CN103073644A

CN103073644A - 特异性抗小鼠tigit的单克隆抗体及其制备方法、鉴定及应用

Info

Publication number: CN103073644A
Application number: CN2012105906189A
Authority: CN
Inventors: 孙汭; 毕嘉成; 张清; 郑晓东; 田志刚; 魏海明
Original assignee: University of Science and Technology of China USTC
Current assignee: Hefei Ruida Immune Drug Research Institute Co Ltd
Priority date: 2012-12-31
Filing date: 2012-12-31
Publication date: 2013-05-01
Anticipated expiration: 2032-12-31
Also published as: CN103073644B

Abstract

本发明涉及一种抗小鼠TIGIT的单克隆抗体，本发明还涉及生产该单克隆抗体的杂交瘤细胞株mTIGIT-mAb-13G6(保藏编号：CCTCC NO：C201299)，本发明还涉及该单克隆抗体的制备方法及应用，本发明的单克隆抗体能高效阻断mTIGIT与mPVR的结合，可以用于Western blot、ELISA、Flow Cytometry检测mTIGIT分子。

Description

特异性抗小鼠TIGIT的单克隆抗体及其制备方法、鉴定及应用

技术领域

本发明涉及到一株抗小鼠TIGIT(全称T cell Ig and ITIM domain)的单克隆抗体。具体地说，涉及到对TIGIT有特异性的单克隆抗体，本发明还涉及产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，以及所述单克隆抗体的制备方法及应用。

背景技术

天然杀伤细胞(即，NK细胞)作为主要的天然免疫细胞，在机体杀伤病毒感染细胞以及肿瘤细胞方面起着重要的作用，NK细胞通过其表面不同的活化型受体和抑制型受体来控制NK细胞的活化、增殖和杀伤等功能。

TIGIT(T cell Ig and ITIM domain)分子是2009年新发现表达在NK细胞表面的抑制性受体，主要包含胞外IgV-样结构域，跨膜区和胞内ITIM基序(Immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif)，以高亲和力结合配体PVR(poliovirus receptor)，并通过胞内ITIM基序传递抑制信号，从而抑制NK细胞的杀伤功能，与活化性受体CD226/CD96协同调控NK细胞的活化与功能。

在黑色瘤荷瘤小鼠中，TIGIT表达上调，肿瘤细胞又高表达配体PVR，并且TIGIT结合PVR的能力远高于CD226/CD96，这使得NK细胞活性受到抑制，会造成肿瘤免疫耐受，导致肿瘤免疫逃逸。

真核表达mTIGIT-hFc融合蛋白，免疫大鼠，取免疫后大鼠的脾细胞与骨髓瘤IR983F细胞融合，筛选出能分泌对mTIGIT有反应的单克隆抗体的杂交瘤细胞，且其抗体能高效阻断mTIGIT与配体mPVR的结合，从杂交瘤培养上清中或者从腹腔接种杂交瘤细胞的裸鼠腹水中获取单克隆抗体。

制备mTIGIT阻断性单克隆抗体，为mTIGIT分子的检测以及mTIGIT功能的研究提供了基础，该抗体可广泛用于分子免疫学的研究中，并且可作为打破肿瘤免疫耐受的潜在治疗工具。

发明内容

本发明的一个目的是提供对小鼠TIGIT(mTIGIT)有特异性的单克隆抗体。

本发明的再一个目的是提供产生特异性抗小鼠TIGIT的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

本发明的又一个目的是提供本发明的单克隆抗体的制备方法。

本发明的又一个目的是提供本发明的单克隆抗体用于检测mTIGIT的应用，所述单克隆抗体能够阻断mTIGIT与其配体PVR的结合，能通过用于Western blot、ELISA或Flow Cytometry检测mTIGIT。

本发明的一个方面涉及一种对mTIGIT有特异性的单克隆抗体以及其制备方法，所述抗体的类型为IgG2a，κ，并且能高效阻断mTIGIT与mPVR的结合。

本发明的另外一个方面涉及一株稳定分泌mTIGIT单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其命名为mTIGIT-mAb-13G6，保藏编号为CCTCC NO：C201299，于2012年9月25日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国武汉，武汉大学，邮编：430072)。

