CN103069008B - 使用聚合物材料作为样品载体直接进行pcr的方法 - Google Patents

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Abstract

一种用于扩增核酸的方法，所述核酸来自诸如哺乳动物或植物的高级真核生物的核酸来源，所述方法包括：(a)使取样装置与所述诸如哺乳动物或植物的高级真核生物的核酸来源接触，以致在所述接触后含诸如哺乳动物或植物的高级真核生物核酸的物质粘附到所述取样装置的至少部件上，其中所述取样装置或其粘附有所述含核酸物质的部件由适合的聚合物材料制成；(b)将所述取样装置或其粘附有所述含核酸物质的部件引入容纳有进行核酸扩增反应用反应混合物的反应器，无需对所述含核酸物质进行任何预先处理；和(c)进行核酸扩增反应。

Description

使用聚合物材料作为样品载体直接进行PCR的方法
本发明涉及用于采集核酸扩增反应中使用的核酸样品的方法和器械。本发明特别涉及用于采集法医检定用样品的方法和器械，所述方法和器械可在例如犯罪或事故现场或发生生物污染的场所使用，而且所述方法和器械适用于最少的手动干预。
本说明书中明显为先前公开的文献的列举或讨论不一定被看作是承认该文献为现有技术的一部分或公知常识。
目前，由固体生物样品进行分析用哺乳动物(包括人)DNA的标准实验室制备需要部分或全部的以下处理：
需要以某种方式处理样品，通过某种形式的润湿或应用溶液从而将细胞从所在基质(例如，织物内干燥的血或棉签上的皮肤细胞等)移除。换句话说，通过液体增溶实现样品转移。
必须以某种方式处理样品从而促进DNA与蛋白质、碳水化合物、其他核酸等的细胞基质分离(即需要分离DNA)。
分离的DNA需要清除结合的蛋白质等从而使DNA分析过程能够开始-例如接近DNA聚合酶以在聚合酶链式反应(PCR)中复制DNA，或接近其他DNA扩增过程有关的酶或限制性酶以结合和切割DNA序列(即需要清洁DNA)。
所述制备需要清除抑制剂、DNA酶等的样品(即需要移除抑制DNA分析的化学物质)。
干样品需要溶剂化以将细胞物质溶解到上述任一要进行的反应用溶液中(即要求细胞/DNA在溶液中)。
上述过程要求谨慎操作样品、测量备用试剂的等份等，所有这些通常均需要实验室设备和经培训的专业人员来操作。
因此，通常认为，哺乳动物(包括人)细胞需要在溶液中以用于处理和/或预备性操作，并且需要预处理以制备用于DNA分析。
无需预备步骤对细胞溶液取样直接进行DNA分析反应是可能的，但是此举包括有限的样品类型和/或特别处理以实现DNA分析。已确定唾液可直接放入或稀释到PCR反应中，由此可进行基因组DNA分析。通常显示将血直接放入或稀释到PCR反应中需要特别的缓冲液和酶，以在任何程度成功再现的情况下进行反应。需要处理细胞溶液中的PCR抑制剂，通常经过稀释来处理。组织培养细胞需要从其培养环境中采集且需要在放入PCR反应中之前洗涤除去介质等。
换句话说，通常溶液中的细胞可以直接放入PCR分析装置，只要应用适当的稀释或聚合酶法对分析进行优化。
玻璃表面和材料长期以来被确定为细胞和DNA的亲水性结合表面，并且也是适于引发或容纳PCR反应的表面(例如，“Nanassy等人,AnalyticalBiochemistry2007,第365卷，第240-245页”显示从未经处理的载玻片(适于PCR)上有效回收基因组DNA)。
WO03/057910涉及一种使用具有未修饰的二氧化硅表面的材料分离DNA和随后在未修饰的二氧化硅存在下扩增的方法。其实施例均表明先进行裂解反应以得到DNA。
WO01/14590记载了一种使用含二氧化硅的磁珠放入DNA目标混合物内并然后用外磁力将结合到二氧化硅基质的DNA从混合物中分离出来的方法。其实施例显示通过之前的细胞裂解步骤使得DNA可用于二氧化硅。
还没有特别研制出接触湿或干的样品而无需预处理即可通过接触直接将细胞从来源转移到PCR反应中的玻璃取样装置。迄今为止也还没有制备出利用玻璃的已知性能通过将细胞/DNA应用到例如干/固体表面来将其直接转移到DNA/RNA扩增反应中以采集和转移细胞/DNA的取样装置。
已经考察了使用其他固体表面来捕集适于DNA/RNA扩增分析的细胞和DNA，并且已知由此提供微生物培养物，其中可直接接触(例如用木制牙签)所述微生物培养物中的细菌菌落且无需任何处理(对于质粒和基因组)而将细菌细胞转移到PCR反应中。
粘性表面(例如邮票)，舔(lick)一下即可结合细胞。粘性材料不适于直接放入PCR反应中且必须先处理以溶解掉粘性物质(例如，在提取DNA前用二甲苯预处理所述邮票)。EP1972688提供一种扩增来自微生物的核酸的方法，包括在低pH值(3.00-6.00)下使用固体表面，洗涤所述表面以移除未结合的物质，然后在相同的容器内通过系列步骤将所述表面用于PCR。WO2006/036243和WO2006/036246教导了使用材料来结合细胞溶液以使核酸经随后的处理后适于随后的释放以用于分析。优选的固相支撑材料使用季鎓核酸结合部分。
US5,496,562、US5,807,527、US6,27,226和US6,645,717涉及用化学物质预浸纤维素或玻璃纤维基质以裂解细胞从而当血或唾液置于其表面时将被吸附且同时被所述化学物质保存和被干燥。含DNA材料必须要预处理以在用于PCR反应前洗除所述化学物质。
传统上认为硅酮(和山都平(Santoprene)及其他热塑弹性体)表面对捕集DNA的过程呈惰性且提供自然保持DNA于适合PCR分析的形态的表面。根据连接在硅-氧骨架上的侧基，硅酮表现出多种形态。尽管已确定亲水性侧基(如羟基)能生成结合DNA的聚合物，但通常用能产生被认为生物学惰性的疏水性来源的烷基或芳基来构建硅酮。
IE20040589显示硅酮用作惰性载体流体。JP2007244389显示硅酮用作惰性层，其中割出凹槽以允许PCR所用的玻璃表面的流动，但是防止泄漏(即，推定硅酮在该过程中显惰性)。JP2008012434显示硅酮为可使DNA固定化于其中的基质，通过使用与有机溶剂混合的两性溶液使DNA进入硅酮的网状结构，然后在此通过移除溶剂而固定DNA。因为两性溶剂具有亲水和疏水部分，这不是自然的吸附过程，因此可用来运载亲水部分和/或用来运载亲水性DNA进入疏水结构。然后移除溶剂以沉积DNA，由此克服了推定的对DNA吸附的抑制。发现PDMS(聚二甲基硅氧烷)内存在的未聚合硅氧烷分子改进了PDMS作为微芯片/流体装置内DNA溶液印刷中的邮票的用途(Thibault等人，Langmuir2007,23,10706-10714)。其机理还不清楚，但未聚合硅氧烷的溶剂提取降低了印压过程中DNA的吸附和转移(推定的)。以前没有探索与DNA来源的干接触。
因此，前述的专利申请和出版物看似基于硅酮和热塑弹性体对于结合的细胞/DNA来说是惰性材料的前提，但是惰性表面性质可以进行修饰以增加与DNA溶液液体接触时的DNA吸附。
一直以来认为塑料表面对捕集细胞过程呈中性且提供能进行PCR分析的表面。塑料本质上是疏水性表面且被认为需要处理以适于结合细胞或DNA。作为实例，可以考虑处理塑料表面用于组织培养的细胞附着。通常用强UV或臭氧处理聚碳酸酯表面以制造亲水性表面。参见Yanchao等人(2007)Anal.Chem.79,426-433，其记载了对聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯和聚丙烯的不同处理以获得最适合的结合。“Liu和Rauch,AnalyticalBiochemistry2003,第317卷,第76-84页”中记载了塑料表面的DNA探针附着和带有样品振动的微流体杂交阵列通道装置。EP0389063教导了聚苯乙烯可用于在离液序列高的物质(如胍盐、碘化钠、碘化钾、异硫氰酸钠等)的存在下从生物物质中分离核酸。因为聚丙烯惰性高而将该材料推举为PCR反应器的选择材料(参见AnnevanderValk在INSights(第13卷)2002中报道的ABgene的研究)。据估计，对于暴露于200ng人基因组DNA的整管表面来说，结合少于5ng。
