CN103145679B - 表没食子儿茶素没食子酸酯的制备方法及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及表没食子儿茶素没食子酸酯的制备方法及其用途。该方法包括：将绿茶进行加醇提取，以便获得绿茶提取液；将绿茶提取液进行纯化，以便获得绿茶提取物；将绿茶提取物进行纯化，以便获得表没食子儿茶素没食子酸酯粗提物；以及将表没食子儿茶素没食子酸酯粗提物进行重结晶，以便获得表没食子儿茶素没食子酸酯。该方法能够有效地制备表没食子儿茶素没食子酸酯，并且该产物够用于制备预防或者治疗贫血的药物、保健品或食品。

Description

表没食子儿茶素没食子酸酯的制备方法及其用途
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及表没食子儿茶素没食子酸酯的制备方法及其用途。
背景技术
绿茶的主要有效成分是茶多酚（tea polyphenol，TP），又名茶单宁、儿茶酸，是茶叶中儿茶素类、黄酮类、酚酸类和花色素类化合物的总称，约占茶叶干重的18-36%，大量研究表明茶多酚具有很强的抗氧化能力，一直作为天然的食品抗氧化添加剂。通过对茶多酚的化学成分研究表明，茶多酚的主要成分是儿茶素类化合物，约占茶多酚总量的70%～80%，主要含有儿茶素（C）、表儿茶素（EC）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）、表没食子酸儿茶素（EGC）及表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）等多种活性物质。
贫血，通常指外周血液中血红蛋白、红细胞和（或）红细胞压积低于同性别、同年龄正常动物的最低值，其中以血红蛋白值最具参考价值。临床常见贫血为缺铁性贫血和巨幼红细胞性贫血。缺铁性贫血可用铁剂如硫酸亚铁、枸橼酸铁铵、右旋糖酐铁，巨幼细胞性贫血可用叶酸和维生素B12治疗。再生障碍性贫血是骨髓造血功能抑制所致，治疗比较困难，对其治疗目前主要是支持疗法、促造血和骨髓移植。支持疗法主要是输注红细胞和血小板以维持血细胞计数，而反复输血容易引发输血性血色病，而仅使用G-CSF、EPO等造血生长因子对再障患者行促造血治疗，临床无显著效果。治疗再生障碍性贫血的药物价格昂贵、治疗费用高、治疗效果不理想。地中海贫血又称珠蛋白生成障碍性贫血，是由于珠蛋白肽链合成量之间不平衡所致，所以纠正珠蛋白肽链失衡成为地中海贫血治疗研究的关键。最有效的治疗方法是采用各类造血干细胞移植治疗，但是相应治疗费用和医疗风险也最高。珠蛋白基因调节剂和辅助性抗氧化剂、祛铁剂等药物治疗及高通量输血可以缓解病情、改善症状，治疗方法容易掌握，但是患者必须终生服用对症药物或依赖输血，因此寻找一种安全有效的贫血症治疗药物非常有意义。
然而，目前表没食子儿茶素没食子酸酯的制备方法及其用途仍有待进一步研究。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种有用的商业选择。为此，本发明的一个目的在于提供一种表没食子儿茶素没食子酸酯的制备方法及其新用途。
本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
近年来，运用中医药对贫血症的治疗的研究日趋深入，中药具有疗效好毒副作用小的优点。绿茶具有清热解毒，收敛除湿等功效，而且经现代医学研究证明，绿茶还具有抗病毒、抗菌、抗氧化、抗增生、抗贫血的作用。目前国内有关于茶多酚及儿茶素和表儿茶素在治疗贫血方面的专利报道，本专利提供了一种治疗贫血症的新的中药单体成分表没食子儿茶素没食子酸酯，该成分近年来研究及其广泛，且是绿茶中含量最高的单体成分，具有很高的开发价值。
