CN103131719A - 具有免疫保护性的脑多头带绦虫烯醇酶TmENO重组蛋白 - Google Patents

Abstract

本发明涉及脑多头带绦虫免疫保护性抗原烯醇酶TmENO重组蛋白及其制备方法及应用。本发明的重组蛋白其氨基酸序列是GenBank登录号JQ627651的ORF序列编码的氨基酸序列SEQ No.5，其编码基因序列按大肠杆菌偏爱密码子进行优化后的基因序列为SEQ No.6。重组蛋白能明显减少寄生在绵羊绵羊大脑中的包囊数，说明具有免疫保护性。相关实验表明，本发明的重组蛋白免疫动物后可产生高滴度的抗体，并对脑多头带绦虫虫卵攻击感染产生较强的免疫保护性。本发明的TmENO重组蛋白是脑多头蚴病疫苗研制的候选靶标，可以用于脑多头蚴病的免疫预防。

Description

具有免疫保护性的脑多头带绦虫烯醇酶TmENO重组蛋白

技术领域

本发明涉及一种脑多头带绦虫免疫保护性抗原烯醇酶TmENO重组蛋白及其制备方法，本发明还涉及该脑多头带绦虫TmENO重组蛋白作为脑多头蚴病防治疫苗的应用。

背景技术

脑多头蚴病（Cerebral coenurosis）俗称脑包虫病，又称眩倒病或蹒跚病，是脑多头带绦虫（Taenia multiceps）的中绦期幼虫脑多头蚴（Coenurus cerebralis）寄生于绵羊和山羊等有蹄类反刍动物的脑内引起的一种严重致死性的寄生虫病，人也可作为中间宿主感染。其成虫寄生于犬科肉食兽的小肠。脑多头蚴病的致死率可达100%，给畜牧业生产造成了巨大的经济损失。该病呈全球性分布，是一种重要的人畜共患寄生虫病（参见Sharma DK and Chauhan PPS. Coenurosis status in Afro-Asian region: a review [J]. Small Rumin Res, 2006, 64: 197-202. 另参见 Scala A and Varcasia A. Updates on morphobiology, epidemiology and molecular characterization of coenurosis in sheep [J]. Parassitologia, 2006, 48(1-2): 61-63.）。目前，脑多头蚴病的诊断及治疗仍面临技术挑战(参见Scott PR. Diagnosis and treatment of coenurosis in sheep [J]. Vet Parasitol, 2012, 189(1): 75-78.)，因此对此病采取预防为主，治疗为辅的防控方案。早在上世纪八十年代，研究者应用脑多头带绦虫六钩蚴体外培养物免疫绵羊，结果表明六钩蚴分泌抗原能保护动物抵抗脑多头蚴的感染（参见Edwards GT, Herbert IV. Preliminary investigation into the immunization of lambs against infection with Taenia multiceps metacestodes [J]. Vet Parasitol, 1982, 9: 193-199. 另参见Verster A, Tustin RC. Preliminary report on the stimulation of immunity to the larval stage of Taenia multiceps [J]. J S Afr Vet Assoc, 1982, 53(3): 175-176. 另参见Verster A and Tustin RC. Immunization of sheep against the larval stage of Taenia multiceps [J]. Onderstepoort J Vet Res, 1987, 54(2): 103-105. 另参见 张文宝，哈江，蔡宏，等. 脑多头带绦虫六钩蚴代谢物对绵羊脑包虫病的免疫效果观察[J].中国兽医科技，1991，21(12): 35-36.）。另外，窦兰清等应用脑多头带绦虫脑多头蚴囊壁、囊液、原头节抗原和原头节排泄分泌抗原免疫绵羊可以诱导产生一定的免疫保护性（参见窦兰清，付宝权，柴忠威，等. 脑多头带绦虫抗原特性的研究—囊液和囊壁粗抗原的免疫原性[J]. 中国兽医技，1996，26(12): 5-7. 另参见窦兰清，付宝权，柴忠威，等. 脑多头带绦虫抗原特性的研究—原头节及其排泄分泌抗原的免疫原性[J]. 中国兽医科技，1997，27(8): 9-11.）。

