TW201609815A - 抗人類膜錨定型免疫球蛋白a抗體能夠溶解帶有膜錨定型免疫球蛋白a的b淋巴球與降低免疫球蛋白a 的生產 - Google Patents

抗人類膜錨定型免疫球蛋白a抗體能夠溶解帶有膜錨定型免疫球蛋白a的b淋巴球與降低免疫球蛋白a 的生產 Download PDF

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Abstract

本文所公開的是一種抗migis-α抗體專一於人類mα鏈上的migis-α，可以結合B淋巴細胞上的mIgA，導致表現mIgA的B淋巴細胞溶解，並降低分泌IgA的B淋巴細胞產生IgA。進一步公開的是一種藥物組合物，包含抗migis-α抗體和醫藥上可接受的載體。進一步公開的方法是用在人受試者體內溶解表現mIgA的B淋巴細胞與減少IgA產生，藉由使用專一於人類mα鏈的抗體，可以結合B淋巴細胞上mIgA的migis-α，造成表現mIgA的B淋巴細胞溶解，並降低分泌IgA的B淋巴細胞產生IgA。本文公開一種方法用來治療受試者的疾病，包括施用抗體其專一於人類mα鏈的migis-α，可以結合B淋巴細胞上的mIgA，因此溶解受試者免疫系統表現mIgA的B淋巴細胞與減少產生IgA抗體。此外，本發明公開使用所述抗migis-α抗體或片段來治療受試者的疾病，它能受惠於在免疫系統中清除表現mIgA的細胞或減少IgA抗體。

Description

抗人類膜錨定型免疫球蛋白A抗體能夠溶解帶有膜錨定型免疫球蛋白A的B淋巴球與降低免疫球蛋白A的生產 相關申請的聲明
此申請要求2013年12月5日提交的美國臨時申請號61/912,395，其內容在此通過引用整體併入本文。
這個發明與特別是那些能夠結合表現人類膜錨定型免疫球蛋白A的B細胞抗體有關。
人類免疫球蛋白A(IgA)有兩種類型，分別是IgA1與IgA2，在血清裡大部分是IgA1(約80%)。IgA1和IgA2分別包含重鏈α1與α2，α1和α2。兩類都有分泌型與膜結合型的序列，是從同一個RNA衍生出兩組mRNA轉譯而來。mα含有膜型表現序列，大部分血清裡的IgA是單體型(約90%)，而不是雙聚體或是多聚體。
分泌型IgA(SIgA)是在外分泌裡含量最多的免疫球蛋白，它在黏膜表面作為對抗入侵微生物的體液免疫，並保持膳食抗原在胃腸管道的平衡。表皮層下由局部漿細胞生產的分泌型IgA主要是與J鏈結合形成雙聚體或多聚體，透過與上皮細胞的基底外側膜聚Ig受體(pIgR)相互作用，在pIgR頂端切割後SIgA通過胞轉作用被運入內腔。切割過的pIgR，已知是種分泌成分，可以保護SIgA不被許多在黏膜的細菌蛋白酶分 解。估計在腸腔每天大概分泌3到5克的SIgA，可以解釋它在調控黏膜免疫系統的主要角色。
除了分泌型，IgA以膜錨定形式存在(mIgA)，它是藉由RNA剪接將CH3表現序列接了一段膜的表現序列。膜表現序列被轉譯成膜錨定胜肽對應於三個不同環境的片段，分別為一個細胞外的胜肽，也稱為mIg的同型特異性(migis-α)片段由26-32個氨基酸組成，一個跨膜區和一個細胞溶質尾段。migis-α片段在五種免疫球蛋白同種型的序列和長度均不同，而它們的跨膜結構域是高度保留的。因此，migis-α段可作為一個抗原區把mIgA與表現mIgA的B細胞作為目標，所得的抗體因此可用於治療相關的疾病，其可以受益於消除mIgA表現的細胞或是在免疫系統中減少IgA抗體，如IgA淋巴癌，IgA腎病(IgAN)，過敏性紫斑症(HSP)，乳糜瀉等。
在IgA1而不是IgA2，膜表現序列有兩個剪接受體區而且mα1 mRNA的異構物是由替代結合從CH3表現序列供體區對膜表現序列2個受體區的其中一個而來，兩個產生的異構物差別在長異構物(mα1L)在migis胜肽N端有多出6個胺基酸，短異構物長度為26個胺基酸(mα1S)。在表現mIgA1的B細胞中長異構物的表現量大概是短異構物的2倍，研究顯示，2個mα1對偶基因可以產生migis-α長與短異構物而且3個mα2對偶基因產生獨特的短異構物。
早在1990年(美國專利號碼5,079,334)migis-α已經被提出當成抗原區用來製備可以結合mIgA的抗體而且能造成表現mIgA的B細胞溶解，沒有這樣的抗體曾被製備。在我們之前的論文[Hung et al.,Mol.Immunol.48(15-16)：1975-1982(2011)]，酵素免疫分析法(ELISA)裡數個能夠強烈的與合成migis-α多胜肽和含有migis-α重組蛋白結合的抗體被製備了，然而這些抗體，只有一個抗體，以29C11表示，稍微可以結合B細胞上的mIgA，像是表現IgA1的DAKIKI細胞或是有轉染 mα1鏈的Daudi細胞。沒有資料關於29C11可以藉由細胞凋亡，抗體依賴型細胞毒性或其它機制來引起表現mIgA的B細胞溶解。
第一個方面，在此公開的實施方案提供抗migis-α抗體或片段其專一於人類mα鏈的migis-α，可以結合B淋巴細胞上的mIgA，進而造成表現mIgA的B細胞溶解與降低分泌IgA的B細胞產生IgA。
在一些實施例中，本文公開其抗migis-α抗體或片段包含以下互補決定區(CDR)：(a)CDR-H1序列為SEQ ID NO：17的26-33，(b)CDR-H2序列為SEQ ID NO：17的51-57，(c)CDR-H3序列為SEQ ID NO：17的96-104，(d)CDR-L1序列為SEQ ID NO：18的27-32，(e)CDR-L2序列為SEQ ID NO：18的50-52，(f)CDR-L3序列為SEQ ID NO：18的89-97。
在一些實施方案中，抗migis-α抗體或片段包含VH闡述於SEQ ID NO：17和VL闡述於SEQ ID NO：18。
在具體的實施方案中，抗migis-α抗體為單株抗體8G7。
在某些實施方案中，本文公開的抗體或片段是包含或上述抗migis-α抗體的F(ab)’2，抗體片段(Fab)，可變片段(Fv)，單鏈可變片段(single-chain Fv)。
第二方面，在此公開的實施方案提供的醫藥組合物包含抗migis-α抗體或片段其專一於人類mα鏈的migis-α，可以結合B淋巴細胞上的mIgA，進而造成表現mIgA的B淋巴細胞溶解與降低分泌IgA的B巴細胞產生IgA和醫藥上可接受的載體。
