；
(3)根据温度变化与相对荧光强度的线性关系，利用预先测得的标准曲线进行计算，得到活细胞内温度的分布图像，这里的相对荧光强度是指温敏荧光化合物的斯托克斯或反斯托克斯发光强度用校准荧光化合物的斯托克斯发光强度作归一化处理所得到的比值。
在优选的实施方式中，R5、R6、R7、R8独立选自烷基、烯基或炔基；在进一步的优选实施方式中，R5、R6、R7、R8独立选自低级烷基；优选地，R5、R6、R7、R8独立选自1-8个碳原子的烷基；更优选地，R5、R6、R7、R8独立选自1-3个碳原子的烷基；更优选地，R5、R6、R7、R8独立选自甲基或乙基；更优选地，R5、R6、R7、R8均为甲基或乙基；最优选地，R5、R6、R7、R8均为乙基。
在优选的实施方式中，所述低级烃基是1-8个碳原子的烷基、烯基或炔基；优选地， 是1-3个碳原子的烷基；更优选地，是甲基、乙基或丙基。
在优选的实施方式中，1-22个碳原子的烃基可以是1-22个碳原子的烷基、烯基或炔基。优选地，可以是1-22个碳原子的直链或支链或环状烷基，例如，甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基、戊基、环戊基、环己基等等；优选直链烷基，例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基，等等；更优选甲基或十六烷基；所述1-3个碳原子的烷基可以是甲基、乙基或丙基，优选甲基；所述2-3个碳原子的酯基可以是乙酯基、丙酯基，优选乙酯基；所述芳基取代的1-3个碳原子的烷基是芳基取代的甲基、芳基取代的乙基或芳基取代的丙基，优选芳基取代的甲基，更优选式IX所示取代基取代的甲基
在另一优选的实施方式中，校准荧光化合物选自式II、式X、式XI或式2所示化合物。
在具体的实施方式中，所述式I所示化合物是下式所示化合物：
在具体的实施方式中，所述活细胞内温度分布是亚细胞结构的温度分布；优选地，所述亚细胞结构是细胞膜、胞浆或线粒体。
在另一优选的实施方式中，所述方法还包括在测量的同时利用抑制有机离子转运蛋白抑制剂来抑制有机离子转运蛋白。
在另一优选的实施方式中，所述有机离子转运蛋白抑制剂是丙磺舒、苯磺唑酮、或MK571。
在第五方面，本发明提供一种在利用温敏荧光化合物测量活细胞内温度分布时对温敏荧光化合物作分布校准的方法，所述方法利用与所用温敏荧光化合物的细胞内浓度分布相 同，但不具备温敏特性的另一种荧光化合物对所述温敏荧光化合物作分布校准。
在优选的实施方式中，所述不具备温敏特性的另一种荧光化合物与所述温敏荧光化合物共价相连；在另一优选的实施方式中，所述不具备温敏特性的另一种荧光化合物与所述温敏荧光化合物通过烃链共价相连；在更优选的实施方式中，所述不具备温敏特性的另一种荧光化合物与所述温敏荧光化合物通过2-18个碳原子的烃链共价相连；在最优选的实施方式中，所述不具备温敏特性的另一种荧光化合物与所述温敏荧光化合物通过4-10个碳原子的烃链共价相连。
在具体的实施方式中，所述方法中利用以下化合物对温敏荧光化合物作分布校准：
在优选的实施方式中，所述温敏荧光化合物的分布校准包括：
当利用式I所示化合物测量活细胞胞浆的温度分布时，利用式II或式X所示化合物作为式I所示化合物浓度分布的校准物质；
当利用式I所示化合物测量活细胞细胞膜的温度分布时，利用式XI所示化合物作为式I所示化合物浓度分布的校准物质；
当利用式I所示化合物测量活细胞线粒体的温度分布时，利用式2所示化合物作为式I所示化合物浓度分布的校准物质。
在另一优选的实施方式中，所述温敏荧光化合物的分布校准包括：
式II所示化合物的分布校准：使用式II所示化合物测量整个胞浆温度时用其自身的斯托克斯发光进行归一；
Rh101ME分布校准：利用激发的Rh800(式2)的斯托克斯发光图像对同样激发的Rh101ME所产生的反斯托克斯发光图像进行归一；
RhBAM分布校准：利用激发的Rh110AM(式X)的斯托克斯发光图像对激发的RhBAM的斯托克斯发光图像进行归一；
RhBME分布校准：利用激发的Rh800(式2)的斯托克斯发光图像对激发的RhBME的斯托克斯发光图像进行归一；
RhB-C16分布校准：利用激发的Rh110-C16(式XI)的斯托克斯发光图像对激发的RhB-C16的斯托克斯发光图像进行归一。
在第六方面，本发明提供一种测量活细胞内温度分布的试剂盒，所述试剂盒装有：
(1)式I所示化合物：
其中，
R9选自：1-22个碳原子的烃基，2-3个碳原子的酯基取代的1-3个碳原子的烷基，或芳基取代的1-3个碳原子的烷基
R5、R6、R7、R8独立选自烃基，和
R1、R2、R3、R4均为H或低级烃基； 
或者
R9选自：1-22个碳原子的烃基，2-3个碳原子的酯基取代的1-3个碳原子的烷基，或芳基取代的1-3个碳原子的烷基，和
R5与R1，R6与R2，R7与R3，R8与R4相连成六元环；
(2)细胞染色所用的辅助试剂；
(3)容纳上述化合物和辅助试剂的容器；和
(4)利用所述化合物测量活细胞内温度分布的使用说明书。
在具体的实施方式中，所述化合物是以下化合物：
在另一具体的实施方式中，所述检测试剂盒还装有以下化合物：
其中，
R9是1-22个碳原子的烃基或2-3个碳原子的酯基取代的1-3个碳原子的烷基，
R5、R6、R7、R8均为H，和
R1、R2、R3、R4均为H或低级烃基； 
或者
R9是1-22个碳原子的烃基或2-3个碳原子的酯基取代的1-3个碳原子的烷基，和
R5与R1，R6与R2，R7与R3，R8与R4相连成六元环。
在另一具体的实施方式中，所述化合物是以下化合物：
在优选的实施方式中，所述活细胞内温度分布是亚细胞结构的温度分布；优选地，所述亚细胞结构是细胞膜、胞浆或线粒体。
在另一优选的实施方式中，所述测量活细胞内温度分布是利用式II或式III所示化合物测量活细胞内胞浆温度分布。
在另一优选的实施方式中，所述测量活细胞内温度分布是利用式IV或式V所示化合物测量活细胞内线粒体温度分布。
在另一优选的实施方式中，所述测量活细胞内温度分布是利用式VI所示化合物测量活细胞内细胞膜的温度分布。
在另一优选的实施方式中，所述用途是利用式VII、VIII所示化合物测量活细胞内线粒体的温度。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
本发明中的术语：
本发明涉及到两种荧光，即斯托克斯发光与反斯托克斯发光。
斯托克斯(Stokes)发光：即通常所说的荧光，其特征为荧光光谱较其相应的吸收光谱发生了向长波长方向的移动(红移)。
反斯托克斯(anti-Stokes)发光：指荧光光谱较其相应的吸收光谱发生了向短波长方向的移动(蓝移)。
