CN104403001A

CN104403001A - 一种全人源抗TLR4的抗体Fab及其全分子抗体IgG和应用

Info

Publication number: CN104403001A
Application number: CN201410765623.8A
Authority: CN
Inventors: 唐奇; 熊四平; 朱进; 冯振卿; 汪茂荣
Original assignee: Inst Of Military Medicine Nanjing Military Area Pla
Current assignee: Inst Of Military Medicine Nanjing Military Area Pla
Priority date: 2014-12-12
Filing date: 2014-12-12
Publication date: 2015-03-11
Anticipated expiration: 2034-12-12
Also published as: CN104403001B

Abstract

本发明涉及一种全人源抗TLR4的抗体Fab及其全分子抗体IgG和应用，该全分子抗体IgG轻链的氨基酸序列为SEQ ID NO.11所示，重链的氨基酸序列为SEQ ID NO.12所示。体外实验结果表明，本发明的全人源抗TLR4全分子抗体IgG可有效识别重组及天然TLR4蛋白，并能阻断LPS诱导的THP-1细胞对TNF-α的表达,抑制率达85.7％。

Description

一种全人源抗TLR4的抗体Fab及其全分子抗体IgG和应用

技术领域

本发明属于基因重组抗体药物技术领域，涉及一种全人源抗TLR4的抗体Fab及其全分子抗体IgG，以及其在制备阻断炎症反应药物中的应用。

背景技术

感染性休克亦称脓毒性休克,或中毒性休克，是指由微生物及其毒素等产物所引起的脓毒病综合征伴休克。感染灶中的微生物及其毒素、胞壁产物等侵入血循环，激活宿主的各种细胞和体液系统，产生细胞因子和内源性介质，作用于机体各种器官、系统，影响其灌注，导致组织细胞缺血缺氧、代谢紊乱、功能障碍，甚至多器官功能衰竭。其特点是病情重、进展快、死亡率高。

感染性休克最重要的发病机制主要与感染的细菌及其内毒素引起的一系列炎症因子有关。内毒素血症可引起发热反应,内毒素直接作用于下丘脑体温调节中枢，或作用于白细胞使之释放内原性致热原；促使血管活性物质如缓激肽、组胺、5-羟色胺、血管紧张素等释放，使血压下降，导致微循环障碍；引起白细胞和血小板减少，激活凝血、纤溶系统，产生出血倾向；弥漫性血管内凝血；经C3旁路或经典途径激活补体；直接或间接损害肝脏，引起糖代谢紊乱及酶学、蛋白代谢的改变；激活白三烯、前列腺素、巨噬细胞、单核细胞及内皮细胞活性。

脂多糖是细菌内毒素(endotoxin)的主要成分，是革兰氏阴性细菌胞壁的成分。内毒素有多种生物活性，进入人体血液可造成内毒素血症(ETM)，可引起多种病理生理过程变化如发热、休克、弥漫性血管内凝血和粒细胞减少等，甚至造成严重后果如呼吸窘迫综合症(ARDS)，急性肾衰竭(ARF)，甚至多器官功能衰竭等多种疾病，最终可因内毒素休克死亡。

TLR4(Toll-like receptor 4,TLR4)是Toll样受体家族的成员之一，也是一种模式识别受体，能够识别微生物进化过程中的一些保守结构PAMP(pathogen-associatedmolecularpattern,PAMP)，如LPS，被认为是内毒素激活炎症反应的关键。TLR4在体内和体外对LPS效应起着主要感受器的作用，并调节细胞的促炎症因子表达和组织对损伤的炎症反应。近年来，对LPS的信号转导与TLR4的关系的研究取得了重大进展。TLR4属于Ⅰ型跨膜受体蛋白；胞外区由富含亮氨酸的重复序列LRR组成，胞内区与IL-1受体胞内区相似，称为TIR(Toll/IL-1receptor)区。TLR4广泛表达在各种淋巴细胞表面，其中既包括非特异免疫细胞如巨噬细胞、中型粒细胞和肥大细胞，又包括介导特异免疫反应的T淋巴细胞和B淋巴细胞，活化TLR4将诱导产生一系列的炎症介质，从而产生强有力的炎症反应。LPS在细胞外被识别后导致TLR4受体寡聚化激活,将LPS刺激信号向细胞内转导,通过MyD88依赖和非MyD88依赖的2条途径触发一系列的信号激联反应,诱导NF-κB、AP-1和IRF-3等转录因子磷酸化和核转位，上调TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8和IFN-γ等细胞因子的表达,最后启动炎症反应。TLR4信号转导通路在这一过程中起着极其重要的作用，可能会成为治疗内毒素血症的重要靶点。