在某些實施方案中，本文公開的醫藥組合物是治療受試者的疾病，它能受惠於在免疫系統中清除表現mIgA的細胞或減少IgA抗體。
在某些實施方案中，疾病挑選來自含有IgA淋巴癌，IgA腎病，過敏性紫斑症(HSP)和乳糜瀉的組別。
在第三個方面，本文公開的實施方案提供一種方法對於受試者在體外或體內溶解表現mIgA的B淋巴細胞與減少IgA的生成。包括採用抗體或片段其專一於人類mα鏈的migis-α，可以結合B淋巴細胞上的mIgA，進而造成表現mIgA的B淋巴細胞溶解與減少分泌IgA的B淋巴細胞產生IgA。
在第四個方面，本文公開的實施方案提供一種方法用來治療受試者的疾病，包括施用抗體或片段其專一於人類mα鏈的migis-α可以結合B淋巴細胞上的mIgA，進而造成受試者免疫系統表現mIgA的B巴細胞溶解與減少IgA抗體。
在第五個方面，本文公開的實施方案提供使用抗migis-α抗體與片段用於治療受試者的疾病，受惠於在免疫系統中清除表現mIgA的細胞或減少IgA抗體。
在某些實施方案中，病挑選來自含有IgA淋巴癌，IgA腎病(IgAN)，過敏性紫斑症(HSP)和乳糜瀉的組別。
圖1顯示了一個老鼠/人類嵌合重組蛋白質包括老鼠α免疫球蛋白的CH2和CH3區域，人類膜結合α鏈上膜錨定胜肽的migis-α部分，和取代了組成跨膜胜肽段的白氨酸拉鍊胜肽，此胜肽形成二聚體。
圖2是描繪抗IgA.Fc單株抗體(3C10)和兩個抗migis-α單株抗體(8G7和29C11)對人類IgA和含有各種人類膜結合α鏈，或其它成份的反應性。
圖3A-3C顯示在ELISA中抗migis-α抗體抗原決定基定位。A)圖3A指出migis-αL的合成胜肽部分，有底線的序列是位在IgA CH3區域。B)圖3B顯示抗migis-α單株抗體與不同migis-αL部位的結合反應性。C)圖 3C指出抗migis-α單株抗體對migis-αL N端短胜肽的結合反應性。
圖4A-4B顯示在ELISA測量8G7和29C11結合mα的相對親和力。A)圖4A顯示8G7和29C11對mα1.FcL-456S-LZ蛋白的結合強度。B)圖4B顯示8G7和29C11在與200nM生物素結合之29C11抗體競爭結合FcL-456S-LZ蛋白質的相對能力。
圖5顯示出抗migis-α單株抗體對DAKIKI細胞和表現mα1.Fc的轉染Ramos細胞染色數據，灰色部分是同類型IgG之背景值。
圖6顯示8G7單株抗體對8個非mIgA表現的細胞株缺乏反應性。
圖7顯示抗migis-α單株抗體對有或沒有處理MβCD的DAKIKI細胞之反應性。
圖8的結果表明3C10和8G7能誘導2株表現mα1.Fc的轉染Ramos細胞進行細胞凋亡，而29C11卻無法有此效果。
圖9的結果表明c8G7，但不是c29C11，可以有劑量依賴性的方式誘導顯著之ADCC，樣品數為4。
圖10A-10B顯示從22個提供者的人類周邊血單核細胞以抗體處理後體外測量IgA和IgM濃度。A)圖10A顯示了c8G7可以顯著並且專一降低周邊血單核細胞IgA的產生。**，P<0.05；***P<0.001。B)圖10B顯示，c8G7治療組IgA濃度降低到對照組濃度的54%。
圖11A-11B顯示在活體內表現mα1.Fc的A20轉染細胞株處理抗migis-α抗體後生長抑制的研究。A)圖11A顯示了兩個A20轉染細胞株細胞表面表現ma1.Fc與B細胞標記的量。B)圖11B顯示純化的抗體對腫瘤移植小鼠的治療時程。
圖12顯示出了8G7單株抗體重鏈和輕鏈的可變區序列。每個鏈的三個互補決定區(CDRs)以粗體顯示。
在表現mIgA的B細胞上膜結合型IgA(mIgA)與Igα/Igβ合的複合 物形成B細胞受體(BCR)，相較於α鏈的IgA(α)，mIgA(mα)的α鏈還含有一個C端膜錨定的胜肽，其包括細胞外、跨膜和胞內段。細胞外區段，稱為mIg的同型特異性(migis-α)段或mα的胞外膜近側域，是特定於mα，並已提出了可當成特定抗原區用來被抗體瞄準同型特異性表現mIgA的B細胞(美國專利號碼5,079,334)，到現在沒有這種抗體曾經被製備出來。
曾經有報告過，似乎指出mIgA上migis-α呈現的抗原決定基不是可接近的，在ELISA中有許多抗migis-α的抗體可以與含有合成migis-α的胜肽或是重組蛋白強烈的結合，然而它們無法偵測到與B細胞上的mIgA結合。29C11可以偵測到與B細胞上的mIgA結合，此結合是很微弱的。從先前技術得到這些結果會建議在B細胞上mIgA的migis-α抗原區以某種原本的構形存在或是被某些鄰近的分子所干擾，導致它們無法被抗體所靠近[Hung et al.,Mol.Immunol.48(15-16)：1975-1982(2011)]。
在目前的申請，我們的理論說明合成的migis-α胜肽無法呈現原本的構形因而無法誘導抗體去辨認migis-α原本的構形，接著再當蛋白質有人類mα的CH3與migis-α時可以呈現原本的構形，這樣的抗原決定基在免疫過程中會被認到鄰近mIgA的CH3區域抗體所擋住，B淋巴細胞帶有專一於migis-α抗原決定基的抗體受體就沒有機會能結合migis-α抗原決定基。基於這樣的假說，我們設計了一個免疫原它可以排除這樣的困難。具體來說，這樣的免疫原包含老鼠的CH3與人類的migis-α，在免疫過的小鼠裡，沒有誘導出結合CH3的抗體，它是個自己的抗原，讓migis-α存在於原本的構形去讓帶有專一於migis-α抗體受體的B細胞辨識。使用這個策略，我們已經產生抗migis-α單株抗體，它可以有更好的結合能力去辨識B細胞上mIgA。我們已經顯示出這個抗migis-α單株抗體可以結合表現mIgA的B細胞而且藉由存在二抗交叉結合能導致 細胞凋亡使這些B細胞溶解而29C11是無法的。我們進一步顯示這個抗migis-α單株抗體可以在體外對人類周邊血單核細胞(PBMC)引起細胞毒殺並降低人類周邊血單核細胞產生IgA。
第一個方面，在此公開的實施方案提供經分離的抗migis-α抗體或片段其專一於人類mα鏈的migis-α，可以結合B淋巴細胞上的mIgA，進而造成表現mIgA的B細胞溶解與降低分泌IgA的B細胞產生IgA。
