CN103131711A - 马铃薯pinⅡ基因5’UTR及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及马铃薯pinⅡ基因5’UTR及其应用，所述5’UTR的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，或该序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸且同等功能的由其衍生的核苷酸序列。本发明从克隆马铃薯pinⅡ基因5’UTR入手，通过对马铃薯pinⅡ基因5’UTR结构和序列的分析，验证了马铃薯pinⅡ基因5’UTR的功能。将本发明5’UTR插入到CaMV35S和GUS基因之间构建重组表达载体，并转化烟草和拟南芥。GUS酶活性测定结果表明：本发明的5’UTR能够增强GUS基因的表达，为植物抗逆基因工程研究提供了新的表达调控元件，也为下一步植物遗传改良和产业化研究奠定了基础。

Description

马铃薯pinⅡ基因5’UTR及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学、基因工程技术领域，具体地说，涉及马铃薯pinⅡ基因5’非翻译区（5’UTR）及其应用。

背景技术

随着生命科学、基因组学、信息学等学科的发展，转基因技术研究日新月异，转基因作物种植面积逐年增加。转基因作物中目的基因的表达强弱，很大程度上影响着转基因作物的应用。因此，在过去的20年中科研工作者一直致力于植物基因表达调控机制的研究。基因表达调控可分为以下五个水平：核酸水平、转录水平、转录后水平、翻译水平和翻译后水平。由于转录水平在很大程度上决定着基因表达的强弱，过去大多数研究集中在开发强的启动子和增强子。最近几年逐渐认识到转录后水平对基因表达调控的重要性，如转录后基因沉默。然而，关于5’非翻译区（5’UTR）在翻译水平对基因表达调控的报道还很少。

mRNA翻译成蛋白质包括三个步骤：起始、延伸和终止。普遍认为翻译起始是蛋白合成过程的限速步骤。而翻译起始效率很大程度上与基因的5’UTR相关。5’UTR中二级结构的稳定性和位置严重影响着mRNA的翻译效率。碱基AU含量高时，不利于二级结构的形成，便于核糖体顺利的扫描mRNA，发现AUG起始密码子，起始翻译。反之亦然。拟南芥多聚核糖体复合物中mRNA的DNA微阵列显示：5’UTR中碱基GC含量高的通常翻译效率较低。5’UTR的长度也影响翻译效率。太短的5’UTR（<25nt）可能会使40S核糖体亚基错过第一个起始密码子AUG，降低翻译的保真度。而太长的5’UTR（>175nt）会增加形成二级结构的几率，阻碍核糖体的结合和扫描，进而影响翻译效率。通常合适的5’UTR长度应在50-75nt之间。

目前，报道的在植物中起翻译调控作用的5’UTR大多来源于病毒，如烟草花叶病毒、马铃薯S病毒。植物来源起翻译调控作用的5’UTR也有一些报道，如矮牵牛Cab22L、绿豆VR-ACS1、烟草NtADH、水稻OsADH，其中矮牵牛Cab22L5’UTR作为翻译增强序列已用于许多遗传研究和转基因作物的研发。分离鉴定植物来源的增强翻译效率的5’UTR对培育转基因作物具有重要意义。一方面提高翻译水平可以降低植物能量损耗，因为基因的转录和mRNA运出细胞核都需要能量；另一方面从生物安全角度考虑，植物来源的5’UTR培育的转基因作物更容易获得审批和被公众接受。

研究中发现：分别用CaMV35S启动子和马铃薯蛋白酶抑制剂Ⅱ（PINⅡ）基因启动子驱动GUS基因在转基因烟草和拟南芥中表达，GUS酶活测定结果显示PINⅡ基因启动子能够更强地驱动GUS基因的表达，然而RT-PCR检测mRNA水平显示CaMV35S启动子能够更强地驱动GUS基因转录。因此，推测马铃薯PINⅡ基因的5’UTR能够增强翻译效率。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有高效翻译活性的马铃薯蛋白酶抑制剂Ⅱ（PINⅡ）基因的5’非翻译区（5’UTR）及其应用。

为了实现本发明目的，本发明的马铃薯pinⅡ基因5’UTR，其核苷酸序列为：i）SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；或ii）SEQ ID No.1所示核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸且同等功能的由i）衍生的核苷酸序列。如在不改变5’UTR功能的情况下，将SEQ ID No.1所示核苷酸序列的3’端9bp（TTATCCATC）替换成16bp（GGGTGGTCAGTCCCTT）而形成的SEQ ID No.2所示核苷酸序列。