本发明的另外一个方面涉及筛选能够表达特异性结合小鼠TIGIT的抗小鼠TIGIT的单克隆抗体的杂交瘤细胞株的方法，所述方法包括：mTIGIT与人Fc的融合蛋白mTIGIT-hFc的表达与纯化，用mTIGIT-hFc免疫大鼠，取免疫后大鼠的脾细胞与骨髓瘤IR983F细胞融合，筛选杂交瘤细胞，其分泌的单克隆抗体能特异性高亲和mTIGIT-hFc，将筛选得到的细胞株命名为mTIGIT-mAb-13G6，保藏编号为CCTCC NO：C201299。

由细胞株mTIGIT-mAb-13G6分泌的抗小鼠TIGIT单克隆抗体能高效阻断mTIGIT与mPVR的结合。

另外，本发明所述的抗小鼠TIGIT单克隆抗体也称为13G6单克隆抗体。

本发明的一个优选方面涉及制备抗小鼠TIGIT单克隆抗体的方法，所述方法包括从保藏号为CCTCC NO：C201299的杂交瘤细胞株mTIGIT-mAb-13G6培养上清中或者从腹腔接种所述杂交瘤细胞株的裸鼠腹水中获取所述单克隆抗体。

本发明的另一方面涉及单克隆抗体对mTIGIT和mPVR结合的阻断作用。用本发明的单克隆抗体检测阻断效率，结果显示，单克隆抗体能高效的阻断mTIGIT与mPVR的结合。

本发明的另一方面涉及单克隆抗体在Western blot检测mTIGIT中应用。用本发明的单克隆抗体鉴定mTIGIT蛋白的表达，Western blot实验显示：单克隆抗体能在Western blot水平用于检测mTIGIT-hFc融合蛋白。

本发明的另一方面涉及单克隆抗体在ELISA水平检测mTIGIT的应用。用本发明的单克隆抗体检测不同浓度的mTIGIT-hFc，结果显示：单克隆抗体能用于ELISA检测mTIGIT-hFc蛋白。

本发明的另一方面涉及单克隆抗体能用于Flow Cytometry检测mTIGIT。用本发明的单克隆抗体标记可以用于标记mTIGIT阳性细胞，而不标记mTIGIT阴性细胞。表明本发明的单克隆抗体能用于Flow Cytometry检测mTIGIT的表达。

本发明还涉及本发明的抗小鼠TIGIT的单克隆抗体在制备用于检测mTIGIT的试剂盒中的应用，所述试剂盒利用本发明所述的抗小鼠TIGIT的单克隆抗体通过Western blot、ELISA或Flow Cytometry来检测mTIGIT。

本发明还涉及一种检测mTIGIT的试剂盒，所述试剂盒包含本发明所述的抗小鼠TIGIT的单克隆抗体。

本发明还涉及一种检测mTIGIT的方法，所述方法包括下述步骤：(1)将本发明的单克隆抗体与待检测的分离的细胞或该细胞的裂解液孵育，(2)判断是否有阳性反应。其中所述阳性反应是指本发明的特异性抗mTIGIT抗体与待测样品中mTIGIT的结合，所述阳性反应可以通过免疫印记、ELISA或流式细胞术检测进行判断。

本发明中，术语“单克隆抗体的特异性”是指单克隆抗体识别抗原上的特定表位或者抗原决定簇并与之结合的性质。

术语“单克隆抗体的反应性”是指在合适的反应条件下，单克隆抗体与抗原结合的能力。

术语“细胞株”是指通过筛选或者有限稀释方法，从原代培养物或者细胞系获得的单细胞培养物。

根据本发明的公开，选择mTIGIT-hFc融合蛋白，按照本文描述的方法制备有特异性的单克隆抗体对本领域的技术人员而言是显而易见的，应该视为包含在本发明的范围内。

综上所述，本发明的有益效果在于：本发明提供了一种抗小鼠TIGIT的单克隆抗体的制备方法、鉴定及应用，该单克隆抗体具有效价高，特异性好等优点，且能高效阻断mTIGIT与mPVR的结合，适用于不同标本的检测。本发明提供的单克隆抗体，可以广泛用于Western blot、ELISA、flowCytometry等不同手段检测mTIGIT蛋白，为研究mTIGIT的功能提供了基础。

