CN105985403A - 一种甾醇内酯及其在制备抗补体药物中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属中药制药领域，涉及甾醇内酯类化合物Fortisterol在制备抗补体药物中的用途。本发明从马勃的子实体中分离得到化合物Fortisterol，结构为B环内酯化的麦角甾醇。采用现代药理研究方法证实其对补体系统经典途径和旁路途径激活均有较强的抑制作用，其CH50和AP50值分别为0.033±0.006mg/ml、0.072±0.012mg/ml，可用于制备补体抑制剂。

Description

一种甾醇内酯及其在制备抗补体药物中的用途
技术领域
本发明属中药制药领域，涉及甾醇内酯及其再制备抗补体药物中的用途，尤其是马勃中一种甾醇内酯Fortisterol及其在制备抗补体药物中的用途。
背景技术
研究公开了补体系统的过度激活会引发系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎(RA)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)等多种重大疾病，然而，目前临床实践中对此类疾病尚缺乏较为理想的治疗药物。多年来抗补体药物的研究一直是世界药学研究的热点和重点，从天然产物中研究开发补体抑制剂是近年来一个受到越来越多关注的重要研究领域，其具有成本低、毒性低等特点。国内外学者已从包括海洋生物在内的多种天然产物中分离得到多种具有补体系统抑制作用的单体化合物，为抗补体药物的研究与开发提供了广阔的前景。
马勃又名马灰包、灰包子等，是一种常见的以药用为主的大型真菌，具有消肿、止血、清肺、利咽、解毒等作用,为灰包科真菌脱皮马勃(Lasiosphaerafenzlii Reich.)、大马勃(Calvatia gigantea(Batsch ex Pers.)Lloyd)或紫色马勃(Calvatia lilacina(Mont.et Berk.)Lloyd)的干燥子实体。有研究对已有的化学成分研究表明其主要活性成分为甾醇，此外还含有萜类、脂肪酸及其酯、氨基酸、多糖等，具有抗菌、抗炎、止咳、抗肿瘤、抑制自由基等药理活性。有研究最初从中国南海海绵BiemnafortisTopsent分离得到相关化学成分的化合物[Huang X C,GuoY W,Song G Q.Fortisterol,a novel steroid with an unusual seven-membered lactone ring B from the Chinese marine sponge BiemnafortisTopsent[J].JAsian Nat.Prod.Res.,2006,8,485-489.]，但未见该化合物的抗补体活性报道。
本申请的发明人拟提供从马勃中分离得到的一种甾醇内酯Fortisterol及其在制备临床上急需高效、低毒、专一的新型补体抑制剂中的用途。从马勃中分离得到一种甾醇内酯Fortisterol，为首次从马勃中分离得到。结构新颖独特，为B环内酯的麦角甾醇结构。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型补体抑制剂，尤其是提供甾醇内酯Fortisterol在制备抗补体药物中的用途。
本发明从马勃中分离得到的一种甾醇内酯Fortisterol，该化合物结构新颖独特，为B环内酯的麦角甾醇结构；
通过下述方法：取药材马勃子实体，粉碎，用95％乙醇回流提取3次，每次2h，合并提取液并浓缩得浸膏，加水混悬，分别以等体积石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取5次，合并萃取液并浓缩至干，得乙酸乙酯萃取物；将乙酸乙酯萃取部位经硅胶(200-300目)柱色谱分离，依次以二氯甲烷-甲醇(50:1-0:1)梯度洗脱，得到10个流份(Fr.1-10)，其中流份Fr.7再经硅胶柱色谱(二氯甲烷-甲醇，30:1,20:1,10:1,5:1,3:1)、Sephadex LH-20柱色谱(氯仿-甲醇，1:1)和反相HPLC(甲醇-水，20:80-80:20，梯度洗脱)等手段纯化，分离得到化合物Fortisterol。
