CN111601826A - 针对tigit的抗体及其变体 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了特异性地识别TIGIT的抗体诸如单克隆抗体(mAb)或其抗原结合片段。还提供了药物组合物、或制备和使用所述抗体或其抗原结合片段的方法。

Description

针对TIGIT的抗体及其变体
相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年1月15日提交的国际专利申请号PCT/CN2018/072607的优先权权益，其内容以引用方式整体并入本文。
ASCII文本文件形式的序列表的提交
本申请含有序列表，所述序列表作为ASCII格式的序列表通过EFS-Web以电子方式提交，文件名为“688096.0120Sequence Listing”，且创建日期为2018年1月12日，并且大小为61kb。通过EFS-Web提交的序列表是本说明书的一部分，并且以引用方式整体并入本文。
技术领域
本申请涉及能够与TIGIT蛋白特异性地结合的抗体或其抗原结合片段、以及此类药剂的用途。在一些实施方案中，本申请涉及针对TIGIT的小鼠和人源化单克隆抗体、以及这些抗体的用途。抗体或其抗原结合片段可用作诊断法且可用于治疗与TIGIT的活性和/或表达相关的疾病。
背景技术
免疫系统是一种包含细胞、组织和器官的集合的宿主防御系统，所述细胞、组织和器官共同工作以防御“外来”入侵者或由突变引起的异常细胞的攻击。入侵者主要是引起感染的生物体，诸如细菌、病毒、寄生虫和真菌。免疫系统检测和破坏异常细胞的能力阻止了许多癌症的发展，并有助于抗击癌症。由中枢免疫器官和外周免疫器官构成的免疫系统作为一个单元共同工作，以抗击感染性疾病。抵御数百万结构上不同的外敌的能力表明了免疫系统的复杂性。这种复杂性通过器官、组织、细胞和分子的动态通信网络来实现。这些器官、组织、细胞和分子相互合作，并且使免疫系统保持平衡以抗击外来入侵并同时保持自身耐受性。
免疫检查点蛋白在调控免疫应答以保持自身耐受性和抗击入侵者中起着重要作用。它们是触发或阻断免疫应答的分子。刺激性免疫检查点蛋白促进免疫力，而抑制性免疫检查点蛋白削弱免疫活性并阻止自身免疫性。在T细胞上表达的抑制性免疫检查点蛋白(诸如PD-1和CTLA-4)起着制动器的作用以抑制免疫应答。阻断抑制性免疫检查点蛋白激活T细胞。
人类肿瘤是遗传学和表观遗传学改变组合的结果。当肿瘤细胞形成时，它们表面上的一些抗原可能发生改变。这些所谓的新抗原将被免疫系统检测到，并且将作为外来物被破坏。异常细胞在进展为晚期癌症之前被消除。然而，肿瘤细胞发展出多种逃避和抑制免疫系统的抵抗机制。肿瘤所应用的常见机制是通过过量表达抑制性免疫检查点调节剂来操纵免疫检查点途径。癌症免疫疗法利用宿主的免疫系统来治疗癌症。从激活效应细胞到阻断抑制因子的机制增强免疫系统并产生抗肿瘤活性。阻断抑制性免疫检查点途径的药物已在各种实体瘤中表现出有希望的临床活性。
PD-1和CTLA-4是被广泛研究的两种抑制性免疫检查点蛋白。针对PD-1或CTLA-4的单克隆抗体彻底改变了晚期黑素瘤患者的管理，并已作为针对许多其他癌症的成功癌症治疗而出现。此外，不仅PD-1或CTLA-4的阻断在癌症患者中表现出肿瘤消退应答，而且其他抑制性免疫检查点蛋白(诸如TIM-3、LAG-3或VISTA)的阻断在许多临床前研究中也显示出有效的抗肿瘤响应。这些结果强调了鉴定用于有效的癌症免疫疗法的针对新型抑制性免疫检查点蛋白的抗体的重要性。
具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)是在T细胞和自然杀伤(NK)细胞上都表达的免疫检查点蛋白。TIGIT含有免疫球蛋白(Ig)和基于免疫受体酪氨酸的抑制性基序(ITIM)结构域，并且起着抑制性免疫检查点蛋白的作用，以靶向适应性免疫系统和先天性免疫系统。ITIM已在大量负向调控免疫细胞活性的抑制性受体中表达。这些受体包括免疫球蛋白(Ig)超家族成员、唾液酸结合凝集素样分子(Siglecs)和C型凝集素受体。当含有ITIM的受体与其配体相互作用时，ITIM被Src家族酪氨酸激酶磷酸化。磷酸化的ITIM为含有Src同源性2结构域的磷酸酶(包括SHIP-1、Shp1和Shp2)提供了停靠位点。这些磷酸酶能够使含有免疫受体酪氨酸-基激活基序(ITAM)的受体脱磷酸化和失活。通过这种机制，含有ITIM的受体抑制了从免疫系统中含有ITAM的受体进行信号传导，并阻止了免疫系统的激活。TIGIT由激活的细胞毒性T细胞和调控性T细胞表达，并且可能充当关键的抑制性免疫检查点调节剂，以“关闭”免疫应答。
当CD28和CTLA-4与它们的配体B7-1或B7-2相互作用时具有相反的作用。B7-1或B7-2与CD28的结合对免疫系统具有刺激作用，并且B7-1或B7-2与CTLA-4的结合具有抑制作用。CD226和TIGIT是CD28和CTLA-4的回忆对(reminiscent pair)。CD226和TIGIT的配体是CD112和CD155(也称为PVR)。激活性CD226和失活性TIGIT竞争相同的配体，这可能导致开启或关闭T细胞的精密平衡。
癌症免疫疗法是一种通过增强患者的免疫系统来抗击癌症的治疗。阻断任何抑制性免疫检查点调节剂都将打破平衡，使平衡朝向免疫系统的激活状态倾斜。它是癌症免疫疗法中的工具之一。TIGIT是抑制性免疫检查点调节剂的有前景的新靶标。开发专门针对TIGIT的拮抗抗体将阻断它对T细胞的抑制作用并增强抗击癌症的免疫力。
发明内容
本申请涉及针对TIGIT蛋白的靶向结合剂、及其制备和使用方法。
在一个总的方面，本申请涉及分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含：
(a)重链可变结构域(VH)，所述重链可变结构域包含：
i.重链互补决定区1(CDR1)，所述重链互补决定区1包含选自由SEQ ID NO:27-39组成的组的氨基酸序列；
ii.重链CDR2，所述重链CDR2包含选自由SEQ ID NO:40-52组成的组的氨基酸序列；和
iii.重链CDR3，所述重链CDR3包含选自由SEQ ID NO:53-65组成的组的氨基酸序列；和
(b)轻链可变结构域(VL)，所述轻链可变结构域包含：
i.轻链CDR1，所述轻链CDR1包含选自由SEQ ID NO:66-78组成的组的氨基酸序列；
ii.轻链CDR2，所述轻链CDR2包含选自由SEQ ID NO:79-91组成的组的氨基酸序列；和
iii.轻链CDR3，所述轻链CDR3包含选自由SEQ ID NO:92-104组成的组的氨基酸序列；
其中所述抗体或其抗原结合片段能够特异性地结合TIGIT，优选地人TIGIT。
本发明提供了小鼠单克隆抗体(70A11A8E6)或抗原结合片段，所述单克隆抗体或抗原结合片段特异性地结合人TIGIT并且包含重链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列，所述重链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列分别包含SEQ ID NO:27、40和53的氨基酸序列。与人TIGIT特异性地结合的小鼠单克隆抗体或抗原结合片段还可包含轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列，所述轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列分别包含SEQ ID NO:66、79和92的氨基酸序列。在一个实施方案中，本发明的抗人TIGIT小鼠单克隆抗体包含70A11A8E6的重链和轻链可变结构域，所述重链和轻链可变结构域包含SEQ ID NO:1和14的氨基酸序列。它涵盖了与这些所公开的序列享有至少80％、85％、90％和95％序列同一性的序列。在另一个实施方案中，小鼠单克隆抗体70A11A8E6或抗原结合片段包含以下功能特征：(a)以通过表面等离子体共振(BIAcore)确定的20nM或更小的KD结合人TIGIT；(b)与食蟹猴TIGIT具有交叉反应性；(c)阻断人TIGIT与其配体CD155之间的相互作用；(d)在报告基因测定中激活T细胞；(e)刺激Jurkat细胞中的IL-2产生。
本发明提供了小鼠单克隆抗体(11D8E12A4)或抗原结合片段，所述单克隆抗体或抗原结合片段特异性地结合人TIGIT并且包含重链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列，所述重链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列分别包含SEQ ID NO:28、41和54的氨基酸序列。与人TIGIT特异性地结合的小鼠单克隆抗体或抗原结合片段还可包含轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列，所述轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列分别包含SEQ ID NO:67、80和93的氨基酸序列。在一个实施方案中，本发明的抗人TIGIT小鼠单克隆抗体包含11D8E12A4的重链和轻链可变结构域，所述重链和轻链可变结构域包含SEQ ID NO:2和15的氨基酸序列。它涵盖了与这些所公开的序列享有至少80％、85％、90％和95％序列同一性的序列。在另一个实施方案中，小鼠单克隆抗体11D8E12A4或抗原结合片段包含以下功能特征：(a)以通过表面等离子体共振(BIAcore)确定的20nM或更小的KD结合人TIGIT；(b)与食蟹猴TIGIT具有交叉反应性；(c)阻断人TIGIT与其配体CD155之间的相互作用；(d)在报告基因测定中激活T细胞；(e)刺激Jurkat细胞中的IL-2产生。
本发明提供了小鼠单克隆抗体(16F10H12C11)或抗原结合片段，所述单克隆抗体或抗原结合片段特异性地结合人TIGIT并且包含重链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列，所述重链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列分别包含SEQ ID NO:29、42和55的氨基酸序列。与人TIGIT特异性地结合的小鼠单克隆抗体或抗原结合片段还可包含轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列，所述轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列分别包含SEQ ID NO:68、81和94的氨基酸序列。在一个实施方案中，本发明的抗人TIGIT小鼠单克隆抗体包含16F10H12C11的重链和轻链可变结构域，所述重链和轻链可变结构域包含SEQ ID NO:3和16的氨基酸序列。它涵盖了与这些所公开的序列享有至少80％、85％、90％和95％序列同一性的序列。在另一个实施方案中，小鼠单克隆抗体16F10H12C11或抗原结合片段包含以下功能特征：(a)以通过表面等离子体共振(BIAcore)确定的20nM或更小的KD结合人TIGIT；(b)与食蟹猴TIGIT具有交叉反应性；(c)阻断人TIGIT与其配体CD155之间的相互作用；(d)在报告基因测定中激活T细胞；(e)刺激Jurkat细胞中的IL-2产生。
本发明提供了小鼠单克隆抗体(8F2D8E7)或抗原结合片段，所述单克隆抗体或抗原结合片段特异性地结合人TIGIT并且包含重链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列，所述重链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列分别包含SEQ ID NO:30、43和56的氨基酸序列。与人TIGIT特异性地结合的小鼠单克隆抗体或抗原结合片段还可包含轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列，所述轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列分别包含SEQ ID NO:69、82和95的氨基酸序列。在一个实施方案中，本发明的抗人TIGIT小鼠单克隆抗体包含8F2D8E7的重链和轻链可变结构域，所述重链和轻链可变结构域包含SEQ ID NO:4和17的氨基酸序列。它涵盖了与这些所公开的序列享有至少80％、85％、90％和95％序列同一性的序列。在另一个实施方案中，小鼠单克隆抗体8F2D8E7或抗原结合片段包含以下功能特征：(a)以通过表面等离子体共振(BIAcore)确定的20nM或更小的KD结合人TIGIT；(b)与食蟹猴TIGIT具有交叉反应性；(c)阻断人TIGIT与其配体CD155之间的相互作用；(d)在报告基因测定中激活T细胞；(e)刺激Jurkat细胞中的IL-2产生。
本发明提供了小鼠单克隆抗体(48B5G4E12)或抗原结合片段，所述单克隆抗体或抗原结合片段特异性地结合人TIGIT并且包含重链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列，所述重链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列分别包含SEQ ID NO:31、44和57的氨基酸序列。与人TIGIT特异性地结合的小鼠单克隆抗体或抗原结合片段还可包含轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列，所述轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列分别包含SEQ ID NO:70、83和96的氨基酸序列。在一个实施方案中，本发明的抗人TIGIT小鼠单克隆抗体包含48B5G4E12的重链和轻链可变结构域，所述重链和轻链可变结构域包含SEQ ID NO:5和18的氨基酸序列。它涵盖了与这些所公开的序列享有至少80％、85％、90％和95％序列同一性的序列。在另一个实施方案中，小鼠单克隆抗体48B5G4E12或抗原结合片段包含以下功能特征：(a)以通过表面等离子体共振(BIAcore)确定的20nM或更小的KD结合人TIGIT；(b)与食蟹猴TIGIT具有交叉反应性；(c)阻断人TIGIT与其配体CD155之间的相互作用；(d)在报告基因测定中激活T细胞；(e)刺激Jurkat细胞中的IL-2产生。
本发明提供了小鼠单克隆抗体(139E2C2D2)或抗原结合片段，所述单克隆抗体或抗原结合片段特异性地结合人TIGIT并且包含重链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列，所述重链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列分别包含SEQ ID NO:32、45和58的氨基酸序列。与人TIGIT特异性地结合的小鼠单克隆抗体或抗原结合片段还可包含轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列，所述轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列分别包含SEQ ID NO:71、84和97的氨基酸序列。在一个实施方案中，本发明的抗人TIGIT小鼠单克隆抗体包含139E2C2D2的重链和轻链可变结构域，所述重链和轻链可变结构域包含SEQ ID NO:6和19的氨基酸序列。它涵盖了与这些所公开的序列享有至少80％、85％、90％和95％序列同一性的序列。在另一个实施方案中，小鼠单克隆抗体139E2C2D2或抗原结合片段包含以下功能特征：(a)以通过表面等离子体共振(BIAcore)确定的20nM或更小的KD结合人TIGIT；(b)与食蟹猴TIGIT具有交叉反应性；(c)阻断人TIGIT与其配体CD155之间的相互作用；(d)在报告基因测定中激活T细胞；(e)刺激Jurkat细胞中的IL-2产生。
本发明提供了小鼠单克隆抗体(128E3G7F5)或抗原结合片段，所述单克隆抗体或抗原结合片段特异性地结合人TIGIT并且包含重链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列，所述重链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列分别包含SEQ ID NO:33、46和59的氨基酸序列。它们还包含轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列，所述轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列分别包含SEQ IDNO:72、85和98的氨基酸序列。在一个实施方案中，本发明的抗人TIGIT小鼠单克隆抗体包含128E3G7F5的重链和轻链可变结构域，所述重链和轻链可变结构域包含SEQ ID NO:7和20的氨基酸序列。它涵盖了与这些所公开的序列享有至少80％、85％、90％和95％序列同一性的序列。在另一个实施方案中，小鼠单克隆抗体128E3G7F5或抗原结合片段包含以下功能特征：(a)以通过表面等离子体共振(BIAcore)确定的20nM或更小的KD结合人TIGIT；(b)与食蟹猴TIGIT具有交叉反应性；(c)阻断人TIGIT与其配体CD155之间的相互作用；(d)在报告基因测定中激活T细胞；(e)刺激Jurkat细胞中的IL-2产生。
本发明提供了小鼠单克隆抗体(121C2F10B5)或抗原结合片段，所述单克隆抗体或抗原结合片段特异性地结合人TIGIT并且包含重链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列，所述重链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列分别包含SEQ ID NO:34、47和60的氨基酸序列。与人TIGIT特异性地结合的小鼠单克隆抗体或抗原结合片段还可包含轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列，所述轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列分别包含SEQ ID NO:73、86和99的氨基酸序列。在一个实施方案中，本发明的抗人TIGIT小鼠单克隆抗体包含121C2F10B5的重链和轻链可变结构域，所述重链和轻链可变结构域包含SEQ ID NO:8和21的氨基酸序列。它涵盖了与这些所公开的序列享有至少80％、85％、90％和95％序列同一性的序列。在另一个实施方案中，小鼠单克隆抗体121C2F10B5或抗原结合片段包含以下功能特征：(a)以通过表面等离子体共振(BIAcore)确定的20nM或更小的KD结合人TIGIT；(b)与食蟹猴TIGIT具有交叉反应性；(c)阻断人TIGIT与其配体CD155之间的相互作用；(d)在报告基因测定中激活T细胞；(e)刺激Jurkat细胞中的IL-2产生。
本发明提供了小鼠单克隆抗体(104G12E12G2)或抗原结合片段，所述单克隆抗体或抗原结合片段特异性地结合人TIGIT并且包含重链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列，所述重链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列分别包含SEQ ID NO:35、48和61的氨基酸序列。与人TIGIT特异性地结合的小鼠单克隆抗体或抗原结合片段还可包含轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列，所述轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列分别包含SEQ ID NO:74、87和100的氨基酸序列。在一个实施方案中，本发明的抗人TIGIT小鼠单克隆抗体包含104G12E12G2的重链和轻链可变结构域，所述重链和轻链可变结构域包含SEQ ID NO:9和22的氨基酸序列。它涵盖了与这些所公开的序列享有至少80％、85％、90％和95％序列同一性的序列。在另一个实施方案中，小鼠单克隆抗体104G12E12G2或抗原结合片段包含以下功能特征：(a)以通过表面等离子体共振(BIAcore)确定的20nM或更小的KD结合人TIGIT；(b)与食蟹猴TIGIT具有交叉反应性；(c)阻断人TIGIT与其配体CD155之间的相互作用；(d)在报告基因测定中激活T细胞；(e)刺激Jurkat细胞中的IL-2产生。
本发明提供了小鼠单克隆抗体(83G6H11C12)或抗原结合片段，所述单克隆抗体或抗原结合片段特异性地结合人TIGIT并且包含重链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列，所述重链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列分别包含SEQ ID NO:36、49和62的氨基酸序列。与人TIGIT特异性地结合的小鼠单克隆抗体或抗原结合片段还可包含轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列，所述轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列分别包含SEQ ID NO:75、88和101的氨基酸序列。在一个实施方案中，本发明的抗人TIGIT小鼠单克隆抗体包含83G6H11C12的重链和轻链可变结构域，所述重链和轻链可变结构域包含SEQ ID NO:10和23的氨基酸序列。它涵盖了与这些所公开的序列享有至少80％、85％、90％和95％序列同一性的序列。在另一个实施方案中，小鼠单克隆抗体83G6H11C12或抗原结合片段包含以下功能特征：(a)以通过表面等离子体共振(BIAcore)确定的20nM或更小的KD结合人TIGIT；(b)与食蟹猴TIGIT具有交叉反应性；(c)阻断人TIGIT与其配体CD155之间的相互作用；(d)在报告基因测定中激活T细胞；(e)刺激Jurkat细胞中的IL-2产生。
本发明提供了小鼠单克隆抗体(92E9D4B4)或抗原结合片段，所述单克隆抗体或抗原结合片段特异性地结合人TIGIT并且包含重链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列，所述重链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列分别包含SEQ ID NO:37、50和63的氨基酸序列。与人TIGIT特异性地结合的小鼠单克隆抗体或抗原结合片段还可包含轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列，所述轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列分别包含SEQ ID NO:76、89和102的氨基酸序列。在一个实施方案中，本发明的抗人TIGIT小鼠单克隆抗体包含92E9D4B4的重链和轻链可变结构域，所述重链和轻链可变结构域包含SEQ ID NO:11和24的氨基酸序列。它涵盖了与这些所公开的序列享有至少80％、85％、90％和95％序列同一性的序列。在另一个实施方案中，小鼠单克隆抗体92E9D4B4或抗原结合片段包含以下功能特征：(a)以通过表面等离子体共振(BIAcore)确定的20nM或更小的KD结合人TIGIT；(b)与食蟹猴TIGIT具有交叉反应性；(c)阻断人TIGIT与其配体CD155之间的相互作用；(d)在报告基因测定中激活T细胞；(e)刺激Jurkat细胞中的IL-2产生。
本发明提供了小鼠单克隆抗体(100C4E7D11)或抗原结合片段，所述单克隆抗体或抗原结合片段特异性地结合人TIGIT并且包含重链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列，所述重链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列分别包含SEQ ID NO:38、51和64的氨基酸序列。与人TIGIT特异性地结合的小鼠单克隆抗体或抗原结合片段还可包含轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列，所述轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列分别包含SEQ ID NO:77、90和103的氨基酸序列。在一个实施方案中，本发明的抗人TIGIT小鼠单克隆抗体包含100C4E7D11的重链和轻链可变结构域，所述重链和轻链可变结构域包含SEQ ID NO:12和25的氨基酸序列。SEQ ID NO:105-108的人源化VH序列具有SEQ ID NO:38、51和64的CDR，并且SEQ ID NO:113-117的人源化VL序列具有SEQ ID NO:77、90和103的CDR。它涵盖了与这些所公开的序列享有至少80％、85％、90％和95％序列同一性的序列。在另一个实施方案中，小鼠单克隆抗体100C4E7D11是由SEQ ID NO:12和105-108的VH序列中的一者与SEQ ID NO:25和113-117的VL序列中的一者组合制成的抗体，所述小鼠单克隆抗体100C4E7D11或抗原结合片段包含以下功能特征：(a)以通过表面等离子体共振(BIAcore)确定的20nM或更小的KD结合人TIGIT；(b)与食蟹猴TIGIT具有交叉反应性；(c)阻断人TIGIT与其配体CD155之间的相互作用；(d)在报告基因测定中激活T细胞；(e)刺激Jurkat细胞中的IL-2产生。
本发明提供了小鼠单克隆抗体(64G1E9B4)或抗原结合片段，所述单克隆抗体或抗原结合片段特异性地结合人TIGIT并且包含重链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列，所述重链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列分别包含SEQ ID NO:39、52和65的氨基酸序列。它们还包含轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列，所述轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列分别包含SEQ ID NO:78、91和104的氨基酸序列。在一个实施方案中，本发明的抗人TIGIT小鼠单克隆抗体包含64G1E9B4的重链和轻链可变结构域，所述重链和轻链可变结构域包含SEQ ID NO:13和26的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述抗体包含在SEQ ID NO:52的重链CDR中的一个氨基酸取代，其中所述取代是在位置7D进行，并且其中残基7D被取代成G。在一个实施方案中，所述抗体包含在SEQ ID NO:65的重链CDR中的一个氨基酸取代，其中所述取代是在位置8M进行，并且其中残基8M被取代成F或L。在一个实施方案中，所述抗体包含在SEQ ID NO:78的轻链CDR中的一个氨基酸取代，其中所述取代是在位置1K进行，并且其中残基1K被取代成R。SEQID NO:109-112的人源化VH序列具有SEQ ID NO:39、52和65的CDR，并且SEQ ID NO:118的人源化VL序列具有SEQ ID NO:78、91和104的CDR。在一些实施方案中，可在SEQ ID NO:109-112的VH序列的相应CDR中进行上文所述的CDR取代，并且可在SEQ ID NO:118的VL序列的相应CDR中进行上文所述的CDR取代。它涵盖了与这些所公开的序列享有至少80％、85％、90％和95％序列同一性的序列。在另一个实施方案中，小鼠单克隆抗体64G1E9B4是由SEQ IDNO:13、109-112的或者用上文所提及的CDR取代对其相应CDR进行取代的SEQ ID NO:109-112的VH序列中的一者与SEQ ID NO:26、118的或者用上文所提及的CDR取代对其相应CDR进行取代的SEQ ID NO:118的VL序列中的一者组合制成的抗体，所述小鼠单克隆抗体64G1E9B4或抗原结合片段包含以下功能特征：(a)以通过表面等离子体共振(BIAcore)确定的20nM或更小的KD结合人TIGIT；(b)与食蟹猴TIGIT具有交叉反应性；(c)阻断人TIGIT与其配体CD155之间的相互作用；(d)在报告基因测定中激活T细胞；(e)刺激Jurkat细胞中的IL-2产生。
本申请的抗体或其抗原结合片段可以是啮齿动物的、嵌合的、人的、部分人源化的或完全人源化的。它也可以是双特异性的，其还包含能够与第二抗原诸如CTLA-4、PD-L1、TIM-3或LAG-3特异性地结合的第二抗体部分。优选地，第二抗体部分是单结构域抗体(sdAb)。
进一步提供了药物组合物，所述药物组合物包含本申请的分离的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段中的任一者、以及药学上可接受的载体。
本申请的另一方面提供了一种治疗患有TIGIT相关疾病的个体的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的上文所述的任何一种药物组合物。在一些实施方案中，TIGIT相关疾病是癌症。在一些实施方案中，癌症是实体瘤，诸如结肠癌。在一些实施方案中，所述方法还包括向个体施用另外的癌症疗法，诸如手术、放射、化学疗法、免疫疗法、激素疗法或其组合。在一些实施方案中，TIGIT相关疾病是病原性感染。在一些实施方案中，药物组合物是全身性地(诸如静脉内地(i.v.))施用的。在一些实施方案中，药物组合物是局部地(诸如瘤内地)施用的。在一些实施方案中，个体是人。
根据以下的公开，包括本发明的详细描述及其优选的实施方案以及所附权利要求书，本发明的其它方面、特征和优点将显而易见。
附图说明
图1A-1C描绘了通过对过量表达人TIGIT的CHO细胞的荧光激活细胞分选(FACS)进行的血清抗体滴度测试。从每只经免疫的小鼠收集血清用于滴度测试(图1A：小鼠#8087；图1B：小鼠#8100；图1C：小鼠#8771)。通过对过量表达人TIGIT的CHO细胞进行FACS研究，筛选测试血。具有高TIGIT结合信号的小鼠显示出更高的滴度，并被选择用于细胞融合前的最终加强免疫。
图2A-2M描绘了来自杂交瘤亚克隆的上清液在人TIGIT上的结合(图2A：8F2D8E7；图2B：16F10H12C11；图2C：11D8E12A4；图2D：48B5G4E12；图2E：70A11A8E6；图2F：139E2C2D2；图2G：104G12E12G2；图2H：64G1E9B4；图2I：83G6H11C12；图2J：92E9D4B4；图2K：100C4E7D11；图2L：128E3G7F5；和图2M：121C2F10B5)。通过对过量表达人TIGIT的CHO细胞进行FACS研究，筛选从杂交瘤亚克隆收集的上清液。选择具有高TIGIT结合信号的亚克隆进行纯化。
图3A-3C描绘了小鼠抗人TIGIT单克隆抗体与在CHO-K1细胞中表达的人或食蟹猴TIGIT的结合。与人TIGIT的结合示于图3A和图3B中。与食蟹猴TIGIT的结合示于图3C中。
图4A-4B描绘了小鼠抗人TIGIT单克隆抗体与PVR重组蛋白之间在人TIGIT上的竞争性结合。
图5A-5B描绘了小鼠抗人TIGIT抗体对T细胞激活的中和作用，所述T细胞激活被PVR对在T细胞中过量表达的TIGIT的结合所抑制。由萤光素酶报告基因信号所指示的T细胞激活示于图5A中，并且由IL-2分泌所指示的T细胞激活示于图5B中。
图6A-6B描绘了嵌合的抗人TIGIT单克隆抗体或人源化抗人TIGIT单克隆抗体与在CHO-K1细胞中表达的人或食蟹猴TIGIT的结合。与人TIGIT的结合示于图6A中，并且与食蟹猴TIGIT的结合示于图6B中。
图7描绘了嵌合的抗人TIGIT单克隆抗体或人源化抗人TIGIT单克隆抗体与PVR重组蛋白之间在人TIGIT上的竞争性结合。
图8描绘了嵌合的抗人TIGIT单克隆抗体或人源化抗人TIGIT单克隆抗体对T细胞激活的中和作用。
图9A-9B示出了人源化抗人TIGIT单克隆抗体在C57BL/6人TIGIT KI小鼠的MC38同源模型中的体内功效实验的结果。
具体实施方式
本申请提供了抗人TIGIT单克隆抗体及其应用。本公开涉及小鼠抗人TIGIT单克隆抗体克隆70A11A8E6、11D8E12A4、16F10H12C11、8F2D8E7、48B5G4E12、139E2C2D2、128E3G7F5、121C2F10B5、104G12E12G2、83G6H11C12、92E9D4B4、100C4E7D11、和64G1E9B4的所述重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的基因序列。其也涉及在这些小鼠抗人TIGIT单克隆抗体克隆中的一些上进行人源化或翻译后修饰之后的所述重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的基因序列。本公开涉及产生抗人TIGIT单克隆抗体的方法。
本申请通过将所公开克隆的重链和轻链的可变结构域与人IgG1的恒定区融合来提供嵌合的抗人TIGIT单克隆抗体。本申请提供了小鼠抗人TIGIT单克隆抗体克隆的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的人源化形式。通过将所公开克隆的重链和轻链的人源化可变结构域与人IgG1的恒定区融合来产生人源化抗人TIGIT单克隆抗体。
I.定义
除非相反地明确指出，否则本发明的实施将采用本领域技术内的病毒学、免疫学、微生物学、分子生物学和重组DNA技术的常规方法，所述方法中的许多在下文中出于说明目的进行了描述。文献中对此类技术进行了充分解释。参见例如，Current Protocols inMolecular Biology or Current Protocols in Immunology,John Wiley&Sons,NewYork,N.Y.(2009)；Ausubel等人,Short Protocols in Molecular Biology,第3版,Wiley&Sons,1995；Sambrook和Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第3版,2001)；Maniatis等人Molecular Cloning:A Laboratory Manual(1982)；DNA Cloning:APractical Approach,第I和II卷(D.Glover,编辑)；Oligonucleotide Synthesis(N.Gait,编辑,1984)；Nucleic Acid Hybridization(B.Hames和S.Higgins,编辑,1985)；Transcription and Translation(B.Hames和S.Higgins,编辑,1984)；Animal CellCulture(R.Freshney,编辑,1986)；Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)和其他类似参考文献。
应该注意的是，除非上下文清楚地指明，否则本文和所附权利要求中所用的单数形式“一个/一种”和“所述/该”包括复数引用物。
除非另有指示，否则在一系列要素之前的术语“至少”应理解为是指所述系列中的每个要素。仅使用常规实验，本领域技术人员将认识到或能够确定本文所述的本发明的特定实施方案的许多等同方案。此类等同方案旨在被本发明所涵盖。
在整个本说明书和其随后的权利要求书中，除非上下文另有要求，否则词语“包含(comprise)”以及变体诸如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”将被理解为暗示包括所述整数或步骤或者整数或步骤组，但不排除任何其他整数或步骤或者整数或步骤组。当在本文中使用时，术语“包含(comprising)”可以被术语“含有(containing)”或“包括(including)”代替，或者有时在本文中使用时可以被术语“具有(having)”代替。
