CN103083342A

CN103083342A - 黄烷类化合物在制备抗补体药物中的用途

Info

Publication number: CN103083342A
Application number: CN2011103387474A
Authority: CN
Inventors: 陈道峰; 金家宏
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2011-10-31
Filing date: 2011-10-31
Publication date: 2013-05-08
Anticipated expiration: 2031-10-31
Also published as: CN103083342B

Abstract

本发明属制药领域，涉及黄烷类化合物在制备抗补体药物中的新用途。本发明应用现代药理筛选方法，对植物药中的抗补体活性物质进行研究，从鸭跖草科植物鸭跖草的正丁醇提取物和蓼科植物金荞麦的正丁醇提取物分离得到黄烷类化合物，并通过体外抗补体活性评价试验证实其对补体系统的经典途径和旁路途径具有很强的抑制作用。所述化合物对补体系统的经典途径抑制作用的CH₅₀为0.13±0.03～0.78±0.06mM，对旁路途径抑制作用的AP₅₀为0.12±0.01～1.00±0.15mM。所述化合物可用于制备抗补体药物。

Description

黄烷类化合物在制备抗补体药物中的用途

技术领域

本发明属中药制药领域，涉及黄烷类化合物在制备抗补体药物中的新用途。

背景技术

现有技术公开了补体系统的过度激活会引发系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、急性呼吸窘迫综合征等多种疾病。抗补体药物研究多年来一直是世界药学研究的热点和重点。目前临床实践对此类疾病尚无理想的治疗药物，因此，临床上急需高效、低毒、专一的新型补体抑制剂。研究表明，直接从天然产物中研究开发补体抑制剂的成本低，并且大多数活性成分作为天然产物的一部分可以直接被机体消化吸收，因此近年来从天然来源中寻找新的具有抗补体活性的药物受到人们越来越多的关注。国内外的学者从包括海洋生物在内的天然产物中分离得到大量的具有补体系统抑制作用的单体化合物，为抗补体药物的研究与开发提供了广阔的前景。

鸭跖草科(Commelinaceae)鸭跖草属(Commelina)植物主要分布于热带，少数种产于亚热带和温带地区。中国产13属49种，多分布于长江以南各省，尤以西南地区为盛。鸭跖草为鸭跖草属(Commelina)植物鸭跖草(Commelinacommunis Linn.)的全草，性温味辛，专入脾胃两经，具有清热解毒，凉血，利尿的功效，在临床上可单独或与其他中药合用用于治疗流行性感冒、急性扁桃腺炎、咽炎、水肿、小儿肺炎、泌尿系感染、急性肠炎、黄疸型肝炎、高血压、痢疾、毒蛇咬伤、疮疗肿毒、痔疮等疾病。近年来对鸭跖草的研究仅集中在化学成分的分离及结构鉴定上，从中分离得到了一些黄酮类、甾体、萜类等化合物，但迄今为止，尚未见黄烷类化合物对补体系统具有抑制作用的报道。

金荞麦为蓼科(Polygonaceae)荞麦属(Fagopyrum)植物金荞麦(Fagopyrumdibotrys(D.Don)Hara)的干燥根茎。生于荒地、路旁、河边阴湿地。具有清热解毒、活血消痈、祛风除湿疮毒、蛇虫咬伤等功效。主治肺热咳喘、咽喉肿痛、痢疾、风湿痹证、跌打损伤和痈肿癌等。现代药理研究证明其具有抗癌和抑菌等作用。化学成分研究表明其中主要成分为黄酮类、单宁类化合物及黄烷类化合物等，但未见其对补体系统具有抑制作用的报道。

发明内容

本发明的目的是提供新的具有抗补体活性的物质，具体涉及鸭跖草、金荞麦中的黄烷类化合物其具有抗补体活性，所述的黄烷类化合物包括儿茶素-3-O-β-D-(2-肉桂酰基)-吡喃葡萄糖苷(1)、(2R，3R，4S)-3′，5′-二叔丁基-3，4，5，7，4′-五羟基黄烷(2)、原花青素B-2(3)和原花青素C-1(4)。

本发明的进一步目的是提供上述黄烷类化合物在制备抗补体药物中的用途。

本发明应用现代药理筛选方法，对植物药中的抗补体活性物质进行研究，从鸭跖草科(Commelinaceae)植物鸭跖草(Commelina communis Linn.)全草乙醇提取物的正丁醇部位和蓼科(Polygonaceae)植物金荞麦(Fagopyrum dibotrys(D.Don)Hara)干燥根茎的乙醇提取物的正丁醇部位分离得到黄烷类化合物并证实其对补体系统的经典途径和旁路途径均有较强的抑制作用。