本发明的发明人经过艰苦的劳动，结合发明人最新的研究研究显示表没食子儿茶素没食子酸酯在治疗溶血性贫血、缺铁性贫血、再生障碍性贫血、地中海贫血方面疗效较好，优于报道所见的绿茶茶多酚及儿茶素和表儿茶素。特别是表没食子儿茶素没食子酸酯应用于乙型地中海贫血、海恩兹小体性（Heinz body）溶血性贫血、缺铁性贫血的治疗，疗效明显优于绿茶茶多酚及儿茶素和表儿茶素，可制备成优良的抗贫血的药物。
在本发明的一个方面，本发明提出了一种制备表没食子儿茶素没食子酸酯的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：将绿茶进行加醇提取，以便获得绿茶提取液；将所述绿茶提取液进行纯化，以便获得绿茶提取物；将所述绿茶提取物进行纯化，以便获得表没食子儿茶素没食子酸酯粗提物；以及将所述表没食子儿茶素没食子酸酯粗提物进行重结晶，以便获得表没食子儿茶素没食子酸酯。由此，利用该方法，能够以较低成本有效地制备单体化合物形式的表没食子儿茶素没食子酸酯。通过HPLC方法进行检测，确定根据本发明的方法所制备的表没食子儿茶素没食子酸酯的纯度可以高达93%以上。
根据本发明的实施例，上述方法还可以具有下列附加技术特征：
根据本发明的一个实施例，将绿茶进行加醇提取，以便获得绿茶提取液进一步包括：将绿茶药材用6-15倍重量的30%-80%的乙醇进行加热回流提取1-4次，每次0.5-3小时，并将分别获得的提取液进行合并，以便获得所述绿茶提取液。由此，可以进一步提高制备表没食子儿茶素没食子酸酯的效率。
根据本发明的一个实施例，将绿茶药材用8-12倍重量的50%-70%乙醇进行加热回流提取1-3次，每次1-3小时，并合并提取液，以便获得绿茶提取液。由此，可以进一步提高制备表没食子儿茶素没食子酸酯的效率。
根据本发明的一个实施例，绿茶药材用10倍量的60%乙醇加热回流提取2次，每次1.5小时，合并提取液。由此，可以进一步提高制备表没食子儿茶素没食子酸酯的效率。
根据本发明的一个实施例，将所述绿茶提取物进行纯化进一步包括：将所述绿茶提取液进行第一减压处理，以便除去乙醇；将所得到的残留物加水溶解后用乙酸乙酯萃取，并分离含有表没食子儿茶素没食子酸酯的乙酸乙酯相；将所述含有表没食子儿茶素没食子酸酯的乙酸乙酯相进行第二减压处理，以便获得所述绿茶提取物。由此，可以进一步提高制备表没食子儿茶素没食子酸酯的效率。
根据本发明的一个实施例，所述第一减压处理是在35～70摄氏度的温度下，优选50～60摄氏度温度下，更优选50摄氏度温度下进行的。由此，可以进一步提高制备表没食子儿茶素没食子酸酯的效率。
根据本发明的一个实施例，将所得到的残留物加水溶解后用乙酸乙酯萃取1～4次，优选2～3次，更优选2次。由此，可以进一步提高制备表没食子儿茶素没食子酸酯的效率。
根据本发明的一个实施例，将所得到的残留物加水溶解后用等体积的乙酸乙酯萃取。由此，可以进一步提高制备表没食子儿茶素没食子酸酯的效率。
根据本发明的一个实施例，所述第二减压处理是在40～90摄氏度的温度下，优选40～60摄氏度的温度下，更优选在50摄氏度的温度下进行的。由此，可以进一步提高制备表没食子儿茶素没食子酸酯的效率。
根据本发明的一个实施例，将所述绿茶提取物进行纯化，以便获得表没食子儿茶素没食子酸酯粗提物进一步包括：将所述绿茶提取物用水溶解后，过大孔树脂柱，收集乙醇洗脱部分，减压干燥，以便获得所述没食子儿茶素没食子酸酯粗提物。由此，可以进一步提高制备表没食子儿茶素没食子酸酯的效率。