在一些實施例中，其本文公開抗migis 抗體或片段包含以下互補決定區(CDR)：(a)CDR-H1序列為SEQ ID NO：17的26-33，(b)CDR-H2序列為SEQ ID NO：17的51-57，(c)CDR-H3序列為SEQ ID NO：17的96-104，(d)CDR-L1序列為SEQ ID NO：18的27-32，(e)CDR-L2序列為SEQ ID NO：18的50-52，(f)CDR-L3序列為SEQ ID NO：18的89-97。
在一些實施方案中，抗migis-α抗體或片段其包含闡述於SEQIDNO：17的VH和闡述於SEQIDNO：18的VL。
“分離的”是指從其天然環境中除去蛋白質。然而，應當理解的是，蛋白質可以與稀釋劑或佐劑配製，仍然為實用目的而被分離。例如，用於治療疾病時的抗體通常與可接受的載體混合。
通常一個免疫球蛋白有一個重鏈與輕鏈，每個重鏈與輕鏈含有一個固定區域與可變區域(分別是VH和VL)，輕鏈與重鏈的可變區含有一“框架”區域被三個高度可變區域也稱為互補決定區所中斷，框架區和互補決定區的範圍已被定義，不同輕鏈或重鏈框架區的序列在物種內是相對保留的。抗體的框架區，即組成輕鏈和重鏈的組合框架區，在三度空間中用於定位和對齊互補決定區。
互補決定區主要負責結合抗原的抗原決定基，互補決定區的每條 鏈通常稱為CDR1，CDR2和CDR3，從N端開始按順序編號，並且通常還透過其中的特定鏈的CDR來識別。因此，VH CDR3位於被發現的抗體重鏈可變區域，而VL CDR1是從它被發現的抗體輕鏈可變區域之CDR1。
在一個實施方案中，抗migis-α抗體或其片段是嵌合，人源化或人的抗體。
通常，人源化抗體中導入來自非人類來源的一個或多個氨基酸，這些非人類氨基酸殘基通常被稱為進口殘基，其通常取自輸入可變區域。人源化基本上遵循Jones等人描述的方法，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature 332：323-327(1988)；或Verhoeyen等人，Science 239：1534-1536(1988)，通過對一個人類抗體的相對應序列取代囓齒類CDRs或CDR序列。因此，這樣的人源化抗體是嵌合抗體(美國專利號4,816,567)，其中完整人類可變區的很少一部分被非人物種相對應序列所取代。實際上，人源化抗體通常是其中一些CDR殘基和可能一些框架殘基被類似位置的囓齒動物抗體殘基所取代。
在一些實施方案中，“人類抗體”指免疫球蛋白包括了人類的高度變異區與人類框架區和恆定區，這種抗體可以使用各種已知的技術來製造，例如體外方法涉及在噬菌體表現上使用人類抗體片段重組庫(如McCafferty等人，1990，Nature348：552-554；Hoogenboom & Winter，J.Mol.Bio.227：381(1991)；和Marks等人，J.Mol.Bio.222：581(1991))，酵母細胞(Boder和Wittrup，1997，Nat Biotechnol 15：553-557)，或核糖體(Hanes和Pluckthun，1997，Proc Natl Acad Sci USA 94：4937-4942)。類似地，人類抗體可以通過將人免疫球蛋白基因導入基因轉殖動物，例如小鼠，其中內源的免疫球蛋白基因部分或完全被去活化。刺激過後，人類抗體的產生被觀察到，它與人類在各方面都非 常地相似，包括基因重組，裝配和抗體分佈。這種方法有被描述過，例如，在美國專利號6,150,584，5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016，並在以下科學出版物：(例如，Jakobavits，Drug Deliv Rev.31：33-42(1998)，Marks等人，Bio/Technology 10：779-783(1992)；Lonberg等人，Nature 368：856-859(1994)；Morrison，Nature 368：812-13(1994)；Fishwild等人，Nature Biotechnology 14：845-51(1996)；Neuberger，Nature Biotechnology 14：826(1996)；Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol.13：65-93(1995)。
在一個具體實施方案中，抗migis-α抗體是單株抗體8G7。
在某些實施方案中，本文公開所敘述抗體或其片段包括上述抗migis-α抗體的F(ab)'2，Fab，Fv，或單鏈Fv片段。
在一些實施方案中，“抗體片段”是指含有完整抗體的一部分，一般是抗體的抗原結合區或可變區。抗體片段的實例包括Fab，Fab'，F(ab')2，和Fv片段；單結構域抗體(例如，Wesolowski，Med Microbiol Immunol.(2009)198(3)：157-74；Saerens等人，Curr Opin Pharmacol.(2008)8(5)：600-8；Harmsen和DeHaard，Appl Microbiol Biotechnol.(2007)77(1)：13-22)；螺旋穩定化抗體(參見，例如，Arndt等人，J Mol Biol 312：221-228(2001)；雙抗體(見下文)；單鏈抗體分子(“scFv，”見，例如，美國專利號5,888,773)；雙硫化穩定抗體(“dsFvs”，見，例如，美國專利號5,747,654和6,558,672)，和結構域抗體(“dAb，”見，例如，Holt等人，Trends Biotech 21(11)：484-490(2003)，Ghahroudi等人，FEBS Lett.414：521-526(1997)，Lauwereys等人，EMBO J 17：3512-3520(1998)，Reiter等，J.Mol.Biol.290：685-698(1999)，Davies和Riechmann，Biotechnology，13：475-479(2001))。