因此，通常认为，未处理的塑料在不预先处理的情况下不适于作为捕集细胞或DNA的表面。
EP1675511记载了一种擦拭装置，该擦拭装置被引入厢室中，通过操作该擦拭装置使拭子(swab)与试剂接触及随后与测试条接触，但该装置不用于核酸分析。WO2005/047451涉及一种带有可拆卸端的匙，其被设计用于采集口部细胞并将所述口部细胞放入管内的稳定化溶液中。从细胞回收DNA用于进一步分析。US2008/0131876记载了一种无需提取DNA而通过使细胞样品与将细胞修饰为可用于PCR的特殊溶液接触来扩增细胞样品的核酸的方法。WO2008/006501涉及一种直接输送拭子到连有微流体装置的厢室以进行PCR反应的仪器。EP1049801提及使用可带电的聚合物膜来结合DNA，然后洗脱掉DNA。Nikiforor和Rogers(1995)Anal.Biochem.227,201-209涉及96孔聚苯乙烯板用于基于DNA杂交的分析的用途。Inouye和Hondo(1990)J.Clin.Microbiol.28,1469-1472涉及扩增的病毒DNA片段的微板杂交。
目前，犯罪现场样品经擦拭(例如血污或指印)或者从材料上切割下来(例如内裤上的精斑)，而且所述拭子或材料被放入细胞裂解缓冲液中，DNA随后从该细胞裂解缓冲液中提取出来(参见，例如，Walsh等人(1991)Biotechniques10,506-513)。
WO2005/032377记载了包含抗微生物剂的生物取样试剂盒及其用途。
US2008/0058676记载了分段采集器擦拭系统。
WO2010/027283记载了适于小体积提取的样品采集装置。
WO2009/129397记载了高通量分配器。
US2003/0059345记载了双针液体取样装置。
Barbany等人(1999)BiomolecularEngineering16,105-111记载了链霉亲和素涂覆的多支管支撑体的分子遗传学应用。
WO99/34214记载了固相尖端及其相关用途。
US2002/0110812记载核酸采集屏障方法及其器械。
US6,103,192记载了在基质材料上固定化和处理样品用于鉴定核酸序列。
Barbaro等人(2004)ForensicScienceInternational146S,S127-S128记载了在基于IsoCode纸的装置上采集的体液的STR检测。
US2004/0152085记载了用于采集和/或纯化核酸的表面。
仍需要用于采集法医检定用含核酸样品的方法和装置，所述方法和装置可在犯罪、事故或其它事件的现场中使用，且适用于“接触并离开”(“contactandgo”)或“采集并离开”(“collectandgo”)方法中的最少手动干预。
其中，本发明提供仅需接触样品(固体或液体)就可既捕集核酸又能使核酸(通常哺乳动物DNA)在随后放入扩增试剂中时以适于DNA扩增(PCR或其它)的形式存在的方法和装置。试剂内存在装置或装置的部件既不影响扩增过程也不影响随后的分析(例如荧光)检测过程。
本文记载的研究证明：直接捕集和输送核酸扩增分析用的哺乳动物(包括人)细胞可仅以一个步骤通过包括塑料、硅酮和玻璃在内的某些聚合物表面的接触转移(“接触并离开”或“采集并离开”)获得，由于目标细胞捕集或转移到核酸扩增反应中，所以不需要润湿或溶解它们，某些简单的常规塑料和/或硅酮表面足以(通常无需修饰，但可以使用对聚合物“DNA灭菌”的处理，如UV照射或环氧乙烷气体处理)作为取样装置或取样装置的部件以从湿或干细胞表面或污渍处转移细胞，在表面上捕集细胞的特点是DNA适于PCR分析并保持结合状态，且如果需要，可放入第二个PCR反应中再利用，而且聚合物取样装置或至少其部件可留于扩增反应内而不对反应有任何损害。
本文记载的研究进一步提供装置，所述装置可使表面上的细胞不仅接触并转移到单DNA分析反应中，而且如果需要可接触并转移到多个不连续的同时进行的反应中。
与塑料、硅酮和热塑弹性体必须经特别处理才能结合核酸否则不适于捕集哺乳动物(包括人)样品和直接引发扩增反应的教导相反，本发明确定某些塑料和硅酮表面可作为适于引发核酸扩增反应的取样装置，仅通过使样品直接与表面接触，然后将接触表面沉积到DNA分析反应中。可不处理这些表面，或对这些表面进行“DNA灭菌”处理，从而使它们不与任何可检测到的会干扰核酸扩增和检测反应的核酸结合，如下文更详细的描述。过去尝试将其他天然材质(如木材、胶乳和金属)的表面直接用作取样装置，但发现不适合。
本文记载的方法和装置具有便携性、易于在短时空内以及在核酸样品取样现场使用和分析。
本发明的第一个方面提供一种用于制备反应器的方法，所述反应器容纳反应混合物和含核酸物质且易于进行核酸扩增反应，所述方法包括：
(a)提供反应器，所述反应器带有容纳进行核酸扩增反应用的反应混合物的单厢室且所述反应器是封闭的；
(b)提供取样装置；
(c)使所述取样装置与所述含核酸物质接触以在所述接触后使含核酸物质粘附到所述取样装置的至少部件上；
(d)开启所述反应器；
(e)将所述取样装置或其粘附有所述含核酸物质的部件放入所述反应器以使所述含核酸物质与所述反应混合物接触；以及
(f)再封闭所述反应器使其密封，所述取样装置或其粘附有所述含核酸物质的部件仍存在于所述反应器中。
所述反应器可为其中进行核酸扩增反应的任何适合的反应器。通常，所述反应器由塑料制成，特别是聚丙烯。适宜地，所述反应器体积为50μl至3ml，优选100μl至1.5ml。通常，所述反应器的圆形横截面为3mm至10mm，通常约5mm。
尽管可使用单反应器实施所述方法，但是将多个反应器连接在一起或以共同的支撑体支撑并且同时制备它们也很方便。因此，通常，两个或三个或四个或六个或八个或十个反应器连接在一起形成规则阵列。各反应器可容纳相同的反应混合物(例如，允许扩增和检测相同的一个或多个基因位点的相同的PCR反应混合物)，或它们可容纳不同的反应混合物(例如，允许扩增和检测不同基因位点的不同PCR反应混合物)。反应器的规则阵列适宜地构造成与适合的装置连接以进行核酸扩增反应和/或检测产物。适合的装置包括温度循环器装置和荧光检测装置。在有些实施方案中，反应器阵列可包括已容纳作为对照的已知和预定的含核酸物质的反应器。
使用取样装置将含核酸物质放入反应器以使所述取样装置或其粘附有含核酸物质的部件存在于反应器中。通常，所述含核酸物质保留在取样装置或其部件上，并且浸没在反应混合物内。在核酸扩增反应期间，扩增的DNA拷贝释放到反应混合物溶液中。
当多个反应器如所讨论的那样连接在一起时，通常取样装置或其粘附有所述含核酸物质的部件被构造成使所述含核酸物质在多个反应器之中分布。因此，例如，当有N个反应器时，将取样装置适宜地构造成使所述含核酸物质分布到N个反应器的每个反应器中。优选地，所述物质基本上均匀分布于反应器中。通常，N可以为2、3、4、6或8。优选地，N为4。优选地，当N为4时，将反应器定位于正方形的角上。
可以理解的是步骤(a)提供的反应器是封闭的。通常封盖是密封的。这意味着反应混合物可保持无污染直至使用。在使用中，封盖在步骤(e)前解封，但是可以理解的是步骤(c)和(d)可以以任何顺序进行。封盖可以是任何适合的封盖，适宜地可易于移除。反应器所用的通常的封盖是可脱掉的箔或塑料膜。其他封盖，如推入塞(push-instopper)形式的，也被考虑用于步骤(a)中提供的反应器。在步骤(f)中，反应器的再封闭防止了其后分析步骤中的蒸发或溢出。含核酸物质通常与反应混合物保持接触。
取样装置具有几个重要特征。与含核酸物质接触时，充足的含核酸物质粘附到取样装置以允许核酸扩增，当取样装置或其粘附有所述含核酸物质的部件放入反应器中时，核酸扩增反应进行。适宜地，所述取样装置或至少其粘附有所述含核酸物质的部件因此能够结合细胞物质，特别是如下更详细记载的存在于干燥样品中的哺乳动物细胞物质。对于“粘附”，包括的含义是，含核酸物质直接粘附于取样装置或取样装置的部件上，无需另外的粘性物质。这通过使取样装置或取样装置的部件与含核酸物质接触实现，例如通过在所述含核酸物质上摩擦所述装置或所述装置的部件。取样装置或取样装置的部件通常无孔。