目前，研究人员普遍认为TLR4是内毒素发挥生物学效应的瓶颈和内毒素瀑布效应的限速步骤，阻断TLR4对内毒素信号的传导，是控制内毒素生物效应的最为有效的手段。虽然现有技术报道了对TLR4进行的相关研究，但是尚无开发出针对人源TLR4的抗体，从而不能有效控制内毒素的生物效应，因此对于TLR4介导的各种炎症反应，没有得到十分有效的控制。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明目的在于提供一种全人源抗TLR4的抗体Fab及其全分子抗体IgG，以及该抗体CDR区域的核苷酸及氨基酸序列、抗体可变区核苷酸及氨基酸序列，及其在抑制TLR4介导的炎症反应中的用途。

为了实现本发明的目的，发明人通过大量试验研究，包括全人源免疫型Fab噬菌体抗体库的构建，抗TLR4特异性抗体的筛选、纯化，抗TLR4全分子抗体IgG的制备、表达及纯化，抗TLR4全分子抗体IgG的特性分析，抗TLR4全分子抗体IgG对TNF-α表达的影响，最终获得了如下技术方案：

一种全人源抗TLR4的抗体Fab，包含轻链可变区和重链可变区，其中：

(1)所述的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体；

且(2)所述的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体。

进一步地，如上所述的全人源抗TLR4的抗体Fab，其中：所述的轻链可变区的抗原互补区CDR的氨基酸序列为SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示；所述的重链可变区的抗原互补区CDR的氨基酸序列为SEQ ID NO.8，SEQ ID NO.9和SEQ IDNO.10所示。

另外，发明人通过对上述抗体Fab进一步研究后获得了一种全人源抗TLR4的全分子抗体IgG，该全分子抗体IgG包含轻链和重链，其中：所述的轻链的氨基酸序列为SEQID NO.11所示，所述的重链的氨基酸序列为SEQ ID NO.12所示。

再进一步地，本发明还提供了一种DNA分子，其编码上述的全分子抗体IgG的重链或/和轻链。

在本发明的一个最优选的实施例中，如上所述的DNA分子中，其编码轻链可变区的核酸序列为SEQ ID NO.1所示，编码重链可变区的核酸序列为SEQ ID NO.2所示。

再进一步地，本发明还提供了一种表达载体，该表达载体包含有上述的DNA分子以及与该DNA分子操作性相连的表达调控序列。

再进一步地，本发明还提供了一种宿主细胞，该宿主细胞被上述的表达载体转化，从而可以表达出全人源抗TLR4的全分子抗体IgG。优选地，该宿主细胞可以是被上述的表达载体转化的293Freestyle细胞。

本发明人通过将得到的全分子抗体IgG用于对TNF-α表达的影响试验得出，该全分子抗体IgG能够有效抑制LPS诱导的NF-α的表达，小鼠体内90min时TNF-α表达的抑制率为81.1％，120min时TNF-α表达抑制率高达89.9％，因此其可以被用来制备抑制TLR4介导的炎症反应的试剂或药物。即，本能发明进一步提供一种抑制TLR4介导的炎症反应的药物，其中：该药物的活性成分为权利要求3所述的全分子抗体IgG。