第二方面，在此公開的實施方案提供的醫藥組合物包含抗migis-α抗體或片段專一於人類mα鏈的migis-α，可以結合B淋巴細胞上的 mIgA進而造成表現mIgA的B淋巴細胞溶解與降低分泌IgA的B淋巴細胞產生IgA和醫藥上可接受的載體。
“醫藥上可接受的”是指可接受用於醫藥和獸醫用途，即沒有不可接受的毒性或其他不適當的。
在某些實施方案中，本文公開的醫藥組合物是治療受試者的疾病，它能受惠於在免疫系統中清除表現mIgA的細胞或減少IgA抗體。
在某些實施方案中，疾病挑選來自含有IgA淋巴癌，IgA腎病(IgAN)，過敏性紫斑症(HSP)和乳糜瀉的組別。
在第三個方面，本文公開的實施方案提供一種方法對於受試者在體外或體內溶解表現mIgA的B淋巴細胞與減少IgA的生成，包括採用抗體或片段其專一於人類mα鏈的migis-α，可以結合B淋巴細胞上的mIgA，進而造成表現mIgA的B淋巴細胞溶解與降低分泌IgA的B淋巴細胞產生IgA。
在第四個方面，本文公開的實施方案提供一種方法用來治療受試者的疾病，包括施用抗體或片段其專一於人類mα鏈的migis-α，可以結合B淋巴細胞上的mIgA，進而造成受試者免疫系統表現mIgA的B淋巴細胞溶解與減少IgA抗體。
在某些實施方案中，疾病挑選來自含有IgA淋巴癌，IgA腎病(IgAN)，過敏性紫斑症(HSP)和乳糜瀉的組別。
在第五個方面，本文公開的實施方案提供使用抗migis-α抗體與片段用於治療受試者的疾病，受惠於在免疫系統中清除表現mIgA的細胞或減少IgA抗體。
在某些實施方案中，疾病挑選來自含有IgA淋巴癌，IgA腎病(IgAN)，過敏性紫斑症(HSP)和乳糜瀉組別。
在某些實施方案中，本文公開的術語“受試者”或“病患”可交替使用。
在某些實施方案中，術語“受試者”或“患者”是指一種細胞(例如一個免疫細胞，一個B淋巴細胞，或表現mIgA的B淋巴細胞)，動物(例如，鳥類，爬行動物和哺乳動物)，偏好哺乳動物，包括非靈長類(例如，駱駝，驢，斑馬，牛，豬，馬，貓，狗，大鼠和小鼠)和靈長類動物(如猴子，黑猩猩和人類)。在某些實施方案中，受試者或患者可以受惠於在免疫系統中清除表現mIgA的細胞或減少IgA抗體。
除非在此另有說明或與上下文明顯矛盾，使用的術語“一”、“一個”和“這個”與類似的指示對象在上下文中描述本發明(特別是在以下權利要求的上下文中)被解釋為包括單數和複數，。除非另有說明。“包括”、“有”、“包含”和“含有”的術語將被理解為開放式術語(即意思是“包含，但不限於，”)。本文在此列舉的數值範圍僅用作為提及每一個落在該範圍內單獨的數值之簡略方式，除非本文另有說明，並且每個單獨的數值併入說明，就好像它在本文中單獨列舉一樣。本文中所描述的所有方法可以以任何合適的順序進行，除非本文另外指出或另外與上下文明顯矛盾。除非另有聲明，本文所提供使用的任何和所有實施例，或示例性語言(例如，“如”)，僅僅是為了更好地闡明本發明，並不構成限制本發明的範圍。說明書中沒有語言應被看作是指示在本發明的實踐中任何未要求保護的元素是必要的。(No language in the specification should be construed as indicating any non-claimed element as essential to the practice of the invention)
本發明在此描述的偏好實施方案，包括發明人已知的用於實施本發明的最佳模式。在閱讀了前面的描述，這些偏好實施方案的變化對本領域的普通技術也許變得顯而易見。發明人預期熟練的技術人員採用這些適當的變化，並且發明人認為本發明被不同於這裡具體描述的所實踐。因此，所附的權利要求書主題裡敘述本發明包括的所有修改和等同物被適當的法律所允許(this invention includes all modifications and equivalents of the subject matter recited in the claims appended hereto as permitted by applicable law)。此外，上述元素的任何組合在所有可能的變化中是被本發明所包括，除非本文另外指出或另外與上下文明顯矛盾。
下面的實施例進一步說明實施方案，當然，不應該被認為以任何方式限制其範圍。
實施例 實施例1
建構與表現含有migis-a的重組蛋白質
為了製備含migis-αL小鼠/人嵌合蛋白(SEQ ID NO：1)來免疫小鼠，人類IgA1.Fc部分被老鼠IgA.Fc所取代，跨膜區被可溶於水的GCN4白氨酸拉鍊所替換(圖1)。表現該嵌合蛋白質的DNA序列通過基因合成(GeneArt)。額外一段表現小鼠鏈的前導胜肽DNA序列，一個聚組氨酸標籤，以及一個連接胜肽被合併在該序列的5'端，此合成序列被接到一個pcDNA3.1載體(Invitrogen)中，嵌合蛋白質是透過使用FreeStyleTM293表現系統(Invitrogen)來表現。對於大規模的細胞轉染，1.2毫克的質體DNA稀釋於20ml無血清DMEM中，與3.6毫克的線性聚乙烯亞胺(Polysciences)稀釋在20毫升9克/公升的NaCl溶液混合。將混合物在室溫下放置10分鐘，然後緩慢加入到一個含有160毫升新鮮FreeStyleTM293表現培養基中有2×109FreeStyleTM293F細胞的培養瓶中。細胞在37℃搖動4小時，然後將600ml新鮮FreeStyleTM293表現培養基加入到瓶中用於進一步的培養。細胞生長5天後，把培養基離心，將上清液通過使用Protino®的Ni-NTA瓊脂糖(MACHEREY-NAGEL)進行蛋白質純化。純化步驟根據生產商的操作手冊，純化的蛋白被儲存在PBS中。為了準備用免疫酵素分析法(ELISA)篩選和檢查融合瘤的重組蛋白，表現各種含有人類migis-α蛋白質同種型與異構物的DNA序列分 別是mα1.Fc(SEQ ID NO：2)和mα1.FcS-LZ(SEQ ID NO：3)，mα1.FcL-456S-LZ(SEQ ID NO：4)，和FcL-456C-LZ(SEQ ID NO：5)，從DAKIKI細胞(ATCC)的mRNA製備cDNA，這是一株表現IgA的B細胞株，或是透過PCR從人類PMBC製備。擴增的DNA片段進一步連接到上述修飾過的pcDNA3.1載體。這些DNA構築體的細胞轉染，蛋白質表現，以及蛋白質純化如以上所敘述。