本发明还提供含有上述马铃薯pinⅡ基因5’UTR的表达盒。

本发明还提供含有上述马铃薯pinⅡ基因5’UTR的载体，所述载体为植物表达载体，例如植物双元表达载体等。

本发明还提供含有上述表达盒或载体的宿主细胞。

本发明还提供含有上述马铃薯pinⅡ基因5’UTR的转化植物细胞。

本发明还提供马铃薯pinⅡ基因5’UTR在增强下游基因表达中的应用，将马铃薯pinⅡ基因5’UTR可操作地插入到启动子（例如烟草花叶病毒CaMV35S启动子）和目的基因之间，从而增强下游目的基因的表达。优选下游基因为GUS基因。

本发明进一步提供马铃薯pinⅡ基因5’UTR在制备转基因植物中的应用。例如，可以将马铃薯pinⅡ基因5’UTR可操作地插入到启动子和目的基因之间，构建得到表达盒，进一步可将该表达盒导入植物表达载体，将获得的重组表达载体通过比如，农杆菌介导、基因枪法以及花粉管通道等方式转化植物，获得转基因植物。从而可以通过引入抗虫、抗病、抗逆等基因，培育出抗虫、抗病、抗逆植物，提高植物抗虫、抗病和/或抗逆活性。本发明提供的马铃薯pinⅡ基因5’UTR可用于制备本领域公知的转基因植物，用于控制外源或内源基因的表达，所述植物为双子叶植物或单子叶植物，如烟草、拟南芥等。

本发明从克隆马铃薯pinⅡ基因5’UTR入手，通过对马铃薯pinⅡ基因5’UTR结构和序列的分析，验证了马铃薯pinⅡ基因5’UTR的功能。将本发明5’UTR插入到CaMV35S和GUS基因之间构建重组表达载体，并转化烟草和拟南芥。GUS酶活性测定结果表明：本发明的5’UTR能够增强GUS基因的表达，为植物抗逆基因工程研究提供了新的表达调控元件，也为下一步植物遗传改良和产业化研究奠定了基础。

附图说明

图1为本发明实施例1中载体pCAMBIA1300-pinⅡ-GUS的构建流程示意图。

图2为本发明实施例1中UTR1-gusA PCR扩增结果。

图3为本发明实施例1中pCAMBIA1300-UTR1-GUS表达载体的构建流程示意图。

图4为本发明实施例2中pCAMBIA1300-UTR2-GUS表达载体的构建流程示意图。

图5为本发明实施例4中转基因烟草叶片和转基因拟南芥叶片GUS酶活定量分析结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（New York:Gold Spring Harbor Laboratory Press,1989），或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1pCAMBIA1300-UTR1-GUS表达载体的构建

1.1马铃薯pinⅡ基因启动子的克隆

根据登录号X04118在GenBank中查询马铃薯蛋白酶抑制剂Ⅱ基因核酸序列。根据此核酸序列设计引物扩增马铃薯pinⅡ启动子片段。设计的引物为：正向引物5'-AACTGCAGCCCAATTCAAAGAACTTG-3'，5'端引入PstI酶切位点，反向引物5'-CGCGGATCCTTAATTAGTACTGCCTCT-3'，5'端引入BamHI酶切位点。以马铃薯基因组DNA为模板，PCR扩增pinⅡ启动子序列，得到928bp的PCR产物。

PCR反应体系：

PCR反应程序：

将扩增得到的PCR产物连接到pGEM-T easy vector载体（Promega公司）上，并利用此载体上的T7和SP6引物对扩增片段进行测序，测序结果显示克隆正确，序列如SEQ ID No.3所示。

1.2pCAMBIA1300-pinⅡ-GUS表达载体的构建

用HindIII和EcoRI双酶切质粒pBI221（上海北诺生物科技有限公司），回收35S-GUS-NOS片段，连接到用HindIII和EcoRI双酶切的pCAMBIA1300（上海北诺生物科技有限公司）上，构建质粒pCAMBIA1300-221。将含有pinⅡ启动子片段的T载体用PstI和BamHI双酶切，酶切产物跑琼脂糖凝胶电泳，回收928bp的片段。同时用Pst1和BamH1双酶切pCAMBIA1300-221载体，酶切产物跑琼脂糖凝胶电泳，回收11kb片段。将回收的启动子片段和载体片段用T4DNA连接酶（Promega公司）连接，使马铃薯pinⅡ启动子取代pCAMBIA1300-221载体上驱动GUS基因表达的CaMV35S启动子，将该载体命名为pCAMBIA1300-pinⅡ-GUS。载体构建流程示意图如图1所示。