斯托克斯发光与反斯托克斯发光产生的原因是：当光线照射到分子并且和分子中的电子云及分子键结产生交互作用，可以将分子从基态激发到一个虚拟的能量状态(激发态)。 当激发态的分子放出一个光子后并返回到一个不同于基态的旋转或振动状态，在基态与新状态间的能量差会使得释放光子的频率与激发光的波长不同。如果最终振动状态的分子比初始状态时能量高，所激发出来的光子频率则较低(即，波长较长)，以确保系统的总能量守衡。这一个频率的改变被命名为斯托克斯位移(Stokes shift)，这一过程所产生的荧光即是斯托克斯发光。如果最终振动状态的分子比初始状态时能量低，所激发出来的光子频率则较高(即，波长较短)，这一个频率的改变被名为反斯托克斯位移(Anti-Stokes shift)，这一过程所产生的荧光即是反斯托克斯发光。
相对荧光强度：指在用温敏荧光化合物测量细胞内温度时，用浓度分布与温敏荧光化合物相一致的非温敏荧光化合物的发光强度对该温敏荧光化合物的发光强度作归一化处理所得到的比值；也可以指用某一荧光化合物不具温敏特性的斯托克斯发光对该荧光化合物具有温敏特性的反斯托克斯发光作归一化处理所得到的比值。
本发明中的“Rh”是“Rhodamine”(罗丹明)的缩写。
附图说明
图1显示了Rh101及其衍生物的光谱图。其中1a显示了Rh101(黑色曲线)、Rh101AM(绿色曲线)、Rh101ME(红色曲线)的激发光谱(虚线，于640nm处收集发射光)和发射光谱(实线，于530nm处激发)。染料浓度是10μM，溶剂为pH 7.5的150mM KCl溶液；1b显示了不同温度下(曲线从上到下分别为45、35、25、15、5℃)，10μM Rh101(溶于pH 7.5的150mM KCl溶液)的反斯托克斯发射光谱(于633nm处激发)，斯托克斯发光强度用25℃时的峰值进行归一；(c)Rh101ME的激发光谱(虚线，于640nm处收集发射光)和斯托克斯发射光谱(实线，于530nm处激发)。染料浓度是10μM，溶剂为pH 7.5的150mM KCl溶液；(d)不同温度下(曲线从上到下分别为45、35、25、15、5℃)，10μM Rh101ME(溶于pH 7.5的150mM KCl溶液)的反斯托克斯发射光谱(于633nm处激发)，反斯托克斯发光强度用25℃时的峰值进行归一。
图2显示了RhB及其衍生物的光谱学特性，其斯托克斯发光发射强度与温度成负线性相关。其中2a显示了RhB(黑色曲线)、RhBAM(绿色曲线)、RhBME(红色曲线)的激发光谱(虚线，于640nm处收集发射光)和发射光谱(实线，于530nm处激发)。染料浓度是10μM，溶剂为pH 7.5的150mM KCl溶液；2b显示了不同温度下(曲线从下到上分别是45、35、25、15、5℃)，10μM RhB(溶于pH 7.5的150mM KCl溶液)的发射光谱(于530nm处激发)，斯托克斯发光强度用25℃时的峰值进行归一；(c)RhBME的激发光谱(虚线，于640nm处收集发射光)和发射光谱(实线，于530nm处激发)。染料浓度是10μM，溶剂为pH 7.5的150mM KCl溶液；(d)不同温度下(曲线从下到上分别为45、35、25、15、5℃)，10μM RhBME(溶于pH 7.5的150mM KCl溶液)的斯托克斯发射光谱(于530nm处激发)，斯托克斯发光强度用25℃时的峰值进行归一。
图3显示了HepG2细胞在37℃的细胞培养箱内用200nM Rh101AM染色60min后，在荧光显微镜(BX61WI，Olympus Ltd.，40倍镜，数值孔径NA为0.8，成像时培养液温度为27.9℃)下用EMCCD(Evolve 512，Photometrice Ltd.)捕获的斯托克斯发光图像。其中，3a显示了单色仪(Optoscan monochromator，Cairn Research Ltd.)在波长555nm(带宽3nm)处激发、于573～613nm处收光所成斯托克斯发光图像；3b显示了单色仪在波长635nm(带宽15nm)处激发、于573～613nm处收光所成反斯托克斯发光图像；3c显示了用图3a对图3b进行归一处理得到的比值图像；3d是用公式(1)计算得到细胞的温度分布图。
图4显示了HepG2细胞在37℃的细胞培养箱内用200nM Rh101染色60min后，在荧光显 微镜(BX61WI，Olympus Ltd.，40倍镜，数值孔径NA为0.8，成像时培养液温度为27.9℃)下用EMCCD(Evolve 512，Photometrice Ltd.)捕获的斯托克斯发光图像。其中，4a显示了单色仪(Optoscan monochromator，Cairn Research Ltd.)在波长555nm(带宽3nm)处激发、于573～613nm处收光所成斯托克斯发光图像；4b显示了单色仪在波长635nm(带宽15nm)处激发、于573～613nm处收光所成反斯托克斯发光图像。
图5显示了HepG2细胞在37℃的细胞培养箱内用200nM Rh101AM或Rh101染色60min后，在荧光显微镜(BX61WI，Olympus Ltd.，40倍镜，数值孔径NA为0.8，成像时培养液温度为27.9℃)下用EMCCD(Evolve 512，Photometrice Ltd.)捕获不同灌流时间点的斯托克斯发光图像。其中，5a-c显示了分别为用Rh101AM染色后，用含有2.5mM丙磺舒的灌流溶液(Tyrode溶液)灌洗细胞0min，10min，20min后，单色仪在波长555nm(带宽3nm)处激发、于573～613nm处收光所成斯托克斯发光图像；5d-f显示了分别为用Rh101AM染色后，用不含丙磺舒的灌流溶液(Tyrode溶液)灌洗细胞0min，10min，20min后，单色仪在波长555nm(带宽3nm)处激发、于573～613nm处收光所成斯托克斯发光图像；5g-i显示了分别为用Rh101染色后，用含有2.5mM丙磺舒的灌流溶液(Tyrode溶液)灌流0min，10min，20min后，单色仪在波长555nm(带宽3nm)处激发所成斯托克斯发光图像；5j显示了上述三种情况下，斯托克斯发光强度随灌流时间的变化曲线，每种情况均以灌流0min时的结果进行归一化。
图6显示了COS7细胞在37℃的细胞培养箱内用100nM Rh101ME和100nM Rh800染色30min后，在激光共聚焦荧光显微镜(FV1000，Olympus，60倍水镜，数值孔径NA为1.2，成像时培养液温度为30℃)下成像。其中，6a显示了用635nm激光激发、于655～755nm处收光所成Rh800产生的斯托克斯发光图像；6b显示了用635nm激光激发、于575～620nm处收光所成Rh101ME产生的反斯托克斯发光图像；6c显示了计算得到的线粒体温度分布图像。
图7显示了COS7细胞在37℃的细胞培养箱内用50nM RhBME和50nM Rh800染色30min后，在激光共聚焦荧光显微镜(FV1000，Olympus，60倍水镜，数值孔径NA为1.2，成像时培养液温度为30℃)下成像。其中，7a显示了559nm激光激发于575～620nm处收光所成RhBME产生的斯托克斯发光图像；7b显示了635nm激光激发于655～755nm处收光所成Rh800产生的斯托克斯发光图像；7c显示了计算得到的线粒体温度分布图像。