取样装置或其粘附有所述含核酸物质的部件在核酸扩增反应期间保留在反应器中，因此必须与核酸扩增反应条件相容。
令人惊奇地，发现未经任何化学诱导或预处理的情况下下述聚合物与样品接触时能够采集充足的含核酸物质，且在反应期间存在时不影响核酸扩增反应。此外，令人惊奇地，发现核酸扩增反应后充足的含核酸物质仍与这些可用于进一步核酸扩增反应的聚合物结合。样品可以是湿或干样品。湿样品可通过液体粘附和转移粘附到所述装置或所述装置的部件。通常，当样品为干样品时，会有含核酸的细胞物质粘附。优选地，样品为干样品。
所述聚合物为玻璃、环烯烃共聚物(如Topas)、丙烯酸树脂(如聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA))、结晶聚苯乙烯、聚丙烯、高密度聚乙烯(HDPE)、聚碳酸酯、中抗冲聚苯乙烯(MediumImpactPolystyrene)、聚氯乙烯(PVC)、液晶聚合物30%(LiquidCrystalPolymer30%)、反式丙烯腈-丁二烯-苯乙烯(反式ABS)、乙缩醛共聚物、聚酯、聚醚酰亚胺、聚乙烯、尼龙、聚醚聚氨酯、苯乙烯丁二烯嵌段共聚物、聚丙烯无规共聚物、乙烯乙酸乙烯共聚物（ethylene-vinylacetate）、硅氧烷(如聚甲基二环氧乙烯硅氧烷(PDMS))和热塑弹性体(如山都平（Santoprene）)。优选地，所述聚合物是下述聚合物：当由所述聚合物制成的装置或其部件与所述样品接触时，含核酸的干物质(如细胞物质干样品)能粘附到该聚合物。因此，特别优选地，取样装置或至少其粘附有所述含核酸物质的部件由这些聚合物的一种或多种制成。优选地，所述聚合物不是泡沫形式，特别是松散泡沫。所述聚合物不是胶乳。所述聚合物可以是任何适合的用玻璃浸渍的聚合物，如任何用玻璃浸渍的上文列举的聚合物(除了玻璃之外)。通常，聚合物能经受住100°C的温度。例如，其在该温度下不分解或变形。
如果聚合物是PMMA、聚丙烯、聚碳酸酯和PDMS的任一种，则是特别优选的。尤其优选聚碳酸酯。
很多不同设计的取样装置均适合用于本发明，下文较详细地记载了其中某些。它们属于以下两个常类。第一类是取样装置或其粘附有含核酸物质的部件安装到反应器(反应器开启后)中且允许在步骤(f)中用单独的封盖再封闭反应器的那些。单独的封盖可以是例如，箔、塑料膜或推入塞。第二类优选是取样装置或其粘附有所述含核酸物质的部件设置有能封闭步骤(f)中的反应器的封盖。下文详细记载了该类取样装置的实施方案。
适宜地，取样装置或其粘附有所述含核酸物质的部件直接放入反应器，在取样后不需要额外的处理。
反应混合物用于进行任何适合的核酸扩增反应，包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)，或等温法，如连接酶链式反应(LCR)、环介导等温扩增(LAMP)、转录介导的扩增(TMA)、RNA信号介导扩增技术(SMART)、链置换扩增(SDA)、滚环扩增(RCA)、等温多重置换扩增(IMDA)、解旋酶依赖性扩增(HAD)、单引物等温扩增(SPIA)、环式解旋酶依赖性扩增(CDHA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。优选PCR；然而，由实施例可看出，使DNA可用于扩增并不需要高温处理(接近100°C)，因此低温法(如等温的LAMP)是适合的。
因此，反应混合物含有进行核酸扩增反应用的所有必要成分，除了待分析的核酸之外。
因此，例如，对于PCR，反应混合物含有PCR引物、脱氧核苷酸、DNA聚合酶、Mg2+离子和约pH7-8的缓冲液。对于其他核酸扩增方法，存在其他酶，如核糖核酸酶H或连接酶。
发现在核酸扩增反应前不必进行含核酸物质的预处理。此外，除了反应所需的那些试剂以外，核酸扩增反应混合物中也不需要有任何特殊试剂。因此，优选地，反应混合物基本上无离液序列高的试剂。类似地，优选地，反应混合物基本上无细胞裂解剂。然而，在某些实施方案中，可存在非离子性除垢剂，如Tween-20。对于“基本上无”所述试剂，根据具体情况，指的是所述试剂不存在，或其存在的浓度低至不会产生离液序列高的反应或细胞裂解反应。如果反应混合物基本上无尿素、胍盐(如盐酸胍)、除垢剂(特别是离子型除垢剂)中的任一种，则是特别优选的。
在特别优选的实施方案中，反应混合物还含有用于检测核酸扩增反应的核酸产物的试剂。因此，通常反应混合物还含有可检测的标记的核酸探针。特别优选的探针是能够与核酸扩增反应产物杂交的荧光标记的寡核苷酸探针。适合的寡核苷酸探针和荧光检测系统记载在例如WO2001/73118、WO2007/010268、WO2009/053679中，这些文献通过引用并入本文。特别优选的是进行短串联重复序列(STR)分析，例如在人DNA指纹分析中。可以理解的是，检测可在封闭反应器内于核酸扩增反应期间或之后进行是有利的，原因是开启反应器有可能引入污染。扩增结果可在反应器内直接观察(例如通过荧光)，或通过从反应混合物溶液取样，将取样装置留在反应器内并分析扩增的DNA(例如通过凝胶电泳)。
含核酸物质可以是任何来源，但优选来自高级真核生物来源，如哺乳动物或植物。高级真核细胞包括动物(包括脊椎动物)。优选哺乳动物(如人)来源的核酸。优选地，核酸为DNA。优选地，核酸为基因组DNA，但源自高级真核生物细胞的病毒核酸包括在术语“高级真核生物来源”中。通常，核酸存在于哺乳动物细胞内，含核酸物质为哺乳动物细胞物质。哺乳动物(包括人)的细胞物质包括血、唾液、精液、细胞(如皮肤细胞)和固体表面上沉积的细胞物质，例如遗留下来作为指纹部分的皮肤细胞。含核酸物质可以基本上无非核酸物质。
在很多应用上，含核酸物质基本上是干的。对于“基本上是干的”，指的是样品没有可见的与其结合的湿迹。例如，含核酸物质可以是细胞(如皮肤细胞)、干燥的血、干燥的精液、干燥的唾液或其他干燥的体液。令人惊奇地，发现取得样品前不必将干燥的物质溶剂化，并且发现干燥的样品可以直接放入反应器，无需预先处理。
尽管不限于该用途，但是容易理解的是，本发明可应用于法医学，特别是犯罪现场。还考虑到临床应用(如遗传病检验)和食物、植物和动物物质等的“来源或起源”检验。类似地，本发明的方法和器械在它们范围内包含在例如疾病感染地点的核酸取样。作为实例，可考虑发生病毒性疾病的病原体(如引起禽流感、严重急性呼吸道综合症(SARS)、所谓的“猪流感”和口蹄疫的那些)感染的地点。在这些地点，快速鉴定引起感染的疾病菌株是极其重要的。
本发明的第二个方面提供一种用于扩增核酸的方法，所述方法包括根据本发明第一个方面制备反应器，和在所述反应器内进行核酸扩增反应。所述反应器一经制备，且因此容纳含有进行核酸扩增反应用的试剂的反应混合物而且还容纳含核酸物质时，则根据反应类型以通常的方式进行核酸扩增反应。因此，例如，PCR可以在适合的温度循环器内进行。
如上所指出的，令人惊奇地，发现在进一步的核酸扩增反应中可以再次使用所述取样装置或至少其粘附有含核酸物质的部件，原因是足够的所述物质保留到至少进一步的核酸扩增反应。因此，本发明的第三个方面提供一种用于扩增核酸的方法，所述方法包括实施本发明第一个方面的方法，移除取样装置(或其粘附有含核酸物质的部件)并将其放入进一步的反应器，和在进一步的反应器中进行核酸扩增反应。在本发明第三个方面的一个实施方案中，移除取样装置，如果需要，用溶液进行洗涤以在放入进一步反应器前去除所有第一反应混合物。如果检测新目标序列的不同探针标记有不同颜色的荧光团，可不必对取样装置进行洗涤，原因是第一反应的任何残留物对其后的分析来说都是“不可见的”。
在本发明第二个方面的另一个实施方案中，在进行第一扩增反应后从反应器中移除反应混合物，在反应器中原位洗涤所述取样装置或其部件，然后将第二反应混合物添加到反应器中。在进一步的实施方案中，取样装置或其部件可含有磁性物质，通过施加适当的磁场可获得反应器内的保留。