尽管研究证实脑多头带绦虫六钩蚴及脑多头蚴虫体抗原、代谢产物免疫羊后可以获得较好的免疫保护，但是由于虫体粗抗原及代谢产物制备繁琐而且对操作者具有感染的风险，基因重组蛋白作为疫苗研制抗原的热点。近年来，Gauci等应用脑多头带绦虫六钩蚴Tm16和Tm18重组蛋白免疫绵羊后能激发免疫应答，在脑多头带绦虫虫卵攻击感染后能减少寄生于绵羊大脑中的脑多头蚴包囊数，说明该抗原可作为脑多头蚴病疫苗的候选抗原(参见Gauci C, Vural G, Oncel T, et al. Vaccination with recombinant oncosphere antigens reduces the susceptibility of sheep to infection with Taenia multiceps [J]. Int J Parasitol, 2008, 38 (8-9): 1041-1050. 另参见Varcasia A, Tosciri G, Coccone GN, et al.  Preliminary field trial of a vaccine against coenurosis caused by Taenia multiceps [J]. Vet Parasitol, 2009, 162(3-4): 285-289.)。国内，由弘等通过RT-PCR扩增从脑多头带绦虫脑多头蚴中获得了45m抗原基因，在原核系统表达的重组蛋白免疫绵羊后能引起机体较强的体液免疫反应，将45m重组蛋白免疫绵羊并攻击感染脑多头带绦虫虫卵后，免疫组减囊率为68.9%，具有一定的保护性（参见由弘，张壮志，赵莉，等. 脑多头蚴病保护性基因的分离与表达[J]. 中国人兽共患病学报，2008，24(9):　846-850. 另参见张壮志，石保新，由弘，等. 脑多头绦虫膜蛋白45M对羊脑多头蚴病的免疫保护效果[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2009，27(4):　336-339）。

上述研究报道的基因重组抗原免疫宿主后能诱导抵抗脑多头蚴感染，但与其它绦虫疫苗相比，其保护率仍然较低（参见Johnson KS, Harrison GB, Lightowlers MW, et al. Vaccination against ovine cysticercosis using a defined recombinant antigen [J]. Nature，1989, 338(6216): 585-587. 另参见Lightowlers MW, Rolfe R, Gauci CG., et al. Taenia saginata: vaccination against cysticercosis in cattle with recombinant oncosphere antigens [J]. Exp Parasitol，1996, 84(3): 330-338. 另参见Lightowlers MW, Lawrence SB, Gauci CG, et al. Vaccination against hydatidosis using a defined recombinant antigen [J]. Parasite Immunol，　1996,18(9): 457-462. 另参见Lightowlers MW, Jensen O, Fernandez E, et al. Vaccination trials in Australia and Argentina confirm the effectiveness of the EG95 hydatid vaccine in sheep [J]. Int J Parasitol，1999, 29(4): 531-534.）。脑多头带绦虫作为多细胞生物，其生活史复杂且抗原表位众多，尤其是其幼虫期脑多头蚴寄生于宿主大脑，处于免疫隔离状态，单一基因重组抗原疫苗诱导产生的免疫保护力不足以抵抗脑多头带绦虫的感染。因此，为了提高脑多头蚴病疫苗的保护性，有必要从脑多头带绦虫的不同发育期包括六钩蚴和脑多头蚴筛选鉴定保护性抗原基因，用多种保护性抗原联合免疫，以达到理想的保护效果。

发明内容

本发明提供了一种具有免疫保护性的脑多头带绦虫重组蛋白。本发明同时提供了在大肠杆菌中高效表达制备这种重组蛋白的方法。

本发明的这种具有免疫保护性的脑多头带绦虫的重组蛋白是脑多头带绦虫烯醇酶TmENO重组蛋白，其氨基酸序列是GenBank登录号JQ627651的ORF序列编码的氨基酸序列SEQ No. 5。

GenBank登录号为JQ627651的TmENO基因全序列是以脑多头蚴原头节基因组DNA为模板，分别以上下游引物SEQ No.1和SEQ No.2进行PCR扩增得到的。

重组蛋白的制备方法是针对前述GenBank登录号JQ627651的ORF序列编码的氨基酸在大肠杆菌中表达量低的不足，本发明对其编码基因序列按大肠杆菌偏爱密码子进行优化，优化后的基因序列为SEQ No. 6。

基因序列SEQ No. 6的重组蛋白的制备方法是在登陆号为JQ627651的ORF序列的5′端和3′端分别加上酶切位点NdeⅠ/ XhoⅠ后，然后将其按下表进行密码子优化后人工合成，测序获得基因序列SEQ No.6。

接着将合成的SEQ No.6产物与载体pET30a分别用NdeⅠ/XhoⅠ双酶切进行连接，构建重组表达质粒pET30a-TmENO，再将pET30a-TmENO转化到表达菌BL21(DE3) 中进行诱导表达，收集菌体并进行纯化处理得到。其具体的制备方法可以是以脑多头蚴原头节ｃＤＮＡ为模板，分别以上下游引物SEQ No. 3和SEQ No.4进行PCR扩增得到该基因。引物SEQ No. 3和SEQ No.4.可用于扩增经优化后的脑多头蚴重组蛋白的；或者用人工合成该基因编码的蛋白。