图8显示了RhB-C16化合物(式VI所示化合物)的温敏特性和细胞膜定位特性；其中8a显示了RhB-C16的激发光谱(虚线，于640nm处收集发射光)和发射光谱(实线，于530nm处激发)；染料浓度是10μM，溶剂DMSO；8b显示了不同温度下(曲线从上倒下分别25、35、45、55℃)，10μM RhB-C16(溶于DMSO)的发射光谱(于530nm处激发)，斯托克斯发光强度用25℃时的峰值进行归一；8c显示了RhB-C16(式VI所示化合物)定位在细胞膜上，HepG2细胞在37℃的细胞培养箱内用1μM RhB-C16染色5min后，在激光共聚焦荧光显微镜(FV1000，Olympus，20倍空气镜，数值孔径NA为0.75，成像时培养液温度为20℃)下成像，为559nm激光激发于575～620nm处收光所成RhB-C16产生的斯托克斯发光图像。
图9显示了RPA化合物(式VII所示化合物)具有温敏特性；其中9a显示了RPA的激发光谱(虚线，于640nm处收集发射光)和发射光谱(实线，于530nm处激发)。染料浓度是10μM，溶剂DMSO；9b显示了不同温度下(曲线从上倒下分别25、35、45、55℃)，10μM RPA(溶于DMSO)的发射光谱(于530nm处激发)，斯托克斯发光强度用25℃时的峰值进行归一。
图10显示了TMRM化合物(式VIII所示化合物)具有温敏特性；其中10a显示了TMRM的激发光谱(虚线，于640nm处收集发射光)和发射光谱(实线，于530nm处激发)。染料浓度是10μM，溶剂为pH7.5的150mM KCl溶液；10b显示了不同温度下(曲线从下到上分别 45、35、25、15、5℃)，10μM RhB(溶于pH 7.5的150mM KCl溶液)的发射光谱(于530nm处激发)，斯托克斯发光强度用25℃时的峰值进行归一。
图11显示了Rh110化合物的斯托克斯发光不具有温敏特性；图11(a)Rh110的激发光谱(虚线，于555nm处收集发射光)和发射光谱(实线，于470nm处激发)。染料浓度是10μM，溶剂为pH 7.5的150mM KCl溶液；(b)不同温度下(45、35、25、15、5℃)，10μM Rh110(溶于pH 7.5的150mM KCl溶液)的发射光谱(于470nm处激发)，斯托克斯发光强度用25℃时的峰值进行归一。
图12显示了Rh101化合物的斯托克斯发光不具有温敏特性；图12(a)Rh101的激发光谱(虚线，于640nm处收集发射光)和发射光谱(实线，于530nm处激发)。染料浓度是10μM，溶剂为pH 7.5的150mM KCl溶液；(b)不同温度下(45、35、25、15、5℃)，10μM Rh101(溶于pH 7.5的150mM KCl溶液)的斯托克斯发射光谱(于530nm处激发)，斯托克斯发光强度用25℃时的峰值进行归一。
图13显示了Rh800化合物的斯托克斯发光不具有温敏特性。(a)Rh800的激发光谱(虚线，于750nm处收集发射光)和发射光谱(实线，于635nm处激发)，染料浓度是10μM，溶剂为pH 7.5的150mM KCl溶液；(b)不同温度下(45、35、25、15、5℃)，10μM Rh800(溶于pH 7.5的150mM KCl溶液)的斯托克斯发射光谱(于635nm处激发)，斯托克斯发光强度用25℃时的峰值进行归一。
图14(a)-(e)分别显示了式II、III、IV、V、VI所示化合物的HNMR图谱，(f)显示了式VI所示化合物的HNMR图谱的局部放大图。
具体实施方式
由于细胞大小为微米级别，并且单个细胞内温度变化很快受到周围溶液的影响，一般传统的温度测量方法难以探测活细胞内的温度分布。荧光染料罗丹明101(Rh101)的反斯托克斯发光强度随着温度升高而增强，罗丹明B(RhB)的斯托克斯发光强度则随温度升高而减弱[2,3]。现有技术中，这两种染料的温敏特性被用来测量细胞内部或组织样品的温度[4,5]。然而本发明人在研究过程中偶然发现，上述两种化合物不能有效穿过细胞膜进入细胞内部，因而所测量的并非细胞内的温度，而上述文献并未注意或暗示有该问题或缺陷存在。若想准确、迅速地测量胞内温度，则需要能够穿透细胞膜进入细胞内部的温敏荧光染料。
发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现罗丹明101(Rh101)和罗丹明B(RhB)进行结构修饰得到的衍生物能够穿过细胞膜，甚至是可以富集于线粒体内，从而更易对细胞染色，进而易于观察胞内以及线粒体内温度的分布和变化。在此基础上完成了本发明。
本发明的化合物
为解决上述现有技术中存在的问题，本发明提供式I所示化合物：
其中，
R9选自：1-22个碳原子的烃基，2-3个碳原子的酯基取代的1-3个碳原子的烷基，或芳基取代的1-3个碳原子的烷基
R5、R6、R7、R8独立选自烃基或H，和
R1、R2、R3、R4均为H或低级烃基； 
或者
R9选自：1-22个碳原子的烃基，2-3个碳原子的酯基取代的1-3个碳原子的烷基，或芳基取代的1-3个碳原子的烷基，和
R5与R1，R6与R2，R7与R3，R8与R4相连成六元环。
本领域普通技术人员知道，本文所述“烃基”表示C和H组成的直链或支链的饱和或不饱和基团，具体是，烷基、烯基或炔基。在优选的实施方式中，所述低级烃基是1-8个碳原子的烷基、烯基或炔基；优选地，是1-3个碳原子的烷基；更优选地，是甲基、乙基或丙基。
在一优选例中，R5、R6、R7、R8独立选自烷基、烯基、炔基或H；在进一步的优选例中，R5、R6、R7、R8独立选自低级烷基或H；优选地，R5、R6、R7、R8独立选自1-8个碳原子的烷基或H；更优选地，R5、R6、R7、R8独立选自1-3个碳原子的烷基或H；更优选地，R5、R6、R7、R8独立选自甲基或乙基或H；更优选地，R5、R6、R7、R8均为甲基或乙基或H；最优选地，R5、R6、R7、R8均为乙基或H。
在一优选例中，1-22个碳原子的烃基可以是1-22个碳原子的烷基、烯基或炔基。优选地，可以是1-22个碳原子的直链或支链或环状烷基，例如，甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基、戊基、环戊基、环己基等等；优选直链烷基，例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基，等等；更优选甲基或十六烷基；所述1-3个碳原子的烷基可以是甲基、乙基或丙基，优选甲基；所述2-3个碳原子的酯基可以是乙酯基、丙酯基，优选乙酯基；所述芳基取代的1-3个碳原子的烷基是芳基取代的甲基、芳基取代的乙基或芳基取代的丙基，优选芳基取代的甲基，更优选式IX所示取代基取代的甲基