通常可基本上如本发明第一个方面所述制备进一步的反应器。尽管通常可不必进行进一步的核酸扩增反应，但是本发明允许进行该进一步的核酸扩增反应，并且在进行进一步确定或独立的核酸扩增反应的情况下，其可具有特殊的用途。该进一步的核酸扩增反应在第一核酸扩增反应后的一段时间内发生。
本发明的第四个方面提供一种扩增核酸的方法，所述核酸来自诸如哺乳动物或植物的高级真核生物的核酸来源，所述方法包括：
(a)使取样装置与诸如哺乳动物或植物的高级真核生物来源核酸接触，以致在所述接触后含诸如哺乳动物或植物的高级真核生物核酸的物质粘附到所述取样装置的至少部件上，其中所述取样装置或其粘附有所述含核酸物质的部件由任何适合的聚合物材料制成；
(b)将所述取样装置或其粘附有含核酸物质的部件引入容纳进行核酸扩增反应用反应混合物的反应器，无需对所述含核酸物质进行任何预先处理；和
(c)进行核酸扩增反应。
聚合物材料是与核酸来源接触(例如通过摩擦)后含核酸物质粘附到其上的材料。聚合物材料也是当存在于反应混合物中时不防碍或基本上不干扰核酸扩增反应的材料。可以确定聚合物是否是适合的聚合物，例如如实施例中所述。特别是，实施例2中记载的方案可用于测定聚合物的适宜性，或者可使用实施例11的方案，但其中PMMA被检验适宜性的另一个聚合物替换并且使用D16探针。
优选地，聚合物材料是下述任何材料：玻璃、环烯烃共聚物(如Topas)、丙烯酸树脂(如PMMA)、结晶聚苯乙烯、聚丙烯、HDPE、聚碳酸酯、中抗冲聚苯乙烯、PVC、液晶聚合物30%、反式ABS、乙缩醛共聚物、聚酯、聚醚酰亚胺、聚乙烯、尼龙、聚醚聚氨酯、苯乙烯丁二烯嵌段共聚物、聚丙烯无规共聚物、乙烯-乙酸乙烯共聚物硅氧烷(如PDMS)和热塑弹性体(如山都平)。
适宜地，如上文所讨论的，诸如哺乳动物或植物的高级真核生物的核酸来源基本上是干的。适宜地，取样装置或其粘附有所述含核酸物质的部件在步骤(c)中保留于反应器中。
本发明的第五个方面提供了一种用于扩增核酸的方法，所述核酸来自诸如哺乳动物或植物的高级真核生物的核酸来源，所述方法包括：
(a)使取样装置与诸如哺乳动物或植物的高级真核生物的核酸来源接触，以致在所述接触后含诸如哺乳动物或植物的高级真核生物核酸的物质粘附到所述取样装置的至少部件上，其中所述诸如哺乳动物或植物的高级真核生物的核酸来源基本上是干的；
(b)将取样装置或其粘附有所述含核酸物质的部件引入容纳进行核酸扩增反应用反应混合物的反应器，无需对所述含核酸物质进行任何预先处理；和
(c)进行核酸扩增反应。
适宜地，取样装置或其粘附有含核酸物质的部件由以下任何材料制成：玻璃、环烯烃共聚物(如Topas)、丙烯酸树脂(如PMMA)、结晶聚苯乙烯、聚丙烯、HDPE、聚碳酸酯、中抗冲聚苯乙烯、PVC、液晶聚合物30%、反式ABS、乙缩醛共聚物、聚酯、聚醚酰亚胺、聚乙烯、尼龙、聚醚聚氨酯、苯乙烯丁二烯嵌段共聚物、聚丙烯无规共聚物、乙烯-乙酸乙烯共聚物硅氧烷(如PDMS)和热塑弹性体(如山都平)。
适宜地，取样装置或其粘附有所述含核酸物质的部件在步骤(c)中保留于反应器中。
通常，本发明的第四或第五个方面中的反应混合物基本上无离液序列高的试剂和/或基本上无细胞裂解试剂(参见上文关于本发明第一个方面的讨论)。
本发明的第六个方面提供了一种制备数据载体的方法，所述数据载体记录与含核酸物质的核酸相关的基因型，所述方法包括实施本发明第二、第四或第五个方面的方法，测定所述含核酸物质内核酸的基因型并在数据载体上记录所述基因型。所述基因型可与SNP(单核苷酸多态性)有关或其可与STR(短串联重复序列)有关。基因型可以是“DNA指纹”。数据载体可以是任何数据载体，但通常是电子数据载体，如计算机磁盘或闪存。可以理解的是，数据载体及其上的数据可用于对所分析的样品的核酸基因型与其他样品的基因型、或与数据库内储存的基因型进行比较。这对本发明的犯罪检测和法律执行实施方案特别有用。
本发明的第七个方面提供一种核酸取样装置的用途，所述核酸取样装置的用途是从诸如哺乳动物或植物的高级真核生物的核酸来源获得核酸，然后将所述诸如哺乳动物或植物的高级真核生物核酸来源引入含有核酸扩增反应混合物的反应器，无需对所述核酸来源预先处理，其中所述诸如哺乳动物或植物的高级真核生物的核酸来源基本上是干的。优选地，核酸粘附到取样装置或其部件上，所述取样装置或其粘附有所述含核酸物质的部件由以下任何材料制成：玻璃、环烯烃共聚物(如Topas)、丙烯酸树脂(如PMMA)、结晶聚苯乙烯、聚丙烯、HDPE、聚碳酸酯、中抗冲聚苯乙烯、PVC、液晶聚合物30%、反式ABS、乙缩醛共聚物、聚酯、聚醚酰亚胺、聚乙烯、尼龙、聚醚聚氨酯、苯乙烯丁二烯嵌段共聚物、聚丙烯无规共聚物、乙烯-乙酸乙烯共聚物、硅氧烷(如PDMS)和热塑弹性体(如山都平)。适宜地，在核酸扩增反应过程中核酸取样装置或其粘附有所述含核酸物质的部件保留于反应器中。
本发明的第八个方面提供一种试剂盒，所述试剂盒包含：(a)反应器，所述反应器容纳进行核酸扩增反应用的反应混合物，所述反应器是封闭的；和(b)取样装置，所述取样装置与含核酸物质接触后，所述含核酸物质可粘附到所述取样装置的至少部件上，其中，所述取样装置或其粘附有所述含核酸物质的部件可被引入所述反应器中，且可在取样装置或其粘附有所述含核酸物质的部件存在下在所述反应器内进行核酸扩增反应。反应器、反应混合物、取样装置和含核酸物质等可为本发明前述各方面中记载的任一种。这些特征的参数与本发明此方面中的相同。
通常，所述试剂盒含有连接在一起的多个反应器，如上文本发明第一个方面中所讨论的。通常，可将取样装置或其可粘附有所述含核酸物质的部件构造成使所述含核酸物质分布于多个反应器之中，如上文本发明第一个方面中所讨论的。
适宜地，在有些实施方案中，当初始封盖被移除时，取样装置或其可粘附有所述含核酸物质的部件设置有反应器封盖。优选地，取样装置或其可粘附有所述含核酸物质的部件由以下任何材料制成：玻璃、环烯烃共聚物(如Topas)、丙烯酸树脂(如PMMA)、结晶聚苯乙烯、聚丙烯、HDPE、聚碳酸酯、中抗冲聚苯乙烯、PVC、液晶聚合物30%、反式ABS、乙缩醛共聚物、聚酯、聚醚酰亚胺、聚乙烯、尼龙、聚醚聚氨酯、苯乙烯丁二烯嵌段共聚物、聚丙烯无规共聚物、乙烯-乙酸乙烯共聚物硅氧烷(如PDMS)和热塑弹性体(如山都平)。适宜地，反应器中存在的反应混合物是本发明前述各方面中记载的任一种反应混合物。
根据本发明的第九个方面，提供一种核酸取样器械，其包括至少一个支撑核酸样品用的探头；和操纵器，所述操纵器可附接到所述探头以允许操纵所述探头，所述探头与所述操纵器是可分离的。
任选地，所述器械包括探头和用于容纳一种或多种试剂和核酸样品的容器，所述容器包括可封闭的开口，操纵器操作导致或允许探头经由开口插入从而在容器中定位样品；所述探头包括封罩，所述封罩在容器中样品位置上关闭所述容器使含核酸物质不漏出或进入。
本发明器械进一步任选的方面在从属权利要求中有所限定。特别地，在本发明范围内的任选配置中，所述器械包括用于容纳一种或多种试剂和核酸样品的容器，所述容器包括可封闭的开口，操纵器操作导致或允许探头经由开口插入从而在容器中定位样品。
参照以下非限定性实施例、实施方案和附图，将对本发明做出更为详细的描述。在附图中：
图1示出了由SGMPlus(AppliedBiosystems)分析获得的一系列用于转移来自口部拭子的口腔细胞和DNA的塑料“珠粒”的峰高。塑料珠粒(以一式三份进行分析)是：1)Topas、2)丙烯酸树脂、3)结晶聚苯乙烯、4)聚丙烯、5)HDPE、6)聚碳酸酯、7)中抗冲聚苯乙烯、8)PVC、9)聚乙烯-聚乙二醇嵌段共聚物、10)乙烯丙烯酸共聚物、11)乙烯醇乙烯共聚物、12)乙烯-乙酸乙烯共聚物共聚物接枝马来酸酐、13)液晶聚合物30%、14)反式ABS、15)环烯烃共聚物、Topas16)乙缩醛共聚物、17)聚酯、18)聚醚酰亚胺、19)聚乙烯、20)尼龙、21)聚醚聚氨酯、22)苯乙烯丁二烯嵌段共聚物、23)聚丙烯无规共聚物和24)乙烯-乙酸乙烯共聚物。