根据本发明的一个实施例，所述过大孔树脂柱是按照0.5-3g绿茶/g树脂，优选1.0-2.5g药材/g树脂，更优选2g药材/g树脂的比例加样而进行的。由此，可以进一步提高制备表没食子儿茶素没食子酸酯的效率。
根据本发明的一个实施例，首先用2-6个柱体积的水，优选3-5个柱体积的水，更优选3个柱体积的水对所述大孔树脂柱进行洗脱，再用4-8个柱体积，优选5-7个柱体积，更优选6个柱体积的5%-15%乙醇，优选8%-12%乙醇，更优选10%的乙醇对所述大孔树脂柱进行洗脱。由此，可以进一步提高制备表没食子儿茶素没食子酸酯的效率。
根据本发明的一个实施例，将所述表没食子儿茶素没食子酸酯粗提物进行重结晶进一步包括：将所述表没食子儿茶素没食子酸酯粗提物配制成饱和水溶液；以及向所述饱和水溶液中加入有机溶剂，以便进行重结晶。由此，可以进一步提高制备表没食子儿茶素没食子酸酯的纯度。
根据本发明的一个实施例，所述有机溶剂为甲醇与异丙醇的混合物，其中，甲醇与异丙醇的体积比为2:1。由此，可以进一步提高制备表没食子儿茶素没食子酸酯的纯度。
根据本发明的一个实施例，所述重结晶是在0～15摄氏度，优选5～10摄氏度，更优选8摄氏度的温度下进行的。由此，可以进一步提高制备表没食子儿茶素没食子酸酯的纯度。
根据本发明的一个实施例，所述表没食子儿茶素没食子酸酯与有机溶剂的重量体积比为1g:2-5ml。由此，可以进一步提高制备表没食子儿茶素没食子酸酯的纯度。
根据本发明的一个实施例，优选表没食子儿茶素没食子酸酯与有机溶剂的重量体积比为1g:3ml。
在本发明的第二方面，本发明提出了表没食子儿茶素没食子酸酯在制备抗贫血产品中的用途，优选地，所述表没食子儿茶素没食子酸酯是根据前面所述的方法制备的。
根据本发明的实施例，所述抗贫血产品的类型并不受特别限制。根据本发明的具体示例，优选地抗贫血产品可以为用于预防或者治疗贫血的药物、保健品或食品。具体的，所述药物可以呈片剂、胶囊剂、颗粒剂、或注射剂的至少一种。
根据本发明的实施例，可以采用本发明的抗贫血产品可以治疗或者预防的贫血可以为选自缺铁性贫血、溶血性贫血、再生障碍性贫血和地中海贫血的至少一种。优选地，可以治疗或者预防的贫血为选自缺铁性贫血、乙型地中海贫血、海恩兹小体性溶血性贫血的至少一种。
发明人发现利用本发明药物活性成分表没食子儿茶素没食子酸酯治疗贫血症时，效果优于绿茶的其它活性成分绿茶茶多酚、表儿茶素、儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、表没食子酸儿茶素。因而，优选将根据本发明实施例的药物活性成分表没食子儿茶素没食子酸酯用于贫血症的治疗。
在表没食子儿茶素没食子酸酯对溶血性贫血小鼠的治疗作用实验中，EGCG可显著增加溶血性贫血小鼠红细胞计数（RBC），并可显著增加溶血性贫血小鼠血红蛋白（Hb）。说明EGCG可用于治疗溶血性贫血。另外，经EGCG作用于贫血小鼠后，单位RBC中血红蛋白肽链的合成有所增加，可用于地中海贫血的治疗。
在表没食子儿茶素没食子酸酯对缺铁性贫血小鼠的治疗作用实验中，EGCG可显著增加缺铁性贫血小鼠RBC，并可显著增加缺铁性贫血小鼠Hb。说明EGCG可用于治疗缺铁性贫血。
在表没食子儿茶素没食子酸酯对再生障碍性贫血小鼠的治疗作用实验中，给与EGCG后，白细胞计数（WBC）、Hb、RBC、血小板计数（PLT）均有明显升高。用骨髓造血肝细胞培养方法观察EGCG、儿茶素、表儿茶素、茶多酚对造血损伤小鼠股骨多向性造血细胞（CFU-mix）、红系祖细胞（CFU-E）、粒单系祖细胞（CFU-GM）的影响，结果表明，EGCG可显著性提高CFU-mix值、CFU-E值、以及CFU-GM值。说明EGCG可用于治疗再生障碍性贫血。