本发明的活性黄烷类化合物具有下述结构通式的化学结构：

本发明中，上述的黄烷类化合物，当R₁＝(S)H，R₂＝(S)O-2-(6-Cinnamyl)-Glu，R₃＝R₄＝R₅＝H时，化合物为儿茶素-3-O-β-D-(2-肉桂酰基)-吡喃葡萄糖苷(1)；

当R₁＝(S)OH，R₂＝(R)OH，R₃＝R₅＝t-Bu，R₄＝OH时，化合物为(2R，3R，4S)-3′，5′-二叔丁基-3，4，5，7，4′-五羟基黄烷(2)；

当(2R)R₁＝(S)8-O-(-)-epicatechin，R₂＝(R)OH，R₃＝H，R₄＝R₅＝OH时，化合物为原花青素B-2(3)；

当(2R)R₁＝(S)8-O-procyanidin B-2，R₂＝(R)OH，R₃＝H，R₄＝R₅＝OH时，化合物为原花青素C-1(4)。

本发明所述的黄烷类化合物通过下述方法制备：

取鸭跖草全草14kg，用乙醇室温冷浸(50L×5次)，合并提取液浓缩至无醇味，提取液加水稀释至2L，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取(各2L×3次)，合并正丁醇萃取液浓缩至干即得正丁醇萃取物19.2g。正丁醇部位经干法上样进行硅胶柱色谱，以石油醚(60～90℃)、石油醚(60～90℃)-丙酮、丙酮梯度洗脱，所得流分以不同洗脱剂进行反复硅胶柱色谱和SephadexLH-20纯化，分离得到化合物儿茶素-3-O-β-D-(2-肉桂酰基)-吡喃葡萄糖苷(1)。

取金荞麦根茎粗粉15kg，用乙醇室温冷浸(50L×5次)，合并提取液浓缩至无醇味，提取液加水稀释至2L，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取(各2L×3次)，合并正丁醇萃取液浓缩至干即得正丁醇萃取物220g。正丁醇部位经干法上样进行硅胶柱色谱，以氯仿、氯仿-甲醇、甲醇梯度洗脱，所得流分以不同洗脱剂进行反复硅胶柱色谱，SephadexLH-20纯化和制备色谱，分离得到化合物(2R，3R，4S)3′，5′-二叔丁基-3，4，5，7，4′-五羟基黄烷(2)，原花青素B-2(3)和原花青素C-1(4)。

本发明中，儿茶素-3-O-β-D-(2-肉桂酰基)-吡喃葡萄糖苷(1)：淡黄色粉末，¹HNMR(400MHz，acetone-d₆，ppm)：δ4.90(1H，d，J＝6.5Hz)，4.19(1H，m)，2.91(1H，dd，J＝16.5，5.5Hz)，2.76(1H，dd，J＝16.5，7.0Hz)，6.04(1H，d，J＝2.5Hz)，5.91(1H，d，J＝2.5Hz)，6.90(1H，dd，J＝2.0Hz)，6.81(1H，d，J＝8.5Hz)，6.78(1H，dd，J＝8.5，2.0Hz)，4.32(1H，d，J＝8.0Hz)，3.13(1H，dd，J＝9.0，8.0Hz)，3.37(1H，dd，J＝9.5，9.0Hz)，3.54(1H，ddd，J＝9.5，6.5，2.0Hz)，4.59(1H，dd，J＝12.0，2.0Hz)，4.29(1H，dd，J＝12.0，6.5Hz)，6.58(1H，d，J＝16.0Hz)，7.69(1H，d，J＝16.0Hz)，7.61(2H，m)，7.40(3H，m)。

本发明中，(2R，3R，4S)-3′，5′-二叔丁基-3，4，5，7，4′-五羟基黄烷(2)：淡黄色粉末，¹HNMR(400MHz，DMSO-d₆，ppm)：δ8.30(1H，s)，7.38(2H，s)，7.28(1H，d，J＝2.1Hz)，7.15(1H，d，J＝2.1Hz)，5.02(1H，brs)，4.75(1H，d，J＝6.4Hz)，4.34(1H，dd，J＝6.4，4.9Hz)，4.28(1H，d，J＝4.9Hz)，1.38(9H，s)，1.35(9H，s)。