1.3pCAMBIA1300-UTR1-GUS表达载体的构建

根据构建的植物表达载体pCAMBIA1300-pinⅡ-GUS的核苷酸序列设计引物：正向引物5'–GGGATCCACACTCTTCACCCCAAAATTAAAAGAAAAAGAGGCAGTACTAATTAATTATCCATCATGTTACGTCCTGTAGAAAC-3'，5'端引入BamHI酶切位点，反向引物5'-CGAGCTCGGTAGCAATTC-3'，5'端引入SacI酶切位点。以pCAMBIA1300-pinⅡ-GUS质粒为模板，PCR扩增得到1.9kb产物（图2）。

PCR反应体系：

PCR反应程序：

将扩增得到的PCR产物连接到pGEM-T easy vector载体（Promega公司）上，并利用此载体上的T7和SP6引物对扩增片段进行测序，测序结果显示扩增片段正确，序列如SEQ ID No.8所示。

将含有上述片段的T载体用BamHI和SacI双酶切，酶切产物跑琼脂糖凝胶电泳，回收1.9kb的片段。同时用BamHI和SacI双酶切pCAMBIA1300-221载体，酶切产物跑琼脂糖凝胶电泳，回收10kb片段。将回收的上述两片段用T4DNA连接酶（Promega公司）连接，构建新的表达载体，将该载体命名为pCAMBIA1300-UTR1-GUS。载体构建流程示意图如图3所示。

实施例2pCAMBIA1300-UTR2-GUS表达载体的构建

根据SEQ ID No.1序列，人工合成两条互补的寡核苷酸片段5'-GATCCACACTCTTCACCCCAAAATTAAAAGAAAAAGAGGCAGTACTAATTAA-3'和5'-TTAATTAGTACTGCCTCTTTTTCTTTTAATTTTGGGGTGAAGAGTGTG-3'。

将该两条寡核苷酸片段退火，形成双链寡核苷酸片段。用BamHI和SmaI双酶切pCAMBIA1300-221载体，酶切产物跑琼脂糖凝胶电泳，回收12kb片段。将上述两片段用T4DNA连接酶（Promega公司）连接，构建新的表达载体，将该载体命名为pCAMBIA1300-UTR2-GUS（即含有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列的5’UTR的表达载体，载体构建流程如图4所示）。

退火过程如下：将合成的两条寡核苷酸片段溶解后，分别稀释成浓度为10μM。取等体积混匀后，置于PCR仪（Bio-Rad公司）上95℃10分钟，关闭PCR仪，自然冷却至室温。

实施例3转基因烟草和拟南芥的获得

3.1表达载体转化烟草

取200μL农杆菌LBA4404感受态细胞，分别加入lμg实施例1和2构建的质粒DNA，以pCAMBIA1300-221为阳性对照。液氮中速冻1分钟，37℃水浴5分钟，冰浴2分钟，然后加入l ml YEB培养基，28℃120rpm振荡培养4小时；4000rpm离心2分钟，弃上清，加入0.l mlYEB培养基重新悬浮细胞，涂布于含有100μg/mL卡那霉素、125μg/mL链霉素和50μg/mL利福平的YEB平板上，28℃培养约48小时。挑取平板上长出的单菌落，接种于含有100μg/mL卡那霉素、125μg/mL链霉素和50μg/mL利福平的YEB液体培养基中，28℃振荡培养过夜。以菌液为模板进行PCR扩增鉴定。

将含有植物表达载体的农杆菌菌液按1：100的体积比接种于含有100μg/mL卡那霉素、125μg/mL链霉素和50μg/mL利福平的YEB液体培养基中，28℃220rpm振荡培养至OD600为0.6-0.8。4000rpm，室温离心10分钟，用MS盐溶液(pH5.8)重新悬浮菌体，使用时用MS盐溶液(pH5.8)稀释至OD600为0.2。