需要说明的是，本发明的药物组合物及其用途是本申请的发明人经过艰苦的创造性劳动和优化工作才完成的。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
具体实施方式
下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。除非特殊说明，在实施例中所进行的操作均为按照《中华人民共和国药典》2010年版以及本领域中公知的方法进行的。
实施例1：表没食子儿茶素没食子酸酯的制备
绿茶药材50g，加入6倍量的80%乙醇加热回流提取4次，每次0.5小时，合并提取液。提取液在35摄氏度下减压回收除去乙醇，加水溶解后用等体积乙酸乙酯萃取1次，萃取后乙酸乙酯层经过40摄氏度进行减压处理以便获得绿茶提取物，将绿茶提取物用纯水溶解后，过滤，配成0.5g药材/g树脂的溶液上大孔树脂柱，用6个柱体积的水洗脱，再用4个柱体积的15%的乙醇洗脱，收集乙醇洗脱部分，减压干燥，得表没食子儿茶素没食子酸酯粗提物；在上述表没食子儿茶素没食子酸酯粗提物饱和水溶液中加入甲醇/异丙醇混合液（甲醇与异丙醇的体积比为2：1，EGCG的重量与加入的混合液体积比为1g：2ml），在5摄氏度下搅拌重结晶，得固体1.04g，纯度为93.5%（HPLC法）。
实施例2：表没食子儿茶素没食子酸酯的制备
绿茶药材50g，加入15倍量的30%乙醇加热回流提取1次，每次3小时，合并提取液。提取液在70摄氏度下减压回收除去乙醇，加水溶解后用等体积乙酸乙酯萃取4次，萃取后乙酸乙酯层经过90摄氏度进行减压处理以便获得绿茶提取物，将绿茶提取物用纯水溶解后，过滤，配成3g药材/g树脂的溶液上大孔树脂柱，用2个柱体积的水洗脱，再用8个柱体积的5%的乙醇洗脱，收集乙醇洗脱部分，减压干燥，得表没食子儿茶素没食子酸酯粗提物；在上述表没食子儿茶素没食子酸酯粗提物饱和水溶液中加入甲醇/异丙醇混合液（甲醇与异丙醇的体积比为2：1，EGCG的重量与加入的混合液体积比为1g：5ml），在8摄氏度下重结晶纯化，得到固体1.15g，纯度为95.1%（HPLC法）。
实施例3：表没食子儿茶素没食子酸酯的制备
绿茶药材50g，加入8倍量的70%乙醇加热回流提取3次，每次1小时，合并提取液。提取液在60摄氏度下减压回收除去乙醇，加水溶解后用等体积乙酸乙酯萃取3次，萃取后乙酸乙酯层经过60摄氏度进行减压处理以便获得绿茶提取物，将绿茶提取物用纯水溶解后，过滤，配成2g药材/g树脂的溶液上大孔树脂柱，用6个柱体积的水洗脱，再用8个柱体积的10%的乙醇洗脱，收集乙醇洗脱部分，减压干燥，得表没食子儿茶素没食子酸酯粗提物；在上述表没食子儿茶素没食子酸酯粗提物饱和水溶液中加入甲醇/异丙醇混合液（甲醇与异丙醇的体积比为2：1，EGCG的重量与加入的混合液体积比为1g：4ml），在0摄氏度下重结晶纯化，得到固体1.19g，纯度为93.9%（HPLC法）。
实施例4：表没食子儿茶素没食子酸酯的制备
绿茶药材50g，加入10倍量的50%乙醇加热回流提取2次，每次1.5小时，合并提取液。提取液在50摄氏度下减压回收除去乙醇，加水溶解后用等体积乙酸乙酯萃取2次，萃取后乙酸乙酯层经过60摄氏度进行减压处理以便获得绿茶提取物，将绿茶提取物用纯水溶解后，过滤，配成1.5g药材/g树脂的溶液上大孔树脂柱，用4个柱体积的水洗脱，再用5个柱体积的10%的乙醇洗脱，收集乙醇洗脱部分，减压干燥，得表没食子儿茶素没食子酸酯粗提物；在上述表没食子儿茶素没食子酸酯粗提物饱和水溶液中加入甲醇/异丙醇混合液（甲醇与异丙醇的体积比为2：1，EGCG的重量与加入的混合液体积比为1g：3ml），在15摄氏度下重结晶纯化，得到固体1.09g，纯度为94.3%（HPLC法）。