缩略语的含义：

mTIGIT：小鼠TIGIT(T cell Ig and ITIM domain)

mPVR：小鼠PVR(poliovirus receptor)，小鼠TIGIT的配体

附图说明

从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中：

图1，载体pcDNA3-mTIGIT-hFc的构建。

图2，mTIGIT-hFc融合蛋白表达、纯化及鉴定，其中：

图2A，mTIGIT-hFc融合蛋白纯化的鉴定结果；

图2B，mTIGIT-hFc融合蛋白的Western blot鉴定结果；

图3，本发明的单克隆抗体纯度鉴定结果。

图4，本发明的单克隆抗体特异性鉴定结果，其中：

图4A，Flow cytometry方法鉴定单克隆抗体对mTIGIT特异性的结果；

1)293T-mTIGIT/hTIGIT/mCD226/mCD96阳性率检测

2)本发明的单克隆抗体不识别细胞表面的hTIGIT/CD226/CD96分子

图4B，间接ELISA法验证单克隆抗体对mTIGIT的特异性的结果；

图4C，Western blot方法鉴定单克隆抗体对mTIGIT特异性的结果。

图5，本发明的单克隆抗体阻断功能的鉴定结果，其中：

图5A，293T-mPVR转染效率检测；

图5B，本发明的单克隆抗体高效阻断293T-mPVR和mTIGIT-hFc蛋白的结合；

图6，本发明的单克隆抗体用于Western blot检测mTIGIT的结果。

图7，本发明的单克隆抗体用于ELISA检测mTIGIT的结果。

图8，本发明的单克隆抗体用于FACS检测mTIGIT的结果。

A.本发明的单克隆抗体检测293A-mTIGIT细胞表面的mTIGIT；

B.商品化的流式抗体(Anti-Mouse TIGIT Alexa

647，eBioscience，Cat.NO.50-9501)检测293A-mTIGIT细胞表面的mTIGIT。

保藏说明

分泌特异性抗小鼠TIGIT的单克隆抗体的大鼠杂交瘤细胞株mTIGIT-mAb-13G6于2012年9月25日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国武汉，武汉大学，邮编：430072)，保藏编号为CCTCC NO：C201299。

序列表说明

具体实施方式

以下实施例将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。

实施例中的实验方法，如无特别说明，均采用本领域常规技术，实验试剂均为市售产品。

实施例1：真核表达载体pcDNA3-mTIGIT-hFc的构建

从pMD18-T-全长小鼠TIGIT载体(pMD18-T购自Takara，Code：D103A)中PCR扩增小鼠TIGIT胞外段编码序列，将序列片段与pcDNA3-hFc重组质粒(pcDNA3购自Invitrogen，编号V790-20)在EcoRI和Xho I处酶切后进行连接，连接产物转化DH5α大肠杆菌，涂板生长过夜，并对筛选得到的菌株进行PCR检测，将PCR鉴定阳性的克隆进行DNA测序，测序结果表明载体pcDNA3-mTIGIT-hFc构建成功。真核表达载体pcDNA3-mTIGIT-hFc的构建流程如图1所示。

实施例2：融合蛋白mTIGIT-hFc的表达、纯化与鉴定

1，融合蛋白mTIGIT-hFc (SEQ ID NO：3)的表达

将pcDNA3-mTIGIT-hFc载体转染293A细胞(购自上海细胞库，目录号：GNHu 1)，收集无血清培养物上清，30kD膜(购自碧云天)浓缩上清，用Protein G纯化柱(购自GE Healthcare，HiTrap Protein G HP，货号：1700404-01)对浓缩上清进行目的蛋白的富集，然后用酸性PBS(pH2.8)进行洗脱，再对洗脱的蛋白溶液用碱性的Tris缓冲液(pH9.0)进行中和，即得到mTIGIT-hFc蛋白溶液。结果如图2A所示。

2，融合蛋白的鉴定

将纯化的mTIGIT-hFc蛋白进行SDS-PAGE&Western Blot鉴定；结果如图2B。

实施例3：单克隆抗体的制备

1，脾细胞的制备

纯化的mTIGIT-hFc蛋白与等体积完全弗氏佐剂(CFA，购自Sigma，货号F5881-10ML)混合，mTIGIT-hFc的终浓度为100μg/ml，将混合物充分混匀形成油包水，取大鼠(购自上海斯莱克，雄性，8周龄)进行初次免疫，每只大鼠注射40-60μg mTIGIT-hFc蛋白(免疫剂量为133-200μg/kg大鼠体重)，间隔2周免疫一次。免疫5次后，酶联免疫吸附实验(ELISA)检测大鼠的血清效价很高，将大鼠处死之后取大鼠脾脏，过200目细胞筛，收集滤过的脾细胞，静置数分钟之后，吸取上层脾细胞。