本发明的具有免疫保护性的脑多头带绦虫重组蛋白可在制备脑多头蚴病疫苗中的应用。

在本发明相关实验中还发现，所得到的重组蛋白在大肠杆菌表达量较低，为解决这一问题，本发明对其基因进行了大肠杆菌稀有密码子优化，最终合成该基因，所得到的经大肠杆菌偏爱密码子优化后的目的蛋白TmENO可在大肠杆菌中高效表达。

脑多头蚴虫体抗原可诱导免疫绵羊抵抗脑多头蚴感染，说明脑多头蚴虫体抗原中具有免疫保护性抗原组分。为了克隆鉴定这种保护性抗原基因，发明人通过构建脑多头带绦虫脑多头蚴cDNA文库并进行EST序列分析和双向电泳结合质谱分析，均鉴定到与其它蠕虫烯醇酶相似的蛋白（参见李文卉，王建魁，盖文燕，等. 脑多头带绦虫脑多头蚴cDNA表达文库的构建及初步分析[J]，寄生虫与医学昆虫学报，2011, 18 (3)：139-146.另参见Wen-Hui LI, Wan-Zhong JIA, Zi-Gang QU, et al. Proteomic studies of the Taenia multiceps metacestode extract by two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry [J]. Submitted to Korean Journal of Parasitology (under revising).）。烯醇酶作为一种抗原性蛋白，在寄生性蠕虫中已有相关报道。如在细粒棘球蚴绦虫和亚洲带绦虫的烯醇酶基因已被克隆鉴定(参见Gan W, Zhao G, Xu H, et al. Reverse vaccinology approach identify an Echinococcus granulosus tegumental membrane protein enolase as vaccine candidate [J]. Parasitol Res, 2010, 106 (4): 873-882. 另参见杜武英，戴佳琳，黄江，等. 亚洲带绦虫烯醇化酶基因的原核表达、鉴定与组织定位 [J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2009，27(6): 458-462.)。另外，日本血吸虫重组烯醇酶疫苗试验表明该重组抗原能减少免疫动物组织中的荷虫量(Yang J, Qiu C, Xia Y, et al. Molecular cloning and functional characterization of Schistosoma japonicum enolase which is highly expressed at the schistosomulum stage [J]. Parasitol Res, 2010, 107(3):667-677.)，Chen等报道猪蛔虫重组烯醇酶免疫小鼠后可诱导61.1%的减虫率（Chen N, Yuan ZG, Xu MJ, et al. Ascaris suum enolase is a potential vaccine candidate against ascariasis [J]. Vaccine, 2012, 30(23):3478-3482.）。但由于生物多样性及不同生物有关特定蛋白的多样性，尚无法预测烯醇酶是一种普遍的抗原性蛋白，尤其是截止目前烯醇酶在脑多头带绦虫有何作用未见有相关报道。本发明的实验证实TmENO基因表达于脑多头带绦虫成虫、幼虫和六钩蚴三个时期，而已知的脑多头带绦虫免疫保护性抗原Tm16，Tm18仅在脑多头带绦虫六钩蚴时期表达，从TmENO重组蛋白在绵羊免疫保护性试验结果看，相比于对照组，TmENO重组蛋白能明显减少寄生在绵羊绵羊大脑中的包囊数，说明具有免疫保护性。因此将多种具有免疫保护性的脑多头带绦虫基因重组抗原联合起来研制脑多头蚴病疫苗将是未来疫苗研制的策略。

本发明的TmENO重组蛋白是含有433个氨基酸的大分子蛋白，只选择了带6个His标签的pET30a载体系统对其进行表达，所得到的表达产物为可溶性且易纯化的蛋白，表达产物经镍亲和层析柱纯化后，获得高纯度的重组蛋白。本发明的重组表达质粒pET30a-TmENO经大肠杆菌偏爱密码子优化后可在大肠杆菌中高效表达，其表达产量由原来优化前的100 mg/L提高到150 mg/L。

附图说明    

图1 是实施例一中TmENO基因的PCR扩增产物在10 g/L琼脂糖凝胶电泳结果。其中，M: DNA分子质量标准 DL2000；1: TmENO基因PCR产物；2: 未加模板的PCR阴性对照。

图2 是实施例二中重组表达质粒pET30a-TmENO转化到BL21(DE3)进行诱导表达和纯化产物的SDS-PAGE电泳分析。图中M：蛋白质标准分子量标准；1：重组菌未诱导对照；2：重组菌诱导3 h；3：纯化后TmENO重组蛋白。