当在本文中使用时，“由……组成”排除未在权利要求要素中指明的任何要素、步骤或成分。当在本文中使用时，“基本上由……组成”不排除不实质性地影响权利要求的基本和新颖特征的材料或步骤。每当在本文中在本申请的方面或实施方案的上下文中使用时，“包含(comprising)”、“含有(containing)”、“包括(including)”和“具有(having)”中的任何前述术语可以被术语“由……组成”或“基本上由……组成”替代，以改变本公开的范围。
如本文所用，在多个叙述要素之间的连接词术语“和/或”应理解为涵盖单独的和组合的选项。例如，在两个要素由“和/或”连接的情况下，第一个选项是指第一要素适用而没有第二要素。第二个选项是指第二要素适用而没有第一要素。第三个选项是指第一要素和第二要素一起适用。这些选项中的任何一个都应理解为落入所述含义内，并因此满足如本文所用术语“和/或”的要求。多个选项中超过一个的同时适用也应理解为落入所述含义内，并因此满足术语“和/或”的要求。
除非另有说明，否则任何数值，例如本文所述的浓度或浓度范围，应理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。因此，数值通常包括所述值±10％。例如，1mg/mL的浓度包括0.9mg/mL至1.1mg/mL。同样，1mg/mL至10mg/mL的浓度范围包括0.9mg/mL至11mg/mL。除非上下文另有明确指示，否则如本文所用，使用的数值范围明确地包括所有可能的子范围、该范围之内的所有单个数值，包括此类范围之内的整数和该范围之内的分数。
术语“表位”意指能够特异性地结合至抗体的蛋白质决定簇。表位通常由分子的化学活性表面基团(诸如氨基酸或糖侧链)组成，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。构象性表位和非构象性表位的区别在于，在变性溶剂的存在下，与前者而非后者的结合丧失。
如本文所用，“治疗”(“treatment”或“treating”)是用于获得有益或期望的结果(包括临床结果)的方法。出于本发明的目的，有益或期望的临床结果包括但不限于以下中的一种或多种：减轻由疾病引起的一种或多种症状、削弱疾病程度、稳定疾病(例如，防止或延迟疾病恶化)、防止或延迟疾病扩散(例如，转移)、防止或延迟疾病复发、延迟或减慢疾病进展、改善疾病状态、提供疾病缓解(部分或全部)、减少治疗疾病所需的一种或多种其他药物的剂量、延迟疾病进展、提高生活质量和/或延长存活期。“治疗”还涵盖减少疾病的病理学后果。本发明的方法涵盖了治疗的这些方面中的任何一个或多个。
本文所用的术语“有效量”是指足以治疗特定障碍、病症或疾病(诸如改善、减轻、减少和/或延迟其一种或多种症状)的药剂或药剂组合的量。关于癌症，有效量包括足以引起肿瘤缩小和/或降低肿瘤生长速率(诸如抑制肿瘤生长)或防止或延迟其他不希望的细胞增殖的量。在一些实施方案中，有效量是足以延迟发育的量。在一些实施方案中，有效量是足以防止或延迟复发的量。有效量可在一次或多次施用中进行施用。有效量的药物或组合物可以：(i)减少癌细胞的数量；(ii)缩小肿瘤尺寸；(iii)在一定程度上抑制、阻止、减慢、并优选地停止癌细胞浸润到周围器官中；(iv)抑制(即在一定程度上减慢，并优选地停止)肿瘤转移；(v)抑制肿瘤生长；(vi)防止或延迟肿瘤发生和/或复发；和/或(vii)在一定程度上缓解与癌症相关的一种或多种症状。
术语“抗体”、“抗体部分”或“抗体构建体”以最广义使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、全长抗体及其抗原结合片段，只要它们展现出期望的抗原结合活性即可。
基本的4链抗体单元是由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链构成的异四聚体糖蛋白。IgM抗体由5个基本异四聚体单元以及称为J链的另外多肽组成，并且含有10个抗原结合位点，而IgA抗体包含2-5个基本4链单元，所述基本4链单元可以聚合形成与J链组合的多价聚集物。在IgG的情况下，4链单元通常为约150,000道尔顿。每条L链通过一个共价二硫键与H链连接，而两条H链根据H链同种型通过一个或多个二硫键彼此连接。每条H和L链还具有规则间隔的链内二硫桥。每条H链在N末端具有一个可变结构域(VH)，随后是每条α和γ链的三个恒定结构域(CH)以及μ和ε同种型的四个CH结构域。每条L链在N末端具有一个可变结构域(VL)，随后是在其另一末端的一个恒定结构域。VL与VH对齐，并且CL与重链的第一恒定结构域(CH1)对齐。据信特定的氨基酸残基在轻链可变结构域与重链可变结构域之间形成界面。VH和VL一起配对形成单个抗原结合位点。对于不同类别抗体的结构和特性，参见例如，Basic and Clinical Immunology,第8版,Daniel P.Sties,Abba I.Terr和TristramG.Parsolw(编辑),Appleton&Lange,Norwalk,Conn.,1994,第71页和第6章。根据其恒定结构域的氨基酸序列，可以将来自任何脊椎动物物种的L链分配为两种明显不同的类型(称为κ和λ)中的一种。取决于其重链恒定结构域(CH)的氨基酸序列，可以将免疫球蛋白分配为不同类别或同种型。免疫球蛋白有五个类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，它们分别具有命名为α、δ、ε、γ和μ的重链。根据CH序列和功能的相对小的差异，将γ和α类别进一步分成亚类，例如，人类表达以下亚类：IgG1、IgG2A、IgG2B、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
术语“仅重链抗体”或“HCAb”是指包含重链、但缺乏通常在4链抗体中发现的轻链的功能性抗体。已知骆驼科动物(诸如骆驼、美洲驼或羊驼)产生HCAb。
术语“单结构域抗体”或“sdAb”是指具有三个互补决定区(CDR)的单一抗原结合多肽。单独的sdAb能够与抗原结合，而不与含相应CDR的多肽配对。在一些情况下，单结构域抗体是从骆驼科动物HCAb工程化而成，并且它们的重链可变结构域在本文中被称为“VHH”(重链抗体的重链的可变结构域)。一些VHH也可称为纳米抗体。骆驼科动物sdAb是已知的最小抗原结合抗体片段之一(参见例如，Hamers-Casterman等人,Nature 363:446-8(1993)；Greenberg等人,Nature 374:168-73(1995)；Hassanzadeh-Ghassabeh等人,Nanomedicine(Lond),8:1013-26(2013))。基本的VHH从N末端至C末端具有以下结构：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，其中FR1至FR4分别是指框架区1至4，并且其中CDR1至CDR3是指互补决定区1至3。
“分离的”抗体是已经从其生产环境的组分(例如，天然或重组)中鉴定、分离和/或回收的一种抗体。优选地，分离的多肽不与来自其生产环境中的所有其他组分缔合。其生产环境的污染组分(诸如由重组转染细胞产生的污染组分)是通常干扰抗体的研究、诊断或治疗用途的物质，并且可包括酶、激素以及其他蛋白质或非蛋白质溶质。在优选的实施方案中，多肽将被纯化：(1)至通过例如Lowry方法确定的大于95％(以抗体重量计)，并且在一些实施方案中，至大于99％(以重量计)；(2)至足以通过使用旋转杯测序仪(spinning cupsequenator)获得N末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度；或(3)至使用考马斯蓝或优选地银染在非还原或还原条件下通过SDS-PAGE达到均质。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体，因为将不存在抗体天然环境的至少一种组分。然而，通常，分离的多肽、抗体或构建体将通过至少一个纯化步骤来制备。
抗体的“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的氨基末端结构域。重链和轻链的可变结构域可分别被称为“VH”和“VL”。这些结构域通常是抗体的变化最大的部分(相对于相同类别的其他抗体)，并且含有抗原结合位点。来自骆驼科物种的仅重链抗体具有单个重链可变区，其被称为“VHH”。因此，VHH是VH的一种特殊类型。
术语“可变的”是指可变结构域的某些区段在抗体之间序列差异很大的事实。V结构域介导抗原结合并且限定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，可变性在可变结构域的整个范围内不是均匀分布。相反，它集中在轻链可变结构域和重链可变结构域中的三个称为互补决定区(CDR)或高变区(HVR)的区段中。可变结构域的更高度保守的部分被称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含由三个CDR连接的、主要采用β-折叠构型的四个FR区，所述三个CDR形成环，所述环连接β-折叠结构并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。每条链中的CDR通过FR区紧密结合在一起，并且与另一条链中的CDR一起有助于形成抗体的抗原结合位点(参见Kabat等人,Sequences of Immunological Interest,第五版,National Institute of Health,Bethesda,Md.(1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但是展现出多种效应子功能，诸如抗体参与抗体依赖性细胞毒性。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本上均质的抗体群体中获得的抗体，即，除可以少量存在的可能的天然发生的突变和/或翻译后修饰(例如，异构化、脱酰胺)以外构成群体的单独抗体是相同的。单克隆抗体具有高度特异性，针对单个抗原位点。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除了其特异性之外，单克隆抗体的优势在于它们是由杂交瘤培养物合成的，不受其他免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆”表示从基本均质的抗体群体获得的抗体的特征，并且不应解释为要求通过任何特定方法来生产抗体。例如，可通过多种技术来制备根据本申请使用的单克隆抗体，所述技术包括例如杂交瘤方法(例如,Kohler和Milstein.,Nature,256:495-97(1975)；Hongo等人,Hybridoma,14(3):253-260(1995)；Harlow等人,Antibodies:A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,第2版1988)；Hammerling等人,于：Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier,N.Y.,1981))；重组DNA方法(参见例如，美国专利号4,816,567)；噬菌体展示技术(参见例如，Clackson等人,Nature,352:624-628(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Sidhu等人,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等人,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；和Lee等人,J.Immunol.Methods284(1-2):119-132(2004))；以及在具有编码人免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因座或基因的部分或全部的动物中生产人抗体或类人抗体的技术(参见例如WO 1998/24893；WO 1996/34096；WO 1996/33735；WO 1991/10741；Jakobovits等人,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 90:2551(1993)；Jakobovits等人,Nature 362:255-258(1993)；Bruggemann等人,Year in Immunol.7:33(1993)；美国专利号5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；和5,661,016；Marks等人,Bio/Technology 10:779-783(1992)；Lonberg等人,Nature 368:856-859(1994)；Morrison,Nature 368:812-813(1994)；Fishwild等人,Nature Biotechnol.14:845-851(1996)；Neuberger,Nature Biotechnol.14:826(1996)；以及Lonberg和Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995)。
术语“全长抗体”、“完整抗体”或“整个抗体”可互换使用，是指与抗体片段相反，呈基本完整的形式的抗体。具体地，全长4链抗体包括具有包含Fc区的重链和轻链的那些抗体。仅全长重链抗体包括重链(诸如VHH)和Fc区。恒定结构域可以是天然序列恒定结构域(例如，人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。在一些情况下，完整抗体可以具有一种或多种效应子功能。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选地完整抗体的抗原结合和/或可变区。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；双抗体；线性抗体(参见美国专利号5,641,870，实施例2；Zapata等人,Protein Eng.8(10):1057-1062[1995])；单链抗体分子；单结构域抗体(诸如VHH)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。木瓜蛋白酶对抗体的消化产生了两个相同的抗原结合片段(称为“Fab”片段)、和一个残留的“Fc”片段(此名称反映了容易结晶的能力)。Fab片段由完整的L链以及H链的可变区结构域(VH)和一个重链的第一恒定结构域(CH1)构成。每个Fab片段就抗原结合而言是单价的，即，其具有单个抗原结合位点。胃蛋白酶对抗体的处理产生单个大的F(ab′)2片段，所述片段大致对应于具有不同抗原结合活性且仍能够交联抗原的两个由二硫键连接的Fab片段。Fab'片段与Fab片段的区别在于其在CH1结构域的羧基末端具有一些另外的残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab′-SH是本文中对Fab'的命名，其中恒定结构域的一个或多个半胱氨酸残基带有游离的硫醇基团。F(ab′)2抗体片段最初是以Fab'片段对产生的，所述Fab'片段在它们之间具有多个铰链半胱氨酸。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。
Fc片段包含两条H链通过二硫键结合在一起的羧基末端部分。抗体的效应子功能由Fc区中的序列决定，所述Fc区也被某些类型的细胞上发现的Fc受体(FcR)识别。
术语“恒定结构域”是指免疫球蛋白分子的一部分，所述部分相对于所述免疫球蛋白的另一部分(即可变结构域)具有更保守的氨基酸序列，其含有抗原结合位点。恒定结构域含有重链的CH1、CH2和CH3结构域(统称为CH)以及轻链的CHL(或CL)结构域。
根据其恒定结构域的氨基酸序列，可以将来自任何哺乳动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”分配为两种明显不同的类型(称为卡帕(“κ”)和兰布达(“λ”))中的一种。
“Fv”是最小的抗体片段，其含有完整的抗原识别和结合位点。此片段由通过紧密的非共价缔合的一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域的二聚体构成。从这两个结构域的折叠中产生六个高变环(来自H链和L链各3个环)，所述高变环为抗原结合贡献氨基酸残基并向抗体赋予抗原结合特异性。然而，即使单个可变结构域(或仅包含对抗原特异的三个CDR的一半Fv)也具有识别和结合抗原的能力，但是亲和力低于整个结合位点。
“单链Fv”也缩写为“sFv”或“scFv”，是包含连接到单个多肽链中的VH和VL抗体结构域的抗体片段。优选地，sFv多肽还包含在VH与VL结构域之间的多肽接头，所述多肽接头使sFv能够形成期望的抗原结合结构。关于sFv的综述，参见Pluckthun于The Pharmacologyof Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编辑,Springer-Verlag,NewYork,第269-315页(1994)。
本文所述抗体的“功能片段”包含完整抗体的一部分，通常包括完整抗体的抗原结合或可变区、或者保留或具有经修饰的FcR结合能力的抗体Fc区。抗体片段的实例包括线性抗体、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。
术语“双抗体”是指通过以下方式制备的小抗体片段：用VH与VL结构域之间的短接头(约5-10个残基)构建sFv片段(参见前述段落)，使得V结构域的链间而非链内配对得以实现，从而产生二价片段，即具有两个抗原结合位点的片段。双特异性双抗体是两个交叉sFv片段的异二聚体，其中两种抗体的VH和VL结构域存在于不同多肽链上。在以下参考文献中对双抗体进行了更详细地描述：例如EP 404,097；WO 93/11161；Hollinger等人,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。
本文的单克隆抗体具体地包括如下“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中一部分重链和/或轻链与源自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，然而一条或多条链的其余部分与源自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体以及此类抗体的片段中的相应序列相同或同源，只要它们展现出期望的生物活性即可(美国专利号4,816,567；Morrison等人,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))。“人源化抗体”被用作“嵌合抗体”的子集。
非人(例如，美洲驼或骆驼科动物)抗体的人源化形式是含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列的抗体。在一些实施方案中，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受的CDR(下文定义)的残基被来自具有期望的特异性、亲和力和/或能力的、非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、兔、骆驼、美洲驼、羊驼、或非人灵长类动物CDR的残基替代。在一些情况下，人免疫球蛋白的框架(“FR”)残基被相应的非人残基替代。此外，人源化抗体可包含在受体抗体中或在供体抗体中未发现的残基。可以进行这些修饰以进一步改善抗体性能，诸如结合亲和力。通常，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个(并且通常两个)可变结构域，其中所有或基本上所有的高变环对应于非人免疫球蛋白序列的那些高变环，并且所有或基本上所有的FR区是人免疫球蛋白序列的那些FR区，但是FR区可包括一个或多个改善抗体性能(诸如结合亲和力、异构化、免疫原性等)的单独的FR残基取代。在FR中的这些氨基酸取代的数量通常在H链中不超过6个，并且在L链中不超过3个。人源化抗体任选地还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)(通常人免疫球蛋白的恒定区)的至少一部分。关于进一步的细节，参见例如，Jones等人,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature 332:323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。还参见例如，Vaswani和Hamilton,Ann.Allergy,Asthma&Immunol.1:105-115(1998)；Harris,Biochem.Soc.Transactions23:1035-1038(1995)；Hurle和Gross,Curr.Op.Biotech.5:428-433(1994)；和美国专利号6,982,321和7,087,409。
“人抗体”是拥有与由人产生的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列和/或已经使用制备如本文所公开的人抗体的任何技术制备的抗体。人抗体的此定义特别排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。可以使用本领域已知的各种技术来生产人抗体，所述技术包括噬菌体展示文库。Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.,222:581(1991)。也可用于制备人单克隆抗体的方法描述于以下参考文献中：Cole等人,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,第77页(1985)；Boerner等人,J.Immunol.,147(1):86-95(1991)。还参见van Dijk和van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.,5:368-74(2001)。可以通过以下方式来制备人抗体：将抗原施用至已被修饰以响应于抗原攻击而产生此类抗体、但其内源基因座已被禁用的转基因动物，例如免疫的异种小鼠(xenomice)(关于XENOMOUSETM技术，参见例如，美国专利号6,075,181和6,150,584)。关于通过人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体，还参见例如，Li等人,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)。
当在本文中使用时，术语“高变区”、“HVR”或“HV”是指抗体可变结构域中序列是高变的和/或形成结构上限定的环的区域。通常，单结构域抗体包含三个HVR(或CDR)：HVR1(或CDR1)、HVR2(或CDR2)和HVR3(或CDR3)。HVR3(或CDR3)在三种HVR中显示出最多的多样性，并且被认为在向抗体赋予精细特异性方面起着独特的作用。参见例如，Hamers-Casterman等人,Nature 363:446-448(1993)；Sheriff等人,Nature Struct.Biol.3:733-736(1996)。
术语“互补决定区”或“CDR”用于指由Kabat系统所定义的高变区。参见Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)。
许多HVR描述正在使用中，并被本文所涵盖。Kabat互补决定区(CDR)是基于序列变异性，并且是最常用的(Kabat等人,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。相反，Chothia是指结构环的位置(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。AbM HVR代表了Kabat HVR与Chothia结构环之间的折衷，并且被OxfordMolecular的AbM抗体建模软件所使用。“contact”HVR是基于对可用复杂晶体结构的分析。来自这些HVR中的每一者的残基在下表1中列出。
表1.HVR描述
Figure BDA0002584023080000261
HVR可以包含以下“扩展HVR”：在VL中的24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)和89-97或89-96(L3)、以及在VH中的26-35(H1)、50-65或49-65(H2)和93-102、94-102、或95-102(H3)。对于这些定义中的每一个，可变结构域残基均根据Kabat等人,同上进行编号。
单结构域抗体(诸如VHH)的氨基酸残基根据由Kabat等人(“Sequence ofproteins of immunological interest”,US Public Health Services,NIH Bethesda,Md.,出版号91)给出的对VH结构域的通用编号进行编号，如应用于以下的文章中来自骆驼科动物的VHH结构域：Riechmann和Muyldermans,J.Immunol.Methods 2000年6月23日；240(1-2):185-195。根据此编号，VHH的FR1包含在位置1-30的氨基酸残基，VHH的CDR1包含在位置31-35的氨基酸残基，VHH的FR2包含在位置36-49的氨基酸，VHH的CDR2包含在位置50-65的氨基酸残基，VHH的FR3包含在位置66-94的氨基酸残基，VHH的CDR3包含在位置95-102的氨基酸残基，并且VHH的FR4包含在位置103-113的氨基酸残基。在此方面，应当注意的是—如本领域中对于VH结构域和对于VHH结构域所熟知的—在每个CDR中的氨基酸残基总数可以变化并且不能对应于由Kabat编号所指示的氨基酸残基总数(即，根据Kabat编号的一个或多个位置在实际序列中不能被占据，或者实际序列中所含的氨基酸残基可能多于Kabat编号所允许的数量)。
表述“如Kabat中的可变结构域残基编号”或“如Kabat中的氨基酸位置编号”及其变体是指在Kabat等人,同上中用于抗体汇编的重链可变结构域或轻链可变结构域的编号系统。使用此编号系统，实际的线性氨基酸序列可以含有较少或另外的氨基酸，其对应于可变结构域的FR或HVR中的缩短或插入。例如，重链可变结构域可包括在H2的残基52之后的单个氨基酸插入物(根据Kabat的残基52a)和在重链FR残基82之后的插入残基(例如，根据Kabat的残基82a、82b和82c等)。对于给定抗体，可以通过在抗体序列的同源性区域与“标准”Kabat编号序列进行比对来确定残基的Kabat编号。
除非在本文中另有指示，否则免疫球蛋白重链中的残基编号是如Kabat等人,同上中的EU索引的编号。“如Kabat中的EU索引”是指人IgG1 EU抗体的残基编号。
“框架”或“FR”残基是除本文所定义的HVR残基以外的那些可变结构域残基。
“人共有框架”或“受体人框架”是代表在选择人免疫球蛋白VL或VH框架序列中最常出现的氨基酸残基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列的选择来自可变结构域序列的亚组。通常，序列的亚组是如在以下参考文献中的亚组：Kabat等人,Sequences of Proteinsof Immunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.(1991)。实例包括如在Kabat等人,同上中，对于VL，亚组可以是亚组κI、κII、κIII或κIV。另外地，如在Kabat等人中，对于VH，亚组可以是亚组I、亚组II或亚组III。另选地，人共有框架可衍生自上述那些，其中特定残基，诸如当人框架残基是通过将供体框架序列与各种人框架序列的集合比对基于其与供体框架的同源性来选择时。“衍生自”人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架可包含其相同的氨基酸序列，或者其可含有预先存在的氨基酸序列变化。在一些实施方案中，预先存在的氨基酸变化的数量是10或更少、9或更少、8或更少、7或更少、6或更少、5或更少、4或更少、3或更少、或2或更少。
“亲和力成熟的”抗体是在其一个或多个CDR中具有一个或多个改变的一种抗体，所述一个或多个改变导致与不拥有一个或多个那些改变的亲本抗体相比抗体对抗原的亲和力得到改善。在一些实施方案中，亲和力成熟的抗体对靶抗原具有纳摩尔或甚至皮摩尔的亲和力。亲和力成熟的抗体通过本领域已知的程序产生。例如，Marks等人,Bio/Technology 10:779-783(1992)描述了通过VH-和VL-结构域改组的亲和力成熟。CDR和/或框架残基的随机诱变被例如以下参考文献所描述：Barbas等人Proc Nat’l.Acad.Sci.USA91:3809-3813(1994)；Schier等人Gene 169:147-155(1995)；Yelton等人J.Immunol.155:1994-2004(1995)；Jackson等人,J.Immunol.154(7):3310-9(1995)；和Hawkins等人,J.Mol.Biol.226:889-896(1992)。
如本文所用，术语“特异性地结合”、“特异性地识别”或“对……特异”是指可测量和可再现的相互作用诸如靶标与抗原结合蛋白(诸如mAb)之间的结合，所述结合决定了在包括生物分子的异质分子群体的存在下所述靶标的存在。例如，特异性地结合靶标(其可以是表位)的抗原结合蛋白(诸如mAb)是以更大的亲和力、亲合力、更容易地和/或以比其结合其他靶标更长的持续时间结合此靶标的抗原结合蛋白(诸如mAb)。在一些实施方案中，如例如通过放射免疫测定(RIA)所测量，抗原结合蛋白(诸如mAb)与不相关靶标的结合程度为所述抗原结合蛋白(诸如mAb)与所述靶标的结合的小于约10％。在一些实施方案中，特异性地结合靶标的抗原结合蛋白(诸如mAb)具有以下解离常数(KD)：≤10-5M、≤10-6M、≤10-7M、≤10-8M、≤10-9M、≤10-10M、≤10-11M、或≤10-12M。在一些实施方案中，抗原结合蛋白特异性地结合蛋白质上的表位，所述表位在来自不同物种的蛋白质中是保守的。在一些实施方案中，特异性结合可以包括但不要求排他结合。
术语“特异性”是指抗原结合蛋白(诸如mAb)对抗原的特定表位的选择性识别。例如，天然抗体是单特异性的。如本文所用，术语“多特异性”表示抗原结合蛋白具有多表位特异性(即，能够与一个生物分子上的两个、三个或更多个不同的表位特异性地结合，或者能够与两种、三种或更多种不同的生物分子上的表位特异性地结合)。如本文所用，“双特异性”表示抗原结合蛋白具有两种不同的抗原结合特异性。除非另有指示，否则所述抗原被所列出的双特异性抗体结合的顺序是任意的。也就是说，例如，术语“抗TIGIT/PD-L1”、“抗PD-L1/TIGIT”、“TIGIT×PD-L1”、“PD-L1×TIGIT”、“PD-L1-TIGIT”和“TIGIT-PD-L1”可互换使用，是指特异性地结合TIGIT和PD-L1二者的双特异性抗体。如本文所用，术语“单特异性”表示具有一个或多个结合位点的抗原结合蛋白(诸如mAb)，每个结合位点结合相同抗原的相同表位。
如本文所用，术语“价”表示抗原结合蛋白中存在指定数量的结合位点。例如天然抗体或全长抗体具有两个结合位点并且是二价的。这样，术语“三价”、“四价”、“五价”和“六价”分别表示在抗原结合蛋白中存在两个结合位点、三个结合位点、四个结合位点、五个结合位点和六个结合位点。
“抗体效应子功能”是指归因于抗体Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的那些生物活性，并且随抗体同种型而变化。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；下调细胞表面受体(例如，B细胞受体)；和B细胞激活。“降低的或最小化的”抗体效应子功能意指其从野生型或未经修饰的抗体降低至少50％(另选地，60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％)。抗体效应子功能的确定是本领域普通技术人员可容易确定和测量的。在一个优选的实施方案中，补体结合、补体依赖性细胞毒性和抗体依赖性细胞毒性的抗体效应子功能受到影响。在一些实施方案中，通过在恒定区中消除糖基化的突变(例如，“无效应子突变(effector-less mutation)”来消除效应子功能。在一个方面，无效应子突变包含在CH2区中的N297A或DANA突变(D265A和/或N297A)。Shields等人,J.Biol.Chem.276(9):6591-6604(2001)。另选地，导致效应子功能降低或消除的另外突变包括：K322A和L234A/L235A(LALA)。另选地，效应子功能可通过生产技术来降低或消除，所述生产技术例如为在不进行糖基化或者其中导致在促进效应子功能方面无效或不太有效的改变的糖基化模式的宿主细胞(例如，大肠杆菌)中表达(例如，Shinkawa等人,J.Biol.Chem.278(5):3466-3473(2003)。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或ADCC是指细胞毒性的一种形式，其中分泌的Ig与某些细胞毒性细胞(例如自然杀伤(NK)细胞、中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)结合使这些细胞毒性效应细胞能够特异性地结合携带抗原的靶细胞并随后用细胞毒素杀伤所述靶细胞。抗体“武装”细胞毒性细胞，并且是通过这种机制杀伤靶细胞所必需的。用于介导ADCC的主要细胞(NK细胞)仅表达FcγRIII，然而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Fc在造血细胞上的表达总结于以下参考文献的第464页的表3中：Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)。为了评估感兴趣分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测定，诸如在美国专利号5,500,362或5,821,337中所述的测定。用于此类测定的有用的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。另选地或另外地，可在例如动物模型中在体内评估感兴趣分子的ADCC活性，所述动物模型例如为在以下参考文献中所公开的动物模型：Clynes等人,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 95:652-656(1998)。
本文中的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C末端区域，包括天然序列Fc区和变体Fc区。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可以变化，但是通常将人IgG重链Fc区定义为从位置Cys226的氨基酸残基或从Pro230延伸至其羧基末端。可以例如在抗体的生产或纯化期间，或者通过重组工程化编码抗体重链的核酸来去除Fc区的C末端赖氨酸(根据EU编号系统的残基447)。因此，完整抗体的组合物可以包含去除了所有K447残基的抗体群体，没有去除K447残基的抗体群体、以及具有带有和不带有K447残基的抗体混合物的抗体群体。可用于本文所述抗体的合适的天然序列Fc区包括人IgG1、IgG2(IgG2A、IgG2B)、IgG3和IgG4。
“Fc受体”或“FcR”描述了结合抗体Fc区的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。此外，优选的FcR是结合IgG抗体的一种FcR(γ受体)并且包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体和另选地剪接形式，FcγRII受体包括FcγRIIA(“激活受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，它们具有主要区别在于其胞质结构域的相似氨基酸序列。激活受体FcγRIIA在其胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。参见M.