酶联免疫吸附实验(ELISA)检测抗体效价的方法如下：用包被液(0.1M碳酸盐缓冲液pH 9.6)稀释纯化的蛋白至10μg/ml，100μl/孔包被96孔ELISA板，4℃过夜，用PBST(0.05％Tween20-PBS pH 7.4)清洗3遍，1％BSA封闭，37℃孵育2小时。PBST清洗3遍，加入待测倍比稀释的大鼠血清(实验组)，设置6-7个梯度，未免疫健康大鼠血清做阴性对照，100μl/孔，37℃孵育1小时。PBST清洗3遍，每孔加入100μl 1∶10000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠抗体(购自Boster公司，货号BA1050)，37℃孵育1小时。清洗后加入TMB底物液(购自eBioscience公司，货号00-4201-56)，100μl/孔，避光显色15分钟，加入终止液(2MH₂SO₄)50μl/孔，终止后立即检测OD490。

2，饲养细胞的制备

在细胞融合前一天，制备大鼠腹腔巨噬细胞，作为饲养层细胞。具体方法如下：将8周龄正常大鼠脱臼处死，75％酒精消毒，暴露腹部，剪开腹膜。用10ml注射器吸取5ml DMEM不完全培养液(购自Gibco公司)注入小鼠腹腔，反复抽吸数次。用注射器回抽腹腔内液体，注入离心管。用DMEM不完全培养基洗涤2次，300g 4℃离心10min，弃上清。用DMEM(含10％小牛血清)培养液重悬细胞，调整细胞浓度为2×10⁵/ml，加100入96孔中，每孔100μl，放入细胞培养箱，37℃，5％CO₂条件下培养。

3，细胞融合及杂交瘤细胞的制备

取制备好的脾细胞(10-15×10⁷)和骨髓瘤细胞IR983F(购自通派(上海)生物科技有限公司，5×10⁷)的在无血清DMEM培养基中充分混匀，离心后洗净培养基，轻轻弹起细胞，加入预热的PEG(分子量1,000-6,000)溶液，PEG的终浓度为50％(W/V)，60秒之后加入无血清DMEM培养基(购自Gibco公司)，离心之后收集沉淀的细胞，加入HAT选择培养基重悬。HAT选择培养基为包含20％FCS(小牛血清)、10mM sodiumhypoxanthine(次黄嘌呤)、40mM aminopterin(氨基蝶呤)、1.6mMthymidine(胸腺嘧啶)的DMEM培养基。

融合的细胞悬液加到预先制备的饲养细胞(即，上述2中制备的饲养细胞)中，融合细胞在HAT选择培养基培养一周之后，换用HT培养基(包含20％FCS、10mM sodium hypoxanthine、1.6mM thymidine的DMEM培养基)持续培养足够的时间，然后筛选产生目的抗体的杂交瘤细胞并进行ELISA检测。同时用含有10％小牛血清的DMEM培养液取代HT培养液进行培养。

将得到的产生本发明单克隆抗体的杂交瘤细胞采用有限稀释方法进行亚克隆化，ELISA多次筛选后得到杂交瘤细胞株mTIGIT-mAb-13G6，连续体外培养2个月以上或者冻存6个月之后，该细胞株仍能稳定和大量分泌抗小鼠TIGIT的抗体。该杂交瘤细胞株于2012年9月25日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国武汉，武汉大学，邮编：430072)，保藏编号为CCTCC NO：C201299。

3，单克隆抗体的制备

制备单克隆抗体时，其一，可以从上述杂交瘤细胞培养上清中获得抗体，具体来说，细胞传代培养2天后收培养上清，上清中含有较高浓度的单克隆抗体。其二，可以将所述杂交瘤细胞注射到用石蜡预先免疫的裸鼠腹腔，通过抽取裸鼠腹水进行提取获得单克隆抗体，具体来说，石蜡免疫8-10周龄的雌性裸鼠，每只裸鼠腹腔注射500μl无菌的液体石蜡；一周之后腹腔注射杂交瘤细胞，每只裸鼠注射1-2×10⁶细胞，7-10天左右产生腹水，收集裸鼠腹水，离心收上清即腹水抗体。通过上述方法获得的抗体，可以用Protein G亲和层析方法纯化，抗体的纯度用SDS-PAGE鉴定。如图3所示，经过纯化的单克隆抗体的纯度接近100％，单克隆抗体分子量约140kDa，其中重链约45kDa，轻链约25kDa。