图3 是实施例二中诱导表达后的可溶性TmENO重组蛋白用不同浓度咪唑缓冲液洗脱后进行SDS-PAGE检测。图中M：蛋白质标准分子量标准；1：10 mmol/L咪唑缓冲液洗脱；2：20 mmol/L咪唑缓冲液洗脱；3：50 mmol/L咪唑缓冲液洗脱；4：100 mmol/L咪唑缓冲液洗脱；5：200 mmol/L咪唑缓冲液洗脱；6：250 mmol/L咪唑缓冲液洗脱；7：300 mmol/L咪唑缓冲液洗脱。

图4 是实施例二中脑多头带绦虫成虫、脑多头蚴原头节抗原、囊液抗原及重组TmENO蛋白的SDS-PAGE电泳图。图中M:分子质量标准；1:成虫抗原；2:原头节抗原；3: 囊液抗原；4: 纯化后的TmENO重组蛋白。

图5 是实施例二中TmENO重组蛋白制备的单抗进行Western blot分析。从图中可以看出抗TmENO重组蛋白的单抗均能识别脑多头带绦虫成虫、脑多头蚴原头节抗原及囊液抗原。图中M:分子质量标准；1:成虫抗原；2:原头节抗原；3: 囊液抗原；4: 纯化后的TmENO重组蛋白。

具体实施方式

本发明以下结合实施例作进一步详述。

一、重组蛋白的制备

（一）脑多头带绦虫TmENO基因的克隆

1. 基因组DNA的提取(用北京天根公司的组织DNA提取试剂盒)：

（1）称取脑多头蚴原头节20～30 mg，加200 μL缓冲液GA，震荡至沉淀悬浮。

（2）加入20 μL蛋白酶K溶液，混匀。在56℃放置，直至组织溶解，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

（3）加入200 μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10 min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

（4）加入200 μL 无水乙醇，充分震荡混匀15 s，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

（5）将上步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中，12，000 rpm离心30 s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

（6）向吸附柱CB3中加入500 μL缓冲液GD，12，000 rpm离心30 s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

（7）向吸附柱CB3中加入700 μL漂洗液PW，12，000 rpm离心30 s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

（8）吸附柱CB3中加入500 μL漂洗液PW，12，000 rpm离心30 s，倒掉废液。

（9）将吸附柱CB3放回收集管中，12，000 rpm离心2 min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

（10）将吸附柱置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50～200 μL洗脱缓冲液TE，室温放置2～5分钟，12，000 rpm离心2 min将溶液收集到离心管中。

基因的扩增

以前述内容提取的脑多头蚴基因组DNA为模板，用上游引物序列SEQ.No.1（5′-AGGCTGTGTATCTAACTAGAAG-3′）和下游引物序列SEQ.No.2（5′-CGCCAGACGACAAGG TACCA-3′）进行PCR扩增得到。PCR反应总体积为50 μL，扩增体系组成为10×PCR反应缓冲液5.0 μL，dNTP混合物（2.5 mmol/L）4.0 μL，上游引物（10 μmol/L）与下游引物（10 μmol/L）各0.2 μL，rTaq DNA 聚合酶（5 U/μL）0.4 μL，脑多头蚴基因组DNA（100 ng /μL）1.0 μL，无菌去离子水补足至50 μL。同时设立不加cDNA模板的反应管作为阴性对照。PCR反应条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35个循环；72℃ 10 min。反应结束后取5 μL PCR产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳观察，结果显示出1条大小约为1.6 kb的特异带（图1）。

本发明的TmENO基因ORF序列稀有密码子的优化蛋白制备是以以前述内容提取的脑多头蚴cDNA为模板，用上游引物序列SEQ.No.3（5′- CATATGTCCATCCAAAAGATT -3′）和下游引物序列SEQ.No.4（5′- CTCGAGTTACAAAGGATTGCGGA -3′）进行PCR扩增得到。

基因的克隆、序列分析

(1) 将上述2的PCR产物用DNA纯化试剂盒进行纯化(北京天根公司DNA纯化试剂盒)，具体步骤如下：

a．柱平衡步骤向吸附柱CB2中加入500 μL的平衡液BL，12，000 rpm离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2重新放回收集管中。

b．估计预纯化的反应液的体积，向其中加入5倍体积的结合液PB，充分混匀。

c．将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB2中，室温放置2 min，12，000 rpm离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。

d．向吸附柱CB2中加入600 μL漂洗液PW，12，000 rpm离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。

e．向吸附柱CB2中加入600 μL漂洗液PW，12，000 rpm离心1 min，倒掉收集管中的废液。

f．将吸附柱CB2放回收集管中，12，000 rpm离心2 min，尽量除去漂洗液。将吸附柱CB2置于室温放置数分钟，彻底晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步实验。