基于此，本发明具体提供了以下合物：
由Rh101及其衍生物的光谱图(图1a)可知，式II所示化合物(Rh101AM)和式IV所示化合物(Rh101ME)的光谱学特性与Rh101的没有明显区别。Rh101随着温度的升高，其反斯托克斯发光强度随之增强(图1b)。
而RhB衍生物(式III和式V所示化合物)的光谱学特性与RhB的光谱特性也是一致的(图2)，其斯托克斯发光强度随温度的升高而降低。
本发明化合物在测量活细胞内温度分布中的用途
由于本发明提供的式I所示化合物的斯托克斯发光或反斯托克斯发光的强度与温度相关，并且能够穿过细胞膜，甚至是可以富集于胞浆、细胞膜、线粒体等亚细胞结构，从而更易对细胞染色，因此，可利用本发明的式I所示化合物测量活细胞内温度分布。
本文所述的活细胞内温度分布是指亚细胞结构的温度分布；亚细胞结构指细胞的部分结构，通常比细胞更小，包括但不限于细胞膜、线粒体、中心体、高尔基体、胞浆等。在优选的实施方式中，所述亚细胞结构是细胞膜、胞浆或线粒体。本文所述的亚细胞定位是指荧光化合物在上述亚细胞结构上的分布。
在具体的实施方式中，可利用本发明的式II或式III所示化合物测量活细胞内胞浆温度分布。在另一具体的实施方式中，可利用本发明的式IV或式V所示化合物测量活细胞内线粒体温度分布。在另一具体的实施方式中，可利用本发明的式VI所示化合物测量活细胞细胞膜的温度分布。在另一具体的实施方式中，可利用本发明的式VII、VIII所示化合物测量活细胞内线粒体的温度。
温敏荧光化合物的分布校准(归一化)
温敏荧光化合物的荧光强度不仅与温度有关，还与化合物的局部浓度有关。由于荧光化合物进入细胞以及线粒体内可能存在分布不均的问题，从而导致细胞内聚集不同量的荧光化合物发出的荧光不能互相比较。
当利用温敏荧光化合物的反斯托克斯发光来测定活细胞内温度分布时，若该化合物的斯托克斯发光不随温度的变化而改变，则可以用来呈现该化合物的浓度分布，用斯托克斯发光强度对反斯托克斯发光强度进行归一，可以将浓度对荧光强度的影响消除，这样得到的比值称为相对荧光强度，其变化规律符合麦克斯韦-玻尔兹曼统计，可以用公式(1)进行拟合[3]：
相对荧光强度： RI = Ae - ΔE k B T , 公式(1)
其中kB是玻尔兹曼常数，T是绝对温度，ΔE是活化能，A是拟合常数， 
用荧光化合物的斯托克斯发光图像对其反斯托克斯发光图像进行归一，可以得到比值图像(即相对荧光强度的图像)，利用预先测得的标准曲线进行计算，可以得到温度分布的图像[4]。但用这种方法进行校准时，由于是对一种化合物用两种不同的激发光来激发，不可能同时激发，因此所收集到的斯托克斯发光与反斯托克斯发光信号之间有时间差，导致计算出的温度可能不准确。这个时间差所带来的误差对于测定胞浆这种较大尺度范围内的温度分布是可以容忍的，但对于更精细的结构，例如线粒体等细胞器的温度测定则影响较大。
为了消除上述校准方法中的时间差所带来的误差，本发明人经过深入的研究，发现可以利用与测量活细胞内温度分布所用的温敏荧光化合物的细胞内浓度分布相同，但不具备温敏特性的另一种荧光化合物对所述温敏荧光化合物作分布校准。通过对激发光的波长和收集荧光信号的波长的仔细选择，可以对温敏和校准两种荧光化合物实现同时激发、同时收集荧光信号，两种荧光信号之间不存在时间差，从而能更为精确地测量胞内温度。
因此，本发明提供对温敏荧光化合物作分布校准的方法，所述方法利用与所用温敏荧光化合物的细胞内浓度分布相同，但不具备温敏特性的另一种荧光化合物(校准化合物)对所述温敏荧光化合物作分布校准。
本发明人进一步发现，可以将上述不具备温敏特性的另一种荧光化合物与温敏荧光化合物共价相连，从而使两种荧光化合物的浓度分布和动力学特性完全相同，进一步消除浓度差异或动力学特性差异所带来的误差。在优选的实施方式中，通过烃链共价连接上述不具备温敏特性的另一种荧光化合物与温敏荧光化合物；更优选的，通过2-18个碳原子的烃链共价连接；最优选的，通过4-10个碳原子的烃链共价连接。基于化学合成领域的常规手段，本领域技术人员可以根据具体的化合物结构，采取各种适当的方法和接头来实现这种共价相连，例如利用2-18个碳原子的二醇，通过酯交换反应或酯化反应将具有酯键或羧基的温敏荧光化合物与校准化合物共价连接：
(n为2-18的自然数)
在具体的实施方式中，利用以下化合物对所述温敏荧光化合物作分布校准：
在具体的实施方式中，分布校准方案为：
Rh101AM(式II所示化合物)分布校准：Rh101AM的斯托克斯发光强度基本不随温度的变化而改变，可以用来呈现染料的浓度分布，用其对Rh101AM反斯托克斯发光图像进行归一，这样就得到了温度分布图像。
Rh101ME(式IV所示化合物)分布校准：经过精心的选择和多次实验，发明人发现Rh800(式2所示化合物)与Rh101ME同样分布于线粒体上，并且Rh800的斯托克斯发光强度在小于700nm的波长范围内基本不随温度的变化而改变，因此可利用Rh800的浓度分布间接反映Rh101ME的浓度分布。同时使用Rh101ME和Rh800对细胞染色，Rh800用波长635nm的激光激发、于655～755nm处收光所得到的斯托克斯发光图像反映了两种染料的浓度分布，用该图像对Rh101ME用635nm激光激发、于575～620nm处收光所得到的反斯托克斯发光图像进行归一，就可以得到反映样品温度分布的比值图像。由于该方案使用相同激发光激发以及在不同发射光范围内收光，因此所收集到的两种荧光信号之间不存在时间差的问题，Rh800的斯托克斯发光图像和Rh101ME的反斯托克斯发光图像在时间上可以完全匹配。
RhBAM(式III所示化合物)分布校准：RhBAM也可以使用与Rh101ME相同的方案做比值图像来测量胞浆或线粒体的温度。经过多次实验，发明人发现Rh110AM(式X所示化合物)适合用来对RhBAM的细胞内分布做校准。Rh110是绿色荧光染料，其斯托克斯发光强度对温度变化不敏感。合成的Rh110AM与RhBAM在胞内分布是一致的，都在胞浆中，他们的发射光范围以及激发光都不同。Rh110AM用波长488nm的激光激发、于505-545nm处收光所得到的斯托克斯发光图像可以用来对RhBAM用波长559nm的激光激发、于575～620nm处收集所得到的斯托克斯发光图像进行归一，从而得到反映胞浆温度分布的比值图像。选择上述激发和发射波长的好处是两种物质的激发光和发射光几乎没有互相干扰，因此可以 同时用两种激发光分别激发RhBAM和Rh110AM，并同时收集两种发射荧光，所收集到的两种荧光信号之间不存在时间差的问题，在时间上是完全匹配的。
RhBME(式V所示化合物)分布校准：Rh800与RhBME同样分布于线粒体上，因此可利用Rh800对RhBME进行校准。Rh800用波长635nm的激光激发、于655～755nm处收光所得到的斯托克斯发光图像可以用来对RhBME用波长559nm的激光激发、于575～620nm处收光所得到的斯托克斯发光图像进行归一，从而得到反映线粒体温度分布的比值图像。同RhBAM的情况类似，上述波长的选择也实现了激发光和发射光互不干扰，也可以对两种物质同时激发和收集荧光信号，两种荧光信号之间不存在时间差的问题。