图2示出了通过SGMPlus分析产生的一系列用于转移来自口部拭子的口腔细胞和DNA的塑料“珠粒”的峰值。塑料珠粒(以一式三份进行分析)是：1)Topas、2)丙烯酸树脂、3)结晶聚苯乙烯、4)聚丙烯、5)HDPE、6)聚碳酸酯、7)中抗冲聚苯乙烯、8)PVC、9)聚乙烯-聚乙二醇嵌段共聚物、10)乙烯丙烯酸共聚物、11)乙烯醇乙烯共聚物、12)乙烯-乙酸乙烯共聚物共聚物接枝马来酸酐、13)液晶聚合物30%、14)反式ABS、15)环烯烃共聚物、16)乙缩醛共聚物、17)聚酯、18)聚醚酰亚胺、19)聚乙烯、20)尼龙、21)聚醚聚氨酯、22)苯乙烯丁二烯嵌段共聚物、23)聚丙烯无规共聚物和24)乙烯-乙酸乙烯共聚物。如果全部目标DNA成功扩增，则应当产生21个DNA产物。
图3显示了D16S539HyBeacon试验产生的熔融峰数据，A)由PMMA使用摩擦法通过接触对织物上的血和对玻璃上的唾液取样得到的结果。B)由PDMS使用摩擦法对织物上的血、玻璃上的血、织物上的唾液和玻璃上的唾液取样得到的结果。C)由山都平(8281-75MED)再次使用摩擦动作对织物上的血、玻璃上的血、织物上的唾液和玻璃上的唾液取样得到的结果。
图4示出了由D16S539HyBeacon试验获得的熔融峰，A)在提取的DNA存在下由PMMA得到的结果。B)在提取的DNA存在下由PDMS得到的结果。C)在提取的DNA存在下由山都平(8281-75MED)得到的结果。较深的迹线代表提取的DNA对照。
图5示出了由D16S539试验获得的熔融峰，A)在表达的(expressed)口腔拭子存在下由PMMA得到的结果。B)在表达的口腔拭子存在下由PDMS得到的结果。C)在表达的口腔拭子存在下由山都平(8281-75MED)得到的结果。较深的迹线代表所述拭子对照。
图6示出了i)由D16S539试验获得的熔融峰。A)由PMMA使用摩擦法对玻璃上的唾液取样得到的结果。B)使用PDMS对玻璃上的唾液取样得到的结果。C)使用山都平(8281-75MED)对玻璃上的唾液取样得到的结果。
图7示出了由D18S51HyBeacon试验获得的熔融峰。从D16S539试验移除取样表面，轻柔洗涤，放入D18S51反应并扩增。A)由PMMA使用摩擦法对玻璃上的唾液取样得到的结果。B)使用PDMS对玻璃上的唾液取样得到的结果。C)由山都平(8281-75MED)在玻璃上的唾液上摩擦得到的结果。
图8示出了使用环介导等温扩增(LAMP)试验分析部分SLC6A4基因获得的A)扩增曲线和B)熔融峰。通过在玻璃上的干燥唾液污渍上摩擦PDMS获得样品。
图9示出了用乙醇通过索氏提取移除未结合的硅氧烷的PDMS的对比。
图10a-10d为本发明核酸取样器械第一实施方案的部件的侧视图(图10a和10d)、俯视图(图10b)和透视图(图10c)。
图11-16示出了本发明器械另一个实施方案的部件的透视图。
图17示出了图11-16配置的一个变体的透视图。
图18-20示出了本发明的进一步的实施方案的侧视图和横截面图，其中各取样探头可以从操纵器中喷射出。
图21-24显示了另一个配置，其中机械凸轮配置可用于使初始邻近的尖端部件在它们从操纵器喷射出前散布开(spreading)。
图25示出玻璃可用于从样品获得含核酸物质而不影响扩增反应。
图26示出为了对聚合物“DNA灭菌”而进行的UV照射对与样品接触后获得含核酸物质的能力和要进行的扩增没有任何影响。
图27是PMMA与KOH蚀刻的PMMA之间用于D16反应的比较。曲线图示出取自8个重复分析的平均熔融峰。
为了显示本发明原理的广泛适用性，在本说明书中，某些术语可互换使用。以下索引表总结了含义相同的术语：
术语1 术语2(含义相同)
反应器 容器
含核酸物质 核酸样品
取样装置 取样器械
此外，如上下文所允许，术语“封盖”和“密封件”在本文中通常可互换使用。
实施例1:与后续实施例有关的材料和方法
珠粒制备
从塑料供货商处(Sovereign;Slough,MatrixPlastics;Slough,EuroPlaz;Southminster)收集以下塑料的塑料颗粒：1)Topas、2)丙烯酸树脂、3)结晶聚苯乙烯、4)聚丙烯、5)HDPE、6)聚碳酸酯、7)中抗冲聚苯乙烯、8)PVC、9)聚乙烯-聚乙二醇嵌段共聚物、10)乙烯丙烯酸共聚物、11)乙烯醇乙烯共聚物和12)乙烯-乙酸乙烯共聚物共聚物接枝马来酸酐、13)液晶聚合物30%、14)反式ABS、15)环烯烃共聚物、16)乙缩醛共聚物、17)聚酯、18)聚醚酰亚胺、19)聚乙烯、20)尼龙、21)聚醚聚氨酯、22)苯乙烯丁二烯嵌段共聚物、23)聚丙烯无规共聚物和24)乙烯-乙酸乙烯共聚物。这些材料以未经改性的方式使用，在后面实验中用解剖刀切割以制造尺寸约1.5mm3的尺寸类似的塑料碎块。所有塑料均用UV放射线在257nm下照射以去除可能的污染性DNA。表1提供了塑料的简要描述。
表1：所用塑料性质的总结
取样方法
多种方法用于评价未纯化样品分析用的各种塑料的适宜性：
1)涡旋法：使用omniswab拭子(WhatmanLtd)取得新鲜口腔刮片。将UV洁净的塑料样品与拭子一起放入6ml灭菌的bijou管中且在高速下用涡旋混合10秒，以使塑料样品与含核酸物质接触。然后使用灭菌的细尖镊子将塑料转移到反应器中。
2)摩擦法：使用一套洁净细尖镊子夹持住UV洁净的塑料样品。然后用这些对着样品(例如，织物/玻璃上干燥的血污渍、织物/玻璃上干燥的唾液污渍等)摩擦塑料的一个表面，以使塑料与含核酸物质接触。然后将塑料取样表面转移至反应器，使摩擦表面朝下进入反应混合物。在两种方法中塑料表面均留置在原位。
总结
用试剂盒(AppliedBiosystems)进行STR目标序列的扩增和鉴定(interrogation)。试剂盒含有十种STR(D16S539、D18S51、D19S433、D2S1338、D21S11、D3S1358、D8S1179、FGA、TH01和vWA)和Amelogenin性别检验。按照试剂盒用户手册的记载使用试剂盒，但使用一半体积的反应。半体积的反应混合物对每个样品使用以下的反应设置：10.5μlAmpFlSTRPCR反应混合物、5.5μlAmpFlSTRSGM和0.5μl引物系列。将15μl反应混合物和10μl水添加到各样品，总反应混合物体积为25μl。
使用AppliedBiosystems9700仪器(AppliedBiosystems)进行目标序列的扩增和鉴定。初始变性激活热启动酶(95°C11分钟)后，用28次循环扩增目标序列，所述循环包括变性(95°C1分钟)、引物退火(59°C1分钟)和产物延伸(72°C1分钟)。扩增后，进行产物腺苷酰化(60°C45分钟)。随后在4°C下保留样品直至需要进一步处理。
使用AppliedBiosystems3100(AppliedBiosystems)进行目标序列的扩增和鉴定。为了分析，将1μl扩增产物添加到8.9μlHi-Di甲酰胺(AppliedBiosystems)和0.1μlGenescan500ROX分子量标准中。将样品注射到36cm毛细管阵列，在3kV下作用10秒。使用GenemapperID分析样品。
使用HyBeacon探针进行STR分析
基于French等人2008(参考文献1)公开的方法，利用荧光寡核苷酸探针、非荧光阻断寡核苷酸和熔融曲线分析进行STR目标序列的扩增和鉴定。
PCR体积为20μl，包括1xSpeedSTAR缓冲液I(TaKaRa)或1个单位的Phire缓冲液(Finnzymes)、1个单位的SpeedSTAR聚合酶(TaKaRa)或1个单位的Phire聚合酶(Finnzymes)、3%BSA(Roche)、0.5%Tween-20(Sigma)和1mMdNTP(每种0.25mM–GEHealthcare,Amersham,UK)。根据进行的分析(即，D16S539或D18S51)，对于适当的试验，使用1μM正向引物、0.1μM反向引物和75nM探针。D16S539和D18S51分析还分别含有1μM和375nM非荧光阻断剂。利用不对称PCR产生过量的目标链，以使探针杂交相对于扩增序列退火占优势(参见WO2007/010268A2)。