与现有技术相比，本发明采用从重症肝炎病患者全血淋巴细胞中分离抗体基因的方法获得一种抗体Fab，并采用基因工程技术表达FAB抗体技术，获得的一组全人源抗TLR4的全分子抗体IgG；通过试验表明它能够有效的阻断LPS诱导的人PBMC细胞对TNF-α的表达，抑制率高达89.9％，因而为治疗TLR4介导的内毒素炎症反应提供了可能，同时为其他相关疾病的基因工程研究提供了技术储备。

附图说明

图1：抗TLR4全分子抗体IgG的酶联免疫吸附实验结果；

图2：抗TLR4全分子抗体IgG的SDS-PAGE检测结果；

图3：抗TLR4全分子抗体IgG的IP检测结果；

图4：细胞水平上抗TLR4全分子抗体IgG对TNF-α表达的影响；

图5：小鼠体内抗TLR4全分子抗体IgG对TNF-α表达的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神下可以对技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

实施例1全人源免疫型Fab噬菌体抗体库的构建

1)采集临床确证为重症肝炎病患者全血50份，分离淋巴细胞，使用Trizol(InvitrogenCat#10296-010)抽提总RNA，采用oligo(dT)20((Invitrogen Cat#18418-020)作为引物，逆转录生成cDNA。

2)使用人抗体可变区通用引物(见表1)分别扩增抗体重、轻链可变区基因组。采用Overlap PCR合成人Fab基因组。使用SfiI内切酶(NEB Cat#R0123S)双酶切消化表达载体pComb3XSS。使用T4DNA Ligase(NEB Cat#M0202S)将Fab基因连接到线性化的pComb3XSS质粒，完成重组。

3)电转化感受态大肠杆菌XL1-Blue，最终构建了容量为5.76×10⁹的全人源Fab抗体库。

表1：人抗体可变区通用引物

实施例2抗TLR4特异性抗体的筛选、纯化

1)用纯化的重组人TLR4蛋白包被固相筛选ELISA板，每孔2μg，洗涤，加封闭液，洗涤，加入噬菌体抗体库抗体，洗涤去除未结合的噬菌体抗体。

2)加入胰蛋白酶，洗脱特异性结合的噬菌体抗体，感染增值，辅助噬菌体VCSM13超感染。

3)重复以上筛选步骤，共进行五轮“吸附-洗脱-扩增”富集筛选。

4)将最后一轮筛选且增值得到的噬菌体稀释后铺于加入100μg/mL的氨苄青霉素培养板上培养过夜，挑取80个单菌落于细胞培养板中，振摇培养过夜。

5)过夜后从第一块板各孔中分别转移5μL菌液至第二块板，振摇培养。

6)加辅助噬菌体VCSM13超感染，振摇培养；离心，培养基重悬沉淀，振摇培养过夜。

7)离心取上清进行ELISA检测，测定每孔450nm和650nm吸光值，按A450nm～A650nm计算每孔吸光值。当P/N值(Positive/Negative)大于4时，该菌株为阳性单克隆噬菌体菌株。

8)将阳性克隆进行核苷酸序列分析，得到1种基因序列正确的Fab，命名为TLR4L4。

筛选得到的Fab的基因序列如下：

抗体轻链可变区核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示，轻链的抗原互补区CDR的氨基酸序列为SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.7所示。

抗体重链可变区核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示，氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示，重链的抗原互补区CDR的氨基酸序列为SEQ ID NO.8，SEQ ID NO.9，SEQ ID NO.10所示。

实施例3抗TLR4全分子抗体IgG的制备、表达及纯化

1)将抗体可变区序列与人类抗体基因组序列进行比对，根据同源性，修复抗体核苷酸序列FR1起始处及FR4结尾处因筛库造成的基因突变。

2)根据Infusion PCR原理设计TLR4L4抗体的重、轻链PCR扩增引物，此引物需要包括表达载体上的15bp的碱基以及插入目的片段的至少15bp碱基，插入目的片段处碱基按照普通引物设计的原则设计。

重链IF-PCR扩增引物：

F：5’-GGTGTCCACTCGCTACAGGTGCAGCTGGTG-3’

R：5’-GCCCTTGGTGGATGCTGCAGAGACAGTGAC-3’