Figure BDA0002584023080000311
Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997)。在以下参考文献中对FcR进行了综述：Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)；Capel等人,Immunomethods 4:25-34(1994)；和de Haas等人,J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)。本文中的术语“FcR”涵盖了其他FcR，包括将来将被鉴定的那些。
术语“Fc受体”或“FcR”还包括负责将母体IgG转移至胎儿的新生儿受体FcRn。Guyer等人,J.Immunol.117:587(1976)和Kim等人,J.Immunol.24:249(1994)。测量与FcRn结合的方法是已知的(参见例如，Ghetie和Ward,Immunol.Today 18:(12):592-8(1997)；Ghetie等人,Nature Biotechnology 15(7):637-40(1997)；Hinton等人,J.Biol.Chem.279(8):6213-6(2004)；WO 2004/92219(Hinton等人)。例如在表达人FcRn的转基因小鼠或转染的人细胞系中，或者在施用了具有变体Fc区的多肽的灵长类动物中，可以测定与FcRn的体内结合和人FcRn高亲和力结合多肽的血清半衰期。WO 2004/42072(Presta)描述了改善或减少与FcR的结合的抗体变体。还参见例如，Shields等人,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指在补体的存在下对靶细胞的裂解。经典补体途径的激活是通过补体系统(C1q)的第一组分与结合其同源抗原的抗体(适当的亚类)的结合引发的。为了评估补体激活，可进行例如在Gazzano-Santoro等人,J.Immunol.Methods202:163(1996)中所描述的CDC测定。具有改变的Fc区氨基酸序列和增加或减少的C1q结合能力的抗体变体描述于美国专利号6,194,551B1和WO99/51642中。将那些专利出版物的内容以引用方式特别地并入。还参见Idusogie等人J.Immunol.164:4178-4184(2000)。
“结合亲和力”通常是指分子(例如，抗体)的单个结合位点与其结合伴侣(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有指示，否则如本文所用，“结合亲和力”是指反映结合对成员之间1:1相互作用的固有结合亲和力。结合亲和力可以用KD、Koff、Kon、或Ka表示。如本文所用，术语“Koff”旨在是指如从动力学选择装配(kinetic selection setup)所确定，以s-1为单位表示的、抗体(或抗原结合结构域)从抗体/抗原复合物解离的解离速率常数。如本文所用，术语“Kon”旨在是指以M-1s-1为单位表示的、抗体(或抗原结合结构域)与抗原缔合形成抗体/抗原复合物的结合速率常数。如本文所用，术语平衡解离常数“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离常数，并且描述了在平衡时占据在抗体分子溶液中存在的所有抗体结合结构域的一半所需的抗原浓度，并且等于Koff/Kon，以M为单位表示。KD的测量预先假定所有结合剂都在溶液中。在抗体被栓系至细胞壁的情况下，例如在酵母表达系统中，相应的平衡速率常数表达为EC50，其给出了对KD的很好估计。亲和常数Ka是解离常数KD的倒数，以M-1为单位表示。
将解离常数(KD)用作指示抗体对抗原的亲和力的指标。例如，使用多种标记药剂标记的抗体通过Scatchard方法，以及通过使用BiacoreX(由Amersham Biosciences制造)(其是成药测量试剂盒)或类似试剂盒根据试剂盒随附的用户手册和实验操作方法，可进行简单分析。可使用这些方法推导出的KD值以M(摩尔/升)为单位表示。特异性地结合靶标的抗体或其抗原结合片段可具有以下解离常数(KD)：例如≤10-5M、≤10-6M、≤10-7M、≤10-8M、≤10-9M、≤10-10M、≤10-11M、或≤10-12M。
抗体或抗原结合结构域的结合特异性可以通过本领域已知的方法通过实验进行确定。此类方法包括但不限于蛋白质印迹、ELISA-、RIA-、ECL-、IRMA-、EIA-、BIAcore-测试和肽扫描。
半数最大抑制浓度(IC50)是物质(诸如抗体)在抑制特定生物或生化功能方面的有效性的量度。它表明抑制给定的生物过程(例如，PD-L1与B7-1之间的结合，或过程的组分，即酶、细胞、细胞受体或微生物)的一半所需要多少特定药物或其他物质(抑制剂，诸如抗体)。所述值通常表示为摩尔浓度。对于激动剂药物或其他物质(诸如抗体)，IC50可与EC50相差无几。EC50还代表获得体内最大作用的50％所需的血浆浓度。如本文所用，“IC50”用于指示在体外中和50％的抗原生物活性(诸如PD-L1生物活性)所需的抗体(诸如抗PD-L1mAb)的有效浓度。可以通过生物测定来测量IC50或EC50，所述生物测定例如为通过FACS分析抑制配体结合(竞争结合测定)、基于细胞的细胞因子释放测定、或放大的发光邻近均质测定(AlphaLISA)。
关于肽、多肽或抗体序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”和“同源性”被定义为在比对序列并引入缺口(如果必要)以获得最大的序列同一性百分比之后，并且不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分时，候选序列中的氨基酸残基与特定的肽或多肽序列中的氨基酸残基相同的百分比。出于确定氨基酸序列同一性百分比目的的比对可通过本领域技术范围内的各种方式来实现，所述方式例如为使用公众可获得的计算机软件诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGNTM(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定用于测量比对的适当参数，包括在所比较的全长序列上实现最大比对所需的任何算法。
编码本文所述的构建体、抗体或其抗原结合片段的“分离的”核酸分子是从在生产其的环境中通常与其相关的至少一种污染核酸分子中鉴定并分离的核酸分子。优选地，分离的核酸不与生产环境相关的所有组分缔合。编码本文所述的多肽和抗体的分离的核酸分子处于不同于其天然发现的形式或背景的形式。因此，分离的核酸分子不同于编码天然存在于细胞中的本文所述的多肽和抗体的核酸。分离的核酸包括在通常含有核酸分子的细胞中所含的核酸分子，但是所述核酸分子存在于染色体外或与其天然染色体位置不同的染色体位置。
如本文所用，术语“载体”是指能够繁殖与其连接的另一核酸的核酸分子。所述术语包括作为自我复制核酸结构的载体，以及掺入已引入其的宿主细胞基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作地连接的核酸的表达。此类载体在本文中被称为“表达载体”。
如本文所用，术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指将外源核酸转移到或引入宿主细胞中的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经用外源核酸转染、转化或转导的一种细胞。所述细胞包括原代受试细胞及其后代。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指已向其中引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和从其衍生的后代，而与传代次数无关。后代的核酸内容物不能与亲代细胞完全相同，但可以含有突变。在本文中包括具有与在原始转化细胞中筛选或选择的功能或生物活性相同的功能或生物活性的突变后代。
“辅助背景”是指个体已具有癌症病史且通常(但不一定)对疗法有反应的临床背景，所述疗法包括但不限于手术(例如，手术切除)、放射疗法和化学疗法。然而，由于他们的癌症病史，这些个体被认为有发生疾病的风险。在“辅助背景”中的治疗或施用是指随后的治疗方式。风险程度(例如，当在辅助背景中的个体被认为处于高风险或低风险时)取决于几个因素，最通常是首次治疗时的疾病程度。
“新辅助背景”是指其中在基本/确定性疗法之前进行所述方法的临床背景。
术语“药物组合物”的“药物制剂”是指这样的制剂，其处于允许活性成分的生物活性有效的这样的形式，并且其不含有对将被施用所述制剂的受试者具有不可接受的毒性的另外组分。此类的制剂是无菌的。“无菌”制剂是无菌的或不含所有活的微生物及其孢子。
应当理解，本文所述的本发明实施方案包括“由实施方案组成”和/或“基本上由实施方案组成”。
本文中提及“约”值或参数包括(并描述)针对该值或参数本身的变化。例如，提及“约X”的描述包括对“X”的描述。
如本文所用，提及“不是”值或参数通常意指并描述“除值或参数以外”。例如，所述方法不用于治疗X型癌症意味着所述方法用于治疗除X型以外类型的癌症。
本文所用的术语“约X-Y”具有与“约X至约Y”相同的含义。
II.抗TIGIT构建体
抗TIGIT单克隆抗体
本文所述的分离的抗TIGIT构建体包含特异性地识别或结合TIGIT的单克隆抗体(mAb)部分(或“抗TIGIT mAb”)。在本发明的一些实施方案中，分离的抗TIGIT构建体是全长IgG。
TIGIT
结构与更大的PVR-连接蛋白分子家族相似，TIGIT蛋白包含细胞外IgV结构域、1型跨膜区和含有ITIM的胞质尾部和免疫球蛋白尾部酪氨酸(ITT)样基序。通过CD155连接TIGIT诱导通过Fyn和Lck对TIGIT磷酸化和通过胞质衔接子Grb2募集SHIP1。将SHIP1募集到TIGIT尾部阻止信号通过PI3K和MAPK途径进行转导，并导致NK细胞抑制。另外地，在磷酸化后，TIGIT的ITT样基序结合β-抑制蛋白2并募集SHIP1以限制NF-κB信号传导。Genbank登录号NP_776160.2公开了人TIGIT的示例性氨基酸序列。
根据本发明的实施方案，人TIGIT序列与Genbank登录号NP_776160.2的人TIGIT具有至少90％的氨基酸序列同一性，并且当与其他物种(例如鼠)的TIGIT氨基酸序列相比时含有鉴定所述氨基酸序列为人的氨基酸残基。在一些实施方案中，人TIGIT与Genbank登录号NP_776160.2的TIGIT可具有至少约95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，人TIGIT序列将显示出与Genbank登录号NP_776160.2的TIGIT不超过10个氨基酸差异。在一些实施方案中，人TIGIT可显示出与Genbank登录号NP_776160.2的TIGIT不超过5、4、3、2或1个氨基酸差异。可以如本文所述确定同一性百分比。在一些实施方案中，本文所述的抗TIGIT mAb特异性地结合与Genbank登录号NP_776160.2的TIGIT具有100％氨基酸序列同一性的TIGIT多肽。在一些实施方案中，本申请的抗TIGIT mAb特异性地结合包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列的TIGIT多肽。
在一些实施方案中，本申请的抗TIGIT mAb可与来自除人以外的物种的TIGIT或跟人TIGIT在结构上相关的其他蛋白质(例如，人TIGIT同源物)进行交叉反应。在一些实施方案中，本申请的抗TIGIT mAb对人TIGIT是完全特异的，并且不展现出物种或其他类型的交叉反应性。
抗体亲和力
抗体或抗原结合结构域的结合特异性可通过本领域已知的方法通过实验进行确定。此类方法包括但不限于蛋白质印迹、ELISA-、RIA-、ECL-、IRMA-、EIA-、BIAcore-测试和肽扫描。
在一些实施方案中，抗TIGIT mAb与TIGIT之间的结合的KD为约10-5M至约10-6M、约10-6M至约10-7M、约10-7M至约10-8M、约10-8M至约10-9M、约10-9M至约10-10M、约10-10M至约10- 11M、约10-11M至约10-12M、约10-5M至约10-12M、约10-6M至约10-12M、约10-7M至约10-12M、约10-8M至约10-12M、约10-9M至约10-12M、约10-10M至约10-12M、约10-5M至约10-11M、约10-7M至约10-11M、约10-8M至约10-11M、约10-9M至约10-11M、约10-5M至约10-10M、约10-7M至约10-10M、约10-8M至约10-10M、约10-5M至约10-9M、约10-7M至约10-9M、约10-5M至约10-8M、或约10-6M至约10-8M。
在一些实施方案中，抗TIGIT mAb与TIGIT之间的结合的Kon为约102M-1s-1至约104M-1s-1、约104M-1s-1至约106M-1s-1、约106M-1s-1至约107M-1s-1、约102M-1s-1至约107M-1s-1、约103M- 1s-1至约107M-1s-1、约104M-1s-1至约107M-1s-1、约105M-1s-1至约107M-1s-1、约103M-1s-1至约106M- 1s-1、或约104M-1s-1至约106M-1s-1。
在一些实施方案中，抗TIGIT mAb与TIGIT之间的结合的Koff为约1s-1至约10-2s-1、约10-2s-1至约10-4s-1、约10-4s-1至约10-5s-1、约10-5s-1至约10-6s-1、约1s-1至约10-6s-1、约10- 2s-1至约10-6s-1、约10-3s-1至约10-6s-1、约10-4s-1至约10-6s-1、约10-2s-1至约10-5s-1、或约10- 3s-1至约10-5s-1。
在一些实施方案中，在抗TIGIT mAb竞争性地阻断CD155(也称为PVR；0.5μg/ml)在过量表达人TIGIT的CHO-K1细胞上的结合的FACS研究中，抗TIGIT mAb的IC50为小于10nM。在一些实施方案中，在通过FACS分析的配体结合抑制(竞争结合测定)或基于细胞的细胞因子释放测定中，抗TIGIT mAb的IC50为小于500nM。在一些实施方案中，抗TIGIT mAb的IC50为小于1nM、约1nM至约10nM、约10nM至约50nM、约50nM至约100nM、约100nM至约200nM、约200nM至约300nM、约300nM至约400nM、或约400nM至约500nM。
嵌合或人源化抗体
在一些实施方案中，本文提供的抗TIGIT抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体描述于例如，美国专利号4,816,567；和Morrison等人,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))中。在一个实例中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，源自骆驼科动物物种诸如美洲驼的可变区)和人恒定区。在另外的实例中，嵌合抗体是其中类别或亚类已经从亲本抗体的类别或亚类发生改变的“类别转换”抗体。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在一些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，将非人抗体人源化以减少对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中HVR(例如CDR)(或其部分)衍生自非人抗体，并且FR(或其部分)衍生自人抗体序列。人源化抗体任选地还将包含人恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如，衍生出HVR残基的抗体)的相应残基取代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其制备方法在以下参考文献中进行了综述：例如，Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)，并且在以下参考文献中进一步进行了描述：例如，Riechmann等人,Nature 332:323-329(1988)；Queen等人,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA 86:10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321、和7,087,409；Kashmiri等人,Methods 36:25-34(2005)(描述SDR(a-CDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述“表面重塑(resurfacing)”)；Dall’Acqua等人,Methods 36:43-60(2005)(描述“FR重排(shuffling)”)；和Osbourn等人,Methods 36:61-68(2005)以及Klimka等人,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述FR重排的“引导选择”方法)。
可用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳拟合”方法选择的框架区(参见例如，Sims等人J.Immunol.151:2296(1993))；从轻链可变区或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列衍生的框架区(参见例如，Carter等人Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；和Presta等人J.Immunol.,151:2623(1993))；人成熟的(体细胞突变的)框架区或人种系框架区(参见例如，Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；以及从筛选FR文库衍生的框架区(参见例如，Baca等人,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)和Rosok等人,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
在一些实施方案中，对mAb进行修饰(诸如人源化)，而不降低结构域对抗原的天然亲和力，并同时降低其对异源物种的免疫原性。例如，可确定抗体重链和轻链可变结构域(VH和VL)的氨基酸残基，并且例如在框架区中的一个或多个小鼠氨基酸被它们如在人共有序列中发现的人对应物替代，而所述多肽不会失去其典型的特征，即所述人源化不会显著影响所得多肽的抗原结合能力。小鼠单克隆抗体的人源化要求在两条链(轻链和重链)中引入和诱变有限数量的氨基酸并保留两条链的装配。
人抗体
在一些实施方案中，本文提供的抗TIGIT抗体(特别是mAb)是人抗体。可使用本领域已知的各种技术来产生人抗体。人抗体一般描述于在van Dijk和van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)以及Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)中。能够产生完全人单结构域抗体的转基因小鼠或大鼠是本领域已知的。参见例如，US20090307787A1、美国专利号8,754,287、US20150289489A1、US20100122358A1、和WO2004049794。
人抗体可通过将免疫原施用于转基因动物来制备，所述转基因动物已被修饰以响应于抗原攻击而产生完整的人抗体或具有人可变区的完整抗体。此类动物通常含有全部或部分人免疫球蛋白基因座，所述全部或部分人免疫球蛋白基因座替代内源性免疫球蛋白基因座或者存在于染色体外或随机整合到动物的染色体中。在这种转基因小鼠中，内源性免疫球蛋白基因座通常已失活。关于从转基因动物中获得人抗体的方法的综述，参见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。还参见例如，描述XENOMOUSETM技术的美国专利号6,075,181和6,150,584，描述
Figure BDA0002584023080000401
技术的美国专利号5,770,429；描述K-M
Figure BDA0002584023080000402
技术的美国专利号7,041,870，以及描述
Figure BDA0002584023080000403
技术的美国专利申请公开号US 2007/0061900。可例如通过与不同的人恒定区组合来进一步修饰来自由此类动物产生的完整抗体的人可变区。
也可通过基于杂交瘤的方法制备人抗体。已描述用于生产人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系。(参见例如，Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等人,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；以及Boerner等人,J.Immunol.,147:86(1991))。通过人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体也描述于Li等人,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)中。另外的方法包括例如在以下参考文献中所述的那些方法：美国专利号7,189,826(描述从杂交瘤细胞系生产单克隆人IgM抗体)；以及Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)(描述人-人杂交瘤)。人杂交瘤技术(Trioma技术)也描述于Vollmers和Brandlein,Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005)；以及Vollmers和Brandlein,Methods and Findings in Experimental andClinical Pharmacology,27(3):185-91(2005)中。
也可通过分离选自人源噬菌体展示文库的Fv克隆可变结构域序列来产生人抗体。然后，可将此类可变结构域序列与期望的人恒定结构域组合。下文描述了从抗体文库中选择人抗体的技术。
文库来源的抗体
可通过筛选组合文库中具有一种或多种所需活性的抗体来分离本申请的抗体。例如，本领域已知多种用于产生噬菌体展示文库并筛选此类文库中拥有所需结合特性的抗体的方法。此类方法在以下参考文献中进行了综述：例如，Hoogenboom等人于Methods inMolecular Biology 178:1-37(O’Brien等人,编辑,Human Press,Totowa,NJ,2001)，并且在以下参考文献中进行了进一步描述：例如，McCafferty等人,Nature 348:552-554；Clackson等人,Nature 352:624-628(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks和Bradbury,于Methods in Molecular Biology 248:161-175(Lo,编辑,HumanPress,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等人,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等人,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA101(34):12467-12472(2004)；以及Lee等人,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004)。已经描述了构建单结构域抗体文库的方法，例如参见美国专利号7371849。
在某些噬菌体展示方法中，通过聚合酶链反应(PCR)分别克隆VH基因和VL基因的库，并且将所述库随机重组在噬菌体文库中，然后可如以下参考文献中所述的筛选所述噬菌体文库中的抗原结合噬菌体：Winter等人,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)。噬菌体通常显示出抗体片段，作为单链Fv(scFv)片段或作为Fab片段。来自免疫来源的文库无需构建杂交瘤即可提供针对免疫原的高亲和力抗体。另选地，可在不进行任何免疫的情况下克隆初始库(naive repertoire)(例如，从人克隆)以提供针对广泛的非自身和自身抗原的单一抗体来源，如以下参考文献所述：Griffiths等人,EMBO J,12:725-734(1993)。最后，还可通过从干细胞克隆未重排的V基因片段并且使用含有随机序列的PCR引物以编码高度可变的CDR3区并完成体外重排来合成制备初始文库，如Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所述。描述人抗体噬菌体文库的专利出版物包括，例如：美国专利号5,750,373和美国专利公开号2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936、和2009/0002360。
从人抗体文库分离的抗体或抗体片段在本文中被认为是人抗体或人抗体片段。
生物活性
可通过测量其半最大抑制浓度(IC50)来确定本文所述的抗TIGIT mAb的生物活性，所述半最大抑制浓度是抗体在抑制特定生物或生化功能(诸如抑制TIGIT与其配体CD155(也称为PVR)之间的结合)方面的有效性的量度。例如，此处的IC50可用于指示体外中和50％的TIGIT生物活性所需的抗TIGIT mAb的有效浓度。对于激动剂药物或其他物质(诸如抗体)，IC50可与EC50相差无几。EC50还代表获得体内最大作用的50％所需的血浆浓度。IC50或EC50可通过本领域已知的测定进行测量，所述测定例如为生物测定，诸如通过FACS分析抑制配体结合(竞争结合测定)、基于细胞的细胞因子释放测定、或萤光素酶报告基因测定。
例如，可使用流式细胞术研究对配体结合的阻断。可从贴壁培养瓶中解离表达人TIGIT的CHO细胞，并且将所述CHO细胞与不同浓度的供测试的抗TIGIT mAb和恒定浓度的经标记的CD155蛋白(诸如生物素标记的hCD155/Fc蛋白)进行混合。可采用抗TIGIT抗体阳性对照，诸如阿特珠单抗(Atezolizumab)。将所述混合物在室温下平衡30分钟，用FACS缓冲液(含有1％BSA的PBS)洗涤三次。然后，添加特异性地识别恒定浓度的经标记的CD155蛋白的抗体(诸如PE/Cy5链霉亲和素二抗)，并且在室温下孵育15分钟。将细胞用FACS缓冲液洗涤并通过流式细胞术分析。可使用Prism(GraphPad Software,San Diego,CA)使用非线性回归来分析数据以计算IC50。来自竞争测定的结果将证明抗TIGIT mAb抑制经标记的CD155与TIGIT之间的相互作用的能力。
通过基于TIGIT的细胞因子释放阻断测定，也可测试抗TIGIT mAb的生物活性。在树突状细胞中，CD155的TIGIT连接抑制IL-12p40产生并诱导IL10产生，从而产生致耐受性的树突状细胞，所述树突状细胞抑制T细胞增殖和从应答T细胞产生IFN-γ(Yu等人,2009)。TIGIT进一步作用于效应T细胞，以诱导从1型或17型占主导地位向IL-10主导的免疫应答转变。TIGIT缺陷型小鼠展现出为IFN-γ+的细胞以及IL-17+CD-4+T细胞的频率增加，而同时在用抗原进行免疫之后IL-10产生几乎完全丧失(Joller等人,2011)。因此，可使用多种监测T细胞增殖、IFN-γ释放、或IL10分泌的生物测定来研究抗TIGIT抗体对TIGIT途径的阻断。
在一些实施方案中，本申请的抗TIGIT抗体(特别是抗TIGIT mAb)阻断或拮抗由CD155配体转导的信号。在一些实施方案中，抗TIGIT mAb可结合TIGIT上的表位，从而抑制TIGIT与CD155相互作用。在一些实施方案中，在抗体结合位点与TIGIT配体结合位点之比为大于1:1且抗体浓度为大于10-8M的条件下，抗TIGIT mAb可将TIGIT与CD155的结合降低至少约5％、10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、95％、99％或99.9％中任一者。
在一些实施方案中，提供了包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的抗TIGIT mAb；所述重链可变结构域具有重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3，所述重链CDR1包含SEQ ID NO:27-39中任一者的氨基酸序列、或其包含至多约3个(诸如约1个、2个或3个中任一者)氨基酸取代的变体，所述重链CDR2包含SEQ ID NO:40-52中任一者的氨基酸序列、或其包含至多约3个(诸如约1个、2个或3个中任一者)氨基酸取代的变体，所述重链CDR3包含SEQ ID NO:53-65中任一者的氨基酸序列、或其包含至多约3个(诸如约1个、2个或3个中任一者)氨基酸取代的变体；并且所述轻链可变结构域具有轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3，所述轻链CDR1包含SEQ ID NO:66-78中任一者的氨基酸序列、或其包含至多约3个(诸如约1个、2个或3个中任一者)氨基酸取代的变体，所述轻链CDR2包含SEQ ID NO:79-91中任一者的氨基酸序列、或其包含至多约3个(诸如约1个、2个或3个中任一者)氨基酸取代的变体，所述轻链CDR3包含SEQ ID NO:92-104中任一者的氨基酸序列、或其包含至多约3个(诸如约1个、2个或3个中任一者)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，抗TIGIT mAb与TIGIT之间的结合的KD为约10-5M至约10-12M(诸如约10-7M至约10-12M、或约10-8M至约10-12M)。在一些实施方案中，抗TIGIT抗体是啮齿动物的、嵌合的、人的、部分人源化的、或完全人源化的。
在一些实施方案中，抗TIGIT mAb包含VH CDR3和VL CDR3，所述VH CDR3包含SEQID NO:53-65中任一者的氨基酸序列，所述VL CDR3包含SEQ ID NO:92-104中任一者的氨基酸序列，并且所述氨基酸取代是在VH结构域和VL结构域的CDR1和/或CDR2中。
因此，在一些实施方案中，提供了包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的抗TIGIT mAb；所述重链可变结构域具有CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1包含SEQ IDNO:27-39中任一者的氨基酸序列、或其包含至多约3个(诸如约1个、2个或3个中任一者)氨基酸取代的变体，所述CDR2包含SEQ ID NO:40-52中任一者的氨基酸序列、或其包含至多约3个(诸如约1个、2个或3个中任一者)氨基酸取代的变体，所述CDR3包含SEQ ID NO:53-65中任一者的氨基酸序列；并且所述轻链可变结构域具有CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1包含SEQID NO:66-78中任一者的氨基酸序列、或其包含至多约3个(诸如约1个、2个或3个中任一者)氨基酸取代的变体，所述CDR2包含SEQ ID NO:79-91中任一者的氨基酸序列、或其包含至多约3个(诸如约1个、2个或3个中任一者)氨基酸取代的变体，所述CDR3包含SEQ ID NO:92-104中任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗TIGIT mAb与TIGIT之间的结合的KD为约10-5M至约10-12M(诸如约10-7M至约10-12M、或约10-8M至约10-12M)或更小。在一些实施方案中，抗TIGIT mAb是啮齿动物的、嵌合的、人的、部分人源化的、或完全人源化的。
在一些实施方案中，提供了包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的抗TIGIT mAb；所述重链可变结构域具有CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1包含SEQ ID NO:27-39中任一者的氨基酸序列，所述CDR2包含SEQ ID NO:40-52中任一者的氨基酸序列，所述CDR3包含SEQ ID NO:53-65中任一者的氨基酸序列；并且所述轻链可变结构域具有CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1包含SEQ ID NO:66-78中任一者的氨基酸序列；所述CDR2包含SEQ ID NO:79-91中任一者的氨基酸序列，所述CDR3包含SEQ ID NO:92-104中任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗TIGIT mAb与TIGIT之间的结合的KD为约10-5M至约10-12M(诸如约10-7M至约10-12M、或约10-8M至约10-12M)。在一些实施方案中，抗TIGIT mAb是啮齿动物的、嵌合的、人的、部分人源化的、或完全人源化的。
在一些实施方案中，本申请的抗体或抗原结合片段包含表17和表18中提供的CDR的序列。
CDR可以各种成对组合方式组合以产生许多人源化的抗TIGIT抗体。人源化取代对于本领域技术人员而言将是清楚的。例如，可通过以下方式来确定潜在有用的人源化取代：将天然存在的VH或VL的FR序列与一种或多种紧密相关的人VH或VL的相应FR序列进行比较，然后使用本领域已知的方法(也如本文所述)将一种或多种此类潜在有用的人源化取代引入所述VH或VL中。将人源化的重链和轻链配对。可测试所得的人源化抗体的TIGIT结合亲和力、稳定性、表达的容易程度和水平、和/或其他期望的特性。本文所述的抗TIGIT mAb可以是部分或完全人源化的。优选地，所得的人源化抗体(诸如人源化mAb)或其抗原结合片段以本文所述的KD、Kon、Koff结合TIGIT。