本发明中，原花青素B-2(3)：淡黄色粉末，¹H NMR(400MHz，acetone-d₆，ppm)：δ2.78-2.90(2H，m，H-4′)，4.23(1H，s，H-3)，4.26(1H，m，H-3′)，4.67(1H，s，H-4)，4.95(1H，s，H-2′)，5.04(1H，s，H-2)，5.93-5.99(3H，m，H-6，6′，8)，6.73-7.08(6H)；¹³C NMR(100MHz，acetone-d₆，ppm)：δ29.2(C-4′)，36.4(C-4)，66.5(C-3′)，72.3(C-3)，76.7(C-2)，79.2(C-2′)，95.4，96.2，96.8(C-8，6，6′)，100.7，101.4(C-10，10′)，107.1(C-8′)，154.0，155.6×2，157.2×2，158.5(C-9，9′，7，7′，5，5′)，114.4，115.0，115.4，115.6(C-2，2′，5，5′)，118.3，119.0(C-6，6′)，131.9×2(C-1，1′)，145.0，145.2，149.4，149.0(C-3，3′，4，4′)。

本发明中，原花青素C-1(4)：淡黄色粉末，¹H NMR(400MHz，CDCl₃，ppm)：δ2.6-3.0(2H，m)，4.17(2H，brs)，4.33(1H)，4.80(2H，brs)，5.01-5.15(3H，m)，5.95-6.10(4H)，6.67-7.14(9H)。

本发明的黄烷类化合物经体外经典途径和旁路抗补体活性评价试验，结果证实，所述化合物对补体系统的经典途径和旁路途径均有显著抑制作用(如表1所示)。其中，儿茶素-3-O-β-D-(2-肉桂酰基)-吡喃葡萄糖苷(1)对补体系统的经典途径有最强的抑制作用，经典途径中，50％溶血所需最小供试品浓度(CH₅₀)分别为0.13±0.03mM；旁路途径中，原花青素C-1(4)对旁路途径均有最强的抑制作用，50％溶血所需最小供试品浓度(AP₅₀)分别为0.12±0.01mM。

本发明的黄烷类化合物可作为药物活性成分，进一步制备抗补体药物。

表1是化合物1～4对补体系统经典途径和旁路途径抑制作用。

表1

^aμg/ml.

附图说明

图1是鸭跖草和金荞麦正丁醇部位所得黄烷类化合物1-4提取分离流程图。

具体实施方式

实施例1制备黄烷类化合物

(1)取鸭跖草全草14kg，用乙醇室温冷浸(50L×5次)，合并提取液浓缩至无醇味，提取液加水稀释至2L，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取(各2L×3次)，合并正丁醇萃取液浓缩至干即得正丁醇萃取物19.2g。正丁醇部位经硅胶柱色谱，以石油醚(60～90℃)、石油醚-丙酮、丙酮梯度洗脱，流份以反复柱色谱，SephadexLH-20纯化得到黄烷类化合物(1)。具体步骤如下：

石油醚-丙酮(2∶1)洗脱所得流份，经SephadexLH-20纯化，得到化合物1(4mg)。采用波谱学方法分析，其结构确定为对儿茶素-3-O-β-D-(2-肉桂酰基)-吡喃葡萄糖苷。

(2)取金荞麦根茎粗粉15kg，用乙醇室温冷浸(50L×5次)，合并提取液浓缩至无醇味，提取液加水稀释至2L，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取(各2L×4次)，合并正丁醇萃取液浓缩至干即得正丁醇萃取物790g。取正丁醇部位220g经干法上样进行硅胶柱色谱，以氯仿、氯仿-甲醇、甲醇梯度洗脱，所得流分以不同洗脱剂进行反复硅胶柱色谱，SephadexLH-20纯化和制备色谱，分离得到化合物2-4。

①氯仿-甲醇(7∶1)洗脱所得流份，经硅胶柱色谱，石油醚-丙酮(3∶1)为洗脱剂，流份经SephadexLH-20纯化，以氯仿-甲醇(1∶1)为洗脱剂，得到化合物2(4mg)。采用波谱学方法分析，其结构确定为(2R，3R，4S)3′，5′-二叔丁基-3，4，5，7，4′-五羟基黄烷。