g．将吸附柱CB2放入一个干净的离心管，向吸附膜中间位置悬空滴加60 μL洗脱缓冲液EB，室温放置2 min。12，000 rpm离心2 min收集DNA溶液。

(2) TmENO基因与pMD-18T克隆载体的连接

连接体系为：pMD18-T克隆载体1 μL(50 ng/μL)，TmENO基因PCR纯化产物 4 μL，Solution I  5 μL，混匀后置16℃连接4 h后转化E.coli DH5α感受态细胞，然后涂布于氨苄青霉素抗性LB平板上，37℃培养过夜。挑选转化后的单个菌落，以pMD18-T载体通用引物（M13-47/RV-M）进行PCR扩增，用10g/L琼脂糖凝胶电泳观察结果。

(3) TmENO基因的序列分析 

分别取3个PCR鉴定为阳性的重组菌送上海英骏生物技术有限公司测序，测序结果通过Multiple sequence alignment比对，确定TmENO基因序列并通过 Blast分析确定其ORF序列及其编码的蛋白序列，其序列登录GenBank，登录号为JQ627651。

（二）脑多头带绦虫TmENO重组蛋白的表达

1. TmENO基因ORF序列稀有密码子的优化及人工合成

用软件RARE CODON CALTOR分析TmENO的ORF序列，将序列中的稀有密码子优化，并在ORF序列两边加上酶切位点NdeⅠ/ XhoⅠ后进行人工合成，测序得到SEQ №6。其具体做法是以脑多头蚴cDNA为模板，用上游引物序列SEQ.No.3（5′- CATATGTCCATCCAAAAGATT-3′）和下游引物序列SEQ.No.4（5′- CTCGAGTTACAAAGGATTGCGGA -3′）进行PCR扩增得到。

重组表达质粒的构建与鉴定

分别用NdeⅠ/ XhoⅠ对载体pET30a及人工合成的目的基因TmENO进行双酶切，二者的酶切体系分别为：a. TmENO目的基因20 μL，10×buffer H  4 μL，NdeⅠ 2 μL，XhoⅠ 2 μL，BSA 2 μL，Triton 2 μL，灭菌双蒸水8 μL；b. pET30a载体质粒12 μL，10×buffer H 4 μL，NdeⅠ 2 μL，XhoⅠ 2 μL，BSA 2 μL，Triton 2 μL，灭菌双蒸水16 μL。将酶切混合物分别离心混匀后，置37℃水浴酶切过夜。酶切产物用DNA纯化试剂盒进行纯化(北京天根公司DNA纯化试剂盒)，然后与pET30a质粒进行连接。连接体系为：TmENO基因酶切回收产物10 μL，pET30a酶切回收产物7 μL，10×Ligation buffer 2.5 μL，T4 DNA连接酶（3 U/μL）1 μL，补充水至25 μL，混匀后置4℃连接过夜，然后转化到E. coli DH5α感受态细胞中，置37 ℃培养12～18 h后，挑取菌落进行阳性重组菌PCR鉴定，并将测序验证正确的阳性菌培养并用质粒提取试剂盒提取质粒，测序鉴定，得到其基因序列为SEQ No 6。将鉴定正确的重组表达质粒命名为pET30a-TmENO。

重组蛋白的表达

将前一步骤得到的pET30a-TmENO重组质粒转化到BL21(DE3)感受态细胞中，挑取单个菌落接种于含有卡那霉素（100 μg/mL）的LB 液体培养基37℃培养过夜培养，次日取10 mL 菌液接种于1000 mL LB培养基（含卡那霉素）中，菌液培养至吸光度OD600＝0.6，加入终浓度1 mmol/L IPTG，37℃培养4 h后，离心收集菌体，加入样品处理液，煮沸5 min,而后进行SDS-PAGE分析。

经对比实验表明，本发明的TmENO重组蛋白是含有433个氨基酸的大分子蛋白，只选择了带6个His标签的pET30a载体系统对其进行表达，所得到的表达产物为可溶性且易纯化的蛋白，表达产物经镍亲和层析柱纯化后，获得高纯度的重组蛋白。本发明的重组表达质粒pET30a-TmENO经大肠杆菌偏爱密码子优化后可在大肠杆菌中高效表达，其表达产量由原来优化前的100 mg/L提高到150 mg/L。