RhB-C16(式VI所示化合物)分布校准：Rh110-C16(式XI所示化合物)与RhB-C16同样分布于细胞膜上，因此可利用Rh110-C16对RhB-C16进行校准。Rh110-C16用波长488nm的激光激发、于505-545nm处收光所得到的斯托克斯发光图像可以用来对RhB-C16用波长559nm的激光激发、于575～620nm处收光所得到的斯托克斯发光图像进行归一，从而得到反映线粒体温度分布的比值图像。同RhBAM的情况类似，上述波长的选择也实现了激发光和发射光互不干扰，可以对两种物质同时激发和收集荧光信号，两种荧光信号之间不存在时间差的问题。
校准荧光化合物的选择
总结上面实验的规律可知，在用温敏荧光化合物测量生物样品的温度时，选择用于校准温敏荧光化合物浓度分布的校准物质可按以下原则进行：
1)校准荧光化合物与温敏荧光化合物在生物样品中有同样的浓度分布与定位；
2)校准荧光化合物的斯托克斯发光强度对温度不敏感，或者至少在被选择用于收集荧光信号的光谱区域内对温度不敏感；
3)用于激发校准荧光化合物与温敏荧光化合物的激发光的波长相同或波长差别较大，优选的波长之差大于30nm，较优的大于40nm，更优的大于50nm，最优的大于60nm；
4)当用于激发校准荧光化合物与温敏荧光化合物的激发光的波长相同时，用于收集两种荧光信号的波段或波长之间相差5nm以上；当用于激发校准荧光化合物与温敏荧光化合物的激发光的波长之差大于30nm时，用于收集两种荧光信号的波段或波长之间相差5nm以上，且与激发光的波长相差5nm以上。
当满足上述条件时，可以实现同时激发校准荧光化合物与温敏荧光化合物，并同时收集所产生的荧光信号，而激发光与荧光信号之间、或两种荧光信号之间并无明显的相互干扰，从而实现两种荧光信号在时间上的完全匹配，不存在时间差。
测量活细胞内温度分布的方法
在提供式I所示化合物的基础上，本发明提供了一种测量活细胞内温度分布的方法，所述方法包括：
当利用荧光化合物的反斯托克斯发光测量活细胞内温度分布时：
(1)利用式I所示化合物对活细胞进行染色；
(2)在荧光显微镜下对步骤(1)所述染色的细胞进行成像；
(3)使用公式(1)对荧光图像进行计算：
相对荧光强度： RI = Ae - ΔE k B T , 公式(1)
其中kB是玻尔兹曼常数，T是绝对温度，ΔE是活化能，A是拟合常数，相对荧光强度是温敏荧光化合物的反斯托克斯发光用该化合物自身的斯托克斯发光归一化之后的比值，预先测定相对荧光强度随温度变化的标准曲线，利用公式(1)进行计算，从而得到活细胞内温度的分布图像；
或
当利用荧光化合物的斯托克斯发光测量活细胞内温度分布时：
(1)利用式I所示化合物以及校准荧光化合物对活细胞进行同时染色；
(2)在荧光显微镜下对步骤(1)所述染色的细胞进行成像；
(3)根据温度变化与相对荧光强度的线性关系，利用预先测得的标准曲线进行计算，得到活细胞内温度的分布图像，这里的相对荧光强度是指温敏荧光化合物的斯托克斯发光强度用校准荧光化合物的斯托克斯发光强度作归一化处理所得到的比值。
在具体的实施方式中，利用式II、III、IV、V、VI、VII或VIII所示化合物测量活细胞内温度分布。
在优选的实施方式中，所述活细胞内温度分布是亚细胞结构的温度分布；优选地，所述亚细胞结构是细胞膜、胞浆或线粒体。
在具体的实施方式中，本发明测量活细胞内温度分布的方法利用式II或式III所示化合物测量活细胞内胞浆温度分布。在另一具体的实施方式中，本发明测量活细胞内温度分布的方法利用式IV或式V所示化合物测量活细胞内线粒体温度分布。在另一具体的实施方式中，本发明测量活细胞内温度分布的方法利用式VI所示化合物测量活细胞细胞膜的温度分布。在另一具体的实施方式中，可利用本发明的式VII、VIII所示化合物测量活细胞内线粒体的温度。在另一具体的实施方式中，可利用本发明的式II、式X、式XI或式2所示化合物作为校准荧光化合物。
发明人在实验过程中发现，细胞内的荧光染料化合物会随着时间的推移而被排出胞外，而在实验体系中加入有机离子转运蛋白抑制剂可以抑制这一过程，从而使得本发明的荧光染料化合物可以更长时间存在于细胞内部或细胞膜上，为需要在较长时间段内测定细胞内温度的实验提供有利条件。
据此，在进一步优选的实施方式中，本发明的测量活细胞内温度分布的方法还包括在测量的同时利用有机离子转运蛋白抑制剂来抑制-荧光染料化合物被转运出胞外的过程。在具体的实施方式中，所述有机离子转运蛋白抑制剂是丙磺舒、苯磺唑酮或MK571。
测量活细胞内温度分布的试剂盒
在提供式I所示化合物及其用途的基础上，本发明进一步提供一种测量活细胞内温度分布的试剂盒，所述试剂盒装有：
(1)本发明的式I所示化合物； 
(2)细胞染色所用的辅助试剂(例如，DMSO，其为助溶剂，50000倍的染料母液(10mM)可以用DMSO配制，并于-20℃保存，再用实验所用细胞外溶液诸如PBS，Tyrode溶液等稀释到终浓度)；
(3)容纳上述化合物和辅助试剂的容器；和
(4)利用所述化合物测量活细胞内温度分布的使用说明书。
在具体的实施方式中，所述化合物是式II、III、IV、V、VI、VII或VIII所示化合物。
在优选的实施方式中，所述测量活细胞内温度分布是利用式II或式III所示化合物测量活细胞内胞浆温度分布。
在另一优选的实施方式中，所述测量活细胞内温度分布是利用式IV或式V所示化合物测量活细胞内线粒体温度分布。
在另一优选的实施方式中，所述测量活细胞内温度分布是利用式VI所示化合物测量活细胞细胞膜的温度分布。
在另一优选的实施方式中，所述测量活细胞内温度分布是利用式VII、VIII所示化合物测量活细胞内线粒体的温度。
在进一步的实施方式中，所述检测试剂盒还装有式X、XI或2所示化合物。
本发明的优点：
1.本发明的荧光染料化合物能够染色活细胞的亚细胞结构，尤其是细胞膜、胞浆或线粒体，进而获得高时空分辨率的细胞内温度分布图像；
2.本发明为研究细胞新陈代谢、细胞炎性发热等领域提供了有力工具；
3.本发明提供了新型的细胞热成像方法，为观察细胞受到各种处理和病理状态时其温度的改变提供了有力工具；
4.本发明创造性地利用与测量活细胞内温度分布所用的温敏荧光化合物的浓度分布相同，但不具备温敏特性的另一种荧光化合物对所述温敏荧光化合物作分布校准，从而能更为精确地测量胞内温度；
5.本发明方法可以很方便的应用在各种荧光显微成像系统中，准确、方便、迅速地获得高时空分辨率的细胞内温度分布图像，从而极易推广应用。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1.合成Rh101AM和RhBAM