轻链IF-PCR扩增引物：

F：5’-ACAGACGCTCGCTGCTCCTATGAGCTGACT-3’

R：5’-GCCCTTGGTGGATGCTGAGGAGACGGTGAC-3’

3)分别使用限制性内切酶Fsp I(NEB Cat#R0135)和Bmt I(NEB Cat#R0658)酶切消化抗体真核表达载体pFUSE-CHIg-hG1、pFUSE-CLIg-hl(购自InvivoGen公司)。该两种质粒分别包含IgG1型人源重链和轻链(Lambda)恒定区基因序列。使用In-FusionPCR Cloning Kit(ClonTech Cat#639636)将抗体可变区去基因PCR产物重组到抗体真核表达质粒中，测序并确认序列连接正确。

4)复苏及培养293Freestyle cell(Invitrogen Cat#R79007),培养基为FreeStyle 293FExpression Medium(Invitrogen Cat#R12338018),培养条件为：CO₂浓度为8％，细胞摇床转速为120rmp，培养温度为37℃。

5)分别取250μL pFUSE-CHIg-hG1-TLR4L4H(200μg/ml)和250μL pFUSE-CLIg-hL-TLR4L4K(200μg/ml)至2.5mlOpti-MEM(Invitrogen Cat#31985062)培养基中；取200μL的293Fectin Transfection Reagent(Invitrogen Cat#12347019)于2.8mL的Opti-MEM培养基中，静置5min。将两种混合液混合，轻轻摇晃至均匀，静置20min。将293F细胞(细胞活力>95％)离心后用293F Expression Medium重悬，吸取90×10⁶个细胞于培养瓶中，用293F Expression Medium定容为94mL。20min结束后加入6mL的DNA、293Fectin混合物。将细胞放在摇床培养箱中培养，培养条件为：CO₂浓度为8％，细胞摇床转速为120rmp，培养温度为37℃。120小时候收集细胞培养上清。

重组表达的TLR4L4抗体的轻链氨基酸序列为SEQ ID NO.11所示，重链氨基酸序列为SEQ ID NO.12所示。

6)将收集的细胞培养上清用0.22μm的滤膜过滤，使用蛋白纯化系统(GE AKTAPurifier 100)和HITRAP PROTEIN A预装柱(GE Cat#17-0402-01)按标准步骤纯化。使用30Kd超滤离心管(Millipore Cat#UFC803008)置换抗体缓冲液并浓缩，使用0.22μm滤膜过滤分装保存。

实施例4抗TLR4全分子抗体IgG的特性分析

1)酶联免疫吸附实验

用包被液(0.1M碳酸盐缓冲液，pH9.6)稀释TLR4重组蛋白至2μg/mL包被ELISA96孔板，每孔加入100μL，4℃过夜；用PBST(PBS含0.5％Tween20)5％脱脂牛奶-洗涤缓冲液封闭，37℃孵育2h；PBST洗涤5次后，每孔加入100μl倍比稀释的抗TLR4L4全分子抗体IgG(2μg/mL起始浓度，14个浓度梯度稀释)，37℃孵育2h；每孔加入100μl羊抗人二抗(1：4000稀释)，37℃孵育1h；PBST洗涤5次后，加过氧化物酶底物显色液，室温下15min后用2M硫酸中止反应，上机检测蛋白吸光度值。

结果如图1示，TLR4L4抗体能与重组TLR4蛋白起明显的抗原抗体反应。

2)免疫共沉淀

将5μg TLR4重组蛋白与5μgTLR4L4抗体混合，用PBS定容到300μl,放置于4℃环境共孵育；2h后加入Protein A免疫磁珠，继续孵育1h。离心10min去除上清，用PBST漂洗5遍后，加入50μl柠檬酸洗脱液，离心并收集上清，加入10μl Tris-base中和上清液。使用SDS-PAGE和Western-blot鉴定(结果见图2和图3)。