重组蛋白的纯化

将pET30a-TmENO/BL21(DE3)重组菌增菌并进行大量诱导表达，离心富集细菌菌体，用pH7.4 PBS缓冲液悬浮，反复冻融3次，超声裂解，4oC，12，000×g离心15 min，分别收集裂解液的上清及沉淀，用SDS-PAGE分析重组蛋白的表达形式。然后将可溶性的蛋白上清用HIS·Tag镍琼脂糖凝胶说明书纯化。蛋白纯化步骤具体如下：  

a.  HIS·Tag镍琼脂糖凝胶装柱。 

用缓冲液1（50 mM pH7.4的PBS缓冲液）平衡5个柱床体积，控制流速为流速为2 mL/min。

将诱导表达后的可溶性重组蛋白上清用0.45 μm滤膜过滤后，加入HIS·Tag镍琼脂糖凝胶柱中，控制流速为1 mL/min。

用缓冲液1洗5个柱床体积，控制流速为2 mL/min。

用分别含10、20、50、100、200、300、400 mmol/L咪唑的PBS缓冲液1进行阶段洗脱，控制流速为2 mL/min，分别收集各阶段洗脱峰。

将纯化后的重组蛋白根据SDS-PAGE蛋白电泳检测确定纯度后，用紫外分光光度计测定浓度，?80℃保存备用。

（三）Western-blot分析TmENO蛋白

将脑多头带绦虫、脑多头蚴虫体蛋白、囊液抗原以及TmENO重组蛋白SDS-PAGE电泳后，转移至NC膜上，用含5%脱脂奶粉的TBS (10 mM Tris-HCl，pH 7.4，150 mM NaCl)置4℃过夜封闭膜，TBST（TBS含0.05% Tween 20）洗三次，每次5 min；将抗TmENO单抗用TBST以1:200 (v/v)稀释后，室温作用1 h，用TBST洗三次；将兔抗鼠IgG-AP用TBST以1:4000 (v/v) 稀释，室温作用1 h，用TBST洗三次；最后用NBT/BCIP底物显色。同时用健康小鼠血清作为阴性对照。从结果可以看出TmENO重组蛋白制备的单抗均能特异性识别脑多头带绦虫成虫、脑多头蚴原头节抗原、囊液抗原及TmENO重组蛋白中的约47.3 kDa的条带，说明烯醇酶蛋白存在于脑多头带绦虫成虫、脑多头蚴原头节及囊液中。

二、TmENO重组蛋白的免疫保护性试验

1. 脑多头带绦虫虫卵的收集

将新鲜收集的脑多头蚴原头节饲喂给已驱虫的犬，感染三个月后，安乐处死犬，取小肠，收集脑多头带绦虫成虫，用生理盐水洗涤干净后，将其末端3～5节成熟孕卵节片用生理盐水洗涤后剪碎使虫卵释放，用100目铜网过滤除去虫体体壁碎片，8000×g离心10 min，沉淀为虫卵，光学显微镜下计数备用。

免疫程序

考虑到对所表达的TmENO目标蛋白进行密码子优化，是为提高其蛋白产量，而对其免疫保护性不产生影响，所以我们应用优化后的蛋白在相同的条件下进行表达且纯化后按以下程序进行免疫：

14只绵羊，分两组：一组为TmENO重组蛋白免疫组（6只），另一组为感染对照组（8只）。免疫组绵羊颈部皮下注射免疫2 mL的免疫原（50 μg TmENO重组蛋白+1 mg Quil A佐剂），共免疫三次，每次免疫间隔两周。

重组蛋白的免疫保护性分析

末次免疫后2周，应用纯化后的TmENO重组蛋白为包被抗原，按常规间接ELISA方法检测免疫绵羊血清抗体滴度，确定产生高滴度的特异抗体后对免疫组和对照组绵羊同时经口感染2500个脑多头带绦虫虫卵，4～5个月后剖检绵羊开颅检查脑多头蚴包囊的数目及原头节活力状况，比较免疫组和对照组脑多头蚴包囊形成数目，应用公式计算减囊率： 减虫率（%）= [(对照组平均包囊数-免疫组平均包囊数）/对照组平均包囊数 ]×100%。

免疫试验结果如下：

结果攻击感染虫卵后后1～2个月，免疫组绵羊先后死去2只，感染对照组绵羊先后死去4只。剖检免疫组剩余的4只绵羊大脑，发现2只无包囊，另外2只绵羊则发现1～2个大小为5～15 mm的包囊，并且整个大脑有多处和脑组织融合在一起的钙化灶，脑多头蚴原头节模糊不清。感染对照组剩余的4只绵羊剖检均发现数目不等的包囊，与免疫组相比包囊囊液清亮，所有原头节饱满、活力旺盛，而且包囊数明显多于免疫组，经计算包囊减虫率为72.7%。用SPASS统计学分析，TmENO重组蛋白免疫组与感染对照组相比 P<0.05，差异显著。本发明的脑多头蚴TmENO重组蛋白能诱导绵羊产生较强的免疫保护力，是潜在的疫苗候选抗原。

