CN103127214A - 一种治疗糖尿病肾病的肾茶有效部位及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有治疗糖尿病肾病的肾茶有效部位及其制备工艺，包括以下步骤：1）肾茶提取及浓缩；2）肾茶提取物上柱；3）肾茶有效部位洗脱收集、浓缩。所得肾茶有效部位可与现有药物、食品赋形剂混合制备用于治疗糖尿病肾病的药物、食品及保健品。本发明提取的有效部位含量高，总黄酮的含量达到50％以上，达到五类中药原料药标准；且所用的洗脱剂无毒性，适用于工业化生产。

Description

一种治疗糖尿病肾病的肾茶有效部位及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种中药有效部位应用及其制备方法，具体是指采用大孔吸附树脂富集肾茶中具有治疗糖尿病肾病的有效部位，应用于治疗糖尿病肾病的药物、食品及保健品，属于医药技术领域。 

背景技术

糖尿病肾病属糖尿病微血管病变范畴，是一种临床常见的继发性肾脏病，属糖尿病心、脑、肾3大严重并发症之一，是糖尿病致死致残的主要原因。据统计糖尿病肾病占糖尿病患者死亡率的60%，糖尿病患者死于糖尿病肾病肾衰者为非糖尿病患者的17倍。在西方国家糖尿病肾病成为终末期肾病(ESRD)的主要病因，目前已成为影响糖尿病患者生存质量和死亡率的重要因素。 

目前针对糖尿病肾病的治疗药物，禁忌及不良反应较多，长期服用，容易导致肝毒性及消化道副作用问题。因此从传统药材中寻找活性强、副作用低有效药物成为解决该问题的新途径。傣药中肾茶是傣医常用的解药品种，经书记载可单用煎汤或开水浸泡当茶饮，具有清热解毒，利水消肿，利尿化石，养肾保肾，凉血止血等功能，现代研究表明肾茶中黄酮类成分具有显著的利尿、抗炎、抗氧化、清除自由基的作用，本研究组还提取富集了具有明显降糖作用的肾茶提取物（已申报专利，申请号为：2011101859979），在此基础上，课题组深入研究，发现肾茶中总黄酮成分包括橙黄酮、佩兰素、及3’-羟基-5,6,7,4’-四甲氧基黄酮，具有显著治疗糖尿病肾病活性，其作用机理可能是肾茶有效部位联合降血糖及抗肾炎作用，目前针对肾茶有效部位治疗糖尿病肾病作用未见报道，本发明针对肾茶有效部位治疗糖尿病肾病的研究开发，具有广阔的市场前景。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有治疗糖尿病肾病的肾茶有效部位制备工艺，通过本发明得到的肾茶有效部位，其总黄酮含量大于50%，达到五类中药新药原料药要求，为后期开发新型治疗糖尿病肾病药物奠定基础。该工艺无毒、操作简便，适用于工业化生产。 

本发明的再一目的在于阐明采用该制备工艺得到的肾茶有效部位可用于开发治疗糖尿病肾病的药物、食品及保健品。 

为达到上述目的，本发明的解决方案是： 

 一种治疗糖尿病肾病的肾茶有效部位及其制备方法，采用以下工艺制备所得：1）肾茶药材提取及浓缩；2）肾茶提取物上柱；3）肾茶有效部位洗脱收集、浓缩干燥。

上述制备工艺中的肾茶提取及浓缩，由以下步骤完成：1）称取肾茶药材，加入5-15倍30%-80%的乙醇进行回流提取1-2小时，过滤，滤渣重新加入5-15倍30%-80%的乙醇重新回流1-2小时，合并两次滤液，于旋转蒸发装置中进行浓缩，浓缩至含生药量为0.8-1.3g/mL的浸膏。 

上述制备工艺中的肾茶提取物上样，由以下步骤完成：1)大孔吸附树脂按照要求进行处理，取权利要求2中制备浸膏，与5-15体积倍的大孔树脂充分混合吸附；2）将上述混合物进行上柱，装实，去离子水洗脱至无色。 

上述制备工艺中的肾茶有效部位洗脱收集浓缩，由以下步骤完成：1）肾茶提取物上柱水洗后，用30%的乙醇洗脱至无色；2）采用30%-60%的乙醇进行洗脱，洗脱至无色，收集洗脱液，于旋转蒸发装置中浓缩至浸膏，减压干燥，得到肾茶有效部位。 