在一些实施方案中，提供了抗TIGIT人源化mAb或其抗原结合片段，所述抗TIGIT人源化mAb或其抗原结合片段包含VH结构域和VL结构域；所述VH结构域包含SEQ ID NO:1-13中任一者的氨基酸序列、或其与SEQ ID NO:1-13中任一者具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％中任一者)序列同一性的变体；并且所述VL结构域包含SEQ ID NO:14-26中任一者的氨基酸序列或其与SEQID NO:14-26中任一者具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％中任一者)序列同一性的变体。在一些实施方案中，提供了包含VH结构域和VL结构域的抗TIGIT mAb；所述VH结构域包含SEQ ID NO:1-13中任一者的氨基酸序列、或其包含在所述VH结构域中的至多约3个(诸如约1个、2个或3个中任一者)氨基酸取代的变体；所述VL结构域包含SEQ ID NO:14-26中任一者的氨基酸序列、或其包含在所述VL结构域中的至多约3个(诸如约1个、2个或3个中任一者)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，抗TIGIT mAb或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:1-13中任一者的氨基酸序列的VH结构域的变体，其中所述变体包含在所述VH的CDR(诸如CDR1和/或CDR2和/或CDR3)中的氨基酸取代；以及具有SEQ ID NO:14-26中任一者的氨基酸序列的VL结构域的变体，其中所述变体包含在所述VL中任一者的CDR(诸如CDR1和/或CDR2和/或CDR3)中的氨基酸取代。在一些实施方案中，抗TIGIT mAb或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:1-13中任一者的氨基酸序列的VH结构域的变体，其中所述变体包含在所述VH中任一者的FR(诸如FR1和/或FR2和/或FR3和/或FR4)中的氨基酸取代；以及具有SEQ ID NO:14-26中任一者的氨基酸序列的VL结构域的变体，其中所述变体包含在SEQ ID NO:14-26中任一者的FR(诸如FR1和/或FR2和/或FR3和/或FR4)中的氨基酸取代。
在一些实施方案中，提供了与本文所述的任何一种抗TIGIT mAb竞争来特异性地结合TIGIT的抗TIGIT抗体(诸如mAb)(下文称为“竞争性抗TIGIT抗体或竞争性抗TIGITmAb”)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，可使用ELISA测定确定竞争性结合。例如，在一些实施方案中，提供了与分别包含SEQ ID NO:1-13中任一者的VH氨基酸序列和SEQ IDNO:14-26中任一者的VL氨基酸序列的抗TIGIT mAb竞争来特异性地结合TIGIT的抗TIGITmAb。对于另一个实例，在一些实施方案中，提供了与包含如下重链可变结构域(VH)和如下轻链可变结构域(VL)的抗TIGIT mAb竞争来特异性地结合TIGIT的抗TIGIT mAb：所述重链可变结构域具有CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1包含SEQ ID NO:27-39中任一者的氨基酸序列，所述CDR2包含SEQ ID NO:40-52中任一者的氨基酸序列，所述CDR3包含SEQ ID NO:53-65中任一者的氨基酸序列；并且所述轻链可变结构域具有CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1包含SEQ ID NO:66-78中任一者的氨基酸序列；所述CDR2包含SEQ ID NO:79-91中任一者的氨基酸序列，所述CDR3包含SEQ ID NO:92-104中任一者的氨基酸序列。对于另一个实例，在一些实施方案中，提供了与表17和表18中所述的任何一种抗TIGIT mAb竞争来特异性地结合TIGIT的抗TIGIT mAb。在一些实施方案中，竞争性抗TIGIT mAb与TIGIT之间的结合的KD为约10-5M至约10-12M(诸如约10-7M至约10-12M、或约10-8M至约10-12M)或更小。在一些实施方案中，竞争性抗TIGIT mAb是啮齿动物的、嵌合的、人的、部分人源化的、或完全人源化的。
包含抗TIGIT mAb的构建体
包含抗TIGIT mAb的抗TIGIT构建体可以是任何可能的形式。
在一些实施方案中，包含抗TIGIT mAb的抗TIGIT构建体可还包含另外的多肽序列，诸如一个或多个抗体部分。此类另外的多肽序列可能或可能不改变或以其他方式影响抗TIGIT mAb的(生物)特性，并且可能或可能不向本文所述的抗TIGIT mAb增加另外的功能。在一些实施方案中，另外的多肽序列向本申请的抗TIGIT mAb赋予一个或多个期望的特性或功能性。在一些实施方案中，抗TIGIT构建体是包含细胞外抗原结合结构域的嵌合抗原受体(CAR)，所述细胞外抗原结合结构域包含本文所述的一个或多个抗TIGIT结合部分。
在一些实施方案中，另外的多肽序列可以是特异性地识别第二抗原的第二抗体部分(诸如sdAb、scFv)。在一些实施方案中，第二抗原不是TIGIT。在一些实施方案中，第二抗体部分特异性地识别在TIGIT上的与本文所述的抗TIGIT mAb相同的表位。在一些实施方案中，第二抗体部分特异性地识别在TIGIT上的与本文所述的抗TIGIT mAb不同的表位。
在一些实施方案中，与本文所述的抗TIGIT mAb本身相比，另外的多肽序列可增加分子的稳定性、溶解性或吸收性，降低免疫原性或毒性，消除或减弱不希望的副作用，和/或向本发明的抗TIGIT构建体赋予其他有利特性和/或降低本发明的抗TIGIT构建体不希望的特性。
全长IgG
在一些实施方案中，抗TIGIT mAb是全长IgG。在一些实施方案中，抗TIGIT mAb包含IgG的恒定区，所述IgG例如为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4中任一者。在一些实施方案中，恒定区是人恒定区。在一些实施方案中，恒定区是人IgG1恒定区。
因此，在一些实施方案中，提供了抗TIGIT全长IgG，所述抗TIGIT全长IgG包含重链，其中所述可变区(VH)包含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1包含SEQ ID NO:27-39中任一者的氨基酸序列、或其包含至多约3个(诸如约1个、2个或3个中任一者)氨基酸取代的变体，所述CDR2包含SEQ ID NO:40-52中任一者的氨基酸序列、或其包含至多约3个(诸如约1个、2个或3个中任一者)氨基酸取代的变体，所述CDR3包含SEQ ID NO:53-65中任一者的氨基酸序列、或其包含至多约3个(诸如约1个、2个或3个中任一者)氨基酸取代的变体，并且其中所述VH融合至免疫球蛋白的重链恒定区(铰链、CH1、CH2和CH3)；以及轻链，其中所述可变区(VL)包含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1包含SEQ ID NO:66-78中任一者的氨基酸序列、或其包含至多约3个(诸如约1个、2个或3个中任一者)氨基酸取代的变体，所述CDR2包含SEQ ID NO:79-91中任一者的氨基酸序列、或其包含至多约3个(诸如约1个、2个或3个中任一者)氨基酸取代的变体，所述CDR3包含SEQ ID NO:92-104中任一者的氨基酸序列、或其包含至多约3个(诸如约1个、2个或3个中任一者)氨基酸取代的变体，并且其中所述VL融合至免疫球蛋白的轻链恒定区(CL)。在一些实施方案中，提供了抗TIGIT全长IgG，所述抗TIGIT全长IgG包含重链，其中所述可变区(VH)包含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1包含SEQ ID NO:27-39中任一者的氨基酸序列，所述CDR2包含SEQ ID NO:40-52中任一者的氨基酸序列，所述CDR3包含SEQID NO:53-65中任一者的氨基酸序列、或其包含至多约3个(诸如约1个、2个或3个中任一者)氨基酸取代的变体，并且其中所述VH融合至免疫球蛋白的重链恒定区(铰链、CH1、CH2和CH3)；以及轻链，其中所述可变区(VL)包含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1包含SEQ ID NO:66-78中任一者的氨基酸序列，所述CDR2包含SEQ ID NO:79-91中任一者的氨基酸序列，所述CDR3包含SEQ ID NO:92-104中任一者的氨基酸序列、或其包含至多约3个(诸如约1个、2个或3个中任一者)氨基酸取代的变体，并且其中所述VL融合至免疫球蛋白的轻链恒定区(CL)。在一些实施方案中，恒定区是人IgG1恒定区。在一些实施方案中，全长抗TIGIT IgG与TIGIT之间的结合的KD为约10-5M至约10-12M(诸如约10-7M至约10-12M、或约10-8M至约10-12M)或更小。在一些实施方案中，全长抗TIGIT IgG是啮齿动物的、嵌合的、人的、部分人源化的、或完全人源化的。
在一些实施方案中，提供了全长抗TIGIT mAb，其包含SEQ ID NO:1-13中任一者的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:14-26中任一者的轻链氨基酸序列。
在一些实施方案中，还提供了与本文所述的任何一种全长抗TIGIT IgG竞争来特异性地结合TIGIT的全长抗TIGIT IgG(下文称为“竞争性抗TIGIT IgG”)。可使用ELISA测定确定竞争性结合。例如，在一些实施方案中，提供了与包含SEQ ID NO:1-13中任一者的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:14-26中任一者的轻链氨基酸序列的抗TIGIT IgG竞争来特异性地结合TIGIT的抗TIGIT IgG。对于另一个实例，在一些实施方案中，提供了与如下抗TIGITIgG竞争来特异性地结合TIGIT的抗TIGIT IgG：所述被竞争的抗TIGIT IgG包含重链，其中所述可变区(VH)包含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1包含SEQ ID NO:27-39中任一者的氨基酸序列，所述CDR2包含SEQ ID NO:40-52中任一者的氨基酸序列，所述CDR3包含SEQ ID NO:53-65中任一者的氨基酸序列；以及轻链，其中所述可变区(VL)包含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1包含SEQ ID NO:66-78中任一者的氨基酸序列；所述CDR2包含SEQ ID NO:79-91中任一者的氨基酸序列，所述CDR3包含SEQ ID NO:92-104中任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，竞争性抗TIGIT IgG与TIGIT之间的结合的KD为约10-5M至约10-12M(诸如约10-7M至约10-12M、或约10-8M至约10-12M)或更小。在一些实施方案中，竞争性抗TIGIT IgG是啮齿动物的、嵌合的、人的、部分人源化的、或完全人源化的。
多价和/或多特异性抗体
在一些实施方案中，抗TIGIT构建体包含与一个或多个其他抗体部分(诸如特异性地识别另一种抗原的抗体部分)融合的本文所述的抗TIGIT mAb。所述一个或多个其他抗体部分可以是任何抗体或抗体片段的形式，诸如sdAb、全长抗体、Fab、Fab'、(Fab’)2、Fv、单链Fv(scFv)、scFv-scFv、微抗体(minibody)或双抗体。关于某些抗体片段的综述，参见Hudson等人Nat.Med.9:129-134(2003)。关于scFv片段的综述，参见例如，Pluckthün,于ThePharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编辑,(Springer-Verlag,New York),第269-315页(1994)；还参见WO 93/16185；以及美国专利号5,571,894和5,587,458。关于包含补救受体(salvage receptor)结合表位残基和具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab')2片段的讨论，参见美国专利号5,869,046。有关多特异性抗体的综述，参见Weidle等人,Cancer Genomics Proteomics,10(1):1-18,2013；Geering和Fussenegger,Trends Biotechnol.,33(2):65-79,2015；Stamova等人,Antibodies,1(2):172-198,2012。双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，所述抗体片段可以是二价的或双特异性的。参见例如，EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003)；以及Hollinger等人,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993)。三抗体和四抗体也描述于Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003)中。如本文所述，抗体片段可通过多种技术制备，所述技术包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)生产。在一些实施方案中，所述一个或多个其他抗体部分是抗体模拟物，所述抗体模拟物是包含让人联想到抗体的抗原结合结构域的小的工程化蛋白(Geering和Fussenegger,Trends Biotechnol.,33(2):65-79,2015)。这些分子衍生自现有的人支架蛋白，并且包含单个多肽。可包含在本文所述的抗TIGIT构建物内的示例性抗体模拟物可以是但不限于设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin；包含侧翼为N末端和C末端Cap结构域的3-5个完全合成的锚蛋白重复)、亲合力多聚体(avimer；包含多个A结构域的高亲和力蛋白，每个结构域对靶标具有低亲和力)、或Anticalin(基于脂蛋白的支架，具有四个可及的环，每个环的序列可以是随机的)。
制备多特异性抗体的技术包括但不限于重组共表达具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对(参见Milstein和Cuello,Nature305:537(1983)；WO 93/08829；以及Traunecker等人,EMBO J.10:3655(1991))和“杵臼结构(knob-in-hole)”工程化(参见例如，美国专利号5,731,168)。多特异性抗体也可通过以下方式来制备：工程化静电操纵效应(electrostatic steering effect)以制备抗体Fc-异二聚体分子(WO 2009/089004A1)；交联两个或更多个抗体或片段(参见例如，美国专利号4,676,980；以及Brennan等人,Science,229:81(1985))；使用亮氨酸拉链以产生双特异性抗体(参见例如，Kostelny等人.,J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992))；使用“双抗体”技术来制备双特异性抗体片段(参见例如，Hollinger等人,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；和使用单链Fv(scFv)二聚体(参见例如，Gruber等人,J.Immunol.,152:5368(1994))；和如例如，在Tutt等人J.Immunol.147:60(1991)中所述的制备三特异性抗体；和产生包含串联单结构域抗体的多肽(参见例如，美国专利申请号20110028695；和Conrath等人J.Biol.Chem.,2001；276(10):7346-50)。本文中还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化抗体，包括“章鱼抗体”(参见例如，US2006/0025576A1)。
肽接头
在一些实施方案中，抗TIGIT构建体内的两个或更多个抗体部分可任选地通过肽接头连接。在抗TIGIT构建体中使用的一个或多个肽接头的长度、柔韧度和/或其他特性可能对特性具有一些影响，所述特性包括但不限于对一种或多种特定抗原或表位的亲和力、特异性或亲合力。例如，可选择更长的肽接头以确保两个相邻结构域在空间上不会彼此干扰。在一些实施方案中，肽接头包含柔性残基(诸如甘氨酸和丝氨酸)，使得相邻结构域相对于彼此自由移动。例如，甘氨酸-丝氨酸成对物可以是合适的肽接头。
肽接头可具有任何合适的长度。在一些实施方案中，肽接头为至少约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个、30个、35个、40个、50个、75个、100个或更多个中任一者的氨基酸长度。在一些实施方案中，肽接头为不超过约100个、75个、50个、40个、35个、30个、25个、20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个或更少个中任一者的氨基酸长度。在一些实施方案中，肽接头的长度为以下中的任一者：约1个氨基酸至约10个氨基酸、约1个氨基酸至约20个氨基酸、约1个氨基酸至约30个氨基酸、约5个氨基酸至约15个氨基酸、约10个氨基酸至约25个氨基酸、约5个氨基酸至约30个氨基酸、约10个氨基酸至约30个氨基酸长、约30个氨基酸至约50个氨基酸、约50个氨基酸至约100个氨基酸、或约1个氨基酸至约100个氨基酸。
肽接头可具有天然存在的序列或非天然存在的序列。例如，衍生自仅重链抗体的铰链区的序列可用作接头。参见例如，WO1996/34103。在一些实施方案中，肽接头是突变的人IgG1铰链(EPKSSDKTHTSPPSP，SEQ ID NO:121)。在一些实施方案中，肽接头是柔性接头。示例性柔性接头包括甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括例如(GS)n、(GSGGS)n、(GGGS)n、和(GGGGS)n，其中n为至少一的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物、和本领域已知的其他柔性接头。在一些实施方案中，肽接头包含GGGGSGGGS的氨基酸序列(SEQ ID NO:119)。在一些实施方案中，肽接头包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列(GGGGSGGGGSGGGGS)。
双特异性抗体
在一些实施方案中，本申请的分离的抗体或抗原结合片段是包含与第二抗体部分融合的本文所述的抗TIGIT IgG的双特异性或多特异性抗体，其中所述第二抗体部分与另一种抗原(优选地另一种抑制性免疫检查点分子)特异性地结合。
在一个实施方案中，另一种抗原是CTLA-4，并且第二抗体部分包含与CTLA-4特异性地结合的抗体或抗原结合片段，诸如抗CTLA-4mAb、优选地抗CTLA-4sdAb。包含针对TIGIT和CTLA-4的双特异性的分离的抗体或抗原结合片段在下文中可称为“抗TIGIT/CTLA-4抗体”、“抗TIGIT/CTLA-4构建体”或“TIGIT×CTLA-4抗体”。
在一个实施方案中，另一种抗原是PD-L1，并且第二抗体部分包含与PD-L1特异性地结合的抗体或抗原结合片段，诸如抗PD-L1 mAb、优选地抗PD-L1 sdAb。包含针对TIGIT和PD-L1的双特异性的分离的抗体或抗原结合片段在下文中可称为“抗TIGIT/PD-L1抗体”、“抗TIGIT/PD-L1构建体”或“TIGIT×PD-L1抗体”。
在一个实施方案中，另一种抗原是TIM-3，并且第二抗体部分包含与TIM-3特异性地结合的抗体或抗原结合片段，诸如抗TIM-3mAb、优选地抗TIM-3sdAb。包含针对TIGIT和TIM-3的双特异性的分离的抗体或抗原结合片段在下文中可称为“抗TIGIT/TIM-3抗体”、“抗TIGIT/TIM-3构建体”或“TIGIT×TIM-3抗体”。
在一个实施方案中，另一种抗原是LAG-3，并且第二抗体部分包含与LAG-3特异性地结合的抗体或抗原结合片段，诸如抗LAG-3mAb、优选地抗LAG-3sdAb。具有针对TIGIT和LAG-3的双特异性的分离的抗体或抗原结合片段在下文中可称为“抗TIGIT/LAG-3抗体”、“抗TIGIT/LAG-3构建体”或“TIGIT×LAG-3抗体”。
与TIGIT类似，CTLA-4、PD-L1、TIM-3和LAG-3是抑制性免疫检查点分子。
在一些实施方案中，提供了分离的抗TIGIT构建体，所述抗TIGIT构建体包含特异性地识别TIGIT的全长IgG和选自由抗CTLA-4sdAb、抗PD-L1 sdAb、抗TIM-3sdAb和抗LAG-3sdAb组成的组的sdAb，其中所述抗TIGIT IgG包含重链，其中所述可变区(VH)包含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1包含SEQ ID NO:27-39中任一者的氨基酸序列、或其包含至多约3个(诸如约1个、2个或3个中任一者)氨基酸取代的变体，所述CDR2包含SEQ ID NO:40-52中任一者的氨基酸序列、或其包含至多约3个(诸如约1个、2个或3个中任一者)氨基酸取代的变体，所述CDR3包含SEQ ID NO:53-65中任一者的氨基酸序列、或其包含至多约3个(诸如约1个、2个或3个中任一者)氨基酸取代的变体，并且其中所述VH融合至免疫球蛋白的重链恒定区(铰链、CH1、CH2和CH3)；以及轻链，其中所述可变区(VL)包含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1包含SEQ ID NO:66-78中任一者的氨基酸序列、或其包含至多约3个(诸如约1个、2个或3个中任一者)氨基酸取代的变体，所述CDR2包含SEQ ID NO:79-91中任一者的氨基酸序列、或其包含至多约3个(诸如约1个、2个或3个中任一者)氨基酸取代的变体，所述CDR3包含SEQID NO:92-104中任一者的氨基酸序列、或其包含至多约3个(诸如约1个、2个或3个中任一者)氨基酸取代的变体，并且其中所述VL融合至免疫球蛋白的轻链恒定区(CL)。在一些实施方案中，sdAb的N末端与特异性地识别TIGIT的全长抗体的至少一条重链的C末端融合。在一些实施方案中，sdAb的C末端与特异性地识别TIGIT的全长抗体的至少一条重链的N末端融合。在一些实施方案中，sdAb的N末端与特异性地识别TIGIT的全长抗体的至少一条轻链的C末端融合。在一些实施方案中，sdAb的C末端与特异性地识别TIGIT的全长抗体的至少一条轻链的N末端融合。在一些实施方案中，任选地通过肽接头连接特异性地识别TIGIT的全长IgG和第二结合部分sdAb。在一些实施方案中，肽接头包含SEQ ID NO:119-121的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗TIGIT mAb与TIGIT之间的结合的KD为约10-5M至约10-12M(诸如约10-7M至约10-12M、或约10-8M至约10-12M)或更小。在一些实施方案中，抗TIGIT IgG是啮齿动物的、嵌合的、人的、部分人源化的、或完全人源化的。
在一些实施方案中，提供了抗TIGIT构建体，所述抗TIGIT构建体包含特异性地识别TIGIT的全长IgG和选自由抗CTLA-4sdAb、抗PD-L1 sdAb、抗TIM-3sdAb和抗LAG-3sdAb组成的组的sdAb，其中所述全长IgG包含VH结构域和VL结构域；所述VH结构域包含SEQ ID NO:1-13中任一者的氨基酸序列、或其与SEQ ID NO:1-13中任一者具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％中任一者)序列同一性的变体，并且其中所述VH融合至免疫球蛋白的重链恒定区(铰链、CH1、CH2和CH3)；并且所述VL结构域包含SEQ ID NO:14-26中任一者的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:14-26中任一者具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％中任一者)序列同一性的变体，并且其中所述VL融合至免疫球蛋白的轻链恒定区(CL)。在一些实施方案中，提供了分离的抗TIGIT构建体，所述抗TIGIT构建体包含特异性地识别TIGIT的全长IgG和选自由抗CTLA-4sdAb、抗PD-L1sdAb、抗TIM-3sdAb和抗LAG-3sdAb组成的组的sdAb，其中所述全长IgG包含VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:1-13中任一者的氨基酸序列、或其包含在所述VH结构域中的至多约3个(诸如约1个、2个或3个中任一者)氨基酸取代的变体，并且其中所述VH融合至免疫球蛋白的重链恒定区(铰链、CH1、CH2和CH3)；并且所述VL结构域包含SEQ ID NO:14-26中任一者的氨基酸序列、或其包含在所述VL结构域中的至多约3个(诸如约1个、2个或3个中任一者)氨基酸取代的变体，并且其中所述VL融合至免疫球蛋白的轻链恒定区(CL)。
在一些实施方案中，包含具有SEQ ID NO:1-13中任一者的氨基酸序列或其变体的VH结构域的抗TIGIT全长IgG包含在SEQ ID NO:1-13中任一者的CDR(诸如CDR1和/或CDR2和/或CDR3)中的氨基酸取代，并且其中所述VH融合至免疫球蛋白的重链恒定区(铰链、CH1、CH2和CH3)；并且具有SEQ ID NO:14-26中任一者的氨基酸序列或其变体的VL结构域包含在SEQ ID NO:14-26中任一者的CDR(诸如CDR1和/或CDR2和/或CDR3)中的氨基酸取代，并且其中所述VH融合至免疫球蛋白的轻链恒定区(CL)。在一些实施方案中，包含具有SEQ ID NO:1-13中任一者的氨基酸序列或其变体的VH结构域的抗TIGIT全长IgG包含SEQ ID NO:1-13中任一者的CDR1和/或CDR2和/或CDR3，并且所述氨基酸取代是在SEQ ID NO:1-13中任一者的FR(诸如FR1、和/或FR2、和/或FR3、和/或FR4)中，并且其中所述VH融合至免疫球蛋白的重链恒定区(铰链、CH1、CH2和CH3)；并且具有SEQ ID NO:14-26中任一者的氨基酸序列或其变体的VL结构域包含SEQ ID NO:14-26中任一者的CDR1和/或CDR2和/或CDR3，并且所述氨基酸取代是在SEQ ID NO:14-26中任一者的FR(诸如FR1、和/或FR2、和/或FR3、和/或FR4)中，并且其中所述VH融合至免疫球蛋白的轻链恒定区(CL)。在一些实施方案中，包含VH结构域的抗TIGIT全长IgG，所述VH结构域包含SEQ ID NO:1-13中任一者的氨基酸序列或其变体，在CDR和FR中均包含氨基酸取代，并且其中VH与免疫球蛋白的重链恒定区(铰链、CH1、CH2和CH3)融合；且包含SEQ ID NO:14-26中任一者的氨基酸序列或其变体的VL结构域在CDR和FR中都包含氨基酸取代，并且其中VL融合到VL的轻链恒定区(CL)免疫球蛋白。在一些实施方案中，提供了分离的抗TIGIT构建体，所述抗TIGIT构建体包含特异性地识别TIGIT的全长IgG和选自由抗CTLA-4sdAb、抗PD-L1 sdAb、抗TIM-3sdAb和抗LAG-3sdAb组成的组的sdAb，其中所述全长IgG包含VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含融合至免疫球蛋白的重链恒定区(铰链、CH1、CH2和CH3)的SEQ ID NO:1-13中任一者的氨基酸序列；并且所述VL结构域包含融合至免疫球蛋白的轻链恒定区(CL)的SEQ ID NO:14-26中任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，sdAb的N末端与特异性地识别TIGIT的全长抗体的至少一条重链的C末端融合。在一些实施方案中，sdAb的C末端与特异性地识别TIGIT的全长抗体的至少一条重链的N末端融合。在一些实施方案中，sdAb的N末端与特异性地识别TIGIT的全长抗体的至少一条轻链的C末端融合。在一些实施方案中，sdAb的C末端与特异性地识别TIGIT的全长抗体的至少一条轻链的N末端融合。在一些实施方案中，任选地通过肽接头连接特异性地识别TIGIT的全长IgG和第二结合部分sdAb。在一些实施方案中，肽接头包含SEQ ID NO:119-121的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗TIGIT mAb与TIGIT之间的结合的KD为约10-5M至约10-12M(诸如约10-7M至约10-12M、或约10-8M至约10-12M)。在一些实施方案中，抗TIGIT mAb是啮齿动物的、嵌合的、人的、部分人源化的、或完全人源化的。
在一些实施方案中，还提供了包含特异性地识别TIGIT的全长IgG的抗TIGIT构建体(下文称为“竞争性抗TIGIT构建体”)，所述抗TIGIT构建体与本文所述的抗TIGIT/CTLA-4构建体、抗TIGIT/PD-L1构建体、抗TIGIT/TIM-3构建体或抗TIGIT/LAG-3构建体中的任何一种竞争来特异性地结合TIGIT。
抗PD-L1抗体变体
在一些实施方案中，考虑了本文提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可能需要改善抗体的结合亲和力和/或其他生物特性。可通过将适当的修饰引入编码抗体的核酸序列中或通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如在抗体氨基酸序列内的残基的缺失和/或插入和/或取代。可进行缺失、插入和取代的任何组合以得到最终的构建体，条件是最终的构建体拥有期望的特性，例如抗原结合。
a)取代、插入、缺失及变体
在一些实施方案中，提供了具有一个或多个氨基酸取代的抗体变体。取代诱变的感兴趣位点包括HVR和FR。在表2中在“优选取代”标题下示出了保守取代。在表2中在“示例性取代”标题下提供了更实质的变化，并且如以下参考氨基酸侧链类别进一步描述的。可将氨基酸取代引入感兴趣的抗体中，并且针对期望的活性(例如，保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性、或改善的ADCC或CDC)来筛选产物。
表2.氨基酸取代
原始残基 示例性取代 优选取代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Asp；Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu；Asn Glu
Cys(C) Ser；Ala Ser
Gln(Q) Asn；Glu Asn
Glu(E) Asp；Gln Asp
Gly(G) Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸 Leu
Leu(L) 正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Val；Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸 Leu
可根据常见的侧链特性对氨基酸进行分组：
(1)疏水性的：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性的：Asp、Glu；
(4)碱性的：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；
(6)芳香族的：Trp、Tyr、Phe。
非保守取代将需要将这些类别中一个的成员交换为另一个类别。
一种类型的取代变体涉及取代亲本抗体(例如，人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，选择用于进一步研究的一种或多种所得变体将相对于亲本抗体在某些生物特性(例如，增加的亲和力、降低的免疫原性)上具有改良(例如改善)和/或将具有亲本抗体的基本上保留的某些生物特性。示例性取代变体是亲和力成熟的抗体，其可例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术(诸如本文所述的那些)方便地产生。简言之，将一个或多个HVR残基突变，并且将变体抗体展示在噬菌体上并筛选特定的生物活性(例如，结合亲和力)。
可在HVR中进行改变(例如取代)以改善抗体亲和力。可在HVR“热点”(即由在体细胞成熟过程中以高频率经历突变(参见例如，Chowdhury,Methods Mol.Biol.207:179-196(2008))的密码子编码的残基)和/或SDR(a-CDR)中进行此类改变，并测试所得变体VH或VL的结合亲和力。在例如Hoogenboom等人于Methods in Molecular Biology 178:1-37(O’Brien等人,编辑,Human Press,Totowa,NJ,(2001))中已经描述了通过构建和重选二级文库的亲和力成熟。在亲和力成熟的一些实施方案中，将多样性引入选择以通过各种方法(例如，易错PCR、链重排、或寡核苷酸定向诱变)中的任何一种来成熟的可变基因中。然后创建了二级文库。然后，筛选所述文库以鉴定具有期望的亲和力的任何抗体变体。引入多样性的另一种方法涉及HVR定向方法，其中几个HVR残基(例如一次4-6个残基)是随机的。例如使用丙氨酸扫描诱变或建模，可特异性地鉴定参与抗原结合的HVR残基。特别是CDR-H3和CDR-L3经常是靶标。
在一些实施方案中，取代、插入或缺失可发生在一个或多个HVR内，只要此类改变基本上不降低抗体结合抗原的能力即可。例如，可在HVR中进行基本上不降低结合亲和力的保守改变(例如，本文所提供的保守取代)。此类改变可能在HVR“热点”或CDR之外。在上文提供的变体VHH序列的一些实施方案中，每个HVR要么是未改变的，要么含有不超过一个、两个或三个氨基酸取代。
用于鉴定可被靶向进行诱变的抗体残基或区域的有用方法称为“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham和Wells(1989)Science,244:1081-1085所述。在这种方法中，残基或靶标残基的组(例如，带电荷的残基，诸如Arg、Asp、His、Lys、和Glu)被鉴定并被中性或带负电荷的氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)替代，以确定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可在展示对初始取代的功能敏感性的氨基酸位置处引入另外的取代。另选地或另外地，抗原-抗体复合物的晶体结构用于鉴定抗体与抗原之间的接触点。此类接触残基和邻近残基可作为取代的候选者被靶向或消除。可筛选变体以确定它们是否含有期望的特性。
氨基酸序列插入包括从一个残基到含有一百个或更多个残基的多肽的长度范围内的氨基-和/或羧基-末端融合物、以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N末端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括将抗体的N末端或C末端与增加抗体的血清半衰期的酶(例如，用于ADEPT)或多肽融合。
b)糖基化变体
在一些实施方案中，改变本文提供的抗TIGIT构建体以增加或降低所述构建体被糖基化的程度。可通过改变氨基酸序列使得一个或多个糖基化位点被创建或去除而方便地实现抗体的糖基化位点的添加或缺失。