<110>  中国农业科学院兰州兽医研究所

<120>  具有免疫保护性的脑多头带绦虫烯醇酶TmENO重组蛋白

<160>  6

 

<210>  1

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列（TmENO基因的扩增上游引物）

<400> 

aggctgtgta tctaactaga ag                                               22

 

<210>  2

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工引物（TmENO基因的扩增下游引物）

<400>

cgccagacga caaggtacca                                                  20

 

<210>  3

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工引物（优化后TmENO 基因ORF编码区扩增上游引物）

<400>

catatgtcca tccaaaagat t                                                21

 

<210>  4

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工引物（优化后TmENO 基因ORF编码区扩增下游引物）

<400>

ctcgagttac aaaggattgc gga                                              23

 

<210>  5

<211>  433

<212>  PRT

<213>  TmENO基因编码的蛋白序列

<400>

Met Ser Ile Gln Lys Ile His Ala Arg Gln Ile Phe Asp Ser Arg

1                5                   10                 15

Gly Asn Pro Thr Val Glu Val Asp Leu Thr Thr Ala Lys Gly Met

                20                   25                  30             

Phe Arg Ala Ala Val Pro Ser Gly Ala Ser Thr Gly Val His Glu

                35                  40                  45              

Ala Val Glu Leu Arg Asp Gly Asp Lys Asn Ala Tyr Met Gly Lys

                50                   55                  60

Gly Val Leu Asn Ala Val Lys Asn Val Asn Glu Val Ile Ala Pro

                65                  70                   75

Ala Leu Leu Lys Glu Lys Phe Val Val Thr Asp Gln Glu Lys Ile

                80                  85                   90

Asp Glu Phe Met Ile Lys Leu Asp Gly Ser Pro Asn Lys Gly Lys

                95                  100                  105

Leu Gly Ala Asn Ala Ile Leu Gly Val Ser Leu Ala Val Cys Lys

                110                 115                  120

Ala Gly Ala Ala Glu Lys Gly Val Pro Leu Tyr Arg His Ile Ala

                125                 130                  135

Asp Leu Ala Gly Asn Lys Asp Val Val Leu Pro Val Pro Ser Phe

                140                 145                  150

Asn Val Leu Asn Gly Gly Ser His Ala Gly Asn Lys Leu Ala Met

                155                 160                  165

Gln Glu Phe Met Ile Leu Pro Thr Gly Ala Lys Asn Phe Thr Glu

                170                 175                 180

Ala Met Lys Met Gly Thr Glu Val Tyr His His Leu Lys Ser Val

                185                 190                 195

Ile Lys Gly Lys Tyr Gly Leu Asp Ala Cys Asn Val Gly Asp Glu

                200                  205                210

Gly Gly Phe Ala Pro Asn Ile Gln Asp Asn Met Glu Gly Leu Glu

               215                   220                225

Leu Leu Lys Thr Ala Ile Asp Arg Ala Gly Tyr Thr Gly Lys Val

                230                 235                 240

Lys Ile Gly Met Asp Val Ala Ala Ser Glu Phe Tyr Gln Asn Gly

                245                 250                 255

Lys Tyr Asn Leu Asp Phe Lys Asn Pro Ala Ala Ala Ala Ser Ser

                260                 265                 270

Ile Val Pro Gly Ser Lys Leu Ala Glu Ile Tyr Leu Glu Met Leu

               275                  280                 285   

Ser Lys Tyr Pro Ile Val Ser Ile Glu Asp Pro Phe Asp Gln Asp

                290                 295                 300

Asp Trp Ala Ala Trp Thr Ala Phe Asn Ala Lys Ala Gly Ile Gln

                305                 310                 315

Ile Val Gly Asp Asp Leu Thr Val Thr Asn Pro Glu Arg Val Gln

                320                 325                 330

Gln Ala Ile Asp Lys Lys Ala Cys Asn Ala Leu Leu Leu Lys Val

                335                 340                 345

Asn Gln Ile Gly Ser Val Thr Glu Ser Ile Lys Ala Cys Lys Met

                350                 355                 360

Ser Arg Ala Ala Gly Trp Gly Val Met Val Ser His Arg Ser Gly

                365                 370                 375

Glu Thr Glu Asp Ser Thr Ile Ala Asp Ile Val Val Gly Leu Arg

                380                 385                 390

Thr Gly Gln Ile Lys Thr Gly Ala Pro Cys Arg Ser Glu Arg Leu

                395                 400                 405

Ala Lys Tyr Asn Gln Leu Leu Arg Ile Glu Glu Glu Leu Gly Ser

                410                 415                 420

Lys Ala Val Tyr Ala Gly Glu His Phe Arg Asn Pro Leu       

                425                 430         433

 