最终干燥得到的肾茶有效部位中总黄酮含量大于50%，主要由佩兰素、橙黄酮、3’-羟基-5,6,7,4’-四甲氧基黄酮等甲氧基黄酮类组成。 

 本发明的有益效果为：首次发现了具有治疗糖尿病肾病的肾茶有效部位，并针对该有效部位进行了分离，与专利（CN 102309542 A）相比，有效部位的提取方法优化，能够富集更多治疗糖尿病肾病的有效组分总黄酮类；与专利（CN 102145040 A）相比，采用不同的提取处理方法，优化30%-60%的乙醇洗脱液，富集了其中的总黄酮含量，通过药效学比较，该方法下得到的肾茶有效部位，治疗糖尿病肾病效果明显，因其总黄酮含量大于50%符合五类中药新药原料药的要求，且处理过程简单、无毒，符合工业生产要求，为治疗糖尿病肾病新药开发奠定基础，具有广泛的市场前景。 

具体实施方案

实施例1 

称取肾茶药材，加入5倍30%的乙醇进行回流提取1小时，过滤，滤渣重新加入5倍30%的乙醇重新回流1小时，合并两次滤液，于旋转蒸发装置中进行浓缩，浓缩至含生药量为0.8g/mL的浸膏。取上述制备浸膏，与5体积倍的大孔树脂充分混合吸附，将混合物进行上柱，装实，去离子水洗脱至无色，再用30%的乙醇洗脱至无色，采用30%的乙醇进行洗脱，洗脱至无色，收集洗脱液，于旋转蒸发装置中浓缩至浸膏，减压干燥，得到肾茶有效部位，测定总黄酮含量为51.3%。

实施例2 

称取肾茶药材，加入15倍80%的乙醇进行回流提取2小时，过滤，滤渣重新加入15倍80%的乙醇重新回流2小时，合并两次滤液，于旋转蒸发装置中进行浓缩，浓缩至含生药量为1.3g/mL的浸膏。取上述制备浸膏，与15体积倍的大孔树脂充分混合吸附，将混合物进行上柱，装实，去离子水洗脱至无色，再用30%的乙醇洗脱至无色，采用60%的乙醇进行洗脱，洗脱至无色，收集洗脱液，于旋转蒸发装置中浓缩至浸膏，减压干燥，得到肾茶有效部位，测定总黄酮含量为59.2%。

实施例3 

称取肾茶药材，加入10倍60%的乙醇进行回流提取1.5小时，过滤，滤渣重新加入10倍60%的乙醇重新回流1.5小时，合并两次滤液，于旋转蒸发装置中进行浓缩，浓缩至含生药量为1.1g/mL的浸膏。取上述制备浸膏，与10体积倍的大孔树脂充分混合吸附，将混合物进行上柱，装实，去离子水洗脱至无色，再用30%的乙醇洗脱至无色，采用50%的乙醇进行洗脱，洗脱至无色，收集洗脱液，于旋转蒸发装置中浓缩至浸膏，减压干燥，得到肾茶有效部位，测定总黄酮含量为65.7%。

实施例4 

称取肾茶药材，加入12倍80%的乙醇进行回流提取1小时，过滤，滤渣重新加入10倍80%的乙醇重新回流2小时，合并两次滤液，于旋转蒸发装置中进行浓缩，浓缩至含生药量为1.0g/mL的浸膏。取上述制备浸膏，与10体积倍的大孔树脂充分混合吸附，将混合物进行上柱，装实，去离子水洗脱至无色，再用30%的乙醇洗脱至无色，采用55%的乙醇进行洗脱，洗脱至无色，收集洗脱液，于旋转蒸发装置中浓缩至浸膏，减压干燥，得到肾茶有效部位，测定总黄酮含量为55.3%。

实施例5 

称取肾茶药材，加入15倍70%的乙醇进行回流提取1小时，过滤，滤渣重新加入10倍70%的乙醇重新回流1.5小时，合并两次滤液，于旋转蒸发装置中进行浓缩，浓缩至含生药量为1.2g/mL的浸膏。取上述制备浸膏，与10体积倍的大孔树脂充分混合吸附，将混合物进行上柱，装实，去离子水洗脱至无色，再用30%的乙醇洗脱至无色，采用50%的乙醇进行洗脱，洗脱至无色，收集洗脱液，于旋转蒸发装置中浓缩至浸膏，减压干燥，得到肾茶有效部位，测定总黄酮含量为57.1%。