②氯仿-甲醇(3∶1)洗脱所得流份，经硅胶柱色谱，石油醚-丙酮(1∶1)为洗脱剂，流份经制备色谱，以氯仿-甲醇(2∶1)为展开剂，得到化合物3(4mg)。采用波谱学方法分析，其结构确定为原花青素B-2。

③氯仿-甲醇(1∶1)洗脱所得流份经SephadexLH-20纯化，以甲醇为洗脱剂，得到化合物4(75mg)。采用波谱学方法分析，其结构确定为原花青素C-1。

实施例2体外抗补体经典途径试验

取补体(豚鼠血清)0.1ml，加入BBS配制成1∶5溶液，用BBS对倍稀释成1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320和1∶640溶液。取1∶1000溶血素、各浓度补体及2％SRBC各0.1ml溶于0.3ml BBS中，混匀，37℃水浴30min后放入低温高速离心机，在5000rpm、4℃条件下离心10min。分别取每管上清0.2ml于96孔板，在405nm测定吸光度。实验同时设置全溶血组(0.1ml 2％SRBC溶于0.5ml三蒸水中)。以三蒸水溶血管的吸光度作为全溶血标准，计算溶血率。以补体稀释度为X轴，各稀释浓度补体造成的溶血百分率为Y轴作图。选择达到相似高溶血率的最低补体浓度作为确保体系能正常溶血所需的临界补体浓度。取临界浓度的补体与分别于本发明的黄烷类化合物1-4混匀，于37℃预水浴10min后，加入适量BBS、溶血素和2％SRBC。将每管37℃水浴30min后放入低温高速离心机，5000rpm、4℃条件下离心10min后分别取每管上清0.2ml于96孔板，405nm下测定吸光度。实验同时设置中药对照组、补体组和全溶血组。将中药组吸光度值扣除相应中药对照组吸光度值后计算溶血率。以中药粗提物浓度作为X轴，溶血抑制率作为Y轴作图，计算CH₅₀值。结果显示，本发明的黄烷类化合物对补体系统的经典途径有较强的抑制作用，如表1所示。

实施例3体外抗补体旁路途径试验

取补体(人血清)0.2ml，加入AP稀释液配制成1∶5稀释溶液，并对倍稀释成1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320和1∶640溶液。取各浓度补体0.15ml、AP稀释液0.15ml及0.5％RE 0.20ml，混匀，37℃水浴30min后放置入低温高速离心机，在5000rpm、4℃条件下离心10min。分别取每管上清0.2ml于96孔板，在405nm测定吸光度。实验同时设置全溶血组(0.20ml 0.5％RE溶于0.3ml三蒸水中)。以三蒸水溶血管的吸光度作为全溶血标准，计算溶血率。以补体稀释度为X轴，各稀释浓度补体造成的溶血百分率为Y轴作图。选择达到相似高溶血率的最低补体浓度作为确保体系能正常溶血所需的临界补体浓度。取确定的临界浓度的补体与供试品混匀，于37℃预水浴10min后，加入适量0.5％RE。将每管37℃水浴30min后放置入低温高速离心机，5000rpm、4℃，离心10min后分别取每管上清0.2ml于96孔板，405nm下测定吸光度。实验同时设置中药对照组、补体组和全溶血组。将中药组吸光度值扣除相应中药对照组吸光度值后计算溶血率。以中药粗提物浓度作为X轴，溶血抑制率作为Y轴作图，计算AP₅₀值。结果显示，本发明的黄烷类化合物对补体系统的旁路途径有较强的抑制作用，如表1所示。

Claims

1.具有下述结构通式的黄烷类化合物在制备抗补体药物中的用途，

当R₁＝(S)H，R₂＝(S)O-2-(6-Cinnamyl)-Glu，R₃＝R₄＝R₅＝H时，化合物为儿茶素-3-O-β-D-(2-肉桂酰基)-吡喃葡萄糖苷(1)；

2.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的黄烷类化合物为鸭跖草科植物鸭跖草的正丁醇提取物或蓼科植物金荞麦的正丁醇提取、分离物。

3.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的儿茶素-3-O-β-D-(2-肉桂酰基)-吡喃葡萄糖苷(1)对补体系统的经典途径有抑制作用，其中，50％溶血所需最小供试品浓度(CH₅₀)为0.13±0.03mM。

4.按权利要求1所述的用途，其特征在于，旁路途径中，所述的原花青素C-1(4)对旁路途径有抑制作用，50％溶血所需最小供试品浓度(AP₅₀)为0.12±0.01mM。