实施例5：表没食子儿茶素没食子酸酯的制备
绿茶药材50g，加入10倍量的60%乙醇加热回流提取2次，每次1.5小时，合并提取液。提取液在50摄氏度下减压回收除去乙醇，加水溶解后用等体积的乙酸乙酯萃取2次，萃取后乙酸乙酯层经过50摄氏度进行减压处理，以便获得绿茶提取物；将绿茶提取物用纯水溶解后，过滤，配成2g药材/g树脂的溶液上大孔树脂柱，用3个柱体积的水洗脱，再用6个柱体积的10%的乙醇洗脱，收集乙醇洗脱部分，减压干燥，得表没食子儿茶素没食子酸酯粗提物；在表没食子儿茶素没食子酸酯粗提物饱和水溶液中加入甲醇/异丙醇混合液（甲醇与异丙醇的体积比为2：1，EGCG的重量与加入的混合液体积比为1g：3ml），在8摄氏度下搅拌重结晶1次，得到表没食子儿茶素没食子酸酯固体1.23g，纯度为95.5%（HPLC法）。
实施例6：表没食子儿茶素没食子酸酯对溶血性贫血小鼠的治疗作用
一、材料
实验药物及试剂：昆明小鼠120只，雌雄各半，体重20±2g，健康状况良好，由武汉大学医学院实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK（鄂）2008-0004。EGCG（按照实施例1制备，批号20110901）；
二、动物造模及给药方法
将实验动物小鼠随机分为6组，每组各20只，分别标记为：空白对照组、EGCG组、茶多酚组、表儿茶素组、儿茶素组、模型对照组，除空白对照组外，其余5组小鼠腹腔注射苯肼的生理盐水溶液，注射剂量为90mg·kg-1造模，当天各组小鼠灌胃给药，每日1次，连续1周，并于末次给药后1h采血测定血红蛋白（Hb）及红细胞计数（RBC）。其中空白对照组及模型对照组都给予等体积的生理盐水，EGCG组给药剂量为30mg/kg体重，茶多酚组给药剂量为60mg/kg体重，表儿茶素组给药剂量为18.8mg/kg体重，儿茶素组给药剂量为20mg/kg体重。
三、结果
上述几种药物对溶血性贫血小鼠RBC及Hb的影响见表1。
表1几种药物对溶血性贫血小鼠RBC及Hb的影响
组别 动物数（只） RBC（×1012/L） Hb（g/L）
空白对照组 20 8.85±0.76 136.7±8.7
模型对照组 20 6.11±0.57** 100.7±7.9**
EGCG组 20 8.48±0.74▲ 128.4±7.7▲▲
儿茶素组 20 7.87±0.69▲ 120.7±9.9▲
表儿茶素组 20 7.48±0.74▲ 109.6±8.4
茶多酚组 20 7.86±0.57▲ 107.8±11.7
注：与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型对照组比较：▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。
结果显示：与空白对照组比较，模型对照组Hb、RBC显著降低(P<0.01)，说明动物造模成功。EGCG组可显著增加溶血性贫血小鼠RBC(P<0.05)，并可显著增加溶血性贫血小鼠Hb(P<0.01)，儿茶素组及表儿茶素组对溶血性贫血小鼠模型的RBC值有显著的提升作用，儿茶素组对Hb的影响显著（P＜0.05），而表儿茶素组和茶多酚组则对RBC和Hb的影响都不具有显著性特征。
实施例7：表没食子儿茶素没食子酸酯对缺铁性贫血的治疗作用
一、材料
实验药物及试剂：昆明小鼠140只，雌雄各半，体重20±2g，健康状况良好，由武汉大学医学院实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK（鄂）2008-0004。EGCG（按照实施例1制备，批号20110901）；