实施例4：单克隆抗体的鉴定

1，间接ELISA测定单克隆抗体效价

ELISA检测单克隆抗体效价的方法如下：

用0.1M碳酸缓冲液稀释mTIGIT-hFc蛋白至0.25μg/ml，100μl/孔，包被96孔ELISA板，4℃过夜，用PBST(0.05％Tween20-PBS，pH 7.4)清洗3遍，1％BSA封闭，37℃孵育2小时。PBST清洗3遍，加入经过倍比稀释的杂交瘤细胞mTIGIT-mAb-13G6培养物上清或腹水，设置8-12个梯度，用其他的杂交瘤细胞(例如，pK136，购自中科院上海细胞库)培养物上清或腹水当阴性对照，设PBS为调零孔，100μl/孔，37℃孵育1小时。PBST清洗3遍，每孔加入100μl辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗大鼠IgG(OLIGOAB02H)抗体(1∶2000稀释，该抗体购自Absea)，37℃孵育1小时。清洗后加入TMB底物液(购自eBioscience公司，货号00-4201-56)，100μl/孔，避光显色10-15分钟，加入终止液(2M H₂SO₄)100μl/孔，酶标仪终止后立即检测OD450和OD630。与PBS孔相比，当测试抗体检测值/阴性对照值(比值)大于2.1设为阳性，以最大稀释度的阳性孔为抗体的滴度。

2，BIAcore 3000测定单克隆抗体的亲和常数。

放入CM5芯片，Dock，用PBS作流动相，致敏两次。先注射50mMNaOH+0.05％SDS(10μl/min，2min)，然后注射50mM NaOH(10μl/min，2min)冲洗芯片表面。首先摸索适宜的mTIGIT-hFc浓度及pH，最终确定抗原浓度为10μg/ml，pH＝5.0。

注射活化液(pH＝5.5和pH＝5.0的醋酸钠按1∶1体积比混匀)(5μl/min，7min，)活化芯片，用PH 5.0的NaAc将抗原(即，mTIGIT-hFc)稀释至10μg/ml，注射稀释的抗原，开始进行抗原标记，只标记一个通道，留另一个通道做空白对照。用乙醇胺封闭，封闭时间流速与活化时相同。1×PBS致敏两次，用不同抗体浓度测试标记效果，同时摸索再生条件，可确定50mM NaOH是比较合适的再生条件。将13G6单克隆抗体(即，本发明的抗小鼠TIGIT单克隆抗体)用1×PBS倍比稀释至0.24μg/ml，0.08μg/ml，0.0267μg/ml，0.0089μg/ml，0.00296μg/ml，0.0001μg/ml，0.000033μg/ml七个浓度，设定程序测定13G6单克隆抗体对抗原mTIGIT-hFc的亲和力。得到亲和力曲线后进行拟合，得出亲和力常数K，单位L/M，见下表1。

3，单克隆抗体的Ig亚类测定

单克隆抗体的亚类、培养上清效价、腹水抗体效价和亲和常数的结果见表1。

表1.本发明的单克隆抗体的亚类、培养上清效价、腹水抗体效价和亲和常数

亚类	IgG2a，κ
		培养上清抗体效价	10^-4～10^-3
腹水抗体效价	1×10^-12
		亲和常数(L/M)	7.14×10¹¹

4，单克隆抗体的特异性鉴定

hTIGIT、mCD226和mCD96分子与mTIGIT分子高度同源，以13G6mAb为一抗，分别与细胞293T-mTIGIT、293T-hTIGIT、293T-mCD226和293T-mCD96结合(上述四种细胞由本发明人按照常规方法制备：构建重组载体pcDNA3-mTIGIT、pcDNA3-hTIGIT、pcDNA3-mCD226和pcDNA3-mCD96，将构建的重组载体分别转染293T细胞(293T细胞购自上海细胞库))，再用PE-抗大鼠IgG2a(购自eBioscience，货号12-4817)为二抗检测13G6单克隆抗体，结果如图4A所示，13G6仅能特异性识别mTIGIT分子，对其余三种分子无识别，说明13G6mAb是针对mTIGIT的特异性单克隆抗体。

用间接ELISA法验证单抗的特异性，13G6mAb为一抗，HRP标记的抗大鼠IgG(OLIGOAB02H)(购自Absea)作为二抗进行ELISA检测，13G6mAb基本不结合eGFP-hFc，如图4B所示。