使用Rotor-Gene6000(CorbettResearch)和CFX96(Bio-Rad)仪器进行目标序列的扩增和鉴定。初始变性激活热启动酶(95°C1分钟)后，用50次循环扩增目标序列，所述循环包括变性(95°C1秒)、引物退火(64°C4秒)和产物延伸(72°C4秒)。扩增后，在熔融曲线分析前使反应物变性(95°C1分钟)和冷却(20°C2分钟)。
将反应物从20°C加热到70°C，以增量0.5°C和滞留时间5秒在各温度下获取荧光，以此进行熔融曲线分析。以荧光相对于温度的负导数(-dF/dT，在y轴上)对温度(x轴)作曲线构建熔融峰。
SLC6A4基因分析和所用的一系列寡核苷酸
基于如MasaomiIwasaki,ToshihiroYonekawa等人(2003)2所记载的环介导等温扩增(LAMP)法，进行多形态SLC6A4基因目标序列的扩增和检测。使用嵌入荧光染料EvaGreen通过熔融曲线分析来实时检测目标序列扩增。
PCR体积为25μl，包括1x等温Master混合物(Genesys)、0.8μM内引物、0.2μM外引物、0.2μM环引物。
使用CFX96(Bio-Rad)仪器进行目标序列的扩增和鉴定。通过使用CFX96仪器(Bio-Rad)，每30秒获取一次荧光，在59°C下温育样品30分钟来扩增目标序列。扩增后，在熔融曲线分析前使反应物变性(95°C3分钟)。
通过将反应物从40°C加热到90°C，以0.5°C增量和5秒滞留时间在各温度下于FAM通道获取荧光，进行熔融曲线分析。以荧光相对于温度的负导数(-dF/dT，在y轴上)对温度(x轴)作曲线构建熔融峰。
索氏提取的PDMS表面的产生和参考方法
在索氏提取器内用乙醇清除PDMS表面未结合的硅氧烷。所用方法基于Thibault等人(2007)3记载的方法。
为检验未结合的硅氧烷的作用，将约20个PDMS表面放入100ml索氏仪器内的多孔套管中。将索氏仪器放入装有180ml无水乙醇的250ml的烧杯中。将索氏仪器设置为每小时回流约8次，共12小时。对材料和试剂不进行称重，原因是提取的硅氧烷对实验没有进一步的意义。如上文所述，使用没有未结合的硅氧烷的表面。
KOH改性表面的生成
通过在85°C下于1MKOH(氢氧化钾)内搅拌表面24小时来KOH蚀刻PMMA表面。为检验是否已发生改性，在0.1%孔雀绿的水溶液中摇动表面(改性的和天然的)。温育10分钟后，去除上清液并且用水充分洗涤珠粒。由于改性珠粒表面具有羧基，带正电的染料得以保留，而天然的珠粒未结合任何染料。成功改性的珠粒显示绿色。
实施例2：生成擦拭装置的塑料材料的评价
将不同尺寸形状的各种塑料(如图1所示)珠粒与口部拭子(Omniswabs,Whatman)一起短暂涡旋，然后放入被设计用于检测10个不同的短串联重复序列类型和amelogenin性别检验( AppliedBiosystems)的商购PCR反应试剂盒中。在半体积25μL反应中，反应利用了厂商推荐的循环条件。使用AppliedBiosystems3100仪器通过毛细管电泳分离所产生的PCR产物。图1说明某些塑料(Topas、丙烯酸树脂、结晶聚苯乙烯、聚丙烯、HDPE、聚碳酸酯、中抗冲聚苯乙烯、PVC、液晶聚合物30%、反式ABS、环烯烃共聚物、乙缩醛共聚物、聚酯、聚醚酰亚胺、聚乙烯、尼龙、聚醚聚氨酯、苯乙烯丁二烯嵌段共聚物、聚丙烯无规共聚物和乙烯-乙酸乙烯共聚物)已采集、转移口部拭子的细胞并适合地使之可用于获取DNA。在本技术的标准应用中，认为大于25rfu的峰高反映了相对于背景(CustodianDocument；CUSTP-GS-003)的实际PCR产物。可以看出，与多种塑料接触能使检测水平显著。该研究中观察到有些塑料不能用(例如聚乙烯-聚乙二醇嵌段共聚物、乙烯丙烯酸共聚物、乙烯醇乙烯共聚物、乙烯-乙酸乙烯共聚物共聚物接枝马来酸酐)，表明观察到的阳性结果不能归因于从拭子到塑料的细胞机械剪切的假象。数据来自由一个个体获得的三个独立样品。所有来自塑料材料的扩增产物为拭子供体特异性的。成功检测了350个碱基对以上的DNA片段(由供体的STR类型决定)，表明当塑料材料留置在反应管中时不抑制PCR。图1说明一系列塑料材料适于吸附生物物质且其效率根据材料类型而不同。
实施例3：生成擦拭装置用的塑料材料的评价
实验条件如实施例2所示。该研究检验了10个不同的短串联重复序列PCR反应和amelogenin基因位点在多路反应中是否全部被检测到。如果所有目标序列均成功扩增，则应该检测到21个DNA产物。图2说明一系列塑料材料适于吸附生物物质且其效率根据材料类型而不同。最有效的是Topas、丙烯酸树脂、结晶聚苯乙烯、聚丙烯、HDPE、聚碳酸酯、中抗冲聚苯乙烯、PVC、液晶聚合物30%、反式ABS、环烯烃共聚物、乙缩醛共聚物、聚酯、聚醚酰亚胺、聚乙烯、尼龙、聚醚聚氨酯、苯乙烯丁二烯嵌段共聚物、聚丙烯无规共聚物和乙烯-乙酸乙烯共聚物。最差的是聚乙烯-聚乙二醇嵌段共聚物、乙烯丙烯酸共聚物、乙烯醇乙烯共聚物、乙烯-乙酸乙烯共聚物共聚物接枝马来酸酐。
实施例4：用于HyBeacon分析中的塑料、硅酮、热塑弹性体(TPE)和玻璃材料的评价
用洁净灭菌的镊子将相同尺寸的PMMA(丙烯酸树脂)、PDMS(硅酮)和山都平(TPE)表面在带有血和唾液污渍的玻璃和织物上摩擦。如第二部分对取样细节所述，随后将样品放入包含称为D16S539的短串联重复序列基因位点(D16S539)的单路PCR扩增的PCR反应中。该分析(与French等人(2008)1记载的类似)是均一反应，不仅包含这些基因位点的PCR引物，还包含独特的荧光寡核苷酸探针(用荧光素dT标记的D16S539探针)和竞争性“阻断剂”寡核苷酸，上文对此有详细记载。PCR扩增后，接着进行一个的温度范围(公知的“熔融曲线”)内(参见图中的x轴数值范围)的反应，对荧光变化率作曲线从而显示结合的探针与其目标序列分离。结果显示塑料、硅酮和TPE表面提供了充分的细胞接触以使样品直接放入反应，不仅支持了正确的PCR扩增，而且还不影响随后的杂交和荧光分析。仅D16S539STR重复“类型”11有望在D16S539FAM荧光通道内的分析中观察到。
该实验使用不同于图1和2中所记载的PCR引物和温度循环条件，而且包括这些实验中不存在的探针和阻断寡核苷酸，因此说明DNA结合到塑料、硅酮和TPE接触表面不具有PCR反应特异性，并且对荧光检测和发生的复杂杂交程序不具抑制性(参考所示仅为输入样品的对照DNA)，如图3所示。
在干燥的口腔拭子上摩擦未改性的1.5mm玻璃珠粒。图25中示出了DNA对照和擦拭结果。11和14所示的峰为D16S539分型分析的STR类型。
实施例5：塑料、硅酮和热塑弹性体的评价：对扩增效率的影响
将洁净的PMMA、PDMS和山都平表面放入包含如上述材料和方法部分所记载的D16S539HyBeacon分析的反应器中。将2ng提取的DNA添加到容纳有取样表面的各反应中。将这些与以2ng提取的基因组DNA为模板而无取样表面的对照D16S539HyBeacon分析相比较。仅D16S539STR重复“类型”11有望在D16S539FAM荧光通道内的分析中观察到。在对照反应与PDMS和PMMA介导的反应之间未观察到差别。在山都平用作转移介质的反应中观察到峰高减少。这可能是因为材料不透明阻断荧光检测。如图4所示，PMMA和PDMS不影响D16S539HyBeacon分析效率。山都平降低了所得信号的强度。
实施例6：塑料、硅酮和热塑弹性体的评价：对未提取的生物样品中细胞裂解效率的影响
将洁净的PMMA、PDMS和山都平表面放入包含如上述材料和方法部分所记载的D16S539HyBeacon分析的反应器中。通过在500μl水稀释剂中涡旋来表达口腔拭子(Omniswab,Whatman)。将2μl表达的拭子与2ng没有取样表面的提取的DNA相比较。仅“类型”11有望在D16S539FAM荧光通道内的分析中观察到。在对照反应与PDMS和PMMA反应之间观察到非常小的差别。使用山都平转移产生的产物质量降低。这可能是因为材料不透明。如图5所示，PMMA和PDMS不改变D16S539HyBeacon分析中未提取的细胞物质的扩增。山都平降低了所得信号的强度。这进一步支持了与不透明表面有关的观点。