二、动物造模及给药方法
将实验动物小鼠随机分为7组，每组各20只，分别标记为：空白对照组、EGCG组、茶多酚组、表儿茶素组、儿茶素组、硫酸亚铁组（阳性对照组）、模型对照组，模型对照组及各给药组小鼠采用低铁饲料喂养，正常饮水，同时每周眼眶取血2次，每次0.4ml，连续2周，空白对照组采用普通饲料喂养，正常饮水。造模成功后除空白对照组外其余各组继续采用低铁饲料喂养，且灌胃给药，每日1次，连续七天，末次给药后1h采血测定Hb及RBC。其中空白对照组及模型对照组都给与等体积的生理盐水，EGCG组给药剂量为30mg/kg体重，茶多酚组给药剂量为60mg/kg体重，表儿茶素组给药剂量为18.8mg/kg体重，儿茶素组给药剂量为20mg/kg体重，硫酸亚铁组给药剂量为90mg/kg体重。
三、结果
上述几种药物对缺铁性贫血小鼠RBC及Hb的影响见表2。
表2几种药物对缺铁性贫血小鼠RBC及Hb的影响
组别 动物数（只） RBC（×1012/L） Hb（g/L）
空白对照组 20 8.27±0.67 124.1±9.4
模型对照组 20 7.11±0.58* 101.5±7.8**
硫酸亚铁片组（阳性对照） 20 8.04±0.55▲ 118.6±8.6▲▲
EGCG组 20 8.24±0.60▲ 121.7±9.8▲▲
儿茶素组 20 7.99±0.63▲ 106.4±8.5
表儿茶素组 20 7.86±0.84▲ 108.7±7.9
茶多酚组 20 7.79±0.70▲ 104.1±10.8
注：与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型对照组比较：▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。
结果显示：与空白对照组比较，模型对照组Hb（P<0.05）、RBC显著降低(P<0.01)，说明动物造模成功。EGCG组可显著增加缺铁性贫血小鼠RBC(P<0.05)，并可极显著增加缺铁性贫血小鼠Hb(P<0.01)，硫酸亚铁片组、儿茶素组、表儿茶素组和茶多酚组均对RBC有显著的提升作用（P<0.05），硫酸亚铁片组可显著增加缺铁性贫血小鼠Hb(P<0.05)，而儿茶素组、表儿茶素组和茶多酚对Hb的影响都不具有显著性特征。
实施例8：EGCG对再生障碍型贫血的治疗作用
一、材料
实验药物及试剂：昆明小鼠120只，雌雄各半，体重20±2g，健康状况良好，由武汉大学医学院实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK（鄂）2008-0004。EGCG（按照实施例1制备，批号20110901）；
二、动物造模及给药方法
将实验动物小鼠随机分为6组，每组各20只，分别标记为：空白对照组、EGCG组、茶多酚组、表儿茶素组、儿茶素组、模型对照组，除空白对照组外，其余5组造模小鼠按15mg/kg的剂量给予白消安，每周一次，腹腔注射，共10周。
其中空白对照组及模型对照组都给与等体积的生理盐水，EGCG组给药剂量为5.6mg/kg体重，茶多酚组给药剂量为10mg/kg体重，表儿茶素组给药剂量为3.5mg/kg体重，儿茶素组给药剂量为3.75mg/kg体重，每日一次，连续灌胃20d。
三、结果
在给药前、给药后每周及末次给药后次日每只小鼠尾静脉取血，观察小鼠WBC、Hb、RBC、PLT的计数，结果见表3。并用骨髓造血肝细胞培养方法，观察EGCG、儿茶素、表儿茶素、茶多酚对造血损伤小鼠股骨多向性造血细胞（CFU-mix）、红系祖细胞（CFU-E）、粒单系祖细胞（CFU-GM）的影响，停药次日测定小鼠股骨内CFU-mix、CFU-GM、CFU-E数量，结果见表4。