本发明所述的甾醇内酯类化合物Fortisterol具有以下化学结构：
所述化合物Fortisterol：白色粉末,分子式C28H40O3,EI-MS m/z:424[M]+。 1H-NMR(400MHz,CDCl3)δH:5.75(H,s),5.73(H,s),5.25(1H,m),5.14(1H,m),1.24(3H,s),1.02(3H,d,J＝6.5Hz),0.92(3H,d,J＝6.8Hz),0.84(3H,d,J＝8.4Hz),0.82(3H,d,J＝8.4Hz),0.64(3H,s).13C-NMR(100MHz,CDCl3)δC:33.9(C-1),33.2(C-2),198.5(C-3),114.7(C-4),173.8(C-5),162.4(C-6),113.3(C-7),159.5(C-8),47.2(C-9),40.3(C-10),22.6(C-11),39.2(C-12),45.9(C-13),58.1(C-14),25.3(C-15),27.7(C-16),56.3(C-17),12.4(C-18),19.9(C-19),40.3(C-20),21.0(C-21),134.7(C-22),132.8(C-23),42.8(C-24),33.0(C-25),19.6(C-26),19.9(C-27),17.6(C-28)。
本发明应用现代药理研究方法，对中药马勃中分离得到的单体化合物进行抗补体活性评价，从马勃子实体的乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位中分离得到甾醇 内酯类化合物Fortisterol，经过体外抗补体活性试验测定，证实其对补体系统的经典途径和旁路途径激活均有较强的补体抑制作用，其CH50和AP50值分别为0.033±0.006mg/ml、0.072±0.012mg/ml。阳性对照肝素CH50和AP50值分别为0.026±0.005mg/ml、0.054±0.016mg/ml。
附图说明
图1是马勃中化合物Fortisterol的提取分离流程图。
具体实施方式
实施例1制备马勃中化合物Fortisterol
取药材马勃子实体25kg，粉碎，用95％乙醇回流提取3次(50L×3)，每次2h，合并提取液并浓缩得浸膏0.85kg，加水(4L)混悬，分别以等体积石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取5次，合并萃取液并浓缩至干，得乙酸乙酯萃取物160g。将乙酸乙酯萃取部位经硅胶(200-300目)柱色谱分离，依次以二氯甲烷-甲醇(50:1-0:1)梯度洗脱，得到10个流份(Fr.1-10)，其中流份Fr.7(8g)再经硅胶柱色谱(二氯甲烷-甲醇，30:1,20:1,10:1,5:1,3:1)、Sephadex LH-20柱色谱(氯仿-甲醇，1:1)和反相HPLC(甲醇-水，20:80-80:20，梯度洗脱)等手段纯化，分离得到化合物Fortisterol；
所述化合物Fortisterol：白色粉末,分子式C28H40O3,EI-MS m/z:424[M]+。 1H-NMR(400MHz,CDCl3)δH:5.75(H,s),5.73(H,s),5.25(1H,m),5.14(1H,m),1.24(3H,s),1.02(3H,d,J＝6.5Hz),0.92(3H,d,J＝6.8Hz),0.84(3H,d,J＝8.4Hz),0.82(3H,d,J＝8.4Hz),0.64(3H,s).13C-NMR(100MHz,CDCl3)δC:33.9(C-1),33.2(C-2),198.5(C-3),114.7(C-4),173.8(C-5),162.4(C-6),113.3(C-7),159.5(C-8),47.2(C-9),40.3(C-10),22.6(C-11),39.2(C-12),45.9(C-13),58.1(C-14),25.3(C-15),27.7(C-16),56.3(C-17),12.4(C-18),19.9(C-19),40.3(C-20),21.0(C-21),134.7(C-22),132.8(C-23),42.8(C-24),33.0(C-25),19.6(C-26),19.9(C-27),17.6(C-28)。
实施例2体外抗补体经典途径试验