3)质谱检测

将SDS-PAGE胶中相应位置的胶切样后送质谱检测。

4)亲和力检测

根据等电点以及按照BiacoreX100 control soft的protocol优化偶联条件，斜率优化选择醋酸钠作为偶联稀释缓冲液。用此缓冲液稀释TLR4L4抗体样品至25ug/ml后偶联到CM5芯片(GE Cat#BR100012)上。预设偶联水平1500RU。用pH7.4的Running buffer稀释mab系列样品,稀释一系列浓度至0uM、5nM、10nM 20nM、40nM、80nM。设置进样时间为180s，解离时间10min，再生缓冲液用50mMpH2.2Gly-HCl。按照BiacoreX100control soft的protocol进行上机测试。经检测抗体的亲和力KD为7.380E(-10)。

实施例5抗TLR4全分子抗体IgG对TNF-α表达的影响

1)复苏及培养THP-1细胞(上海博古Cat#BG460)，培养条件为:CO₂浓度为5％，培养温度为37℃，FBS浓度为10％。收集THP细胞，1000r/min离心10min，用含10％FBS的1640培养液重悬，细胞计数，调整细胞数至0.5×10⁶个/ml,加入PMA(SIGMACat#P1585)(工作浓度0.1μg/ml),每孔200μl接种于96孔细胞培养板。

2)24h后吸去细胞上清，更换成无血清1640培养液，每孔200ul，培养箱孵育过夜。

3)吸去细胞培养上清，采用倍比稀释法稀释待测抗TLR4抗体，起始浓度为1mg/ml，稀释范围为1:1至1:128倍。将待测抗体按照每孔200ul加入96孔板中，培养箱孵育2h。

4)将LPS(SIGMA,Cat#L2880)稀释至1ug/ml，根据最终浓度0.03ug/ml计算每孔应添加的量(6ul)，添加LPS后继续孵育4小时。

5)收集96孔板中的细胞上清，用TNF-α检测试剂盒(联科Cat#EK1822)进行检测。

检测结果显示，抗TLR4全分子抗体IgG能够明显地抑制LPS诱导的人THP1细胞对TNF-α的表达，计算抑制率＝对照组-实验组/对照组，抗体的抑制率达85.7％(图4)。

体内研究表明，当Balb/c小鼠体内注射0.5mg/kg、1mg/kg和2mg/kg不同浓度的抗TLR4的抗体后，再注射1mg/kg的LPS，分别在不同的时间点检查TNF-α的表达量。结果显示抗TLR4的抗体能够有效抑制LPS诱导的NF-α的表达，小鼠体内90min时TNF-α表达的抑制率为81.1％，120min时TNF-α表达抑制率高达89.9％(图5)。

Claims

1.一种全人源抗TLR4的抗体Fab，包含轻链可变区和重链可变区，其特征在于：

2.根据权利要求1所述的全人源抗TLR4的抗体Fab，其特征在于：所述的轻链可变区的抗原互补区CDR的氨基酸序列为SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示；所述的重链可变区的抗原互补区CDR的氨基酸序列为SEQ ID NO.8，SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。

3.一种全人源抗TLR4的全分子抗体IgG，包含轻链和重链，其特征在于：所述的轻链的氨基酸序列为SEQ ID NO.11所示，所述的重链的氨基酸序列为SEQ ID NO.12所示。

4.一种DNA分子，其编码权利要求3所述的全分子抗体IgG的重链或/和轻链。

5.根据权利要求4所述的DNA分子，其特征在于：其编码轻链可变区的核酸序列为SEQ ID NO.1所示，编码重链可变区的核酸序列为SEQ ID NO.2所示。

6.一种表达载体，包含有权利要求4所述的DNA分子以及与该DNA分子操作性相连的表达调控序列。

7.一种宿主细胞，它被权利要求6所述的表达载体转化。

8.权利要求3所述的全分子抗体IgG在制备抑制TLR4介导的炎症反应的试剂或药物中的用途。

9.一种抑制TLR4介导的炎症反应的药物，其特征在于：该药物的活性成分为权利要求3所述的全分子抗体IgG。