无菌烟草叶片切去边缘和主要叶脉，切成0.5cm×0.5cm的小块，在农杆菌菌液中浸泡10分钟；用无菌滤纸吸干植物材料表面的菌液，转入上铺一层滤纸的含有30g/L蔗糖和8g/L琼脂粉的MS基本培养基，24℃暗培养三天。然后将材料转到含有抗生素的分化培养基(MS+3mg/L6-BA+0.2mg/L NAA+50mg/L潮霉素+250μg/mL塞孢霉素+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉)。2周后用分化培养基继代一次。待抗性芽生长至2-3cm高时，切下小芽转入生根培养基中（MS+50mg/L潮霉素+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉）。2周后小芽生根，即可驯化移栽，提取DNA进行PCR鉴定。获得转pCAMBIA1300-UTR1-GUS、pCAMBIA1300-UTR2-GUS和pCAMBIA1300-221载体的烟草各20余株。

3.2表达载体转化拟南芥

取200μL农杆菌GV3101感受态细胞，分别加入lμg实施例1和2构建的质粒DNA，以pCAMBIA1300-221为阳性对照。液氮中速冻1分钟，37℃水浴5分钟，冰浴2分钟，然后加入l ml YEB培养基，28℃120rpm振荡培养4小时；4000rpm离心2分钟，弃上清，加入0.l mlYEB培养基重新悬浮细胞，涂布于含有100μg/mL卡那霉素和50μg/mL利福平的YEB平板上，28℃培养约48小时。挑取平板上长出的单菌落，接种于含有100μg/mL卡那霉素和50μg/mL利福平的YEB液体培养基中，28℃振荡培养过夜。以菌液为模板进行PCR扩增鉴定。

将200μL鉴定阳性的农杆菌菌液涂布于含有100μg/mL卡那霉素和50μg/mL利福平的YEB平板上。28℃培养40小时，用涂布器刮取菌层至一小烧杯中，用40ml YEB液体培养基悬浮。4000rpm离心10分钟，弃上清。然后用YEB液体培养基重悬，稀释OD600为0.8-1.0，用花序浸染法转化拟南芥。将收取的T0代转基因植株的种子铺于含20mg/L潮霉素、30g/L蔗糖和8g/L琼脂粉的MS培养基上筛选，存活下来的苗为转基因阳性苗，提取DNA进行PCR鉴定。获得转pCAMBIA1300-UTR1-GUS、pCAMBIA1300-UTR2-GUS和pCAMBIA1300-221载体的拟南芥各20余株。

实施例4转基因烟草和拟南芥的GUS酶活测定

取转基因烟草6周的幼嫩叶片和转基因拟南芥4周的幼嫩叶片，在液氮中研磨成粉末，加入GUS蛋白提取缓冲液（50mM磷酸钠缓冲液，pH7.0、10mM Na·EDTA、0.1%Triton X-100、10mMβ-巯基乙醇）混匀。4℃13000rpm离心10分钟，取上清用于GUS酶活分析。GUS酶活高低用GUS蛋白粗提液催化底物4-甲基伞形酮-β-D-葡糖醛酸苷（4-MUG）生成产物四甲基伞形酮(4-MU)的量进行测定。用多功能酶标仪Varioskan Flash（Thermo公司）测定荧光值，用酶标仪Model680（Bio-Rad公司）以考马斯亮蓝法测定GUS蛋白粗提液中总蛋白含量。测定结果显示：马铃薯pinⅡ基因5’UTR（SEQ ID No.1和SEQ ID No.2）能够增强基因的表达（图5）。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.马铃薯pinⅡ基因5’UTR，其特征在于，其核苷酸序列为：

i）SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；或

ii）SEQ ID No.1所示核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸且同等功能的由i）衍生的核苷酸序列。

2.含有权利要求1所述马铃薯pinⅡ基因5’UTR的表达盒。

3.含有权利要求1所述马铃薯pinⅡ基因5’UTR的载体。

4.含有权利要求2所述表达盒或权利要求3所述载体的宿主细胞。

5.权利要求1所述的马铃薯pinⅡ基因5’UTR在增强下游基因表达中的应用，其特征在于，将马铃薯pinⅡ基因5’UTR可操作地插入到启动子和目的基因之间，从而增强下游目的基因的表达。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述启动子为烟草花叶病毒CaMV35S启动子。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，下游基因为GUS基因。

8.权利要求1所述马铃薯pinⅡ基因5’UTR在制备转基因植物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述植物为双子叶植物或单子叶植物。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述植物为烟草、拟南芥。

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