實施例2
確認一個嶄新能夠顯著地結合表現mIgA的B細胞之抗migis-α單株抗體
在兩週的間隔用五十微克嵌合蛋白質以皮下注射4-5次來免疫每隻Balb/c小鼠，細胞融合前三天，注射10微克嵌合蛋白質到每隻小鼠靜脈裡。從免疫小鼠中分離的脾細胞透過使用聚乙二醇1500(Roche)與小鼠骨髓瘤細胞FO融合。在融合過程後，細胞生長在HAT篩選培養基中10-12天而且培養液被取出用於ELISA篩選(在下一節詳述)。重組蛋白mα1.FcL-456S-LZ和mα1.Fc分別作為陽性抗原和陰性抗原。融合瘤產生抗體與mα1.FcL-LZ反應但未與mα1.Fc反應被鑑定為可能的細胞，藉由在ELISA中使用辣根過氧化物酶(HRP)結合山羊抗小鼠IgG.Fc抗體(Jackson Immuno Research)。為了進一步測試會結合表現mIgA的B細胞之融合瘤，將2×105DAKIKI細胞與100μl細胞培養液在冰上靜置30分鐘，細胞用染色緩衝液[PBS，2%胎牛血清(FBS，Invitrogen)和0.05%疊氮化鈉]洗滌後，與FITC結合的兔子F(ab)'2抗小鼠IgG抗體(AbD Serotech)以1：400稀釋溶在染色緩衝液靜置在冰上30分鐘。將細胞重新溶於200μl染色緩衝液，並進行流式細胞分析。在本實施例的新型抗migis-α融合瘤8G7可以顯著結合DAKIKI細胞被鑑定出來，通過細胞選殖的方式進一步獲得此融合瘤並確認。
實施例3
檢查抗migis-α單株抗體結合反應性和相對結合親和力
從融合瘤細胞培養液中使用蛋白質A瓊脂糖CL-4B介質(GE Healthcare)純化抗migis-α單株抗體8G7(Igγ2b，κ)和29C11(Igγ1，κ)，純化的單株抗體以1毫克/毫升的濃度儲存在PBS中。小鼠抗人單株抗IgA1.Fc抗體3C10(Igγ1，Abcam)和小鼠總IgG(Sigma-Aldrich公司)分別用作陽性和陰性對照，數個含有migis-α重組蛋白和幾個不相干蛋白在ELISA中進行測試。蛋白質在4℃以1微克/毫升，在0.05M碳酸鹽/碳酸氫鹽緩衝液覆蓋在免疫分析盤一整夜。用PBST(PBS含0.05%Tween®20)洗滌免疫分析盤，並在室溫下1小時以PBS/BSA(PBS含有1%BSA)阻斷。用PBST洗滌後，單株抗體以1微克/毫升的濃度在PBS/BSA中加入免疫分析盤裡並在室溫下放置1小時。免疫分析盤用PBST洗滌，然後HRP結合的山羊抗小鼠抗體IgG.Fc以1：10,000稀釋在PBS/BSA中加入到免疫分析盤。在室溫下放置1小時後用PBST洗滌，四甲基聯苯胺受質(Clinical Scientific Products)加入到免疫分析盤作為比色測量，圖2顯示出了8G7專一反應於migis-α片段。
進一步在ELISA用合成migis-αL多胜肽研究抗migis-α單株抗體的抗原決定基。多胜肽maFL(SEQ ID NO：9)，maFa(SEQ ID NO：10)，maFb(SEQ ID NO：11)，和maFc(SEQ ID NO：12)代表migis-αL序列全長片段，N端部分，中間部分，以及C末端部分(圖3A)。多胜肽maF1-2(SEQ ID NO：13)，maF1-3(SEQ ID NO：14)，maF2(SEQ ID NO：15)，和maF2-1(SEQ ID NO：16)被設計用來測試抗migis-α單株抗體對較短序列的結合活性。多胜肽以10微克/毫升的濃度覆蓋在免疫分析盤上作反應並跟據上面所述的ELISA流程。結果表明8G7與migis-αL的N端序列部分反應，但不與N端多胜肽的短片段反應(圖3B-C)。相較之下，29C11是能夠結合migis-αL序列N端和中間部分，並且與N端多胜肽的短片段反應(圖3B-C)。
為了確定抗migis-α單株抗體的相對結合親和力，用連續稀釋的單株抗體與mα1.FcL-456S-LZ蛋白反應，由ELISA進行定量結果，結合曲線是由軟件Prism®(GraphPad)進行分析，並用以下的方程試計算出Y=Bmax*X/(Kd+X)
Bmax為最大結合，與Y為同一單位，Kd是平衡結合常數，相當於在平衡時抗體結合一半抗原的濃度。8G7達到一半最大結合的濃度比29C11低約6倍(圖4A)。
用競爭性ELISA測定8G7和29C11抑制結合生物素標記的29C11對mα1.FcL-456S-LZ蛋白的能力，使用EZ-Link的磺基-NHS-生物素和生物素化試劑組(Thermo Scientific)對29C11進行生物素結合，依過程依照使用手冊來進行。在ELISA中，mα1.FcL-456S-LZ蛋白以1微克/毫升覆蓋在免疫分析盤上接著以PBS/BSA阻斷。8G7和29C11以500nM的起始濃度4倍連續稀釋分別與200nM生物素結合的29C11預先混合，並且在室溫下靜置20分鐘，混合物然後轉移到免疫分析盤並在室溫靜置2小時。洗滌後，將HRP結合的抗生物素蛋白(Sigma-Aldrich)以1：100,000稀釋在PBS/BSA加入免疫分析盤並靜置30分鐘。經過徹底的洗滌後加入TMB受質用於比色測量。ELISA結果是由軟件PRISM®分析而且兩個單株抗體的抑制濃度(IC50)由下面的方程式所計算Y=Bottom+(Top-Bottom)/(1+10(X-LogIC50))
頂部和底部是在Y軸的單位高原且IC50是競爭者造成在底部和頂部之間結合一半的濃度。圖4B顯示8G7能夠與生物素結合29C11對migis-α結合做競爭而且比29C11更有效，本實施例的結果證明，8G7的親和力比29C11更高。
實施例4
流式細胞分析抗migis-α單株抗體靠近表現mIgA的B細胞