实施例6 

药理实验

 1 材料与方法

1.1 试验药物 肾茶有效部位提取为中国医学科学院药用植物研究所云南分所研发中心制备提供。盐酸二甲双胍(上海信谊药厂有限公司批号:121121)，格列本脲片(山西汾河制药有限公司批号: 121101)。

1.2 动物 SD大鼠，雌性，体重200±20g，由第四军医大学实验动物中心提供，合格证号SCXK(军)2007－007。饲料由第四军医大学提供。饲养环境：中国医学科学院药用植物研究所SPF动物饲养观察室，室温20℃～25℃，相对湿度45%～65%，自由饮水。 

1.3 试剂 链脲佐菌素(Sigma)；尿素氮、血肌酐试剂盒，长春汇力生物技术有限公司(批号:2012006、2010028) ；超氧化物歧化酶、丙二醛、糖化血红蛋白测试盒，南京建成生物工程研究所 (批号:20120104、20121230、20121029)。 

1.4 仪器 UV2300紫外-可见分光光度计；罗氏活力型血糖仪及血糖试纸(批号:23417832) ；尿糖试纸(广州市花都高尔宝生物技术有限公司 批号:20100517)。 

1.5 方法 大鼠适应性饲养3d后，随机抽取10只作为正常组，其余大鼠禁食不禁水24h后，腹腔注射STZ60mg/kg[STZ临用前以0.1mmol/L枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液(pH4.6)配制]，复制大鼠糖尿病肾病模型。注射第15d用尿糖试纸检测尿糖，尿糖+++以上为何合格，同时血糖试纸挑选空腹血糖＞11.1 mmol/L的大鼠为糖尿病肾病模型大鼠。造模成功大鼠，按血糖浓度等级和体重分为模型组(生理盐水)，肾茶有效部位组(2.4g/kg、1.2 g/kg、0.6g/kg)，二甲双胍组(40 mg/kg)，空白组组(生理盐水)，共6组，每组10只，灌胃治疗12W。实验中动物自由饮水饮食。观察指标：①随时观察大鼠一般状况，定期测定饮食量、饮水量、体重等变化；②治疗前后采血检测血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)等；③给药治疗结束后取血测定超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、糖化血红蛋白(HbAlc)。 

2结果 

2．1 肾茶有效部位对大剂量STZ致DN大鼠血肌酐、尿素氮的影响 

结果表明，造模后，造模组血肌酐明显升高，高于正常组血肌酐2倍左右；各造模组之间无显著性差异；治疗12W后，模型组血肌酐仍高于正常组(P＜0。01)，基本保持在12周前水平。与模型组比较，肾茶有效部位1.2g/kg组显著降低血肌酐水平(P＜0.01)，且比治疗前明显降低(P＜0.05)。糖尿病造模后，与正常组比较，各实验组无明显差异；12周后模型组血尿氮素较正常对照组明显升高(P＜0.01)；各实验组大鼠尿氮素有一定程度降低，与模型组比较，有显著性差异(P＜0.05或P＜0.01)，见表1。

表1 肾茶有效部位对大剂量STZ致DN大鼠血肌酐、尿素氮的影响（ 

±s） 

与模型组比较 # P<0.05 ##P<0.01；与治疗前比较 * P<0.05 ** P<0.01

2.2 肾茶有效部位对大剂量STZ致DN大鼠SOD、MDA及糖化血红蛋白的影响结果显示：糖尿病成模12W后模型组SOD水平较正常对照组明显降低，有显著性差异(P＜0.01)，与模型组比较，二甲双胍组、肾茶有效部位组SOD水平均明显升高，有显著差异(P＜0.01)；糖尿病成模12W后模型组大鼠MDA水平较正常对照组明显升高，有显著性差异(P＜0.01)；与模型组比较，肾茶有效部位2.4g/kg组、二甲双胍组的MDA水平均明显下降，有显著性差异(P＜0.01)。糖尿病成模12W后模型组糖化血红蛋白较正常对照组明显升高(P＜0.01)；与模型组比较，肾茶有效部位2.4g/kg组HbAlc水平均明显下降，有显著性差异(P＜0.01)，芪药消渴胶囊1.2g/kg也显著降低(P＜0.05)，见表2。