实施例7：生物物质与用于多重反应的塑料、硅酮和热塑弹性体结合的评价
将洁净的PMMA、PDMS和山都平表面在洁净且以前未接触过的载玻片上的干燥唾液污渍上摩擦。使用如上述材料和方法部分所记载的D16S539HyBeacon分析来分析样品。这些样品的结果如图6所示。扩增后，从反应器中移除并丢弃试剂混合物，然后用组织培养水通过吸液管抽吸轻柔洗涤样品表面以去除任何残留的D16S539分析组分和扩增产物。使表面变干然后转移到洁净的反应器中。然后将洁净的样品表面用作如上文材料和方法部分中所记载的D18S51HyBeacon分析的模板，用以测定保持在表面上的充足生物材料是否促进第二个独立的目标序列的分析。D18S51目标序列位于与D16S539目标序列不同的染色体上，D18S51探针不会检测到扩增的D16S539目标序列，而D16S539试剂也不会扩增D18S51目标序列。D18S51试验还使用与D16S539探针不同的染料标记，确保两个试验彼此完全独立。
图7示出转移的表面有足够的生物材料吸附在取样表面以允许扩增第二个目标序列。仅“类型”11有望在D16S539FAM荧光通道内的分析中观察到，以及仅“类型”19有望在D18S51TAMRA荧光通道内的分析中观察到。D16S539和D18S51试验得到的熔融峰Tm相当不同。
实施例8：扩增的初始95℃变性步骤对促进细胞物质可用于扩增的作用的评价
在沾污有唾液样品的载玻片上摩擦洁净的PDMS表面，如上文材料和方法部分所述。用设计为扩增和检测SLC6A4目标序列的环介导等温扩增(LAMP,Eiken)试验以一式三份分析PDMS表面。该分析在59°C下温育等温扩增的扩增试剂30分钟。用嵌入染料检测扩增产物。将三个PDMS样品与作为对照的来自相同供体的提取的DNA样品相比较。图8所示的荧光熔融峰显示了由塑料表面进行了成功的目标扩增。
这表明95°C变性步骤对结合到PDMS表面的细胞物质的扩增不是必需的。
实施例9：PDMS内未结合的硅氧烷对细胞物质结合的作用的评价
Thibault等人(2007)3的文章提到短链硅氧烷和未聚合的硅氧烷作为DNA结合PDMS的可能机理。将洁净的PDMS表面放入索氏仪器且用乙醇以每小时冲洗约8次的速率回流12小时。索氏提取的PDMS表面用无DNA的灭菌镊子夹持且使其摩擦以前未接触的洁净载玻片上的干燥唾液污渍。对干燥血污渍也进行这样的操作，使其摩擦以前未接触的洁净载玻片上的干燥血污渍。将这些与天然的PDMS表面相比较。所有样品转移到PCR微管并用D16S539HyBeacon分析来扩增。所有方法均如上文材料和方法部分所述。供体样品有望产生如图9所示的观察到的等位基因11。天然和非天然PDMS表面获得的结果之间无显著差异。这显示未结合的硅氧烷不是使生物材料吸附到PDMS表面的唯一机理。
实施例10：未包括在上述范例中的其他成功实验的概况
表2详细记载了所进行的上述各图没有包含的其他实验。
实施例11：用于DNA灭菌的UV照射对取样及随后的扩增没有影响
用洁净灭菌的夹持器使经不同UV处理的1.64mmPMMA(丙烯酸树脂)珠粒在玻璃上的唾液污渍上摩擦，如实施例1取样方法第二部分中所述。随后将样品放入包含称为D16(D16S539)的STR基因位点的单路PCR扩增的PCR反应中。该分析(与French等人(2008)(参考文献1)记载的类似)是均一反应，不仅包含这些基因位点的PCR引物，还包含独特的荧光寡核苷酸探针(用FAM标记的D16探针)和竞争性“阻断剂”寡核苷酸。PCR扩增后，接着进行一个温度范围内(参见图26的x轴数值范围)的反应，对荧光变化率作曲线从而显示存在成功的探针检测。结果显示PMMA的UV处理对该材料采集生物物质的能力影响非常小。
图26示出了4次重复试验的未经UV照射的PMMA(平均浓度)、UV照射30分钟(平均30min)的PMMA和UV照射超过24小时(平均24小时)的PMMA以及由2.5ngDNA(阳性)获得的平均熔融峰。
实施例12：KOH改性对PMMA表面的影响
用洁净灭菌的夹持器使KOH改性的和未改性的PMMA表面在玻璃上的唾液污渍上摩擦。随后将样品放入包含STR基因位点D16S539的基于Phire的PCR反应中。该分析(与French等人(2008)记载的类似)是均一反应，不仅包含该基因位点的PCR引物，还包含独特的荧光寡核苷酸探针(用FAM标记的D16探针)和竞争性“阻断剂”寡核苷酸。PCR扩增后，接着进行一个温度范围内(参见图27的x轴数值范围)的反应，对荧光变化率作曲线从而显示存在成功的探针检测。结果显示PMMA的KOH处理导致所得峰高轻微降低。
本发明的装置
参考图10a到图10d，根据本发明的核酸取样装置11、12、13的第一实施例包括：作为主要部件的一组容器11，这些容器11中的一个在图10d中可以看到；多个探头元件12，其数量对应于容器11的数量；以及操纵器，呈外观可变化的把手13的形式。图10a到图10d的取样装置11、12、13和以下描述的其它取样装置适于并旨在实现本文所描述和限定的方法和用途。
图10a到图10d的装置包括一组（在优选的实施例中示出的）四个中空、直立、细长的容器11，每个容器11均在其上端敞口以限定各自的开口14。
根据以下描述的配置，容器中的开口14是可密封的。多个容器11优选彼此相同，并且优选地在框架（未示出）中如所示那样被支撑为一排。支撑容器11的框架的优选尺寸是使得其能够容易用手拿、能够存放在公文包中以及能够手动地常规操作。
在本发明的范围内的另一配置中，容器11可设置为正方形或其它多边形的形式、设置为非直线的形式、或者设置为圆形或椭圆形的形式。
容器11可由聚合物制造，或者至少其内表面上布满聚合物，所述聚合物对于核酸以及用于上述放大反应的试剂而言呈惰性，使得容器11不会影响其中的核酸或放大反应。该框架由轻质的材料（如聚合物）、轻金属合金或不与容器11的材料反应的天然存在的材料制造。
在替代方案中，该框架可由与容器相同的材料制成并且可与其同时形成。
因此，在本发明的优选实施例中，容器11可固定到框架或者与框架一体地形成，使得框架和容器一起使用和废弃。在一些情况下，这样的配置可在样本集的标记、样本的可追溯性以及研究活动完成后对样本的处理或销毁进行证明等方面提供益处。
在本发明的又一实施例中，如图10d中示出的，框架可以被去掉，并且容器11以“单独”的方式使用。
如所陈述的图10a到图10d的装置包括多个细长的探头元件12a-12d，它们被固定到细长把手13并且由细长把手13支撑。
图10a示出了用于核酸取样的装置在开始使用时的探头元件12和把手13的结构。
把手13包括呈细长的四分体形式的四个（在示出的实施例中为四个，尽管在本发明的范围内可以是其它数量）把手部13a、13b、13c、13d。
每个四分体13a-13d沿着大致平行于探头/把手组合体12、13的伸长方向而延伸的界面接合至少一个相邻的四分体。这些接合处由四分体的邻接表面15限定，这些四分体形成有匹配的定位销15a与凹处15b的组合体，所述组合体允许四分体13a-13d可拆开地固定在一起。结果，当装配在一起时，四分体限定圆柱形把手13，该把手13可分离为四个不同的、圆形段截面的把手部13a-13d。
在本发明的范围内的另一配置中，把手段能够借助所谓的“活动铰接件（livinghinges）”（即，四分体的材料的铰接件足够薄而呈柔性的和可选择地易碎的）连接。
四分体13a-13d中的每一个的一个面是凸曲的。在每种情况中，该面位于四分体的接合组的外部，使得当被连接在一起时，它们共同地限定圆截面的把手13。
从每个四分体13a-13d的所用下端中突出的是呈刚性的、锥形的、细长杆的形式的各个探头元件12a、12b、12c、12d。