在融合瘤的篩選中使用DAKIKI細胞，它表現mα1鏈長的和短的亞 型，藉由純化的單株抗體定量檢測。為了進一步測試對每個mα1亞型的結合，人類B細胞株Ramos(IgM+B淋巴細胞，ATCC)分別穩定表現mα1.FcL-456C(SEQ ID NO：6)的Ramos/mα1.FcL-456C或mα1.FcS(SEQ ID NO：7)的Ramos/mα1.FcS被製備。簡言之，5×106Ramos細胞溶於300μl無血清的RPMI 1640培養基(Invitrogen)中含有15微克構建的DNA，並通過Gene Pulser Xcell電穿孔系統(Bio-Rad公司)以230V/950μF電擊。細胞立即轉移至完全RPMI培養基(RPMI加10% FBS和青黴素/鏈黴素)。生長兩天後，將細胞轉移到完全的RPMI培養基中加1毫克/毫升G418(Merck)裡，用於篩選穩定的轉染細胞。穩定表現mα1.FcL-456C和mα1.FcS細胞藉由流式細胞分析用FITC結合的山羊抗人類IgA抗體分別被挑選出，細胞維持在含有0.5毫克/毫升G418完全RPMI培養基。
對於在實施例中的流式細胞測定法，3C10被用作檢測表現mIgA的陽性對照和小鼠抗人類膜結合mIgE單株抗體4B12(Igγ1，κ)被用作陰性對照。為了進行細胞染色，106細胞洗滌並與單株抗體在100μl染色緩衝液放置在冰上30分鐘，細胞隨後用染色緩衝液洗滌並與FITC標記的兔子F(ab)'2抗小鼠IgG抗體(Invitrogen)以1：400稀釋在100μl染色緩衝液放置冰上30分鐘。洗滌後，將細胞重新溶於400μl染色緩衝液並用FACSCanto II(BD Biosciences)進行流式細胞分析。圖5顯示8G7以劑量依賴的方式結合DAKIKI細胞與Ramos轉染細胞而且螢光強度在高濃度(10微克/毫升)顯著的增加，在該濃度29C11結合細胞的能力不佳。在低濃度(1微克/毫升)29C11對這三個表現mIgA的B細胞染色信號是偵測不到的，8G7對DAKIKI平均螢光強度(MFI)的增加{(MFI[高濃度]-MFI[背景])-(MFI[低濃度]-MFI[背景])}是比29C11高12.51倍。在低濃度(1微克/毫升)8G7對Ramos/mα1.FcL-456S和Ramos/mα1.FcS的MFI超過背景值{(MFI8G7-MFIbackground)/(MFI29C11-MFIbackground)}分別比2911高13.49和10.37倍。
藉由數個沒有表現mIgA的細胞株，有Ramos，Daudi(IgM+B淋巴細胞，ATCC)，IM-9(IgG+B淋巴細胞，ATCC)，U266(IgE+B淋巴細胞，ATCC)，H929(IgA+B淋巴細胞，ATCC)，CCRF-CEM(T淋巴細胞，ATCC)，KU812(嗜鹼性細胞，ATCC)和U-937(單核細胞，ATCC)，來檢驗8G7的反應性(圖6)，結果顯示8G7對這些細胞株的表面分子不具有反應性。
由於mIgA與B細胞表面Igα/Igβ異二聚體結合形成B細胞受體複合物可與脂筏相互作用，一些migis-α段可能被埋在複合物內。為了研究抗migis-α單株抗體對B細胞上mIgA反應的屏障，膽固醇萃取化合物甲基β環糊精(MβCD，Sigma-Aldrich)被用來瓦解mIgA受體複合物的完整性。DAKIKI細胞用預熱的RPMI培養基中洗條兩次並溶在濃度10mM MβCD的RPMI培養基中(5×106細胞/毫升)在37℃偶爾攪拌30分鐘。細胞隨後用染色緩衝液兩次，並在流式細胞分析中進行細胞染色。10微克/毫升的單株抗體用於染色而且用FITC標記的兔子F(ab)'2抗小鼠IgG抗體以1：400稀釋來偵測。MβCD處理後，29C11顯現增加結合DAKIKI細胞的訊號，而3C10的螢光強度下降超過10倍(圖7)。在相同的抗體濃度8G7結合MβCD處理過的DAKIKI細胞比3C10和29C11更好。在這個例子的結果表明，8G7能夠與B細胞表面原本形態的mIgA結合，只有當脂筏遭到破壞時29C11才能結合mIgA。
實施例5
藉由抗migis-α單株抗體8G7誘導表現mIgA的B轉染細胞進行細胞凋亡
為了測試交叉結合的mIgA受體複合物是否能夠誘導細胞凋亡信號，Ramos的轉染細胞，Ramos/mα1.FcL-456C和Ramos/mα1.FcS分別用抗體處理，200μl完全RPMI 1640培養基含105細胞接種於96孔盤中對每個條件以三重複來操作。單株抗體的連續稀釋液加入到孔中並在37℃ 下靜置1小時，交叉結合用山羊的F(ab')2抗小鼠IgG(Jackson Immuno Research)以10微克/毫升的最終濃度加入到孔中與細胞培養在37℃下24小時。然後把細胞轉移到5ml聚苯乙烯試管並用PBS洗滌兩次。為了偵測細胞凋亡，細胞在100μl結合緩衝液[10mM Hepes/NaOH(pH7.4),140mM NaCl,2.5mM CaCl2]中用2微克碘化丙啶(PI，Sigma-Aldrich)和1μl的膜聯蛋白V-FITC(Annexin V-FITC,Biovision)進行染色。在室溫下靜置20分鐘後，加入400μl結合緩衝液到管中，細胞隨後進行流式細胞分析。細胞凋亡被定義為膜聯蛋白V+/PI-加膜聯蛋白V+/PI+。圖8顯示出3C10和8G7在最大濃度(1.5微克/毫升)分別誘導73.67%和66.68%Ramos/mα1.FcL-456C的細胞凋亡，在相同的濃度3C10和8G7可分別誘導89.70%和49.45%的Ramos/mα1.FcS(圖8)。與小鼠IgG對照組的結果相較，在此濃度範圍29C11對這2株Ramos轉染細胞株不會誘導任何顯著的細胞凋亡。比較誘導這兩個轉染細胞株細胞凋亡的效率，8G7誘導Ramos/mα1.FcL-456C細胞凋亡比Ramos/mα1.FcS強。
實施例6
對人類周邊血單核細胞用老鼠/人類嵌合抗migis-α單株抗體c8G7觸發抗體依賴型細胞毒性(ADCC)
ADCC是抗體聚集帶有Fcγ受體的作用細胞如自然殺手(NK)細胞和巨噬細胞，破壞被抗體覆蓋的細胞之有效機制之一。在本實施例2株人類mIgA1轉染細胞株，Ramos/mα1.FcL-456C和Ramos/mα1.FcS，分別被用作標靶細胞且從血庫(台北，台灣)中得到白血球濃縮物裡面分離出人類周邊血單核細胞擔任作用細胞，人類血液樣本的操作是根據醫學研究倫理委員會(中央研究院，台灣)所核准。小鼠/人類嵌合單株抗體的製備是透過基因工程將與人類對應部分(γ1和κ)取代老鼠的γ和κ恆定區，並在FreeStyleTM293表現系統中表現，嵌合8G7和29C11分別 被標示為c8G7和c29C11，會與gp120蛋白發生反應的老鼠/人類嵌合單株抗cBAT123用作陰性對照。