在抗TIGIT构建体包含Fc区的情况下，可改变与其附接的碳水化合物。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含分支的双触角寡糖，所述双触角寡糖通常通过N键连接到Fc区的CH2结构域的Asn297上。参见例如，Wright等人TIBTECH 15:26-32(1997)。寡糖可包括各种碳水化合物，例如，甘露糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸、以及附接至双触角寡糖结构的“茎”中的GlcNAc上的岩藻糖。在一些实施方案中，可对本申请的抗PD-L1构建体中的寡糖进行修饰，以便产生具有某些改善的特性的抗体变体。
在一些实施方案中，提供了具有碳水化合物结构的抗体变体，所述碳水化合物结构缺少与Fc区附接(直接或间接)的岩藻糖。例如，此类抗体中的岩藻糖的量可以为1％至80％、1％至65％、5％至65％、或20％至40％。例如，如WO 2008/077546中所述，通过计算相对于如通过MALDI-TOF质谱所测量的与Asn 297附接的所有糖结构(例如，复杂、杂合和高甘露糖结构)的总和，在Asn297处在糖链内岩藻糖的平均量来确定岩藻糖的量。Asn297是指位于Fc区中约位置297处的天冬酰胺残基(Fc区残基的EU编号)；然而，由于抗体中的微小序列变化，Asn297也可位于位置297上游或下游约±3个氨基酸，即，在位置294与300之间。此类岩藻糖基化变体可具有改善的ADCC功能。参见例如，美国专利公开号US 2003/0157108(Presta,L.)；US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。与“去岩藻糖基化”或“岩藻糖缺陷型”抗体变体有关的出版物的实例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够产生去岩藻糖基化抗体的细胞系的实例包括缺乏蛋白质岩藻糖基化的Lec13 CHO细胞(Ripka等人Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；美国专利申请号US 2003/0157108A1,Presta,L；和WO 2004/056312A1,Adams等人，尤其是实施例11)、以及敲除细胞系，诸如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因(FUT8)敲除CHO细胞(参见例如，Yamane-Ohnuki等人Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda,Y.等人,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；和WO2003/085107)。
抗TIGIT构建体变体还提供有二等分的寡糖，例如，其中与抗体的Fc区附接的双触角寡糖被GlcNAc二等分。此类抗体变体可具有减少的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此类抗体变体的实例在例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)；美国专利号6,602,684(Umana等人)；和US 2005/0123546(Umana等人)中有描述。还提供了在与Fc区附接的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。此类抗体变体可具有改善的CDC功能。此类抗体变体在例如WO 1997/30087(Patel等人)；WO 1998/58964(Raju,S.)；和WO 1999/22764(Raju,S.)中有描述。
c)Fc区变体
在一些实施方案中，可将一个或多个氨基酸修饰引入本文提供的抗TIGIT构建体的Fc区中，从而产生Fc区变体。Fc区变体可包含在一个或多个氨基酸位置具有氨基酸修饰(例如取代)的人Fc区序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)。
在一些实施方案中，本申请考虑了拥有一些而非全部效应子功能的抗TIGIT构建体变体，这使其成为如下应用的理想候选者：其中抗TIGIT构建体的体内半衰期是重要的但某些效应子功能(诸如补体和ADCC)是不必要的或有害的。可进行体外和/或体内细胞毒性测定，以确认CDC和/或ADCC活性的降低/耗尽。例如，可进行Fc受体(FcR)结合测定，以确保抗体缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。用于介导ADCC的主要细胞(NK细胞)仅表达FcγRIII，然而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。FcR在造血细胞上的表达总结于以下参考文献的第464页的表3中：Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)。评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定的非限制性实例描述于美国专利号5,500,362中(参见例如，Hellstrom,I.等人Proc.Nat’lAcad.Sci.USA 83:7059-7063(1986))以及Hellstrom,I等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA82:1499-1502(1985)；5,821,337(参见Bruggemann,M.等人,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))。另选地，可采用非放射性测定方法(参见例如，用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(Cell Technology,Inc.Mountain View,CA)；和CytoTox
Figure BDA0002584023080000641
非放射性细胞毒性测定(Promega,Madison,WI))。用于此类测定的有用的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。另选地或另外地，可在例如动物模型中在体内评估感兴趣分子的ADCC活性，所述动物模型例如为在以下参考文献中所公开的动物模型：Clynes等人Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 95:652-656(1998)。还可以进行C1q结合测定，以确认抗体无法结合C1q并因此缺乏CDC活性。参见例如，WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可进行CDC测定(参见例如，Gazzano-Santoro等人,J.Immunol.Methods202:163(1996)；Cragg,M.S.等人,Blood 101:1045-1052(2003)；以及Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood 103:2738-2743(2004))。也可使用本领域已知的方法进行FcRn结合和体内清除/半衰期确定(参见例如，Petkova,S.B.等人,Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。
效应子功能降低的抗体包括具有Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中一个或多个的取代的那些抗体(美国专利号6,737,056)。此类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中两个或更多个处具有取代的Fc突变体，包括残基265和297被取代为丙氨酸的所谓“DANA”Fc突变体(美国专利号7,332,581)。
描述了具有改善或减少的与FcR的结合的某些抗体变体。(参见例如，美国专利号6,737,056；WO 2004/056312，以及Shields等人,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001))。
在一些实施方案中，抗TIGIT构建体变体包含一个或多个具有改善ADCC的氨基酸取代的Fc区，所述氨基酸取代例如为在Fc区的位置298、333和/或334的取代(残基的EU编号)。
在一些实施方案中，在Fc区中进行改变，所述改变导致改变的(即改善的或减少的)C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如，如美国专利号6,194,551；WO 99/51642；以及Idusogie等人J.Immunol.164:4178-4184(2000)中所述。
在一些实施方案中，提供了包含变体Fc区的抗TIGIT构建体(例如HCAb)变体，所述变体Fc区包含增加半衰期和/或改善与新生儿Fc受体(FcRn)的结合的一个或多个氨基酸取代。半衰期增加且与负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等人,J.Immunol.117:587(1976)以及Kim等人,J.Immunol.24:249(1994))的新生儿Fc受体(FcRn)的结合得以改善的抗体在US2005/0014934A1(Hinton等人)中有描述。那些抗体包含在其中具有改善Fc区与FcRn的结合的一个或多个取代的Fc区。此类Fc变体包括具有以下取代的那些Fc变体：在Fc区残基238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434中的一个或多个处的取代，例如Fc区残基434的取代(美国专利号7,371,826)。
关于Fc区变体的其他实例，还参见Duncan和Winter,Nature322:738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；和WO 94/29351。
考虑了包含本文所述的任何Fc变体或其组合的抗TIGIT构建体(诸如与sdAb融合的全长IgG或抗TIGIT IgG)。
d)半胱氨酸工程化抗体变体
在一些实施方案中，可能需要产生半胱氨酸工程化抗TIGIT构建体，例如“thioMAbs”，其中抗体的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代。在特定的实施方案中，经取代的残基出现在抗体的可及位点。通过用半胱氨酸取代那些残基，反应性硫醇基团由此位于抗体的可及位点，并且可用于将抗体与其他部分诸如药物部分或接头-药物部分缀合，以产生免疫缀合物，如本文进一步所述。在一些实施方案中，以下残基中的任何一个或多个可被半胱氨酸取代：重链的A118(EU编号)；和重链Fc区的S400(EU编号)。如例如美国专利号7,521,541中所述，可产生半胱氨酸工程化抗TIGIT构建体。
e)抗体衍生物
在一些实施方案中，本文提供的抗TIGIT构建体可被进一步修饰以含有本领域已知的并且容易获得的另外的非蛋白质部分。适用于抗体衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡萄聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三氧杂环己烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)、以及葡萄聚糖或聚(正乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由于其在水中的稳定性可在制造中具有优势。所述聚合物可具有任何分子量，并且可以是分支的或不分支的。与抗体附接的聚合物的数量可以变化，并且如果附接了超过一个聚合物，则它们可以是相同或不同的分子。一般来讲，可基于以下考虑因素来确定用于衍生化的聚合物数量和/或类型，所述考虑因素包括但不限于待改善的抗体的特定特性或功能、抗体衍生物是否将用于所限定条件下的疗法中等。
在一些实施方案中，提供了可通过暴露于辐射而选择性地加热的抗TIGIT构建体和非蛋白质部分的缀合物。在一些实施方案中，非蛋白质部分是碳纳米管(Kam等人,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA102:11600-11605(2005))。辐射可以是任何波长，并且包括但不限于不伤害普通细胞、但将非蛋白质部分加热至杀死与抗体-非蛋白质部分邻近的细胞的温度的波长。
在一些实施方案中，可进一步修饰本文提供的抗TIGIT构建体(诸如抗TIGIT IgG、抗-TIGIT/CTLA-4双特异性抗体、抗TIGIT/PD-L1双特异性抗体、抗TIGIT/TIM-3双特异性抗体、或抗TIGIT/LAG-3双特异性抗体)，以含有一种或多种生物活性蛋白、多肽或其片段。如本文所用，“生物活性的”(“Bioactive”或“biologically active”)意指在体内显示出生物活性以执行特定功能。例如，它可表示与特定生物分子(诸如蛋白质、DNA等)组合，并且然后促进或抑制这种生物分子的活性。在一些实施方案中，生物活性蛋白或其片段具有免疫刺激/免疫调控、膜转运或酶促活性。
在一些实施方案中，可与本文所述的抗TIGIT构建体融合的生物活性蛋白或其片段是配体，诸如与特异性细胞受体相互作用的淋巴因子和细胞因子。淋巴因子是当抗原或凝集素刺激T细胞生长时由T细胞分泌的低分子量蛋白质。淋巴因子的实例包括但不限于干扰素-α、干扰素-γ、白介素1(IL-1)、白介素2(IL-2)、白介素3(IL-3)、肿瘤坏死因子(TNF)、集落刺激因子(例如CSF-1、G-CSF或GM-CSF)、化学吸引素、巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)、巨噬细胞激活因子(MAF)、NK细胞激活因子、T细胞替代因子、白细胞抑制因子(LIF)、淋巴毒素、破骨细胞激活因子(OAF)、可溶性免疫应答抑制剂(SIRS)、生长刺激因子、单核细胞生长因子等。可掺入本发明的抗TIGIT融合蛋白中的细胞因子包括但不限于肿瘤坏死因子α(TNFα)、干扰素(IFN)和神经生长因子(NGF)等。
III.药物组合物
本申请还提供了药物组合物，所述药物组合物包含任何一种抗TIGIT构建体和任选地药学上可接受的载体，所述抗TIGIT构建体包含如本文所述的特异性地识别TIGIT的全长IgG(诸如抗TIGIT IgG、抗TIGIT/CTLA-4双特异性抗体、抗TIGIT/PD-L1双特异性抗体、抗TIGIT/TIM-3双特异性抗体或抗TIGIT/LAG-3双特异性抗体)。可通过将具有所需纯度的本文所述的抗TIGIT构建体与任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington'sPharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编辑(1980))以冻干制剂或水性溶液的形式混合来制备药物组合物。
药物组合物优选地是稳定的，其中包含这里所述的抗TIGIT mAb的抗TIGIT构建体在储存后基本上保持了其物理和化学稳定性和完整性。用于测量蛋白质稳定性的各种分析技术在本领域中是可获得的，并且在Peptide and Protein Drug Delivery,247-301,Vincent Lee编辑,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,Pubs.(1991)以及Jones,A.Adv.Drug Delivery Rev.10:29-90(1993)中进行了综述。可在选定的温度下在选定的时间段内测量稳定性。为了快速进行筛选，可将制剂在40℃下保存2周至1个月，此后测量稳定性。在要将制剂储存在2-8℃的情况下，通常所述制剂应在30℃或40℃下稳定至少1个月，和/或在2-8℃下稳定至少2年。在要将制剂储存在30℃的情况下，通常所述制剂应在30℃下稳定至少2年，和/或在40℃下稳定至少6个月。例如，在储存期间的聚集程度可用作蛋白质稳定性的指标。在一些实施方案中，本文所述的抗TIGIT构建体的稳定制剂可包含小于约10％(优选地小于约5％)的作为聚集物存在于制剂中的抗TIGIT构建体。
可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所使用的剂量和浓度下对接受者无毒，并且包括缓冲剂；抗氧化剂，包括抗坏血酸、蛋氨酸、维生素E、焦亚硫酸钠；防腐剂、等渗剂(例如氯化钠)、稳定剂、金属络合物(例如锌-蛋白质络合物)；螯合剂(诸如EDTA)和/或非离子表面活性剂。
生理上可接受的载体的实例包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物(包括葡萄糖、甘露糖或糊精)；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属络合物(例如锌-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM、聚乙二醇(PEG)、和PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
尤其是在稳定性取决于pH的情况下，使用缓冲剂将pH控制在优化治疗有效性的范围内。缓冲剂优选地以约50mM至约250mM的浓度存在。用于在本申请中使用的合适的缓冲剂包括有机酸和无机酸及其盐。例如，柠檬酸盐、磷酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、富马酸盐、葡糖酸盐、草酸盐、乳酸盐、乙酸盐。另外地，缓冲剂可包含组氨酸和三甲胺盐(诸如Tris)。
添加防腐剂以阻止微生物生长，并且通常以0.2％-1.0％(w/v)的范围存在。防腐剂的添加可例如促进多用途(多剂量)制剂的生产。用于在本申请中使用合适的防腐剂包括十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苄烷铵卤化物(例如，氯化物、溴化物、碘化物)、苄索氯铵；硫柳汞、苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚间苯二酚；环己醇、3-戊醇和间甲酚。
存在张度剂，有时称为“稳定剂”，以调节或维持组合物中液体的张度。当与带电荷的大型生物分子(诸如蛋白质和抗体)一起使用时，它们通常被称为“稳定剂”，因为它们可与氨基酸侧链的带电基团相互作用，从而减少分子间和分子内相互作用的可能性。考虑到其他成分的相对量，张度剂可以在0.1％至25％(按重量计)之间、优选地1％至5％之间的任何量存在。优选的张度剂包括多羟糖醇，优选地三羟或更高级的糖醇，诸如甘油、赤藓糖醇、阿糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇。
另外的赋形剂包括可用作以下中的一种或多种的药剂：(1)填充剂、(2)溶解度增强剂、(3)稳定剂、和(4)和防止变性或粘附于容器壁的药剂。此类赋形剂包括：多羟糖醇(上文所列举的)；氨基酸，诸如丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等；有机糖或糖醇，诸如蔗糖、乳糖、乳糖醇、海藻糖、水苏糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、核糖醇、肌醇糖(myoinisitose)、肌醇(myoinisitol)、半乳糖、半乳糖醇、甘油、环糖醇(例如，肌醇(inositol))、聚乙二醇；含硫的还原剂，诸如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、硫代乙醇酸钠、硫代甘油、α-单硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量蛋白质，诸如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或其他免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；单糖(例如，木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；二糖(例如，乳糖、麦芽糖、蔗糖)；三糖(诸如棉子糖)；以及多糖(诸如糊精或葡萄聚糖)。
存在非离子型表面活性剂或洗涤剂(也称为“湿润剂”)，以帮助溶解治疗剂以及保护治疗蛋白质免受搅动诱导的聚集，这也允许制剂暴露于剪切表面应力而不会导致活性治疗蛋白质或抗体变性。非离子型表面活性剂以约0.05mg/ml至约1.0mg/ml、优选地约0.07mg/ml至约0.2mg/ml的范围存在。
合适的非离子型表面活性剂包括聚山梨醇酯(20、40、60、65、80等)、泊洛沙姆(184、188等)、
Figure BDA0002584023080000701
多元醇、
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聚氧乙烯山梨醇酐单醚(
Figure BDA0002584023080000703
等)、聚桂醇400、聚氧乙烯40硬脂酸酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油10、50和60、单硬脂酸甘油酯、蔗糖脂肪酸酯、甲基纤维素和羧甲基纤维素。可使用的阴离子洗涤剂包括月桂基硫酸钠、二辛基磺基琥珀酸钠和二辛基磺酸钠。阳离子洗涤剂包括苯扎氯铵或苄索氯铵。
为了将药物组合物用于体内施用，它们必须是无菌的。可通过无菌滤膜过滤来使药物组合物无菌。本文的药物组合物通常被放置在具有无菌进入口的容器中，所述容器例如为具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶。
施用途径是根据已知和公认的方法，诸如通过长时间段以合适的方式单次或多次推注或输注，例如通过皮下、静脉内、腹膜内、肌内、动脉内、病灶内或关节内途径进行注射或输注、局部施用、吸入或通过持续释放或延长释放方式。在一些实施方案中，药物组合物是局部地(诸如瘤内地)施用的。
可制备持续释放的制剂。持续释放制剂的合适实例包括含有拮抗剂的固体疏水性聚合物的半透性基质，所述基质呈定型制品(例如薄膜或微胶囊)的形式。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟基乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸和乙基-L-谷氨酸的共聚物、不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
对于所治疗的特定适应症而言，如有需要，本文的药物组合物还可含有超过一种活性化合物，优选地具有不会互相不利影响的互补活性的那些活性化合物。另选地或另外地，所述组合物可包含细胞毒性剂、化学治疗剂、细胞因子、免疫抑制剂或生长抑制剂。此类分子合适地以对于预期目的有效的量组合存在。
活性成分也可被包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合所制备的微胶囊(例如，分别为羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中，在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)中，或在微乳剂中。此类技术公开在Remington's Pharmaceutical Sciences第18版中。
在一些实施方案中，药物组合物被包含在一次性小瓶中，诸如一次性密封小瓶中。在一些实施方案中，药物组合物被包含在多次使用小瓶中。在一些实施方案中，药物组合物被包含在散装容器中。在一些实施方案中，药物组合物是冷冻保存的。
IV.使用或应用的方法
包含如本文所述的特异性地识别TIGIT的mAb(诸如抗TIGIT全长IgG、抗TIGIT/CTLA-4双特异性抗体、抗TIGIT/PD-L1双特异性抗体、抗TIGIT/TIM-3双特异性抗体或抗TIGIT/LAG-3双特异性抗体)的抗TIGIT构建体及其组合物(诸如药物组合物)可用于诸如诊断、分子测定和治疗中的多种应用。
本发明的一个方面提供了一种在对其有需要的个体中治疗TIGIT相关疾病或病症的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的包含本文所述的抗TIGIT构建体的药物组合物。在一些实施方案中，TIGIT相关疾病是癌症。在一些实施方案中，TIGIT相关疾病是病原性感染，诸如病毒感染。
本申请部分地考虑了蛋白质构建体(诸如抗TIGIT全长IgG、抗TIGIT/CTLA-4双特异性抗体、抗TIGIT/PD-L1双特异性抗体、抗TIGIT/TIM-3双特异性抗体或抗TIGIT/LAG-3双特异性抗体)、核酸分子和/或编码其的载体、包含核酸分子和/或编码其的载体的宿主细胞，它们可单独或与其他疗法组合(并且在至少一些方面，与药学上可接受的载体或赋形剂一起)施用。在一些实施方案中，在施用抗TIGIT构建体之前，它们可与本领域熟知的合适的药物载体和赋形剂组合。根据本公开制备的组合物可用于治疗癌症或延迟癌症的恶化。
在一些实施方案中，提供了一种治疗癌症的方法，所述方法包括向个体施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含分离的抗TIGIT构建体，所述抗TIGIT构建体包含特异性地识别TIGIT的mAb(诸如抗TIGIT全长IgG、抗TIGIT/CTLA-4双特异性抗体、抗TIGIT/PD-L1双特异性抗体、抗TIGIT/TIM-3双特异性抗体或抗TIGIT/LAG-3双特异性抗体)。在一些实施方案中，癌症是实体瘤(诸如结肠癌)。在一些实施方案中，药物组合物是全身性地(诸如静脉内地)施用的。在一些实施方案中，药物组合物是局部地(诸如瘤内地)施用的。在一些实施方案中，所述方法还包括向个体施用另外的癌症疗法(诸如手术、放射、化学疗法、免疫疗法、激素疗法或其组合)。在一些实施方案中，个体是人。在一些实施方案中，治疗癌症的方法具有以下生物活性中的一种或多种：(1)杀伤癌细胞(包括旁观者杀伤)；(2)抑制癌细胞的增殖；(3)诱导在肿瘤中的免疫应答；(4)缩小肿瘤尺寸；(5)减轻患有癌症的个体的一种或多种症状；(6)抑制肿瘤转移；(7)延长生存期；(8)延长到癌症进展的时间；以及(9)防止、抑制或减少癌症复发的可能性。在一些实施方案中，由本文所述的药物组合物介导的杀伤癌细胞的方法可实现至少约40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更高中任一者的肿瘤细胞死亡率。在一些实施方案中，由本文所述的药物组合物介导的杀伤癌细胞的方法可实现至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更高中任一者的旁观者肿瘤细胞(未被溶瘤细胞VV感染)的死亡率。在一些实施方案中，由本文所述的药物组合物介导的减少肿瘤尺寸的方法可减少至少约10％(包括例如至少约20％、30％、40％、60％、70％、80％、90％或100％中任一者)的肿瘤尺寸。在一些实施方案中，由本文所述的药物组合物介导的抑制肿瘤转移的方法可抑制至少约10％(包括例如至少约20％、30％、40％、60％、70％、80％、90％或100％中任一者)的转移。在一些实施方案中，由本文所述的药物组合物介导的延长个体(诸如人)的存活期的方法可将个体的存活期延长至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18或24个月中的任一者。在一些实施方案中，由本文所述的药物组合物介导的延长到癌症进展的时间的方法可将到癌症进展的时间延长至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12周中的任一者。
本文所述的方法适用于治疗多种癌症，包括实体癌和液体癌二者。所述方法适用于所有阶段的癌症，包括早期癌症、非转移性癌症、原发性癌症、晚期癌症、局部晚期癌症、转移性癌症或缓解期癌症。本文所述的方法可在辅助背景或新辅助背景中(即所述方法可在基本/确定性疗法之前进行)用作第一疗法、第二疗法、第三疗法或与本领域已知的其他类型的癌症疗法的组合疗法，所述其他类型的癌症疗法例如为化学疗法、手术、激素疗法、放射、基因疗法、免疫疗法(诸如T细胞疗法)、骨髓移植、干细胞移植、靶向疗法、冷冻疗法、超声疗法、光动力疗法、射频消融等。在一些实施方案中，所述方法用于治疗先前已被治疗的个体。在一些实施方案中，癌症对于先前疗法而言是难治的。在一些实施方案中，所述方法用于治疗先前未被治疗过的个体。
在一些实施方案中，所述方法适用于治疗具有异常TIGIT表达、活性和/或信号传导的癌症，所述癌症包括(作为非限制性实例)黑素瘤、前列腺癌、肺癌、结肠癌、胃癌、卵巢癌、乳腺癌、和胶质母细胞瘤。
因此，在一些实施方案中，提供了一种治疗免疫疗法应答性实体瘤(诸如癌或腺癌，诸如具有异常的TIGIT表达、活性和/或信号传导的癌症)的方法，所述方法包括向个体施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含分离的抗TIGIT构建体，所述抗TIGIT构建体包含特异性地识别TIGIT的单克隆抗体(诸如抗TIGIT全长IgG、抗TIGIT/CTLA-4双特异性抗体、抗TIGIT/PD-L1双特异性抗体、抗TIGIT/TIM-3双特异性抗体或抗TIGIT/LAG-3双特异性抗体)。在一些实施方案中，癌症是实体瘤(诸如结肠癌)。在一些实施方案中，药物组合物是全身性地(诸如静脉内地)施用的。在一些实施方案中，药物组合物是局部地(诸如瘤内地)施用的。在一些实施方案中，所述方法还包括向个体施用另外的癌症疗法(诸如手术、放射、化学疗法、免疫疗法、激素疗法或其组合)。在一些实施方案中，所述个体是人。在一些实施方案中，治疗癌症的方法具有以下生物活性中的一种或多种：(1)杀伤癌细胞(包括旁观者杀伤)；(2)抑制癌细胞的增殖；(3)诱导在肿瘤中的免疫应答；(4)缩小肿瘤尺寸；(5)减轻患有癌症的个体的一种或多种症状；(6)抑制肿瘤转移；(7)延长生存期；(8)延长到癌症进展的时间；以及(9)防止、抑制或减少癌症复发的可能性。在一些实施方案中，由本文所述的药物组合物介导的杀伤癌细胞的方法可实现至少约40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更高中任一者的肿瘤细胞死亡率。在一些实施方案中，由本文所述的药物组合物介导的杀伤癌细胞的方法可实现至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更高中任一者的旁观者肿瘤细胞(未被溶瘤细胞VV感染)的死亡率。在一些实施方案中，由本文所述的药物组合物介导的减少肿瘤尺寸的方法可减少至少约10％(包括例如至少约20％、30％、40％、60％、70％、80％、90％或100％中任一者)的肿瘤尺寸。在一些实施方案中，由本文所述的药物组合物介导的抑制肿瘤转移的方法可抑制至少约10％(包括例如至少约20％、30％、40％、60％、70％、80％、90％或100％中任一者)的转移。在一些实施方案中，由本文所述的药物组合物介导的延长个体(诸如人)的存活期的方法可将个体的存活期延长至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18或24个月中的任一者。在一些实施方案中，由本文所述的药物组合物介导的延长到癌症进展的时间的方法可将到癌症进展的时间延长至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12周中的任一者。
在一些实施方案中，所述方法适用于治疗具有异常的CD155或TIGIT表达、活性和/或信号传导的癌症，所述癌症包括(作为非限制性实例)血液学癌症和/或实体瘤。使用本发明的抗体可抑制其生长的一些癌症包括通常对免疫疗法有响应的癌症。治疗的其他癌症的非限制性实例包括黑素瘤(例如转移性恶性黑素瘤)、肾癌(例如透明细胞癌)、前列腺癌(例如激素难治性前列腺腺癌)、乳腺癌、结肠癌和肺癌(例如非小细胞肺癌)。另外地，本发明包括使用本发明的抗体可抑制其生长的难治性或复发性恶性肿瘤。可使用本发明的抗体进行治疗的其他癌症的实例包括骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病(包括急性髓样白血病、慢性髓样白血病、急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病)、儿童期实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)赘生物、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊髓轴肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西氏肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症(包括石棉诱发的那些癌症)、以及所述癌症的组合。所述应用也可用于治疗转移性癌症，特别是表达TIGIT的转移性癌症(Iwai等人(2005)Int.Immunol.17:133-144)。
因此，在一些实施方案中，提供了一种治疗免疫疗法应答性实体瘤(诸如癌或腺癌，诸如具有异常的TIGIT表达、活性和/或信号传导和/或异常的CTLA-4、PD-L1、TIM-3和LAG-3的表达、活性和/或信号传导的癌症)的方法，所述方法包括向个体施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含分离的抗TIGIT构建体，所述抗TIGIT构建体包含与CTLA-4、PD-L1、TIM-3或LAG-3sdAb融合的、特异性地识别TIGIT的全长IgG。在一些实施方案中，提供了一种治疗免疫疗法应答性实体瘤(诸如癌或腺癌，诸如具有异常的TIGIT表达、活性和/或信号传导和/或异常的CTLA-4、PD-L1、TIM-3、LAG-3的表达、活性和/或信号传导的癌症)的方法，所述方法包括向个体施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含分离的抗TIGIT构建体，所述抗TIGIT构建体包含与CTLA-4、PD-L1、TIM-3或LAG-3sdAb融合的、特异性地识别TIGIT的全长IgG。
在一些实施方案中，本文所述的方法适用于治疗结肠直肠癌，诸如腺癌、胃肠道类癌瘤、胃肠道间质瘤、平滑肌肉瘤、黑素瘤或鳞状细胞癌。
本申请的药物组合物的剂量和所需的药物浓度可根据预期的特定用途而变化。适当的剂量或施用途径的确定完全在普通技术人员的技术范围内。动物实验为确定人类疗法的有效剂量提供了可靠的指导。可按照Mordenti,J.和Chappell,W.“The Use ofInterspecies Scaling in Toxicokinetics,”于Toxicokinetics and New DrugDevelopment,Yacobi等人,编辑,Pergamon Press,New York 1989,第42-46页制定的原则进行有效剂量的种间标定。