将Rh101(购自Santa Cruz)、氟化铯、溴醋酸以1:2:1.2的比例混合溶于十倍的二甲基甲酰胺(DMF)，室温下搅拌反应2小时。然后经制备型高效液相色谱分离纯化得到Rh101AM(式II所示化合物)。
RhBAM的合成方法与Rh101AM的类似：
将RhB(购自Santa Cruz)、氟化铯、溴醋酸以1:2:1.2的比例混合溶于十倍的二甲基甲酰胺(DMF)，室温下搅拌反应2小时。然后经制备型高效液相色谱分离纯化得到RhBAM (式III所示化合物)。
实施例2.合成Rh101ME和RhBME
将Rh101与亚硫酰氯以1:5的比例混合溶于十倍的氯仿，加热至60℃搅拌反应10分钟。然后将混合物冷却至室温后用甲醇进行淬火处理，之后利用旋转蒸发仪于负压下除去溶剂，并经制备型高效液相色谱分离纯化得到Rh101ME(式IV所示化合物)。
RhBME的合成方法与Rh101ME的类似：
将RhB与亚硫酰氯以1:5的比例混合溶于十倍的氯仿，加热至60℃搅拌反应10分钟。然后将混合物冷却至室温后用甲醇进行淬火处理，之后利用旋转蒸发仪于负压下除去溶剂，并经制备型高效液相色谱分离纯化得到RhBME(式V所示化合物)。
实施例3.利用Rh101AM测量胞浆温度分布
利用Rh101AM对活细胞进行染色后在荧光显微镜下成像，并使用公式(1)对荧光图像进行计算，可以得到胞内温度的分布图像。
图3为HepG2细胞在37℃的细胞培养箱内用200nM Rh101AM染色60min后，在荧光显微镜(BX61WI，Olympus Ltd.，40倍镜，数值孔径NA为0.8，成像时培养液温度为27.9℃)下用EMCCD(Evolve 512，Photometrice Ltd.)捕获的斯托克斯发光图像。其中图3(a)为单色仪(Optoscan monochromator，Cairn Research Ltd.)在波长555nm(带宽3nm)处激发、于573～613nm处收光所成斯托克斯发光图像，图3(b)为单色仪在波长635nm(带宽15nm)处激发、于573～613nm处收光所成反斯托克斯发光图像，使用图3(a)对图3(b)进行归一处理得到的比值图像如图3(c)所示，进一步用公式(1)计算得到细胞的温度分布图如3(d)所示。
该结果显示细胞内温度并非通常认为那样是均一的。Kachynski等曾将Rh101用于测量活细胞内部的温度，并显示活细胞内部的温度是均一的[4]，这与本发明的结果不一致。为了探索其原因，本发明人在与前述Rh101AM相同条件下用Rh101对活细胞染色和成像，得到的斯托克斯发光图像和反斯托克斯发光图像如图4所示。结果显示，Rh101染色活细胞得到的斯托克斯发光图像和反斯托克斯发光图像清晰度远比Rh101AM染色的效果差，并且空间上没有特异性的分布。更为重要的是，图4(a)的荧光强度比图3(a)并没有显著降低，说明两图中Rh101与Rh101AM的浓度是近似的，然而图4(b)显示的Rh101的反斯托克斯发光却比图3(b)弱了很多，由于反斯托克发光与温度呈正相关的关系，该结果反映出图4所示细胞的温度比图3所示细胞要低的多，但两者成像条件和温度条件是一致的，从而说明图4反映出的细胞温度水平不正确。
由于细胞膜本身是较好的隔热材料，而且活细胞的代谢活动也能产生一定热量用来维持细胞温度，细胞从37℃的培养条件下放入28℃的成像条件下时胞内温度不会立刻降低。图4反映细胞温度较低很可能是因为Rh101没有进入胞内，只是粘附在胞外(图4(a)并没有比图3(a)显著低)，因此受到较低的溶液温度影响，图4(b)所示的Rh101的反斯托克斯发光显著弱于图3(b)所示的。
与进入细胞内的染料相比，粘附在胞外的染料比较容易被洗脱。为了进一步证明Rh101是粘附在胞外的，在用上述相同染色条件对HepG2细胞染色后，用灌流的方法观察染料在稍强洗脱条件下对细胞染色的情况，结果如图5所示。其中图5(a-c)分别为用Rh101AM染色后，用含有2.5mM丙磺舒的灌流溶液(Tyrode溶液)灌洗细胞0min，10min，20min后，单色仪在波长555nm(带宽3nm)处激发、于573～613nm处收光所成斯托克斯发光图像。图5(d-f)分别为用Rh101AM染色后，用不含丙磺舒的灌流溶液(Tyrode溶液)灌洗细胞0min， 10min，20min后，单色仪在波长555nm(带宽3nm)处激发、于573～613nm处收光所成斯托克斯发光图像。图5(g-i)分别为用Rh101染色后，用含有2.5mM丙磺舒的灌流溶液(Tyrode溶液)灌流0min，10min，20min后，单色仪在波长555nm(带宽3nm)处激发、于573～613nm处收光所成斯托克斯发光图像。图5(j)为上述三种情况下，斯托克斯发光强度随灌流时间的变化曲线。其中丙磺舒的作用是抑制存在于细胞膜上的能将进入胞内的染料转运出细胞的有机离子转运蛋白。结果显示用Rh101染色后，用含有丙磺舒的灌流溶液灌流10min以后，细胞斯托克斯发光几乎全部消失(图5(h，j))；Rh101AM染色后，无论用含有丙磺舒还是不含丙磺舒的灌流溶液灌流10min后，细胞内都保持了相当量的荧光(50％以上，图5(b，e，j))。该结果提示Rh101大部分结合在细胞表面，很容易洗脱，而Rh101AM显著富集于胞内，较难洗脱。结合前述的Rh101染色比Rh101AM染色得到的细胞温度(反斯托克发光所反映的温度)更低的事实，可知大部分Rh101只是粘附在细胞外，并未进入胞内，得到的温度图像仅仅反映了细胞表面的温度，难以反映胞内温度分布，而用Rh101AM染色得到的温度分布图才真正反映了细胞内温度的分布情况。此外，本发明人亦发现RhB同样难以进入细胞。
另外，结果显示Rh101AM染色后，随着灌流时间的延长，细胞荧光强度都趋向减弱，用不含丙磺舒的灌流溶液灌流25min以后，细胞斯托克斯发光几乎全部消失(图5(j))，而用含丙磺舒的灌流溶液灌流30min以上后细胞还有一定斯托克斯发光(图5(j))。说明尽管大部分染料在较长时间的洗脱情况下，可能由于胞吐作用而被洗脱，但通过丙磺舒抑制有机离子转运蛋白可以减少Rh101AM的漏出，这为需要在较长时间段内测定细胞内温度的实验提供了有利条件。
实施例4.利用Rh101ME测量线粒体温度分布
Rh101ME和Rh800(式2所示化合物)对活细胞进行染色后在激光共聚焦荧光显微镜下成像，并使用公式(1)对荧光图像进行计算，可以得到线粒体温度的分布图像。
图6为COS7细胞在37℃细胞培养箱内用100nM Rh101ME和100nM Rh800共染色30min后，在激光共聚焦荧光显微镜(FV1000，Olympus，60倍水镜，数值孔径NA为1.2，成像时培养液温度为30℃)下所成图像。其中，图6(a)为635nm激光激发、于655～755nm处收光所成Rh800产生的斯托克斯发光图像，图6(b)为635nm激光激发、于575～620nm处收光所成Rh101ME产生的反斯托克斯发光图像，使用图6(a)对图6(b)进行归一处理后，用公式(1)计算得到胞内线粒体的温度分布图如6(c)所示。该结果显示线粒体内温度也存在差异。