表3几种药物对再生障碍性贫血小鼠外周血的影响
组别 动物数(只) WBC（×109/L） Hb（g/L） RBC（×1012/L） PLT（×109/L）
空白对照组 20 13.86±4.60 139.0±20 9.01±1.03 1597±298
模型对照组 20 5.93±1.86* 108.1±15* 6.54±0.97* 891±204*
EGCG组 20 12.39±2.94▲ 132.2±18▲ 8.84±0.88▲ 1530±211▲
儿茶素组 20 11.29±3.28▲ 118.6±15▲ 6.41±1.01* 1301±198▲
表儿茶素组 20 8.38±2.38▲ 110.4±10* 7.09±0.86* 1025±230*
茶多酚组 20 10.57±2.67▲ 114.6±13* 7.15±0.98▲ 964±246*
注：与空白对照组比较：*P＜0.05；与模型对照组比较：▲P＜0.05
表4几种药物对再生障碍性贫血小鼠CFU-mix、CFU-GM、CFU-E的影响
注：（1）与空白对照组比较：*P＜0.05；与模型对照组比较：▲P＜0.05
（2）MNC指单个核细胞（Mononuclear Cell）
结果表明，再生障碍性贫血模型对照组的WBC、Hb、RBC、PLT较空白对照组都有明显减少（P＜0.05），模型对照组的CFU-mix、CFU-GM、CFU-E较空白对照组都有明显减少（P＜0.05），说明动物建模成功。给予EGCG后，WBC、Hb、RBC、PLT与模型对照组相比均有明显升高（P＜0.05），CFU-mix、CFU-GM、CFU-E较空白对照组都有明显减少（P＜0.05）。而儿茶素组对RBC的指标影响不明显，与模型对照组相比无明显差异，而表儿茶素对Hb、RBC、PLT等指标无明显影响作用，茶多酚组对Hb、PLT等指标无明显提升作用。EGCG对再生障碍性贫血贫血的治疗作用明显。
实施例9：EGCG胶囊的制备
处方：
制备方法：按照实施例5制备EGCG固体，加入淀粉、糊精，混匀过筛，制粒，过16目筛，50摄氏度干燥，整粒，适量硬脂酸镁混匀，装胶囊即得。
实施例10：EGCG注射剂的制备
处方：
EGCG         50g
氯化钠       8.5g
注射用水     加至1000ml
制备方法：按照实施例2制备得到EGCG，将EGCG溶解于注射用水中，使全部溶解，加氯化钠再溶解，加注射用水至1000ml，滤过，灌封于5mL安瓿瓶中，100摄氏度灭菌30min即得。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (11)

1.一种制备表没食子儿茶素没食子酸酯的方法，其特征在于，包括：
将绿茶进行加醇提取，以便获得绿茶提取液；
将所述绿茶提取液进行纯化，以便获得绿茶提取物；
将所述绿茶提取物进行纯化，以便获得表没食子儿茶素没食子酸酯粗提物；以及
将所述表没食子儿茶素没食子酸酯粗提物进行重结晶，以便获得表没食子儿茶素没食子酸酯，
其中，
将所述表没食子儿茶素没食子酸酯粗提物进行重结晶进一步包括：
将所述表没食子儿茶素没食子酸酯粗提物配制成饱和水溶液；以及
向所述饱和水溶液中加入有机溶剂，以便进行重结晶，
其中，
所述有机溶剂为甲醇与异丙醇的混合物，其中，甲醇与异丙醇的体积比为2:1；
所述重结晶是在8摄氏度的温度下进行的，
所述表没食子儿茶素没食子酸酯与所述有机溶剂的比为1g:3ml，
其中，将所述绿茶提取液进行纯化进一步包括：