表2 肾茶有效部位对大剂量STZ致DN大鼠SOD、MDA及糖化红蛋白的影响（

±s） 

与模型组比较 # P<0.05 ##P<0.01

3 结论

血肌酐(SCr)和尿素氮(BUN)两者分别为含氮的有机物和蛋白质代谢的终末产物，在肾功能正常的情况下，这些小分子物质从肾小球滤出，当肾小球滤过功能减低时，血肌酐和尿素氮因潴留而增高，人体在相对稳定的生理活动情况下，机体内血肌酐(SCr)和尿素氮(BUN)的生成量是恒定的，所以当肾功能减退时会出现SCr值和BUN值会增加。本实验结果显示，糖尿病成模后，血肌苷水平即显著升高，说明此时肾功能一定有一定程度损伤，继续造模12周后血肌酐、尿氮素均保持在较高水平，高于正常组大鼠两倍左右，表明肾功能已经严重损害，肾茶有效部位治疗后血肌酐、尿素氮均明显下降，提示肾茶有效部位具有能保护肾脏，减少糖尿病发展引起的肾脏损伤的作用。

糖化血红蛋白是体血液中红细胞内的血红蛋白与血糖结合的产物，血糖和血红蛋白的结合生成糖化血红蛋白是不可逆反应，并与血糖浓度成正比，且保持较长时间，糖化血红蛋白测试通常可以反映患者近8～12周的血糖控制情况，糖化血红蛋白的测定便于研究血糖的控制情况。本研究显示，糖尿病成模继续发展 12 周后模型组糖化血红蛋白水平较对照组明显升高，表明大剂量STZ一次造模糖尿病模型血糖维持在较高水平，模型较好。肾茶有效部位治疗后，HbAlc明显下降，表明肾茶有效部位能较好的控制血糖水平，对于糖尿病及糖尿病肾病的治疗有较好作用。 

Claims (6)

1.一种治疗糖尿病肾病的肾茶有效部位及其制备方法，其特征在于：肾茶有效部位具有明显治疗糖尿病肾病作用，由以下工艺制备所得：1）肾茶提取及浓缩；2）肾茶提取物上柱；3）肾茶有效部位洗脱收集、浓缩干燥。

2.如权利要求1所述的一种治疗糖尿病肾病的肾茶有效部位及其制备方法，其特征在于：制备工艺中的肾茶提取及浓缩，由以下步骤完成：1）称取肾茶药材，加入5-15倍30%-80%的乙醇进行回流提取1-2小时，过滤，滤渣重新加入5-15倍30%-80%的乙醇重新回流1-2小时，合并两次滤液，于旋转蒸发装置中进行浓缩，浓缩至含生药量为0.8-1.3g/mL的浸膏。

3.如权利要求1所述的一种治疗糖尿病肾病的肾茶有效部位及其制备方法，其特征在于：制备工艺中的肾茶提取物上样，由以下步骤完成：1)大孔吸附树脂按照要求进行处理，取权利要求2中制备浸膏，与5-15体积倍的大孔树脂充分混合吸附；2）将上述混合物进行上柱，装实，去离子水洗脱至无色。

4.如权利要求1所述的一种治疗糖尿病肾病的肾茶有效部位及其制备方法，其特征在于：制备工艺中的肾茶有效部位洗脱收集浓缩，由以下步骤完成：1）肾茶提取物上柱水洗后，用30%的乙醇洗脱至无色；2）采用30%-60%的乙醇进行洗脱，洗脱至无色，收集洗脱液，于旋转蒸发装置中浓缩至浸膏，减压干燥，得到肾茶有效部位。

5.如权利要求1所述的一种治疗糖尿病肾病的肾茶有效部位及其制备方法，其特征在于：干燥得到的肾茶有效部位中总黄酮含量大于50%，主要由佩兰素、橙黄酮、3’-羟基-5,6,7,4’-四甲氧基黄酮等甲氧基黄酮类组成。

6.如权利要求1所述的一种治疗糖尿病肾病的肾茶有效部位及其制备方法，其特征在于：得到的肾茶有效部位可与现有可知的食品、药物赋形剂混合通过剂型制备工艺制成具有治疗糖尿病肾病的药物、食品及保健品。