<210>  6

<211>  1302

<212>  DNA

<213>  优化后的TmENO基因序列

<400>

 atgtccatcc aaaagattca tgctcgtcag atcttcgaca gtcgtggtaa tcctactgtt 60

 gaggttgatc ttaccaccgc caagggtatg tttcgcgctg ccgttccttc tggtgcctcc 120

 actggtgtac atgaagcggt tgaactccgc gatggtgaca aaaatgccta catgggcaag 180

 ggtgttctca atgccgtcaa gaacgtcaat gaagtcatcg ctcctgcttt gctcaaggag 240

 aaattcgtcg tcaccgacca ggagaagatc gatgagttca tgatcaagct ggatggttca 300

 ccaaacaaag gcaagctggg tgcaaacgcc atcttgggtg tttctctggc agtctgcaag 360

 gctggtgctg ccgagaaggg tgttcctctc taccgccaca ttgctgactt ggctggtaac 420

 aaggacgtcg tccttcctgt gccttcattc aacgtgctca atggtggcag ccacgctggt 480

 aacaagctgg ctatgcagga gttcatgatt cttcctaccg gtgccaagaa cttcacagaa 540

 gccatgaaga tgggcaccga ggtataccat cacctcaagt ccgttatcaa gggcaaatac 600

 ggtctggacg cctgtaacgt tggcgatgag ggtggctttg ctcctaacat ccaggacaat 660

 atggagggtc ttgaactcct caagaccgcc attgaccgcg caggctacac cggcaaggtc 720

 aagatcggca tggatgtggc cgcctctgaa ttctaccaaa acggcaagta taatctggac 780

 ttcaagaatc ctgcggcggc tgcgtcttcc atcgttcctg gttcgaagct ggctgagatc 840

 tacttggaga tgctttccaa atacccaatt gtctccattg aggatccttt cgatcaagat 900

 gattgggccg cctggactgc ctttaacgcc aaggctggta ttcagattgt tggtgacgat 960

 ttgactgtga caaaccctga gcgtgtgcag caagctatcg acaagaaggc ttgcaacgcc 1020

 cttctgctga aggtgaatca gatcggttcg gtgactgagt ctatcaaggc ttgcaagatg 1080

 tctcgcgctg ctggttgggg cgtaatggtg tcgcatcgct caggtgaaac tgaggactcc 1140

 acaattgctg acatcgttgt cggtctccgc accggtcaga tcaagactgg tgcgccatgt 1200

 cgctcagagc gtcttgctaa gtacaaccag cttctgcgta ttgaggagga acttggctct 1260

 aaggccgtct acgctggcga gcacttccgc aatcctttgt aa                    1302

Claims (8)

1. 一种具有免疫保护性的脑多头带绦虫的重组蛋白，其特征是这种具有免疫保护性的重组蛋白是脑多头带绦虫烯醇酶TmENO重组蛋白，其氨基酸序列是GenBank登录号JQ627651的ORF序列编码的氨基酸序列SEQ No. 5。

2.根据权利要求1 所述的具有免疫保护性的脑多头带绦虫重组蛋白，其特征在于对其编码基因序列按大肠杆菌偏爱密码子进行优化，优化后的基因序列为SEQ No. 6。

3.权利要求1所述的重组蛋白的制备方法，其特征在于以脑多头蚴原头节基因组DNA为模板，分别以上下游引物SEQ No. 1和SEQ No.2进行PCR扩增得到该基因全序列。

4.权利要求2所述的重组蛋白的制备方法，其特征在于：在登陆号为JQ627651的ORF序列的5′端和3′端分别加上酶切位点NdeⅠ/ XhoⅠ后，然后将其按下表进行密码子优化,

后人工合成基因SEQ No.6，接着将合成的SEQ No.6 的DNA产物与载体pET30a分别用NdeⅠ/XhoⅠ双酶切进行连接，构建重组表达质粒pET30a-TmENO，再将pET30a-TmENO转化到表达菌BL21(DE3) 中进行诱导表达，收集菌体并进行纯化处理得到。

5.根据权利要求4所述的重组蛋白的制备方法，其特征在于以脑多头蚴原头节cDNA为模板，分别以上下游引物SEQ No. 3和SEQ No.4进行PCR扩增得到该基因编码的蛋白。

6.根据权利要求4所述的重组蛋白的制备方法，其特征是人工合成该基因编码的蛋白。

7.用于扩增权利要求2的重组蛋白的引物SEQ No. 3和SEQ No.4。

8.权利要求1或2所述的具有免疫保护性的脑多头带绦虫重组蛋白在制备脑多头蚴病疫苗中的应用。

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