将所述绿茶提取液进行第一减压处理，以便除去乙醇；
将所得到的残留物加水溶解后用乙酸乙酯萃取，并分离含有表没食子儿茶素没食子酸酯的乙酸乙酯相；
将所述含有表没食子儿茶素没食子酸酯的乙酸乙酯相进行第二减压处理，以便获得所述绿茶提取物，
其中，
所述第一减压处理是在35～70摄氏度的温度下下进行的，
将所得到的残留物加水溶解后用乙酸乙酯萃取1～4次，
将所得到的残留物加水溶解后用等体积的乙酸乙酯萃取；
所述第二减压处理是在40～90摄氏度的温度下进行的，
其中，将所述绿茶提取物进行纯化，以便获得表没食子儿茶素没食子酸酯粗提物进一步包括：
将所述绿茶提取物用水溶解后，过大孔树脂柱，收集乙醇洗脱部分，减压干燥，以便获得所述没食子儿茶素没食子酸酯粗提物，
其中，所述过大孔树脂柱是按照0.5-3g绿茶/g树脂的比例加样而进行的；
首先用2-6个柱体积的水对所述大孔树脂柱进行洗脱，再用4-8个柱体积的5％-15％乙醇对所述大孔树脂柱进行洗脱。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将绿茶进行加醇提取，以便获得绿茶提取液进一步包括：
将绿茶药材用10倍重量的60％的乙醇进行加热回流提取2次，每次1.5小时，并将分别获得的提取液进行合并，以便获得所述绿茶提取液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一减压处理是在50～60摄氏度温度下进行的，
将所得到的残留物加水溶解后用乙酸乙酯萃取2～3次，
所述第二减压处理是在40～60摄氏度的温度下进行的。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述第一减压处理是在50摄氏度温度下进行的，
将所得到的残留物加水溶解后用乙酸乙酯萃取2次，
所述第二减压处理是在50摄氏度的温度下进行的。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述过大孔树脂柱是按照1.0-2.5g药材/g树脂的比例加样而进行的；
首先用3-5个柱体积的水对所述大孔树脂柱进行洗脱，再用5-7个柱体积的8％-12％乙醇对所述大孔树脂柱进行洗脱。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述过大孔树脂柱是按照2g绿茶/g树脂的比例加样而进行的；
首先用3个柱体积的水对所述大孔树脂柱进行洗脱，再用6个柱体积的10％乙醇对所述大孔树脂柱进行洗脱。
7.表没食子儿茶素没食子酸酯在制备抗贫血产品中的用途，所述表没食子儿茶素没食子酸酯是根据权利要求1～6任一项所述的方法制备的。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述抗贫血产品为用于预防或者治疗贫血的药物、保健品或食品。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述药物呈片剂、胶囊剂、颗粒剂、或注射剂的至少一种。
10.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述贫血为选自缺铁性贫血、溶血性贫血、再生障碍性贫血和地中海贫血的至少一种。
11.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述贫血为选自缺铁性贫血、乙型地中海贫血、海恩兹小体性溶血性贫血的至少一种。
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