采用免疫印迹的法进行特异性检测，我们以该单克隆抗体作为一抗，HRP标记的抗大鼠IgG(OLIGOAB02H)(购自Absea)作为二抗进行Western blot检测，检测融合蛋白mTIGIT-hFc和eGFP-hFc，经Western blot鉴定，如图4C所示，在分子量41kDa(mTIGIT-hFc)处有一特异性条带，而在55kDa左右(eGFP-hFc)处没有特异性条带。进一步证明杂交瘤细胞所分泌的单克隆抗体对hFc无反应，是针对mTIGIT的特异性单克隆抗体。5，单克隆抗体阻断功能的鉴定

13G6mAb细胞培养物上清先与1μg mTIGIT-hFc蛋白孵育，4℃，20min；再用孵育混合物重悬293T-mPVR细胞(293T细胞购自上海细胞库，目录号：GNHu17)，4℃，20min；PBS清洗3遍，3500rpm离心5min，标记流式抗体PE-山羊抗人Fc(购自BD Bioscience)，4℃，20min，转入流式管，用小型流式细胞仪检测(BD FACSCalibur)检测。结果如图5B所示，对比全阻断和未阻断组，13G6mAb基本能完全阻断mTIGIT与mPVR的结合，说明该单抗有高效的阻断能力。实施例5：抗小鼠TIGIT单克隆抗体的应用

1)用于Western blot检测mTIGIT

用纯化的单克隆抗体作为一抗，HR 标记的兔抗大鼠抗体(购自BOSTER，货号：BA1058)作为二抗进行Western blot检测，如图6，该单克隆抗体能够检测293A-mTIGIT-hFc细胞全裂解液中的mTIGIT-hFc蛋白，293A-eGFP-hFc总蛋白中未检测到信号。

2)用于ELISA检测mTIGIT

分别用不同浓度的融合蛋白mTIGIT-hFc包被96孔板，所制备的单克隆抗体作为一抗，HRP标记的抗大鼠IgG(OLIGOAB02H)(购自Absea)作为二抗，最后加入TMB显色液(购自eBioscience，货号00-4201-56)，检测OD450和OD630，计算Δ450＝OD450-OD630，做不同浓度的融合蛋白mTIGIT-hFc对应的Δ450曲线图，经过拟合之后R²可以达到ELISA要求。结果见如图7，表明该单克隆抗体能够用于ELISA检测mTIGIT蛋白。

3)用于Flow Cytometry检测mTIGIT

FACS检测mTIGIT在细胞系293A-mTIGIT(pcNDA3-mTIGIT质粒转染293A细胞，293A购自上海细胞库)和293A表面的表达，所制备的单克隆抗体作为一抗，用PE-抗大鼠IgG2a(购自BD Bioscience)作为二抗，用本发明的单克隆抗体13G6标记表达mTIGIT的阳性细胞(293A-mTIGIT)和阴性细胞(293A)，如图8(A)所示，所制备的单克隆抗体能结合到293A-mTIGIT细胞表面，但不与293A细胞结合。对比商品化的Alexa 647/mTIGIT标记mTIGIT，如图8(B)，两者比例接近，结果表明本发明的单克隆抗体可以用于流式检测小鼠TIGIT分子。

应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由权利要求书所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。

Claims

1.一种特异性抗小鼠TIGIT的单克隆抗体，所述抗体由保藏号为CCTCC NO：C201299的大鼠杂交瘤细胞株mTIGIT-mAb-13G6分泌产生。

2.按照权利要求1所述的抗体，其亚型为IgG2a，κ。

3.按照权利要求1所述的抗体，其能高效阻断mTIGIT与mPVR的结合。

4.产生权利要求1所述单克隆抗体的杂交瘤细胞株mTIGIT-mAb-13G6，其保藏号为CCTCC NO：C201299。

5.制备权利要求1所述的单克隆抗体的方法，所述方法包括从保藏号为CCTCC C201299的杂交瘤细胞株mTIGIT-mAb-13G6培养上清中或者从腹腔接种所述杂交瘤细胞株的裸鼠腹水中获取所述单克隆抗体。

6.权利要求1的单克隆抗体在制备用于检测mTIGIT的试剂盒中的应用，所述试剂盒利用权利要求1的单克隆抗体通过Western blot、ELISA或Flow Cytometry来检测mTIGIT。

7.一种检测mTIGIT的试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1所述的抗小鼠TIGIT的单克隆抗体。

8.一种检测mTIGIT的方法，所述方法包括下述步骤：

(1)将权利要求1所述的单克隆抗体与待检测的分离的细胞或该细胞的裂解液孵育；

(2)判断是否有阳性反应。

9.根据权利要求8的方法，其中所述阳性反应通过免疫印记、ELISA或流式细胞术检测进行判断。