实施例5.利用RhBME测量线粒体温度分布
RhBME和Rh800对活细胞进行染色后在激光共聚焦荧光显微镜下成像，并根据相对斯托克斯发光强度与温度的线性关系，利用标准曲线对比值图像进行计算，可以得到线粒体温度的分布图像。
图7为COS7细胞在37℃细胞培养箱内用50nM RhBME和50nM Rh800染色30min后，在激光共聚焦荧光显微镜(FV1000，Olympus，60倍水镜，数值孔径NA为1.2，成像时培养液温度为30℃)下所成图像。其中图7(a)为559nm激光激发于575～620nm处收光所成RhBME产生的斯托克斯发光图像，图7(b)为635nm激光激发于655～755nm处收光所成Rh800产生的斯托克斯发光图像，使用图7(b)比上图7(a)，得到反映线粒体温度分布的比值图像。根据相对斯托克斯发光强度与温度呈线性关系，计算得到胞内线粒体的温度分布图如7(c)所示。
该结果显示线粒体温度分布不均匀，这与Rh101ME的检测结果一致。
实施例6.利用RhBAM测量胞浆温度分布
重复实施例5，不同之处在于利用RhBAM和Rh110AM(式X所示化合物)，而非RhBME和Rh800，对活细胞进行染色后在激光共聚焦荧光显微镜下成像。Rh110AM用波长488nm的激光激发、于505-545nm处收集所得到的斯托克斯发光图像可以用来对RhBAM用波长559nm的激光激发、于575～620nm处收集所得到的得到斯托克斯发光图像进行归一，从而得到反映胞浆温度分布的比值图像。根据相对荧光强度与温度的线性关系对比值图像进行计算，可以得到胞浆温度的分布图像。结果同样显示细胞内的温度分布不是均一的(测量结果未示出)。
实施例7.合成RhB-C16(式VI所示化合物)
将7g罗丹明B悬浮在10ml干燥苯中，加入3ml干燥的吡啶混匀，滴加27ml亚硫酰氯，同时搅拌和冷却。室温下，搅拌该反应混合物12小时。然后加入1克十六烷醇，继续搅拌再反应12小时。蒸发去除苯，将粉末溶解于少量乙醇中，将得到的溶液点样于层析板上，然后在溶剂系统(石油醚和乙酸乙酯)中展开，然后在乙醚中展开以除去产物中的十六烷醇。将产物重悬在乙醇中，层析分离重复两次。蒸发最终的乙醇溶液，得到蜡状固体的产物。
实施例8.利用RhB-C16测量细胞膜温度分布
图8(a)显示RhB-C16的光谱性质；图8(b)显示RhB-C16的斯托克斯发光与RhB的其他衍生物一样具有温敏特性。利用RhB-C16对活细胞进行染色后在荧光显微镜下成像，如8(c)所示，从而证明RhB-C16明确定位于细胞膜上。因此，可以利用RhB-C16来测定细胞膜的温度分布。
重复实施例5，不同之处在于利用RhB-C16和Rh110-C16(式XI所示化合物)，而非RhBME和Rh800，对活细胞进行染色后在激光共聚焦荧光显微镜下成像。Rh110-C16用波长488nm的激光激发、于505-545nm处收集所得到的斯托克斯发光图像可以用来对RhB-C16用波长559nm的激光激发、于575～620nm处收集所得到的得到斯托克斯发光图像进行归一，从而得到反映细胞膜温度分布的比值图像。根据相对荧光强度与温度的线性关系对比值图像进行计算，可以得到细胞膜温度的分布图像。
实施例9.其它化合物的温敏特性
发明人进一步测试了式VII所示化合物(rhodamine B-[(1,10-phenanthrolin-5-yl)aminocarbonyl]benzyl ester，缩写为RPA)、式VIII所示化合物(tetramethylrhodamine methyl ester，缩写为TMRM)以及Rh110化合物、Rh101化合物和Rh800化合物的光谱性质和温敏性质，发现式VII所示化合物和式VIII所示化合物的斯托克斯发光具有温敏特性(见图9和10)；而Rh110化合物和Rh101化合物的斯托克斯发光不具有温敏特性(见图11-12)；Rh800化合物的斯托克斯发光在波长小于700nm的范围内不具有温敏特性(见图13)。已知RPA和TMRM都是定位于线粒体的荧光染料，因此它们都可以用来测定活细胞内线粒体的温度分布。
实施例10.式X和XI所示化合物的合成
将Rh110(购自Santa Cruz)、氟化铯、溴醋酸以1:2:1.2的比例混合溶于十倍的二甲 基甲酰胺(DMF)，室温下搅拌反应2小时。然后经制备型高效液相色谱分离纯化得到式X所示化合物，Rh110AM。
将7g Rh110悬浮在10ml干燥苯中，加入3ml干燥的吡啶混匀，滴加27ml亚硫酰氯，同时搅拌和冷却。室温下，搅拌该反应混合物12小时。然后加入1克十六烷醇，继续搅拌再反应12小时。蒸发去除苯，将粉末溶解于少量乙醇中，将得到的溶液点样于层析板上，然后在溶剂系统(石油醚和乙酸乙酯)中展开，然后在乙醚中展开以除去产物中的十六烷醇。将产物重悬在乙醇中，层析分离重复两次。蒸发最终的乙醇溶液，得到最终的产物Rh110-C16(式XI所示化合物)。
讨论：
使用本发明方法，得到的细胞温度分布图(图3(d))以及线粒体温度分布图(图6(c)，图7(c))显示细胞内和线粒体的温度并不是通常认为的那样均一。而现有技术，例如Kachynski等的报道显示胞内温度分布没有明显波动[4]，原因在于使用的染料本身难以穿透细胞膜，而该文献并未注意或暗示有该问题或缺陷存在，因此其结果不可靠。
而现有技术中的其他温度测量方案，例如，使用热电偶方法测量细胞单个位置的温度具有高时间分辨率的优点，但其应用于两维细胞温度分布的测量，其高时间分辨率的优点会大打折扣，此外基于热电偶探头的这种接触式的温度测量，很可能在两维扫描的过程中损伤细胞。本发明的方法不仅不会损伤细胞，而且时间分辨率也足够高，用自身斯托克斯发光做校准的方法的时间间隔仅需数秒甚至是一秒以内(取决于成像速度)，而用另一种荧光化合物做校准的方法不存在时间差。
现有技术中的亲水性温敏荧光纳米材料作为细胞温度测量材料时，由于其聚集非常不均匀，使用整个细胞的平均荧光强度来反映其温度就显得非常粗略了[1]。而本发明的温敏荧光染料化合物不仅可以进入细胞内，而且可以得到很高空间分辨率的温度分布图，分辨出细胞内不同位置的温度。综上所述，本发明的方法满足了胞内温度需要小尺寸测量和迅速测量的要求，达到了空间和时间上的高分辨率。相比于现有技术，本发明方法在细胞温度测量上具有明显优势。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
参考文献
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Claims (17)

1.一种式I所示化合物，
其中，
R9是1-22个碳原子的烃基或2-3个碳原子的酯基取代的1-3个碳原子的烷基，