当使用包含本文所述的抗TIGIT mAb的抗TIGIT构建体的体内施用时，正常剂量的量取决于施用途径可在每天约10ng/kg至多达约100mg/kg哺乳动物体重或更多，优选地约1mg/kg/天至10mg/kg/天，诸如约1-3mg/kg/天、约2-4mg/kg/天、约3-5mg/kg/天、约4-6mg/kg/天、约5-7mg/kg/天、约6-8mg/kg/天、约6-6.5mg/kg/天、约6.5-7mg/kg/天、约7-9mg/kg/天、或约8-10mg/kg/天的范围内变化。在本申请的范围内，不同的制剂对不同的治疗和不同的障碍将是有效的，并且旨在治疗特定器官或组织的施用可能需要以与针对另一器官或组织不同的方式递送。此外，剂量可通过一次或多次分开的施用或通过连续输注来施用。对于几天或更长时间的重复施用，取决于病症，持续治疗直至出现期望的疾病症状抑制。然而，其他剂量方案也可能有用。通过常规技术和测定很容易监测此疗法的进展。
在一些实施方案中，药物组合物被施用一次(例如推注注射(bolus injection))。在一些实施方案中，药物组合物被施用多次(诸如2、3、4、5、6或更多次中任一者)。如果多次施用，则它们可通过相同或不同的途径进行，并且可在同一站点或可选的站点发生。可每周两次、每周3次、每周4次、每周5次、每天、每天不间断、每周一次、每周不间断、每2周一次、每3周一次、每个月一次、每2个月一次、每3个月一次、每4个月一次、每5个月一次、每6个月一次、每7个月一次、每8个月一次、每9个月一次、每10个月一次、每11个月一次、或每年一次地施用药物组合物。施用之间的间隔时间可以是24h至48h、2天至3天、3天至5天、5天至1周、1周至2周、2周至1个月、1个月至2个月、2个月至3个月、3个月至6个月、或6个月至一年中的任一者。间隔时间也可以是不规则的(例如，肿瘤进展后)。在一些实施方案中，给药时间表没有间断。在一些实施方案中，药物组合物每4天施用，持续4次。通过监测患者的疾病征兆并相应地调节治疗，医学领域的技术人员可以容易地确定针对特定患者的最佳剂量和治疗方案。
根据已知方法，诸如作为大丸剂静脉内施用，或通过在一段时间内连续输注，通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、静脉内(i.v.)、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部或吸入途径，将本申请的药物组合物(包括但不限于复溶的和液体制剂)施用至需要用本文所述的抗TIGIT构建体治疗的个体(优选地人)。可通过将本文所述的冻干的抗TIGIT构建体溶解于稀释剂中以使蛋白质完全分散开来制备复溶的制剂。适用于本申请中使用的示例性药学上可接受的(对施用至人而言安全且无毒的)稀释剂包括但不限于无菌水、注射用抑菌水(BWFI)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)、无菌盐水溶液、林格氏溶液或葡萄糖溶液、或盐和/或缓冲剂的水性溶液。
在一些实施方案中，将药物组合物通过皮下(即在皮肤下方)施用至个体。对于此目的，可使用注射器注射药物组合物。然而，也可获得施用药物组合物的其他装置，诸如注射装置；注射器笔；自动注射器装置、无针装置；和皮下贴片递送系统。
在一些实施方案中，将药物组合物静脉内地施用至个体。在一些实施方案中，将药物组合物通过输注(诸如静脉内输注)施用至个体。用于免疫疗法的输注技术在本领域中是已知的(参见例如，，Rosenberg等人,New Eng.J.of Med.319:1676(1988))。
如本文所述的包含特异性地识别TIGIT的mAb(诸如抗TIGIT全长IgG、抗TIGIT/CTLA-4双特异性抗体、抗TIGIT/PD-L1双特异性抗体、抗TIGIT/TIM-3双特异性抗体或抗TIGIT/LAG-3双特异性抗体)的抗TIGIT构建体及其组合物(诸如药物组合物)也可用于诊断或分子测定中。例如，抗体或抗原结合片段可用于检测或定量生物样品中的TIGIT，从而检测或监测与TIGIT有关的疾病(诸如上述那些疾病)的进展或治疗。
V.制备方法
本文所述的抗TIGIT构建体(诸如抗TIGIT单克隆抗体)可使用本领域已知的或本文所述的任何方法来制备。
可使用本领域已知的以下方法获得啮齿类动物单克隆抗体：诸如通过免疫啮齿类动物物种(诸如小鼠或大鼠)并从其中获得杂交瘤，或通过使用本领域已知的分子生物学技术克隆Fab片段或单链Fc(scFv)文库、并随后通过ELISA用未选择文库的单个克隆或通过使用噬菌体展示进行选择。
为了重组生产单克隆抗体，分离或合成编码单克隆抗体的核酸，并将其插入可复制的载体中以进一步克隆(扩增DNA)或表达。编码单克隆抗体的DNA易于使用常规程序(例如，通过使用能够与编码抗体的重链和轻链的基因特异性地结合的寡核苷酸探针)进行分离和测序。许多载体是可获得的。载体的选择部分取决于要使用的宿主细胞。通常，优选的宿主细胞是原核或真核(通常是哺乳动物)来源的。
实施方案
本发明还提供了以下非限制性实施方案。
实施方案1包含一种分离的抗体，优选地mAb，或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含：
(a)重链可变结构域(VH)，所述重链可变结构域分别包含：
i.重链互补决定区1(CDR1)，所述重链互补决定区1包含选自由SEQ ID NO:27-39组成的组的氨基酸序列；
ii.重链CDR2，所述重链CDR2包含选自由SEQ ID NO:40-52组成的组的氨基酸序列；和
iii.重链CDR3，所述重链CDR3包含选自由SEQ ID NO:53-65组成的组的氨基酸序列；以及
(b)轻链可变结构域(VL)，所述轻链可变结构域分别包含：
i.轻链CDR1，所述轻链CDR1包含选自由SEQ ID NO:66-78组成的组的氨基酸序列；
ii.轻链CDR2，所述轻链CDR2包含选自由SEQ ID NO:79-91组成的组的氨基酸序列；和
iii.轻链CDR3，所述轻链CDR3包含选自由SEQ ID NO:92-104组成的组的氨基酸序列；
其中所述抗体或其抗原结合片段能够特异性地结合TIGIT，优选地人TIGIT。
实施方案2是如实施方案1所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中：
(1)所述VH包含分别具有SEQ ID NO:27、40和53的氨基酸序列的所述重链CDR1、CDR2和CDR3序列，并且所述VL包含分别具有SEQ ID NO:66、79和92的氨基酸序列的所述轻链CDR1、CDR2和CDR3；
(2)所述VH包含分别具有SEQ ID NO:28、41和54的氨基酸序列的所述重链CDR1、CDR2和CDR3序列，并且所述VL包含分别具有SEQ ID NO:67、80和93的氨基酸序列的所述轻链CDR1、CDR2和CDR3；
(3)所述VH包含分别具有SEQ ID NO:29、42和55的氨基酸序列的所述重链CDR1、CDR2和CDR3序列，并且所述VL包含分别具有SEQ ID NO:68、81和94的氨基酸序列的所述轻链CDR1、CDR2和CDR3；
(4)所述VH包含分别具有SEQ ID NO:30、43和56的氨基酸序列的所述重链CDR1、CDR2和CDR3序列，并且所述VL包含分别具有SEQ ID NO:69、82和95的氨基酸序列的所述轻链CDR1、CDR2和CDR3；
(5)所述VH包含分别具有SEQ ID NO:31、44和57的氨基酸序列的所述重链CDR1、CDR2和CDR3序列，并且所述VL包含分别具有SEQ ID NO:70、83和96的氨基酸序列的所述轻链CDR1、CDR2和CDR3；
(6)所述VH包含分别具有SEQ ID NO:32、45和58的氨基酸序列的所述重链CDR1、CDR2和CDR3序列，并且所述VL包含分别具有SEQ ID NO:71、84和97的氨基酸序列的所述轻链CDR1、CDR2和CDR3；
(7)所述VH包含分别具有SEQ ID NO:33、46和59的氨基酸序列的所述重链CDR1、CDR2和CDR3序列，并且所述VL包含分别具有SEQ ID NO:72、85和98的氨基酸序列的所述轻链CDR1、CDR2和CDR3；
(8)所述VH包含分别具有SEQ ID NO:34、47和60的氨基酸序列的所述重链CDR1、CDR2和CDR3序列，并且所述VL包含分别具有SEQ ID NO:73、86和99的氨基酸序列的所述轻链CDR1、CDR2和CDR3；
(9)所述VH包含分别具有SEQ ID NO:35、48和61的氨基酸序列的所述重链CDR1、CDR2和CDR3序列，并且所述VL包含分别具有SEQ ID NO:74、87和100的氨基酸序列的所述轻链CDR1、CDR2和CDR3；
(10)所述VH包含分别具有SEQ ID NO:36、49和62的氨基酸序列的所述重链CDR1、CDR2和CDR3序列，并且所述VL包含分别具有SEQ ID NO:75、88和101的氨基酸序列的所述轻链CDR1、CDR2和CDR3；
(11)所述VH包含分别具有SEQ ID NO:37、50和63的氨基酸序列的所述重链CDR1、CDR2和CDR3序列，并且所述VL包含分别具有SEQ ID NO:76、89和102的氨基酸序列的所述轻链CDR1、CDR2和CDR3；
(12)所述VH包含分别具有SEQ ID NO:38、51和64的氨基酸序列的所述重链CDR1、CDR2和CDR3序列，并且所述VL包含分别具有SEQ ID NO:77、90和103的氨基酸序列的所述轻链CDR1、CDR2和CDR3；或者
(13)所述VH包含分别具有SEQ ID NO:39、52和65的氨基酸序列的所述重链CDR1、CDR2和CDR3序列，并且所述VL包含分别具有SEQ ID NO:78、91和104的氨基酸序列的所述轻链CDR1、CDR2和CDR3；
实施方案3是如实施方案2所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含分别具有SEQ ID NO:38、51和64的氨基酸序列的所述重链CDR1、CDR2和CDR3序列，并且所述VL包含分别具有SEQ ID NO:77、90和103的氨基酸序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3。
实施方案4是如实施方案2所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含分别具有SEQ ID NO:39、52和65的氨基酸序列的所述重链CDR1、CDR2和CDR3序列，并且所述VL包含具有SEQ ID NO:78、91和104的氨基酸序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3。
实施方案5是如实施方案1-4中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含SEQ ID NO:1-13中任一者的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:1-13中任一者具有至少约80％、至少约90％或至少约95％序列同一性的变体，并且所述VL包含SEQ ID NO:14-26中任一者的氨基酸序列、或其分别与SEQ ID NO:14-26中任一者具有至少约80％、至少约90％或至少约95％序列同一性的变体。
实施方案6是如实施方案5所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含选自由SEQ ID NO:1-13组成的组的氨基酸序列、或其包含在所述VH中的至多约3个氨基酸取代的变体；并且所述VL包含选自由SEQ ID NO:14-26组成的组的氨基酸序列、或其包含在所述VL中的至多约3个氨基酸取代的变体。
实施方案7是如实施方案5或6所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中：
(1)所述VH包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，并且所述VL包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；
(2)所述VH包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，并且所述VL包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；
(3)所述VH包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，并且所述VL包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；
(4)所述VH包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，并且所述VL包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；
(5)所述VH包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，并且所述VL包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列；
(6)所述VH包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，并且所述VL包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列；
(7)所述VH包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，并且所述VL包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；
(8)所述VH包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，并且所述VL包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；
(9)所述VH包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，并且所述VL包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列；
(10)所述VH包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列，并且所述VL包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；
(11)所述VH包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列，并且所述VL包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列；
(12)所述VH包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列，并且所述VL包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列；或者
(13)所述VH包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列，并且所述VL包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列。
实施方案8是如实施方案7所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列，并且所述VL包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列。
实施方案9是如实施方案7所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列，并且所述VL包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列。
实施方案10是如实施方案1-9中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH融合至免疫球蛋白的重链恒定区。
实施方案11是如实施方案1-10中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述VL融合至免疫球蛋白的轻链恒定区(CL)。
实施方案12是如实施方案1-11中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与所述TIGIT之间的结合的KD为10-7M至约10-12M，优选地约10-8M至约10-12M，更优选地约10-9M至约10-12M。
实施方案13是如实施方案1-12中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段是啮齿动物的、嵌合的、人的、部分人源化的、或完全人源化的。
实施方案14是如实施方案13所述的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段是人源化的。
实施方案15是如实施方案14所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含选自由SEQ ID NO:105-112组成的组的氨基酸序列，并且所述VL包含选自由SEQ ID NO:113-118组成的组的氨基酸序列。
实施方案16是如实施方案1-15中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段还包含第二抗体部分，其中所述第二抗体部分能够特异性地结合第二抗原。
实施方案17是如实施方案16所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述第二抗体部分是Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、单链Fv(scFv)、scFv-scFv、微抗体、双抗体、sdAb或抗体模拟物。
实施方案18是如实施方案17所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述第二抗体部分是sdAb。
实施方案19是如实施方案16-18中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述第二抗体部分能够特异性地结合CTLA-4，优选地，所述第二抗体部分是能够特异性地结合CTLA-4的sdAb。
实施方案20是如实施方案16-18中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述第二抗体部分能够特异性地结合PD-L1，优选地，所述第二抗体部分是能够特异性地结合PD-L1的sdAb。
实施方案21是如实施方案16-18中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述第二抗体部分能够特异性地结合TIM-3，优选地，所述第二抗体部分是能够特异性地结合TIM-3的sdAb。
实施方案22是如实施方案16-18中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述第二抗体部分能够特异性地结合LAG-3，优选地，所述第二抗体部分是能够特异性地结合LAG-3的sdAb。
实施方案23是如实施方案19-22中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中能够特异性地识别TIGIT的全长IgG的重链或轻链的氨基末端任选地通过肽接头融合至能够与CTLA-4、PD-L1、TIM-3或LAG-3特异性地结合的sdAb的羧基末端。
实施方案24是如实施方案19-22中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中能够特异性地识别TIGIT的全长IgG的重链或轻链的羧基末端任选地通过肽接头融合至能够与CTLA-4、PD-L1、TIM-3或LAG-3特异性地结合的sdAb的氨基末端。
实施方案25是如实施方案23或24所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中能够特异性地识别TIGIT的所述全长IgG通过肽接头融合至能够与CTLA-4、PD-L1、TIM-3或LAG-3特异性地结合的sdAb，所述肽接头具有SEQ ID NO:119-121中的一者的氨基酸序列。
实施方案26是一种第二分离的抗体或其抗原结合片段，所述第二分离的抗体或其抗原结合片段能够与如实施方案1-25中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段竞争来特异性地结合TIGIT。
实施方案27是一种药物组合物，所述药物组合物包含如实施方案1-25中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段或如实施方案26所述的第二分离的抗体或其抗原结合片段、以及药学上可接受的载体。
实施方案28是如实施方案1-25中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段、如实施方案26所述的第二分离的抗体或其抗原结合片段、或如实施方案27所述的药物组合物，用于治疗有需要的受试者的TIGIT相关疾病的用途。
实施方案29是用于如实施方案28所述的用途的分离的抗体或其抗原结合片段或药物组合物，其中所述TIGIT相关疾病是癌症。
实施方案30是用于如实施方案29所述的用途的分离的抗体或其抗原结合片段或药物组合物，其中所述癌症是实体瘤。
实施方案31是用于如实施方案29所述的用途的分离的抗体或其抗原结合片段或药物组合物，其中所述癌症是结肠癌。
实施方案32是与另外的癌症疗法组合的、用于如实施方案28-31中任一项所述的用途的分离的抗体或其抗原结合片段或药物组合物。
实施方案33是用于如实施方案32所述的用途的分离的抗体或其抗原结合片段或药物组合物，其中所述另外的癌症疗法是手术、放射、化学疗法、免疫疗法、激素疗法或其组合。
实施方案34是用于如实施方案28所述的用途的分离的抗体或其抗原结合片段或药物组合物，其中所述TIGIT相关疾病是病原性感染。
实施方案35是用于如实施方案28-34中任一项所述的用途的分离的抗体或其抗原结合片段或药物组合物，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段或药物组合物被用于全身性或局部施用。
实施方案36是用于如实施方案28-34中任一项所述的用途的分离的抗体或其抗原结合片段或药物组合物，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段或药物组合物被用于静脉内施用。
实施方案37是如实施方案28-34中任一项所述的用途的分离的抗体或其抗原结合片段或药物组合物，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段或药物组合物被用于瘤内施用。
实施方案38是用于如实施方案28-37中任一项所述的用途的分离的抗体或其抗原结合片段或药物组合物，其中所述受试者是人。
实施方案39是一种在对其有需要的受试者中治疗TIGIT相关疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如实施方案27所述的药物组合物。
实施方案40是如实施方案39所述的方法，其中所述TIGIT相关疾病是癌症。
实施方案41是如实施方案40所述的方法，其中所述癌症是实体瘤。
实施方案42是如实施方案40或41所述的方法，其中所述癌症是结肠癌。
实施方案43是如实施方案40-42中任一项所述的方法，所述方法还包括向所述个体施用另外的癌症疗法。
实施方案44是如实施方案43所述的方法，其中所述另外的癌症疗法是手术、放射、化学疗法、免疫疗法、激素疗法或其组合。
实施方案45是如实施方案39所述的方法，其中所述TIGIT相关疾病是病原性感染。
实施方案46是如实施方案39-45中任一项所述的方法，其中将所述药物组合物全身性地或局部地施用。
实施方案47是如实施方案39-45中任一项所述的方法，其中将所述药物组合物静脉内地施用。
实施方案48是如实施方案39-45中任一项所述的方法，其中将所述药物组合物瘤内地施用。
实施方案49是如实施方案39-48中任一项所述的方法，其中所述个体是人。
实施例
以下实施例旨在仅仅是本发明的示例，并且因此不应被视为以任何方式限制本发明。通过说明而非限制的方式提供以下实施例和详细描述。
实施例1：小鼠抗人TIGIT杂交瘤细胞系和单克隆抗体的生成
在本公开中，小鼠抗人TIGIT单克隆抗体70A11A8E6、11D8E12A4、16F10H12C11、8F2D8E7、48B5G4E12、139E2C2D2、128E3G7F5、121C2F10B5、104G12E12G2、83G6H11C12、92E9D4B4、100C4E7D11和64G1E9B4是通过以下免疫方法获得的。
对于动物免疫，免疫原是Fc标签人TIGIT蛋白的融合蛋白(Acro Bioscience：TIT-5254)。将50μg TIGIT Fc融合蛋白与完全弗氏佐剂(Sigma-Aldrich)在200μl中1:1混合来免疫雌性Balb/c小鼠。然后，每两周用与不完全弗氏佐剂1:1混合的25μg TIGIT Fc融合蛋白对小鼠进行腹膜内加强，最多3次。融合之前4天，选择通过荧光激活细胞分选(FACS，图1A-1C)在流式细胞术研究中具有高TIGIT结合信号的三只小鼠(#8087、#8100和#8771)，用25μg TIGIT Fc融合蛋白(无佐剂)进行最终腹膜内加强。应用FACS结合测试来评价杂交瘤上清液中的抗体与在CHO-K1(GenScript)细胞表面上表达的TIGIT蛋白的结合能力。将CHO-K1亲本细胞和过量表达人TIGIT的CHO-K1都收集并用PBS洗涤三次。将2.5x 105个细胞和100μl杂交瘤上清液添加到96孔板的每个孔中，在4℃下孵育1小时。然后使用PBS将板洗涤3次。添加100μl iFluor标记的山羊抗小鼠IgG并在4℃下孵育45min。最后，将细胞用PBS洗涤3次，并通过FACS BD Calibur读出信号。
为了进行杂交瘤融合和筛选，将分离的脾制成均质的单细胞悬液，并且还针对骨髓瘤细胞(SP 2/0细胞)制备单细胞悬液。将8.9×107个脾细胞和4.1×107个SP 2/0细胞通过电融合方法融合。将来自每种杂交瘤融合物的融合细胞重悬于100ml含有胸腺核苷嘧啶、次黄嘌呤和氨基蝶呤杂交瘤选择试剂的DMEM/10％FBS培养基中。将细胞悬液各100μl分配到五十个96孔中。将96孔板在37℃孵育箱中以6％CO2浓度培养7天。然后通过ELISA结合、封闭和FACS结合来测试杂交瘤上清液，以通过ELISA结合测试来检测抗人TIGIT抗体的存在。
ELISA结合测试：采用间接ELISA来获得上清液中的抗体与人TIGIT Fc融合蛋白的结合能力。将0.5μg/ml重组TIGIT Fc融合蛋白或人IgG1在ELISA板中以每孔100μl在PBS中于4℃下包被过夜。使用PBST(0.05％tween)洗涤板。使用含1％BSA的PBST以200μl/孔将板封闭0.5小时。稍后丢弃封闭缓冲液，并以每孔100μl添加杂交瘤上清液，在室温下孵育1小时。然后将板用PBST洗涤3次。向每孔100μl中添加山羊抗小鼠IgG(Fab特异性)HRP并在37℃下孵育半小时。然后将板用PBST洗涤5次，并且将TMB缓冲液(GenScript)添加至孔中并在室温下孵育15min。以每孔50μl添加1M HCL(Sigma)终止缓冲液以终止反应，并且在450nm处读板。
选择从其对人TIGIT Fc融合蛋白与对人IgG1的上清液ELISA测试的读数之间的OD值差超过500的杂交瘤，用于进一步的杂交瘤亚克隆。通过有限稀释进行亚克隆。将细胞计数并在含有胸腺核苷嘧啶、次黄嘌呤和氨基蝶呤杂交瘤选择试剂的DMEM/10％FBS培养基中连续稀释至5-15个细胞/ml的浓度。对于每个杂交瘤克隆，将200μl杂交瘤悬液以每孔1-3个细胞的浓度转移到96个孔中。将板在37℃下与5％CO2一起孵育1周。并且然后将上清液用于FACS结合研究以评价抗人TIGIT抗体的存在。已确认来自70A11A8E6、11D8E12A4、16F10H12C11、8F2D8E7、48B5G4E12、139E2C2D2、128E3G7F5、121C2F10B5、104G12E12G2、83G6H11C12、92E9D4B4、100C4E7D11和64G1E9B4的杂交瘤上清液通过FACS研究特异性地结合人TIGIT(图2A-2M)。
实施例2：小鼠抗人TIGIT杂交瘤细胞系和单克隆抗体的测序和表达
将表达小鼠同种型ELISA试剂盒(Clonotyping System-HRP,SouthernBiotech；Birmingham,AL)用于鉴定单克隆抗体的同种型。然后使用TRIzol(Ambion)从3×106–5×106个杂交瘤细胞中提取单克隆的总RNA。使用同种型特异性引物和通用引物(PrimeScriptTM第1链cDNA合成试剂盒，Takara；Mountain View,CA)将RNA反转录为cDNA，然后应用RACEPCR(GenScript)扩增抗体重链和轻链的可变区，并且将PCR产物亚克隆到pMD18-T载体系统(Takara)中。使用载体特异性引物来验证并测序插入片段。最后，获得70A11A8E6、11D8E12A4、16F10H12C11、8F2D8E7、48B5G4E12、139E2C2D2、128E3G7F5、121C2F10B5、104G12E12G2、83G6H11C12、92E9D4B4、100C4E7D11和64G1E9B4的可变区DNA/蛋白质序列。
合成上述每个克隆的重链或轻链可变区和恒定区的DNA片段，并且将其插入pTT5表达载体中。将所构建的质粒用于转染HEK293-6E细胞，并将HEK293-6E细胞在摇瓶中于37℃下培养10天。然后收集上清液用于纯化。纯化之前，将管和蛋白质A柱用0.2M NaOH处理以去除热原。然后，用0.05M Tris和1.5M NaCl(pH 8.0)重新平衡所述柱。将之前收集的上清液与平衡缓冲液1:1混合并过滤以保持无菌。将过滤的上清液与蛋白质A柱在室温下孵育2小时，并用1X平衡缓冲液洗涤。用无菌0.1M柠檬酸钠(pH 3.5)洗脱IgG。用1/9体积的1MTris-HCl(pH 9.0)中和洗脱溶液。将中和过的溶液更换为PBS(pH 7.4)缓冲液以去除其他缓冲液内容物，并且在无菌条件下浓缩最终样品溶液。然后通过OD280 nm以1.43消光系数Ec(0.1％)确定浓度。在BioRad电泳系统上使用10％预制凝胶(GenScript)通过SDS-PAGE测试纯化的抗体。将凝胶用Estain 2.0(GenScript)染色，并且通过与蛋白质梯状物(GenScript)比较来估算纯度和分子量。
实施例3：小鼠抗人TIGIT单克隆抗体与人TIGIT重组蛋白的结合
使用表面等离子体共振(SPR)生物传感器
Figure BDA0002584023080000922
T200(GE Healthcare；Little Chalfont,United Kingdom)确定了小鼠抗人TIGIT单克隆抗体与人TIGIT的结合动力学。从50nM起始以3倍连续稀释制备不同浓度的小鼠抗人TIGIT单克隆抗体。通过Fc捕获方法将每种小鼠抗人TIGIT单克隆抗体固定在传感器芯片上。将具有HIS标签的人TIGIT蛋白用作分析物。解离(kd)和缔合(ka)速率常数使用
Figure BDA0002584023080000923
T200评价软件来获得。表观平衡解离常数(KD)由kd与ka之比计算。如表3所示，小鼠抗人TIGIT单克隆抗体具有与人TIGIT蛋白相当的结合动力学(表3)。
表3：小鼠抗人TIGIT单克隆抗体对人TIGIT的结合
Figure BDA0002584023080000921
Figure BDA0002584023080000931
实施例4：小鼠抗人TIGIT单克隆抗体与在CHO-K1细胞中表达的人或食蟹猴TIGIT的结合
使用基于荧光激活细胞分选(FACS)的测定确定了小鼠抗人TIGIT单克隆抗体与在CHO-K1细胞上过量表达的人或食蟹猴TIGIT的结合亲和力。制备了小鼠抗人TIGIT单克隆抗体(对于人TIGIT从111μM起始，并且对于食蟹猴TIGIT从55.6μM起始，以9种浓度进行3倍连续稀释)作为一抗用于FACS分析。将表达人TIGIT的CHO-K1细胞从贴壁培养瓶中解离，并与不同浓度的小鼠抗人TIGIT单克隆抗体(均在96孔板中)混合。将混合物在室温下平衡30分钟，并用FACS缓冲液(含1％BSA的PBS)洗涤三次。添加iFluor标记的山羊抗小鼠IgG作为二抗，并在室温下孵育45min。最后，将细胞用PBS洗涤3次，并通过FACS BD Calibur读取信号。通过PRISMTM(GraphPad软件，San Diego,CA)使用非线性回归来分析数据，并且计算EC50值。如图3A-3C和表4所示，FACS研究证明小鼠抗人TIGIT单克隆抗体以在0.3nM至16.3nM范围内的EC50值结合至在CHO-K1细胞中过量表达的人TIGIT。
表4：抗人TIGIT单克隆抗体在CHO-K1/人TIGIT细胞上的结合
Figure BDA0002584023080000932
Figure BDA0002584023080000941
在所测试的小鼠抗人TIGIT单克隆抗体中，只有139E2C2D2、128E3G7F5、121C2F10B5、104G12E12G2、83G6H11C12、92E9D4B4、100C4E7D11和64G1E9B4结合至食蟹猴TIGIT。如图3A-3C和表5所示，FACS研究证明一些小鼠抗人TIGIT单克隆抗体以在1nM至18.5nM范围内的EC50值结合至在CHO-K1细胞中过量表达的食蟹猴TIGIT。
表5：抗人TIGIT单克隆抗体在CHO-K1/食蟹猴TIGIT细胞上的结合
Figure BDA0002584023080000942
实施例5：小鼠抗人TIGIT单克隆抗体与PVR重组蛋白之间在CHO-K1细胞中过度表达的人TIGIT上的竞争结合
使用FACS测定评估了小鼠抗人TIGIT单克隆抗体与PVR重组蛋白之间在人TIGIT上的竞争结合。为了评估小鼠抗人TIGIT单克隆抗体与PVR之间在人TIGIT上的竞争结合，制备了小鼠抗人TIGIT单克隆抗体样品(从500nM起始，以10种浓度进行3倍连续稀释)。将表达人TIGIT的CHO细胞从贴壁培养瓶中解离，并与不同浓度的每种小鼠抗人TIGIT单克隆抗体和5μg/ml具有生物素标记的人TIGIT-Fc融合蛋白混合。将所述混合物在室温下平衡30分钟，并用FACS缓冲液(含有1％BSA的PBS)洗涤三次。然后，将PE/Cy5链霉亲和素二抗添加到混合物，并在室温下孵育15分钟。随后，将细胞用FACS缓冲液洗涤并通过流式细胞术分析。通过PRISMTM(GraphPad软件，San Diego,CA)使用非线性回归来分析数据，并且计算IC50值(图4A-4B和表6)。竞争性FACS研究证明除16F10H12C11以外，小鼠抗人TIGIT单克隆抗体以0.75nM至73.5nM范围内的IC50值阻断人TIGIT与人PVR之间的结合的能力。
表6：抗人TIGIT单克隆抗体对TIGIT/PVR结合的阻断
Figure BDA0002584023080000951
实施例6：小鼠抗人TIGIT单克隆抗体对人TIGIT的表位结合