為了製備周邊血單核細胞，白血球濃縮物(50毫升)與50毫升Hank’s平衡鹽溶液(HBSS，Invitrogen)混合，20毫升的稀釋濃縮物小心的加到裝有15毫升Ficoll-Hypaque Plus溶液(GE Healthcare)的50毫升離心管。四管有1百毫升總稀釋的濃縮物進行離心，從濃縮物殘留的紅血球細胞以300xg離心40分鐘以分離周邊血單核細胞。取出周邊血單核細胞層並用50毫升的HBSS洗三次，周邊血單核細胞的數量以台盼藍排除法計算且所需的周邊血單核細胞數目以5×106細胞/毫升溶於完全RPMI培養基中供接下來使用，剩下的周邊血單核細胞中儲存在含10%二甲基亞碸的FBS放在液氮裡。為了使用保存的周邊血單核細胞當成作用細胞，進行ADCC檢測之前將周邊血單核細胞解凍並培養在完全的RPMI培養基中24小時。
以羧基琥珀酰亞胺酯(CFSE，Invitrogen公司)標記靶細胞，1×106的轉染細胞，用10毫升溫的0.1%BSA/PBS洗滌一次並溶於1ml溫的含有1μm CFSE的0.1%的BSA/PBS隨後在37℃下靜置10分鐘。加入冰冷的完全RPMI培養基(3ml)到標記的細胞並在冰上靜置5分鐘。然後將細胞離心以除去培養基並用1ml冰冷的完全RPMI培養基洗滌兩次，然後將標記的細胞以2×105個細胞/毫升溶在溫的完全RPMI培養基中進行下列測試。為了測試ADCC活性，將2×104標記的靶細胞(100μl)加到圓底96孔盤的每個孔裡，不同濃度的嵌合抗體(5μl)加入到孔裡並在37℃下靜置30分鐘，隨後混合5×105的PBMC(100μl)，然後細胞混合物培養在37℃ 16-20小時。在這個例子中4位捐助者的周邊血單核細胞個別進行了測試且每個抗體濃度實驗為三重複。在將細胞送入FACSCanto II流式細胞分析前，將0.25微克7-氨基放線菌素D(7-AAD)加入到每個孔裡，並在室溫下培養15分鐘，活靶細胞被定義為CFSE+/7-AAD-，靶細胞溶 解百分比(%ADCC)的由下面的算試所計算%of target cell lysis={([%of living target cells]no mAb treated-[%of living target cells]mAb treated)/[%of living target cells]nomAbtreated}*100
結果顯示，莫須瘤和c8G7對這兩個靶細胞顯現劑量依賴性的ADCC(圖9)，c8G7在10微克/毫升的濃度下對Ramos/mα1.FcL-456C和Ramos/mα1.FcS分別誘導25.23%和28.30%ADCC(圖9)。在相同濃度下莫須瘤對Ramos/mα1.FcL-456C和Ramos/mα1.FcS分別誘導58.16%和65.4%細胞溶解，本實施例測試的抗體濃度範圍內，c29C11組沒有造成顯著的ADCC。
實施例7
人類PBMC藉由處理小鼠/人類嵌合抗migis-α單株抗體c8G7而減少產生IgA的體外測試
22名健康者提供的PBMC以前面例子中所描述的程序製備，細胞以濃度2×106/毫升溶於完全IMDM(Invitrogen)而且將200μl的細胞加到96孔培養盤的每個孔裡，然後以5微克/毫升的最終濃度將抗體加入到孔中。培養5天後，將細胞以400xg離心5分鐘，將上清液(各孔150μl)與等體積的1%的BSA/PBS混合，用人類IgA和IgM ELISA試劑組(Bethyl Laboratories,Inc)分別定量IgA和IgM濃度，根據所附手冊中描述的程序執行。在這個例子中，與人類膜結合IgE專一反應的小鼠/人類嵌合抗體4B12用作對照單株抗體，每個抗體處理實驗組重複三次，測量之間的數據相關性以配對樣本t檢驗進行計算。
結果顯示，c8G7和莫須瘤處理過的組別與對照組相比IgA濃度減少具有高度統計上顯著(圖10A)，c29C11在此處理的濃度不能降低IgA產生(圖10A)。雖然在c29C11和c8G7處理過的組別IgM濃度比對照組略低，但它們之間與對照組沒有統計上顯著性(圖10A)。相較之下，莫須瘤可以有效地抑制IgM的產生(圖10A)，圖10B顯示出每個組與對 照組IgA和IgM濃度的百分比。在這種處理條件與對照組相比，c8G7和莫須瘤分別降低IgA的濃度50%與20%(圖10B)，與對照組相比只有莫須瘤可以減少IgM濃度40%，為統計上顯著(圖10B)。
實施例8
以抗migis-α單株抗體8G7治療表現mIgA的B轉染細胞移植到小鼠之生長抑制
小鼠B細胞株A20(IgG+B淋巴細胞，ATCC)穩定表達mα1.FcL-456S(SEQ ID NO：8)或mα1.FcS(SEQ ID NO：7)，分別稱為A20/mα1.FcL456S和A20/mα1.FcS，以細胞電穿孔和藥物篩選製備細胞的過程，與前面的例子準備Ramos的轉染細胞一樣。由流式細胞分析用FITC標記的山羊抗人類IgA抗體分別有挑選到穩定表現mα1.FcL-456S和mα1.FcS的細胞株，(圖11A)且維持在含有0.5毫克/毫升G418的完全RPMI培養基中。2株轉染細胞的小鼠B細胞標記CD19，CD45R，和CD79b也藉由流式細胞鑑定，分別用FITC標記的大鼠抗小鼠CD19，PE標記的大鼠抗小鼠CD45R，和FITC標記的倉鼠抗小鼠CD79(BD Biosciences)測定(圖11A)。
為了測試抗體處理A20的轉染細胞體內生長抑制，細胞用Hank’s平衡鹽溶液(HBSS，Invitrogen)洗滌兩次，並以1×108細胞/毫升溶於HBSS中，然後將細胞與GeltrexTMLDEV低生長因子基底膜基質(Invitrogen)以1：1混合，並小心轉移到裝有22號針頭的針筒。細胞混合物(5×106個細胞/100μl/部位)以皮下方式接種到6-8週C.B-17Scid小鼠的腹腔側面(國家實驗動物中心，台灣)。植入(第0天)後，小鼠接受純化29C11或8G7以5毫克/公斤的劑量通過尾靜脈在第1，4，7，10，14和21天進行靜脈注射(圖11B)，純化的小鼠血清IgG(Sigma-Aldrich)用於對照組。每種抗體組測試五隻腫瘤接種的小鼠，腫瘤大小的測定為每週用游標卡尺而且體積計算採用下列算式：1/2×長×寬平方，腫瘤達到3000立方毫米體積就會將小鼠犧性。