R5、R6、R7、R8均为烃基或H，和
R1、R2、R3、R4均为H或低级烃基；
或者
R9是2-22个碳原子的烃基或2-3个碳原子的酯基取代的1-3个碳原子的烷基，和
R5与R1，R6与R2，R7与R3，R8与R4相连成六元环。
2.如权利要求1所示的化合物，其特征在于，所述化合物为下式所示化合物：
3.式I所示化合物在测量活细胞内温度分布中的用途，
其中，
R9选自：1-22个碳原子的烃基，2-3个碳原子的酯基取代的1-3个碳原子的烷基，或芳基取代的1-3个碳原子的烷基
R5、R6、R7、R8独立选自烃基，和
R1、R2、R3、R4均为H或低级烃基；
或者
R9选自：1-22个碳原子的烃基，2-3个碳原子的酯基取代的1-3个碳原子的烷基，或芳基取代的1-3个碳原子的烷基，和
R5与R1，R6与R2，R7与R3，R8与R4相连成六元环。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述化合物是下式所示化合物：
5.如权利要求3或4所述的用途，其特征在于，所述活细胞内温度分布是亚细胞结构的温度分布；优选地，所述亚细胞结构是细胞膜、胞浆或线粒体。
6.式I所示化合物或式2所示化合物在利用温敏荧光化合物测量活细胞内温度分布时的温敏荧光化合物分布校准中的用途，
其中，
R9是1-22个碳原子的烃基或2-3个碳原子的酯基取代的1-3个碳原子的烷基，
R5、R6、R7、R8均为H，和
R1、R2、R3、R4均为H或低级烃基；
或者
R9是1-22个碳原子的烃基或2-3个碳原子的酯基取代的1-3个碳原子的烷基，和
R5与R1，R6与R2，R7与R3，R8与R4相连成六元环。
7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述化合物是以下化合物：
8.一种测量活细胞内温度分布的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
当利用温敏荧光化合物的反斯托克斯发光成像测量活细胞内温度分布时，
(1)利用式I所示化合物对活细胞进行染色；
其中，
R9选自：1-22个碳原子的烃基，2-3个碳原子的酯基取代的1-3个碳原子的烷基，或芳基取代的1-3个碳原子的烷基，
R5、R6、R7、R8独立选自烃基，和
R1、R2、R3、R4均为H或低级烃基；
或者
R9选自：1-22个碳原子的烃基，2-3个碳原子的酯基取代的1-3个碳原子的烷基，或芳基取代的1-3个碳原子的烷基，和
R5与R1，R6与R2，R7与R3，R8与R4相连成六元环；
(2)在荧光显微镜下对步骤(1)所述染色的细胞进行成像；
(3)使用公式(1)对荧光图像进行计算：
相对荧光强度：公式(1)
其中kB是玻尔兹曼常数，T是绝对温度，ΔE是活化能，A是拟合常数，相对荧光强度是式I所示化合物的反斯托克斯发光用该化合物自身的斯托克斯发光归一化之后的比值，
预先测定相对荧光强度随温度变化的标准曲线，利用公式(1)进行计算，从而得到活细胞内温度的分布图像；
或者
当利用温敏荧光化合物的斯托克斯发光或反斯托克斯发光成像测量活细胞内温度分布时，
(1)利用式I所示化合物以及校准荧光化合物对活细胞进行同时染色；
其中，
R9选自：1-22个碳原子的烃基，2-3个碳原子的酯基取代的1-3个碳原子的烷基，或芳基取代的1-3个碳原子的烷基，
R5、R6、R7、R8独立选自烃基，和
R1、R2、R3、R4均为H或低级烃基；
或者
R9选自：1-22个碳原子的烃基，2-3个碳原子的酯基取代的1-3个碳原子的烷基，或芳基取代的1-3个碳原子的烷基，和
R5与R1，R6与R2，R7与R3，R8与R4相连成六元环；
(2)在荧光显微镜下对步骤(1)所述染色的细胞进行成像；
(3)根据温度变化与相对荧光强度的线性关系，利用预先测得的标准曲线进行计算，得到活细胞内温度的分布图像，这里的相对荧光强度是指温敏荧光化合物的斯托克斯或反斯托克斯发光强度用校准荧光化合物的斯托克斯发光强度作归一化处理所得到的比值。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述式I所示化合物是下式所示化合物：
10.如权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述活细胞内温度分布是亚细胞结构的温度分布；优选地，所述亚细胞结构是细胞膜、胞浆或线粒体。
11.一种在利用温敏荧光化合物测量活细胞内温度分布时对温敏荧光化合物作分布校准的方法，其特征在于，所述方法利用与所用温敏荧光化合物的细胞内浓度分布相同，但不具备温敏特性的另一种荧光化合物对所述温敏荧光化合物作分布校准。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述不具备温敏特性的另一种荧光化合物与所述温敏荧光化合物共价连接；优选地，所述不具备温敏特性的另一种荧光化合物与所述温敏荧光化合物通过烃链共价连接；更优选的，通过2-18个碳原子的烃链共价连接；最优选的，通过4-10个碳原子的烃链共价连接。
13.如权利要求11或12所述的方法，其特征在于，所述方法中利用以下化合物对温敏荧光化合物作分布校准：
14.一种测量活细胞内温度分布的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒装有：
(1)式I所示化合物：
其中，
R9选自：1-22个碳原子的烃基，2-3个碳原子的酯基取代的1-3个碳原子的烷基，或芳基取代的1-3个碳原子的烷基
R5、R6、R7、R8独立选自烃基，和
R1、R2、R3、R4均为H或低级烃基；
或者
R9选自：1-22个碳原子的烃基，2-3个碳原子的酯基取代的1-3个碳原子的烷基，或芳基取代的1-3个碳原子的烷基，和
R5与R1，R6与R2，R7与R3，R8与R4相连成六元环；
(2)细胞染色所用的辅助试剂；
(3)容纳上述化合物和辅助试剂的容器；和
(4)利用所述化合物测量活细胞内温度分布的使用说明书。
15.如权利要求14所述的检测试剂盒，其特征在于，所述化合物是以下化合物：
16.如权利要求14或15所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还装有以下化合物：
其中，
R9是1-22个碳原子的烃基或2-3个碳原子的酯基取代的1-3个碳原子的烷基，
R5、R6、R7、R8均为H，和
R1、R2、R3、R4均为H或低级烃基；
或者
R9是1-22个碳原子的烃基或2-3个碳原子的酯基取代的1-3个碳原子的烷基，和
R5与R1，R6与R2，R7与R3，R8与R4相连成六元环。
17.如权利要求16所述的检测试剂盒，其特征在于，所述化合物是以下化合物：
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