在Octet RED96仪器(ForteBio；Menlo Park,CA)上对128E3G7F5、121C2F10B5、104G12E12G2、83G6H11C12、92E9D4B4、100C4E7D11和64G1E9B4进行表位结合测试。所有测量均在30℃下进行。使用胺偶联方法将一种感兴趣的抗体固定在生物传感器上。将抗原蛋白TIGIT稀释在PBST缓冲液(1x PBS，pH 7.4，和0.05％Tween-20)中用作分析物1。抗原蛋白TIGIT(与分析物1中的浓度相同)和第二抗体的混合物用作分析物2。首先将涂覆的生物传感器浸入分析物1中，并且然后在再生和平衡之后浸入分析物2中。比较分析物1和分析物2的传感图。如果分析物1的结合水平显著高于分析物2的结合水平，则认为第二抗体能够与固定的抗体竞争以结合靶蛋白TIGIT。如果分析物1的结合水平显著低于分析物2的结合水平，则认为第二抗体不能与固定的抗体竞争以结合靶蛋白TIGIT。重复所述实验直到对所有抗体进行了分析。128E3G7F5、121C2F10B5、104G12E12G2、83G6H11C12、92E9D4B4、100C4E7D11和64G1E9B4被映射到三组(表7)。每个组中的小鼠抗人TIGIT单克隆抗体在人TIGIT上具有密切相关或相同的表位。
表7：针对人TIGIT的小鼠抗人TIGIT抗体的表位鉴定
抗体ID 组
64G1E9B4 I
100C4E7D11 II
83G6H11C12 II
92E9D4B4 II
104G12E12G2 I
121C2F10B5 III
128E3F10F3F2 III
实施例7：小鼠抗人TIGIT抗体对T细胞激活的中和作用被PVR对在T细胞中过量表达的TIGIT的结合所抑制
通过稳定转染T细胞受体(TCR)激活剂，将CHO-K1细胞工程化为人工树突状细胞(APC)。然后，CHO-K1 APC过量表达有PVR。用NFAT诱导型Lucia报告基因构建体稳定转染Jurkat细胞系，以生成Jurkat/NFAT报告基因细胞系。然后，Jurkat/NFAT报告基因细胞系过量表达有人TIGIT。将CHO-K1 APC/PVR细胞与Jurkat/NFAT报告基因/TIGIT细胞共培养，以评价小鼠抗人TIGIT单克隆抗体的中和活性。在添加CHO-K1 APC/PVR细胞之前，将Jurkat/NFAT报告基因/TIGIT细胞与每种小鼠抗人TIGIT单克隆抗体的系列稀释液一起预孵育30分钟。在相互作用数小时之后，从每个孔中收集20μl上清液用于IL-2测量，并且然后将ONE-STEPTM萤光素酶试剂添加到系统以测量NFAT活性。通过萤光素酶信号的强度或IL-2的分泌来评价Jurkat/NFAT报告基因/TIGIT细胞的激活。在两种细胞之间PVR对TIGIT的结合抑制了Jurkat/NFAT报告基因/TIGIT细胞激活。小鼠抗人TIGIT单克隆抗体阻断了PVR与TIGIT之间的相互作用，并且然后中和了PVR对TIGIT的抑制。添加的中和抗体越多，激活的Jurkat/NFAT报告基因/TIGIT细胞越多，萤光素酶信号越多或分泌的IL-2越多(图5A-5B、表8和表9)。通过PRISMTM(GraphPad软件，San Diego,CA)使用非线性回归来分析数据，并且对归一化的萤光素酶信号和IL-2分泌均计算EC50值。
表8：小鼠抗人TIGIT抗体对T细胞激活中萤光素酶信号的影响
Figure BDA0002584023080000971
表9：小鼠抗人TIGIT抗体对T细胞激活中IL-2分泌的影响
Figure BDA0002584023080000972
实施例8：嵌合抗人TIGIT单克隆抗体或人源化抗人TIGIT单克隆抗体与人TIGIT重组蛋白的结合
通过将100C4E7D11或64G1E9B4的重链和轻链的可变结构域与人IgG1的恒定区融合来制备嵌合抗人TIGIT单克隆抗体(100C4E7D11嵌合体或64G1E9B4嵌合体)。
100C4E7D11的人源化抗人TIGIT单克隆抗体(100C4E7D11VH1_VL1)是通过将100C4E7D11的重链(SEQ ID NO:105)和轻链(SEQ ID NO:113)的人源化可变结构域与人IgG1恒定区融合来制备的。
64G1E9B4的人源化抗人TIGIT单克隆抗体(64G1E9B4VH1_VL1.M1)是通过将64G1E9B4的重链(SEQ ID NO:109)和轻链(SEQ ID NO:118)的人源化可变结构域与人IgG1恒定区融合来制备的。人源化64G1E9B4VH1_VL1.M1单克隆抗体包含在SEQ ID NO:78的轻链CDR中的一个氨基酸取代，其中在位置1K进行所述取代，并且其中残基1K被取代为R。
64G1E9B4的人源化抗人TIGIT单克隆抗体(64G1E9B4VH1.M1_VL1.M1)是通过将64G1E9B4的重链(SEQ ID NO:109)和轻链(SEQ ID NO:118)的人源化可变结构域与人IgG1恒定区融合来制备的。人源化64G1E9B4VH1.M1_VL1.M1单克隆抗体包含在SEQ ID NO:52的重链CDR中的一个氨基酸取代，其中在位置7D处进行所述取代，并且其中残基7D被取代为G。其还包含在SEQ ID NO:78的轻链CDR中的一个氨基酸取代，其中在位置1K处进行所述取代，并且其中残基1K被取代为R。
使用表面等离子体共振(SPR)生物传感器
Figure BDA0002584023080000981
T200(GE Healthcare)确定了嵌合抗人TIGIT单克隆抗体和人源化抗人TIGIT单克隆抗体与人TIGIT的结合动力学。从50nM起始以3倍连续稀释制备不同浓度的嵌合抗人TIGIT单克隆抗体或人源化抗人TIGIT单克隆抗体。通过Fc捕获方法将每种嵌合抗人TIGIT单克隆抗体或每种人源化抗人TIGIT单克隆抗体固定在传感器芯片上。具有HIS标签的人TIGIT蛋白用作分析物。使用
Figure BDA0002584023080000992
T200评价软件获得解离(kd)和缔合(ka)速率常数。表观平衡解离常数(KD)由kd与ka之比计算。如表10所示，嵌合抗人TIGIT单克隆抗体和人源化抗人TIGIT单克隆抗体具有相当的针对人TIGIT蛋白的结合动力学(表10)。
表10：嵌合的或人源化抗人TIGIT抗体对人TIGIT的结合
Figure BDA0002584023080000991
实施例9：嵌合抗人TIGIT单克隆抗体和人源化抗人TIGIT单克隆抗体与在CHO-K1细胞中表达的人或食蟹猴TIGIT的结合
使用基于荧光激活细胞分选(FACS)的测定确定了嵌合抗人TIGIT单克隆抗体和人源化抗人TIGIT单克隆抗体与在CHO-K1细胞上过量表达的人或食蟹猴TIGIT的结合亲和力。制备了嵌合抗人TIGIT单克隆抗体和人源化抗人TIGIT单克隆抗体(对于人TIGIT从100μM起始，并且对于食蟹猴TIGIT从55.6μM起始，以10种浓度进行3倍连续稀释)作为一抗用于FACS分析。将表达人TIGIT的CHO-K1细胞从贴壁培养瓶中解离，并与不同浓度的小鼠抗人TIGIT单克隆抗体(均在96孔板中)混合。将混合物在室温下平衡30分钟，并用FACS缓冲液(含1％BSA的PBS)洗涤三次。添加iFluor标记的山羊抗小鼠IgG作为二抗，并在室温下孵育45min。最后，将细胞用PBS洗涤3次，并通过FACS BD Calibur读取信号。通过PRISMTM(GraphPad软件，San Diego,CA)使用非线性回归来分析数据，并且计算EC50值。如图6A和表11所示，FACS研究证明嵌合抗人TIGIT单克隆抗体和人源化抗人TIGIT单克隆抗体以在0.4nM至1.2nM范围内的EC50值结合在CHO-K1细胞中过量表达的人TIGIT。
表11：抗人TIGIT单克隆抗体在CHO-K1/人TIGIT细胞上的结合
Figure BDA0002584023080001001
嵌合抗人TIGIT单克隆抗体和人源化抗人TIGIT单克隆抗体也与食蟹猴TIGIT结合。如图6B和表12所示，FACS研究证明嵌合抗人TIGIT单克隆抗体和人源化抗人TIGIT单克隆抗体以在0.9nM至2.9nM范围内的EC50值结合至在CHO-K1细胞中过量表达的食蟹猴TIGIT。
表12：抗人TIGIT单克隆抗体在CHO-K1/食蟹猴TIGIT细胞上的结合
Figure BDA0002584023080001002
实施例10：嵌合抗人TIGIT单克隆抗体或人源化抗人TIGIT单克隆抗体与PVR重组蛋白之间在于CHO-K1细胞中过度表达的人TIGIT上的竞争结合
使用FACS测定评估了嵌合抗人TIGIT单克隆抗体或人源化抗人TIGIT单克隆抗体与PVR重组蛋白之间在人TIGIT上的竞争性结合。为了评估嵌合抗人TIGIT单克隆抗体或人源化抗人TIGIT单克隆抗体与PVR重组蛋白之间在人TIGIT上的竞争性结合，制备了嵌合抗人TIGIT单克隆抗体或人源化抗人TIGIT单克隆抗体样品(从300nM起始，以10种浓度进行3倍连续稀释)。将表达人TIGIT的CHO细胞从贴壁培养瓶中解离，并与不同浓度的每种嵌合抗人TIGIT单克隆抗体或人源化抗人TIGIT单克隆抗体和5μg/ml具有生物素标记的人TIGIT-Fc融合蛋白混合。将所述混合物在室温下平衡30分钟，并用FACS缓冲液(含有1％BSA的PBS)洗涤三次。然后，将PE/Cy5链霉亲和素二抗添加到混合物，并在室温下孵育15分钟。随后，将细胞用FACS缓冲液洗涤并通过流式细胞术分析。通过PRISMTM(GraphPad软件，San Diego,CA)使用非线性回归来分析数据，并且计算IC50值(图7和表13)。竞争性FACS研究证明小鼠抗人TIGIT单克隆抗体以0.4nM至1.3nM范围内的IC50值阻断人TIGIT与人PVR之间的结合的能力。
表13：抗人TIGIT单克隆抗体对TIGIT/PVR结合的阻断
Figure BDA0002584023080001011
实施例11：嵌合抗人TIGIT单克隆抗体和人源化抗人TIGIT单克隆抗体对T细胞激活的中和作用被PVR对在T细胞中过量表达的TIGIT的结合所抑制
通过稳定转染T细胞受体(TCR)激活剂，将CHO-K1细胞工程化为人工树突状细胞(APC)。然后，PVR在CHO-K1 APC中过量表达。人TIGIT在Jurkat细胞系中过量表达。将CHO-K1APC/PVR细胞与Jurkat/TIGIT细胞共培养，以评价嵌合抗人TIGIT单克隆抗体和人源化抗人TIGIT单克隆抗体的中和活性。在添加CHO-K1 APC/PVR细胞之前，将Jurkat/TIGIT细胞与每种嵌合抗人TIGIT单克隆抗体或每种人源化抗人TIGIT单克隆抗体的系列稀释液一起预孵育30分钟。在相互作用数小时之后，从每个孔中收集20μl上清液用于IL-2测量。通过IL-2的分泌评价Jurkat/TIGIT细胞的激活。在两种细胞之间PVR对TIGIT的结合抑制了Jurkat/TIGIT细胞的激活。嵌合抗人TIGIT单克隆抗体或人源化抗人TIGIT单克隆抗体阻断了PVR与TIGIT之间的相互作用，并且然后中和了PVR对TIGIT的抑制。添加的中和抗体越多，激活的Jurkat/TIGIT细胞越多，分泌的IL-2越多(图8和表14)。通过PRISMTM(GraphPad软件，SanDiego,CA)使用非线性回归来分析数据，并且对IL-2分泌计算EC50值。
表14抗人TIGIT抗体对T细胞激活中的IL-2分泌的影响
Figure BDA0002584023080001021
实施例12：抗TIGIT抗体的体内抗肿瘤功效
通过将MC38肿瘤细胞(一种鼠结肠腺癌细胞系)植入C57BL/6人TIGIT Knockin(KI)小鼠(Biocytogen；Worcester,MA)中来制备小鼠异种移植模型。将MC38肿瘤细胞培养，悬浮于无镁和无钙的HBSS-/-中，并在6-8周龄的雌性C57BL/6人TIGIT KI小鼠胁腹皮下注射1×106个细胞。将肿瘤体积使用卡尺测量并用公式(长度x宽度x宽度)/2进行计算。当平均肿瘤体积达到90-100mm3时，将小鼠随机分组，开始用人源化抗人TIGIT单克隆抗体进行治疗。人源化抗人TIGIT单克隆抗体每4天通过i.p.(5mg/kg)给药一次。在整个研究过程中测量体重。
如图9A-9B所示，与人IgG对照相比，人源化抗人TIGIT单克隆抗体100C4E7D11VH1_VL1、64G1E9B4VH1_VL1.M1和64G1E9B4VH1.M1_VL1.M1表现出更高的肿瘤抑制功效。在研究日期间，每个测试组的平均体重均未表现出任何显著的差异。
表15.小鼠抗TIGIT抗体的重链可变区(VH)序列。
Figure BDA0002584023080001031
Figure BDA0002584023080001041
ID：SEQ ID NO
表16：小鼠抗TIGIT抗体的轻链可变区(VL)序列
Figure BDA0002584023080001042
Figure BDA0002584023080001051
Figure BDA0002584023080001061
ID：SEQ ID NO
表17：重链可变区(VH)CDR序列。
Figure BDA0002584023080001062
ID：SEQ ID NO；CDR：互补决定区
表18：轻链可变区(VL)CDR序列。
Figure BDA0002584023080001063
Figure BDA0002584023080001071
ID：SEQ ID NO；CDR：互补决定区
表19：人源化重链可变区(VH)序列。
Figure BDA0002584023080001072
表20：人源化轻链可变区(VL)序列。
Figure BDA0002584023080001081
表21：抗原序列
Figure BDA0002584023080001082
表22：肽接头
接头 ID 序列
G4SG3S 119 GGGGSGGGS
(G4S)3 120 GGGGSGGGGSGGGGS
突变hIgG1铰链 121 EPKSSDKTHTSPPSP
序列表
<110> 南京传奇生物科技有限公司（Nanjing Legend Biotech Co., Ltd.）
<120> 针对TIGIT的抗体及其变体
<130> 688096.0120
<160> 122
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 小鼠VH
<400> 1
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Trp Phe Arg Arg Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 2
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 小鼠VH
<400> 2
Glu Val Leu Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Pro Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Met Asp Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Trp Leu Leu Leu Val Tyr Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 3
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 小鼠VH
<400> 3
Glu Val Leu Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Pro Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Ile Asp Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Asn Pro Asn Thr Gly Gly Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Trp Leu Leu Leu Val Tyr Ala Val Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 4
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 小鼠VH
<400> 4
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Gln Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Gly Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Phe Pro Gly Thr Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ile Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Ser Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Arg Asp Gly Lys Val Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 5
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 小鼠VH
<400> 5
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Ala Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Leu Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 6
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> 小鼠VH
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Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val
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Ala Ile Ile Ser Ser Gly Gly Asn Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
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Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
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Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
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Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ala Tyr
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Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
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Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val
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Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Phe Tyr
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1 5 10 15
Gly
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 小鼠VH CDR2
<400> 51
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1 5 10 15
Gly
<210> 52
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 小鼠VH CDR2
<400> 52
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1 5 10 15
Gly
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<220>
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Ala
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<220>
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<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 小鼠VL CDR2
<400> 81
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<400> 82
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<400> 83
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 小鼠VL CDR2
<400> 84
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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Gly Ala Ser Thr Arg Gly Ser
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 小鼠VL CDR2
<400> 88
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1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<400> 89
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<220>
<223> 小鼠VL CDR2
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1 5
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<211> 7
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<220>
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<400> 92
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<211> 9
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 小鼠VL CDR3
<400> 93
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<220>
<223> 小鼠VL CDR3
<400> 94
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1 5
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<211> 9
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<400> 95
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<220>
<223> 小鼠VL CDR3
<400> 96
Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Tyr Thr
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<211> 9
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 小鼠VL CDR3
<400> 97
Gln His Phe Trp Gly Thr Ala Tyr Thr
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 小鼠VL CDR3
<400> 98
Gln Asn Asp His Ser Tyr Pro Tyr Thr
1 5
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<211> 9
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 小鼠VL CDR3
<400> 99
Gln His Phe Trp Asp Asn Ala Tyr Thr
1 5
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<211> 9
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 小鼠VL CDR3
<400> 100
Leu Gln Tyr Ala Ser Tyr Pro Tyr Thr
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<400> 101
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1 5
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<400> 102
His Tyr Tyr His Arg Ser Pro Tyr Thr
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<400> 103
His Leu Tyr His His Ser Pro Tyr Thr
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 小鼠VL CDR3
<400> 104
Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Trp Thr
1 5
<210> 105
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人源化VH
<400> 105
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
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20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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115
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<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人源化VH
<400> 106
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Phe Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Ser Leu Pro Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
100 105 110
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115
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<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人源化VH
<400> 107
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Phe Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
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100 105 110
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115
<210> 108
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人源化VH
<400> 108
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Phe Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
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Ser Arg Ser Leu Pro Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 109
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人源化VH
<400> 109
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu His
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 110
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人源化VH
<400> 110
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu His
20 25 30
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50 55 60
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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Thr Arg Ala Ala Lys Leu Leu Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 111
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人源化VH
<400> 111
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu His
20 25 30
Val Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Phe Asn Pro Asn His Asp Gly Thr Ile Tyr Asn Gln Ile Phe
50 55 60
Arg Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
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85 90 95
Thr Arg Ala Ala Lys Leu Leu Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 112
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人源化VH
<400> 112
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu His
20 25 30
Val Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Phe Asn Pro Asn His Asp Gly Thr Ile Tyr Asn Gln Ile Phe
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Thr Arg Ala Ala Lys Leu Leu Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 113
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人源化VL
<400> 113
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Thr
20 25 30
Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
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50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
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85 90 95
Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 114
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人源化VL
<400> 114
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Thr
20 25 30
Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Trp
35 40 45
Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Leu Tyr His His Ser Pro
85 90 95
Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 115
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人源化VL
<400> 115
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Thr
20 25 30
Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Trp
35 40 45
Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