取补体(豚鼠血清)0.04ml，加入巴比妥缓冲液(BBS)配制成1:10的溶液，用BBS对倍稀释成1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640和1:1280的溶液；取1:1000溶血素、2％羊红细胞(SRBC)各0.1ml及各浓度补体0.2ml溶于0.2ml BBS中，混匀，37℃水浴30min后放入低温高速离心机，在4000rpm、4℃条件下离心5min，分别取每管上清0.2ml于96孔板，在405nm测定其吸光度；实验同时设置全溶血组(0.1ml 2％SRBC、0.1ml溶血素溶于0.4ml三蒸水)，以三蒸水溶血管的吸光度作为全溶血标准，计算溶血率，以补体稀释度为X轴，溶血百分率为Y轴作图，选择达到相似高溶血率的最低补体浓度作为确保体系能正常溶血所需的临界补体浓度，取临界浓度的补体与供试品混匀，按上述方法于405nm下测定吸光度；实验同时设置供试品对照组、补体组和全溶血组；将供试品吸光度值扣除相应供试品对照组吸光度值后计算溶血率，以供试品浓度作为X轴，溶血抑制率作为Y轴作图，计算50％抑制溶血所需供试品的浓度(CH50)，结果为0.033±0.006mg/ml，阳性对照肝素CH50值为0.026±0.005mg/ml。
实施例3体外抗补体旁路途径试验
取补体(人血清)0.2ml，加入AP稀释液(巴比妥缓冲液，pH＝7.4,含5mM Mg2+,8mM EGTA)配制成1:5的溶液，并对倍稀释成1:10、1:20、1:40、1:80、1:160、1:320和1:640的溶液；取各浓度补体0.15ml、AP稀释液0.15ml及0.5％兔红细胞(RE)0.20ml，混匀，37℃水浴30min后置于低温高速离心机，在4000rpm、4℃条件下离心5min。分别取每管上清0.2ml于96孔板，在405nm测定吸光度；实验同时设置全溶血组(0.20ml 0.5％RE溶于0.3ml三蒸水)，以三蒸水溶血管的吸光度作为全溶血标准，计算溶血率，以补体稀释度为X轴，溶血百分率为Y轴作图，选择达到相似高溶血率的最低补体浓度作为确保体系能正常溶血所需的临界补体浓度，取确定的临界浓度的补体与供试品混匀，按上述方法于405nm下测定其吸光度，实验同时设置供试品对照组、补体组和全溶血组。将供试品吸光度值扣除相应供试品对照组吸光度值后计算溶血率，以供试品浓度作为X轴，溶血抑制率作为Y轴作图，计算50％抑制溶血所需供试品的浓度(AP50)，结果为0.072±0.012mg/ml，阳性对照肝素AP50值为0.054±0.016mg/ml。
本发明中实验采用的试剂均为本领域公知技术，可市购。

Claims (4)

1.结构如下式的甾醇内酯Fortisterol在制备抗补体药物中的用途，
2.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的甾醇内酯Fortisterol通过下述方法制备：
取药材马勃子实体，粉碎，用95％乙醇回流提取3次，每次2h，合并提取液并浓缩得浸膏，加水混悬，分别以等体积石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取5次，合并萃取液并浓缩至干，得乙酸乙酯萃取物；将乙酸乙酯萃取部位经硅胶200-300目柱色谱分离，依次以二氯甲烷-甲醇50:1-0:1梯度洗脱，得到10个流份(Fr.1-10)，其中流份Fr.7再经硅胶柱色谱其中，二氯甲烷-甲醇，30:1,20:1,10:1,5:1,3:1、Sephadex LH-20柱色谱其中氯仿-甲醇，1:1和反相HPLC其中甲醇-水，20:80-80:20，梯度洗脱、纯化，分离得到化合物Fortisterol。
3.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的甾醇内酯Fortisterol对补体系统的经典途径有补体抑制作用。
4.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的甾醇内酯Fortisterol对补体系统的旁路途径激活有补体抑制作用。
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