SEQ ID NO 1
長度：306
類型：PRT
生物體：人工序列
特徵：粗體，小鼠IgA.Fc；帶下劃線字體，人類migis-α1L；斜體，白胺酸拉鏈
其他資訊：含小鼠/人類嵌合migis-αL之蛋白質
序列：1
SEQ ID NO 2
長度：243
類型：PRT
生物體：智人
特徵：
其他資訊：人類mα1.Fc
序列：2
SEQ ID NO 3
長度：297
類型：PRT
生物體：智人
特徵：
其他資訊：人類mα1.FcS-LZ
序列：3
SEQ ID NO 4
長度：303
類型：PRT
生物體：智人
特徵：
其他資訊：人類mα1.FcL-456S-LZ
序列：4
SEQ ID NO 5
長度：303
類型：PRT
生物體：智人
特徵：
其他資訊：人類mα1.FcL-456C-LZ
序列：5
SEQ ID NO 6
長度：314
類型：PRT
生物體：智人
特徵：
其他資訊：人類mα1.FcL-456C
序列：6
SEQ ID NO 7
長度：308
類型：PRT
生物體：智人
特徵：
其他資訊：人類mα1.FcS
序列：7
SEQ ID NO 8
長度：314
類型：PRT
生物體：智人
特徵：
其他資訊：人類mα1.FcL-456S
序列：8
SEQ ID NO 9
長度：36
類型：PRT
生物體：人工序列
特徵：
其他資訊：合成肽maFL
序列：9
SEQ ID NO 10
長度：18
類型：PRT
生物體：人工序列
特徵：
其他資訊：合成肽maFa
序列：10
SEQ ID NO 11
長度：16
類型：PRT
生物體：人工序列
特徵：
其他資訊：合成肽maFb
序列：11
SEQ ID NO 12
長度：16
類型：PRT
生物體：人工序列
特徵：
其他資訊：合成肽maFc
序列：12
SEQ ID NO 13
長度：12
類型：PRT
生物體：人工序列
特徵：
其他資訊：合成肽maF1-2
序列：13
SEQ ID NO 14
長度：12
類型：PRT
生物體：人工序列
特徵：
其他資訊：合成肽maF1-3
序列：14
SEQ ID NO 15
長度：12
類型：PRT
生物體：人工序列
特徵：
其他資訊：合成肽maF2
序列：15
SEQ ID NO 16
長度：12
類型：PRT
生物體：人工序列
特徵：
其他資訊：合成肽maF2-1
序列：16
SEQ ID NO 17
長度：115
類型：PRT
生物體：小家鼠
特徵：
其他資訊：小鼠8G7重鏈之可變區
序列：17
SEQ ID NO 18
長度：107
類型：PRT
生物體：小家鼠
特徵：
其他資訊：小鼠8G7輕鏈之可變區
序列：18
SEQ ID NO 19
長度：120
類型：PRT
生物體：小家鼠
特徵：
其他資訊：小鼠29C11重鏈之可變區
序列：19
SEQ ID NO 20
長度：106
類型：PRT
生物體：小家鼠
特徵：
其他資訊：小鼠29C11輕鏈之可變區
序列：20

Claims (14)

  1. 一種抗migis-α抗體或片段，其專一於人類mα鏈的migis-α，可以結合B淋巴細胞上的mIgA進而造成表現mIgA的B細胞溶解與/或降低分泌IgA的B細胞產生IgA。
  2. 如請求項1之抗migis-α抗體或片段，其是包含抗migis-α抗體的F(ab)’2，抗體片段(Fab)，可變片段(Fv)，單鏈可變片段(single-chain Fv)。
  3. 如請求項1或2之抗migis-α抗體或片段，其中抗體或片段含有下列互補決定區的序列(CDRs)：(a)CDR-H1序列為SEQ ID NO：17的26-33，(b)CDR-H2序列為SEQ ID NO：17的51-57，(c)CDR-H3序列為SEQ ID NO：17的96-104，(d)CDR-L1序列為SEQ ID NO：18的27-32，(e)CDR-L2序列為SEQ ID NO：18的50-52，(f)CDR-L3序列為SEQ ID NO：18的89-97。
  4. 如請求項1至3中任一項之抗migis-α抗體或片段，其中抗體或片段包含闡述於SEQ ID NO：17的VH和闡述於SEQ ID NO：18的VL。
  5. 如請求項1至4中任一項之抗migis-α抗體或片段，其中抗體是單株抗體8G7。
  6. 如請求項1至5中任一項之抗migis-α抗體或片段，其中抗體或片段是嵌合，人源化或人的抗體。
  7. 一種醫藥組合物，其包含請求項1至6中任一項之抗migis-α抗體或片段與醫藥上可接受的載體。
  8. 如請求項7之醫藥組合物，其中醫藥組合物是治療受試者的疾病，它能受惠於在免疫系統中清除表現mIgA的細胞或減少IgA抗體。
  9. 如請求項8之醫藥組合物，其中疾病挑選來自含有IgA淋巴癌，IgA腎病(IgAN)，過敏性紫斑症(HSP)和乳糜瀉的組別。
  10. 一種對於受試者在體外或體內溶解表現mIgA的B淋巴細胞與減少IgA的生成之方法，包括採用抗體或片段其專一於人類mα鏈的migis-α，可以結合B淋巴細胞上的mIgA，進而造成表現mIgA的B淋巴細胞溶解與減少分泌IgA的B淋巴細胞產生IgA。
  11. 一種用來治療受試者的疾病之方法，包括施用抗體或片段其專一於人類mα鏈的migis-α，可以結合B淋巴細胞上的mIgA，因此溶解受試者免疫系統表現mIgA的B淋巴細胞與減少產生IgA抗體。
  12. 如請求項11之方法，其中疾病挑選來自含有IgA淋巴癌，IgA腎病(IgAN)，過敏性紫斑症(HSP)和乳糜瀉的組別。
  13. 一種如請求項1至6中任一項之抗migis-α抗體或片段之用途，其用於治療受試者的疾病，它能受惠於在免疫系統中清除表現mIgA的細胞或減少IgA抗體。
  14. 如請求項13之用途，其中疾病挑選來自含有IgA淋巴癌，IgA腎病(IgAN)，過敏性紫斑症(HSP)和乳糜瀉的組別。
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