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85 90 95
Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 116
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人源化VL
<400> 116
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Met Ser Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Thr
20 25 30
Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Trp
35 40 45
Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Leu Tyr His His Ser Pro
85 90 95
Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 117
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人源化VL
<400> 117
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Met Ser Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Thr
20 25 30
Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Trp
35 40 45
Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Ala Ala Val Tyr Tyr Cys His Leu Tyr His His Ser Pro
85 90 95
Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 118
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人源化VL
<400> 118
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln His Val Ser Asn Ala
20 25 30
Val Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Pro Ser Tyr Arg Phe Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 119
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 肽接头
<400> 119
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 120
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 肽接头
<400> 120
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 121
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 肽接头
<400> 121
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro
1 5 10 15
<210> 122
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TIGIT
<400> 122
Met Arg Trp Cys Leu Leu Leu Ile Trp Ala Gln Gly Leu Arg Gln Ala
1 5 10 15
Pro Leu Ala Ser Gly Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn
20 25 30
Ile Ser Ala Glu Lys Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser
35 40 45
Ser Thr Thr Ala Gln Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln
50 55 60
Leu Leu Ala Ile Cys Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser
65 70 75 80
Phe Lys Asp Arg Val Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln
85 90 95
Ser Leu Thr Val Asn Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr
100 105 110
Tyr Pro Asp Gly Thr Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu
115 120 125
Ser Ser Val Ala Glu His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro Leu Leu Gly
130 135 140
Ala Met Ala Ala Thr Leu Val Val Ile Cys Thr Ala Val Ile Val Val
145 150 155 160
Val Ala Leu Thr Arg Lys Lys Lys Ala Leu Arg Ile His Ser Val Glu
165 170 175
Gly Asp Leu Arg Arg Lys Ser Ala Gly Gln Glu Glu Trp Ser Pro Ser
180 185 190
Ala Pro Ser Pro Pro Gly Ser Cys Val Gln Ala Glu Ala Ala Pro Ala
195 200 205
Gly Leu Cys Gly Glu Gln Arg Gly Glu Asp Cys Ala Glu Leu His Asp
210 215 220
Tyr Phe Asn Val Leu Ser Tyr Arg Ser Leu Gly Asn Cys Ser Phe Phe
225 230 235 240
Thr Glu Thr Gly

Claims (38)

1.一种分离的抗体或其抗原结合片段，其包含：
(a)重链可变结构域(VH)，所述重链可变结构域分别包含：
i.重链互补决定区1(CDR1)，所述重链互补决定区1包含选自由SEQ ID NO:27-39组成的组的氨基酸序列；
ii.重链CDR2，所述重链CDR2包含选自由SEQ ID NO:40-52组成的组的氨基酸序列；和
iii.重链CDR3，所述重链CDR3包含选自由SEQ ID NO:53-65组成的组的氨基酸序列；以及
(b)轻链可变结构域(VL)，所述轻链可变结构域分别包含：
i.轻链CDR1，所述轻链CDR1包含选自由SEQ ID NO:66-78组成的组的氨基酸序列；
ii.轻链CDR2，所述轻链CDR2包含选自由SEQ ID NO:79-91组成的组的氨基酸序列；和
iii.轻链CDR3，所述轻链CDR3包含选自由SEQ ID NO:92-104组成的组的氨基酸序列；
其中所述抗体或其抗原结合片段能够特异性地结合至TIGIT，优选地人TIGIT。
2.如权利要求1所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中：
(1)所述VH包含分别具有SEQ ID NO:27、40和53的氨基酸序列的所述重链CDR1、CDR2和CDR3序列，并且所述VL包含分别具有SEQ ID NO:66、79和92的氨基酸序列的所述轻链CDR1、CDR2和CDR3；
(2)所述VH包含分别具有SEQ ID NO:28、41和54的氨基酸序列的所述重链CDR1、CDR2和CDR3序列，并且所述VL包含分别具有SEQ ID NO:67、80和93的氨基酸序列的所述轻链CDR1、CDR2和CDR3；
(3)所述VH包含分别具有SEQ ID NO:29、42和55的氨基酸序列的所述重链CDR1、CDR2和CDR3序列，并且所述VL包含分别具有SEQ ID NO:68、81和94的氨基酸序列的所述轻链CDR1、CDR2和CDR3；
(4)所述VH包含分别具有SEQ ID NO:30、43和56的氨基酸序列的所述重链CDR1、CDR2和CDR3序列，并且所述VL包含分别具有SEQ ID NO:69、82和95的氨基酸序列的所述轻链CDR1、CDR2和CDR3；
(5)所述VH包含分别具有SEQ ID NO:31、44和57的氨基酸序列的所述重链CDR1、CDR2和CDR3序列，并且所述VL包含分别具有SEQ ID NO:70、83和96的氨基酸序列的所述轻链CDR1、CDR2和CDR3；
(6)所述VH包含分别具有SEQ ID NO:32、45和58的氨基酸序列的所述重链CDR1、CDR2和CDR3序列，并且所述VL包含分别具有SEQ ID NO:71、84和97的氨基酸序列的所述轻链CDR1、CDR2和CDR3；
(7)所述VH包含分别具有SEQ ID NO:33、46和59的氨基酸序列的所述重链CDR1、CDR2和CDR3序列，并且所述VL包含分别具有SEQ ID NO:72、85和98的氨基酸序列的所述轻链CDR1、CDR2和CDR3；
(8)所述VH包含分别具有SEQ ID NO:34、47和60的氨基酸序列的所述重链CDR1、CDR2和CDR3序列，并且所述VL包含分别具有SEQ ID NO:73、86和99的氨基酸序列的所述轻链CDR1、CDR2和CDR3；
(9)所述VH包含分别具有SEQ ID NO:35、48和61的氨基酸序列的所述重链CDR1、CDR2和CDR3序列，并且所述VL包含分别具有SEQ ID NO:74、87和100的氨基酸序列的所述轻链CDR1、CDR2和CDR3；
(10)所述VH包含分别具有SEQ ID NO:36、49和62的氨基酸序列的所述重链CDR1、CDR2和CDR3序列，并且所述VL包含分别具有SEQ ID NO:75、88和101的氨基酸序列的所述轻链CDR1、CDR2和CDR3；
(11)所述VH包含分别具有SEQ ID NO:37、50和63的氨基酸序列的所述重链CDR1、CDR2和CDR3序列，并且所述VL包含分别具有SEQ ID NO:76、89和102的氨基酸序列的所述轻链CDR1、CDR2和CDR3；
(12)所述VH包含分别具有SEQ ID NO:38、51和64的氨基酸序列的所述重链CDR1、CDR2和CDR3序列，并且所述VL包含分别具有SEQ ID NO:77、90和103的氨基酸序列的所述轻链CDR1、CDR2和CDR3；或者
(13)所述VH包含分别具有SEQ ID NO:39、52和65的氨基酸序列的所述重链CDR1、CDR2和CDR3序列，并且所述VL包含分别具有SEQ ID NO:78、91和104的氨基酸序列的所述轻链CDR1、CDR2和CDR3。
3.如权利要求2所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含分别具有SEQID NO:38、51和64的氨基酸序列的所述重链CDR1、CDR2和CDR3序列，并且所述VL包含分别具有SEQ ID NO:77、90和103的氨基酸序列的所述轻链CDR1、CDR2和CDR3。
4.如权利要求2所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含分别具有SEQID NO:39、52和65的氨基酸序列的所述重链CDR1、CDR2和CDR3序列，并且所述VL包含具有SEQ ID NO:78、91和104的氨基酸序列的所述轻链CDR1、CDR2和CDR3。
5.如权利要求1-4中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中分别地所述VH包含与选自由SEQ ID NO:1-13组成的组的序列至少90％同一性的氨基酸序列，并且所述VL包含与选自由SEQ ID NO:14-26组成的组的序列至少90％同一性的氨基酸序列。
6.如权利要求5所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含选自由SEQ IDNO:1-13组成的组的氨基酸序列、或其包含在所述VH中的至多约3个氨基酸取代的变体；并且所述VL包含选自由SEQ ID NO:14-26组成的组的氨基酸序列、或其包含在所述VL中的至多约3个氨基酸取代的变体。
7.如权利要求5或6所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中：
(1)所述VH包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，并且所述VL包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；
(2)所述VH包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，并且所述VL包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；
(3)所述VH包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，并且所述VL包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；
(4)所述VH包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，并且所述VL包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；
(5)所述VH包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，并且所述VL包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列；
(6)所述VH包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，并且所述VL包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列；
(7)所述VH包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，并且所述VL包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；
(8)所述VH包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，并且所述VL包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；
(9)所述VH包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，并且所述VL包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列；
(10)所述VH包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列，并且所述VL包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；
(11)所述VH包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列，并且所述VL包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列；
(12)所述VH包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列，并且所述VL包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列；或者
(13)所述VH包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列，并且所述VL包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列。
8.如权利要求7所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列，并且所述VL包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列。
9.如权利要求7所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列，并且所述VL包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列。
10.如权利要求1-9中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH融合至免疫球蛋白的重链恒定区。
11.如权利要求1-10中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述VL融合至免疫球蛋白的轻链恒定区(CL)。
12.如权利要求1-11中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与所述TIGIT之间的结合的KD为10-7M至约10-12M，优选地约10-8M至约10-12M，更优选地约10-9M至约10-12M。
13.如权利要求1-12中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段是啮齿动物的、嵌合的、人的、部分人源化的、或完全人源化的。
14.如权利要求13所述的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段是人源化的。
15.如权利要求14所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含选自由SEQID NO:105-112组成的组的氨基酸序列，并且所述VL包含选自由SEQ ID NO:113-118组成的组的氨基酸序列。
16.如权利要求1-15中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段还包含第二抗体部分，其中所述第二抗体部分能够特异性地结合至第二抗原。
17.如权利要求16所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述第二抗体部分是Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、单链Fv(scFv)、scFv-scFv、微抗体、双抗体、sdAb或抗体模拟物。
18.如权利要求17所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述第二抗体部分是sdAb。
19.如权利要求16-18中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述第二抗体部分能够特异性地结合至CTLA-4，优选地，所述第二抗体部分是能够特异性地结合至CTLA-4的sdAb。
20.如权利要求16-18中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述第二抗体部分能够特异性地结合至PD-L1，优选地，所述第二抗体部分是能够特异性地结合至PD-L1的sdAb。
21.如权利要求16-18中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述第二抗体部分能够特异性地结合至TIM-3，优选地，所述第二抗体部分是能够特异性地结合至TIM-3的sdAb。
22.如权利要求16-18中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述第二抗体部分能够特异性地结合至LAG-3，优选地，所述第二抗体部分是能够特异性地结合至LAG-3的sdAb。
23.如权利要求19-22中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中能够特异性地识别TIGIT的全长IgG的重链或轻链的氨基末端任选地通过肽接头融合至能够与CTLA-4、PD-L1、TIM-3或LAG-3特异性地结合的sdAb的羧基末端。
24.如权利要求19-22中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中能够特异性地识别TIGIT的全长IgG的重链或轻链的羧基末端任选地通过肽接头融合至能够与CTLA-4、PD-L1、TIM-3或LAG-3特异性地结合的sdAb的氨基末端。
25.如权利要求23或24所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中能够特异性地识别TIGIT的所述全长IgG通过肽接头融合至能够与CTLA-4、PD-L1、TIM-3或LAG-3特异性地结合的sdAb，所述肽接头具有SEQ ID NO:119-121中的一者的氨基酸序列。
26.一种第二分离的抗体或其抗原结合片段，其能够与如权利要求1-25中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段竞争来特异性地结合至TIGIT。
27.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求1-25中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段或如权利要求26所述的第二分离的抗体或其抗原结合片段、以及药学上可接受的载体。
28.如权利要求1-25中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段、如权利要求26所述的第二分离的抗体或其抗原结合片段、或如权利要求27所述的药物组合物，其用于治疗有需要的受试者的TIGIT相关疾病的用途。
29.如权利要求28所述的使用的分离的抗体或其抗原结合片段或药物组合物，其中所述TIGIT相关疾病是癌症。
30.如权利要求29所述的使用的分离的抗体或其抗原结合片段或药物组合物，其中所述癌症是实体瘤。
31.如权利要求29所述的使用的分离的抗体或其抗原结合片段或药物组合物，其中所述癌症是结肠癌。
32.如权利要求28-31中任一项所述的使用的分离的抗体或其抗原结合片段或药物组合物，其与另外的癌症疗法组合。
33.如权利要求32所述的使用的分离的抗体或其抗原结合片段或药物组合物，其中所述另外的癌症疗法是手术、放射、化学疗法、免疫疗法、激素疗法或它们的组合。
34.如权利要求28所述的使用的分离的抗体或其抗原结合片段或药物组合物，其中所述TIGIT相关疾病是病原性感染。
35.如权利要求28-34中任一项所述的使用的分离的抗体或其抗原结合片段或药物组合物，其中所述分离的抗体或抗原结合片段或药物组合物用于全身性或局部施用。
36.如权利要求28-34中任一项所述的使用的分离的抗体或其抗原结合片段或药物组合物，其中所述分离的抗体或抗原结合片段或药物组合物用于静脉内施用。
37.如权利要求28-34中任一项所述的使用的分离的抗体或其抗原结合片段或药物组合物，其中所述分离的抗体或抗原结合片段或药物组合物用于瘤内施用。
38.如权利要求28-37中任一项所述的使用的分离的抗体或其抗原结合片段或药物组合物，其中所述受试者是人。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024041639A1 (en) * 2022-08-26 2024-02-29 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Antibodies targeting tigit and uses thereof

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK3618863T3 (da) 2017-05-01 2023-08-21 Agenus Inc Anti-tigit-antistoffer og fremgangsmåder til anvendelse deraf
AU2019407814A1 (en) 2018-12-21 2021-07-22 Ose Immunotherapeutics Bifunctional anti-PD-1/IL-7 molecule
WO2020165374A1 (en) 2019-02-14 2020-08-20 Ose Immunotherapeutics Bifunctional molecule comprising il-15ra
AU2020406083A1 (en) 2019-12-17 2022-06-16 Ose Immunotherapeutics Bifunctional molecules comprising an IL-7 variant
CN115943312A (zh) 2020-05-07 2023-04-07 法国居里学院 免疫抑制性成纤维细胞群体的生物标志物antxr1及其在预测对免疫疗法的反应中的用途
CN111995681B (zh) * 2020-05-09 2022-03-08 华博生物医药技术（上海）有限公司 抗tigit的抗体、其制备方法和应用
IL298946A (en) 2020-06-18 2023-02-01 Genentech Inc Treatment with anti-TIGIT antibodies and PD-1 spindle-binding antagonists
TW202216778A (zh) 2020-07-15 2022-05-01 美商安進公司 Ｔｉｇｉｔ及ｃｄ１１２ｒ阻斷
US20240002500A1 (en) * 2020-11-23 2024-01-04 Guangdong Fapon Biopharma Inc. Anti-TIGIT Antibody or Antigen-Binding Fragment Thereof
WO2022112198A1 (en) 2020-11-24 2022-06-02 Worldwide Innovative Network Method to select the optimal immune checkpoint therapies
WO2022148781A1 (en) 2021-01-05 2022-07-14 Institut Curie Combination of mcoln activators and immune checkpoint inhibitors
IL307419A (en) 2021-04-09 2023-12-01 Ose Immunotherapeutics A new scaffold for bifunctional molecules with improved properties
WO2022214652A1 (en) 2021-04-09 2022-10-13 Ose Immunotherapeutics Scaffold for bifunctioanl molecules comprising pd-1 or cd28 and sirp binding domains
AR125753A1 (es) 2021-05-04 2023-08-09 Agenus Inc Anticuerpos anti-tigit, anticuerpos anti-cd96 y métodos de uso de estos
CN115466327A (zh) * 2021-06-10 2022-12-13 北京天广实生物技术股份有限公司 结合tigit的抗体及其用途
WO2023010094A2 (en) 2021-07-28 2023-02-02 Genentech, Inc. Methods and compositions for treating cancer
TW202321308A (zh) 2021-09-30 2023-06-01 美商建南德克公司 使用抗ｔｉｇｉｔ抗體、抗ｃｄ３８抗體及ｐｄ—１軸結合拮抗劑治療血液癌症的方法
WO2023138639A1 (zh) * 2022-01-24 2023-07-27 原启生物科技(上海)有限责任公司 靶向tigit的抗原结合蛋白及其用途
WO2023240058A2 (en) 2022-06-07 2023-12-14 Genentech, Inc. Prognostic and therapeutic methods for cancer
WO2024003360A1 (en) 2022-07-01 2024-01-04 Institut Curie Biomarkers and uses thereof for the treatment of neuroblastoma
WO2024028386A1 (en) 2022-08-02 2024-02-08 Ose Immunotherapeutics Multifunctional molecule directed against cd28
CN116444653B (zh) * 2023-03-09 2024-03-15 中国农业科学院上海兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心上海分中心) 一株阻断性非洲猪瘟病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备与应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103073644A (zh) * 2012-12-31 2013-05-01 中国科学技术大学 特异性抗小鼠tigit的单克隆抗体及其制备方法、鉴定及应用
WO2016011264A1 (en) * 2014-07-16 2016-01-21 Genentech, Inc. Methods of treating cancer using tigit inhibitors and anti-cancer agents
WO2016106302A1 (en) * 2014-12-23 2016-06-30 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies to tigit
WO2016106157A1 (en) * 2014-12-22 2016-06-30 Systimmune, Inc. Bispecific tetravalent antibodies and methods of makiing and using thereof
WO2016191643A2 (en) * 2015-05-28 2016-12-01 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Tigit-binding agents and uses thereof
CN107148430A (zh) * 2014-08-19 2017-09-08 默沙东公司 抗tigit抗体

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20180041717A (ko) * 2015-08-20 2018-04-24 애브비 스템센트알엑스 엘엘씨 항-dll3 항체 약물 컨쥬게이트 및 그의 이용 방법
AU2016325610B2 (en) 2015-09-25 2019-10-10 Genentech, Inc. Anti-TIGIT antibodies and methods of use
PL3356413T3 (pl) 2015-10-01 2022-04-19 Potenza Therapeutics, Inc. Białka anty-tigit wiążące antygen oraz sposoby ich zastosowania
EP3565839A4 (en) * 2017-01-05 2021-04-21 Gensun Biopharma Inc. CHECKPOINT REGULATOR ANTAGONISTS

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103073644A (zh) * 2012-12-31 2013-05-01 中国科学技术大学 特异性抗小鼠tigit的单克隆抗体及其制备方法、鉴定及应用
WO2016011264A1 (en) * 2014-07-16 2016-01-21 Genentech, Inc. Methods of treating cancer using tigit inhibitors and anti-cancer agents
CN107148430A (zh) * 2014-08-19 2017-09-08 默沙东公司 抗tigit抗体
WO2016106157A1 (en) * 2014-12-22 2016-06-30 Systimmune, Inc. Bispecific tetravalent antibodies and methods of makiing and using thereof
WO2016106302A1 (en) * 2014-12-23 2016-06-30 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies to tigit
WO2016191643A2 (en) * 2015-05-28 2016-12-01 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Tigit-binding agents and uses thereof

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
STEPHEN J. BLAKE ET AL.: "Molecular Pathways: Targeting CD96 and TIGIT for Cancer Immunotherapy" *
高义: "DNA免疫法制备抗小鼠TIGIT多克隆抗体及其功能鉴定" *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024041639A1 (en) * 2022-08-26 2024-02-29 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Antibodies targeting tigit and uses thereof

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