当四分体13a-13d被连接在一起时，这些杆延伸成朝向彼此汇聚。当四分体采取图10a和图10b中可见的结构时，杆的自由端极为靠近彼此而终止。在该结构中，元件12a、12b、12c、12d的自由端构成拼合探头12。
当把手被如此构造时，由杆12a、12b、12c、12d的自由端限定的拼合探头12可同时接触核酸源。这可通过简单地手动抓握和操纵四分体13a-13d所限定的把手13来实现。探头元件12a、12b、12c、12d的自由端可包括例如衬垫或其它突出物，它们彼此邻接以限定用于触碰核酸的呈基本连续的接合表面的形式的拼合尖端。
该接触使得自由端被大致均匀地涂覆核酸材料。为了促使核酸粘附到探头元件12a-12d的自由端，这些自由端可由在此讨论的、适于实现该目标的任何材料制成、被涂覆或者制成尖端。
探头/把手组合体12、13以图10a、图10b中示出的结构提供。用户抓握把手13，并且将其用作操纵器以便使自由端所限定的探头12的尖端接触或者进入包含核酸的材料中，而不会存在用户的DNA接触探头元件的严重风险。由于元件12a-12d的自由端选择的材料，以及根据如这里所描述或所限定的本发明的原理，这导致大致等量的携带核酸的材料粘附到每个自由端。
如上所述那样可选择地支撑在框架中的容器11可以被供给包括弹性可变形的塞子、可剥离的金属箔封盖或者可以被去除以允许进入容器11的内部的相似封盖，从而密封其中的开口14。
容器11借助塞子或其它密封类型将实现核酸放大反应所需要的试剂保留在其内部，例如但不限于在此讨论的类型。在探头的自由端接触核酸材料以后，将四分体13a-13d固定成其连接结构的保持装置或定位装置如图10c所示那样被拆开。结果，四分体（其单独的示例在图10d中可见）可彼此分离而采取图10c和图10d中所示的释放结构。
这种变形可通过手动操作四分体来实现，而不需要用户触碰探头。因此，用户的DNA接触自由端的机会几乎是零。
当四分体13a-13d采取图10c和图10d的分开的结构时，探头元件12彼此隔开。
因此，概括而言，图10的装置包括多个探头元件12a-12d，它们在邻接结构与相互分开的结构之间一个相对于另一个可移动，每个探头元件12a、12b、12c、12d均包括尖端部件，当探头元件采取该邻近的结构时，该尖端部件与其它尖端部件组合而限定用于接触含核酸材料的拼合尖端。
接着，在去除或打开了以上描述的一般类型的封盖以后，把手四分体13a-13d可用于操纵各自的探头元件12a-12d朝向各自的容器11中的开口14。
在该配置中，探头元件12a-12d可以经由各自的开口14a-14d而被推入到容器的内部中。
在其远离所附接的探头元件的末端处，每个四分体13a-13d被形成为包括耳片17，其通常平行于四分体的伸长方向而延伸。耳片17可用于使通过手操纵探头元件12a-12d进入每个容器11所限定的内部空间中的精细操作更加便利。
探头元件12a-12d的每一个通过圆柱形密封件16固定到其关联的把手四分体13a-13d，根据探头元件/把手组合体的精确结构，该密封件16与其一体地形成或者例如采取环形卡圈的形式固定到其上。
每个开口14的截面是圆形的。每个密封件16的直径使得当所附接的探头元件12插入在容器11中的一个的内部时，密封件16紧紧地密封容器而防止液体进入或离开，尤其防止包含或载送核酸的液体进入或离开。结果，在每种情况下，粘附到探头元件12的核酸都被提供并放置成与其中的试剂接触。因此，例如在此讨论的类型的核酸放大反应于是发生。
通常，容器11由透明或者半透明的材料制造，或者可包括一个或多个透明或半透明的窗口。因此，例如使用光学设备来进行反应结果的光学评定。因此，框架16和/或容器11可借助这样的设备形成为适于使用的形状和尺寸。
现在，参照图11到图16，以立体图示出根据本发明的核酸取样装置21、22、23的另一实施例。
在图11中，四个容器21a、21b、21c、21d被形成为中空的截头锥构件，所述中空的截头锥构件从由聚合材料（该聚合材料对核酸呈惰性，即对其无影响）制成的刚性薄片24的所用下侧向下延伸。在本发明的优选实施例中，容器21a-21d通过将它们与薄片24共同模制而形成。
如所示的容器21a-21d被形成为邻近正方形薄片24的四个边角，尽管在本发明的范围内可以采取其它数量和样式的容器21；并且薄片24不必采用示出的大致正方形。
容器21a-21d能够以通过密封膜进行初始密封的形式来供应，该密封膜例如是对容器21a-21d的所用最上端处形成的开口27a-27d进行密封的金属箔。因此，容器可预密封地供给并且包含例如PCR或者其它放大试剂，使得确保该试剂洁净直到需要使用该装置。此时，可以将存在的金属箔从薄片24剥去，从而打开以下描述的探头元件22a、22b、22c、22d插入到其中的孔。
探头元件22a-22d被形成为由例如在此讨论的材料中的一种制成的各个锥体或锥节段，根据本发明的原理，核酸粘附到其上。然而，在本发明的范围内的替代性配置中，锥体可涂覆有或者尖端涂有这样的材料，从而使核酸粘附到该装置的所需部分。此外，可提供除了锥体以外的其它形状或其一部分，尽管所示出的分段锥体被认为是特别适合作为探头元件。
探头元件22a-22d从由例如聚合材料（尤其是如以上解释的对核酸呈惰性的材料）制成的另一薄片28的一侧突出。事实上，通常薄片28可由与探头尖端相同的材料制成。
薄片28还是大致正方形，或者以类似四叶草的方式成形。使得各自的、大致圆形的凸缘围绕限定探头元件22a-22d的锥体的每一个的较宽的（上部）末端延伸。邻近每个探头元件的上端的凸缘28或其它薄片成形部被彼此接合以限定所描述的薄片形状。
如示出的，当薄片采取如图11到图16中示出的未受压结构时，四个探头元件全部沿基本上相同的方向从薄片28的相同侧延伸。
在远离探头元件22a-22d的一侧上，如初始使用的薄片28可拆开地固定到细长的操纵器23的一端。
操纵器23的尺寸形成为能够用手抓握，并且主要由刚性材料（如宽范围的塑料材料或金属合金）形成。不排除使用天然存在的材料或者玻璃作为操纵器23的主要结构材料，但是这些材料被认为不如所提到的塑料和金属那样方便形成和处理。
操纵器23包括细长的、中空的圆柱形柄30，其在一端变宽，薄片28在可拆开的附件31处固定到该变宽的一端。在相反的端部，柄29在抓握把手32中终止，抓握把手32可采用各种可能的形式。
在示出的实施例中，把手包括两个平行的平板32a、32b，它们横向于柄30的伸长方向而延伸，并且借助强化的主干构件32c而沿伸长方向彼此隔开。
柄30的上端在其相反的侧面包括一对设置在柄30的相反侧面上的凸缘26a、26b。
每个凸缘26a、26b限定面向内、端部开口的槽26c、26d。如图11中所示，各个槽26c、26d在柄30的相反侧上彼此相对。
从板32a的所用下侧延伸并且刚性地固定到其上的是伸长的柱塞29，其在柄30的中空内部的内侧滑动配合。通过抓握上平板32b，柱塞29在如图11中所示的部分暴露的位置与完全容纳在柄30的内部的另一位置之间可移动。
在后者的位置中，上平板32b可旋转以使得平行的下平板32a的端部进入由凸缘26a、26b限定的相对的槽中，从而防止柱塞29回复到部分暴露的位置，除非故意地旋转上平板32b以使下平板32a的端部离开前述的槽。
以下将描述该配置的目的。
薄片28被固定到附件31的末端边缘。附件31包括中空的内部，柱塞29的所用的下端在该中空的内部中沿平行于柄的伸长方向而延伸。在以上描述的部分暴露的位置与缩回位置之间运动的柱塞29充当用于使探头元件22a-22d在两种结构之间选择性地运动的启动器（activator），在其中一种结构中，远离薄片28的其尖端33连续地接触，在如图11到图16中所示的另一种结构中，探头元件彼此隔开与容器21a-21d的间距对应的间距。
柱塞29因薄片28的柔性而实现该效果。柱塞29处于将操纵器23固定到薄片28的初始条件中。如上所述，杆在中空柄30的内侧可移动。因此，杆朝向缩回位置的运动将柔性薄板28部分地抽吸到附件31内部的内侧。这进而抽吸尖端部件33朝向彼此以限定拼合尖端，其中尖端部件彼此接触并限定用于接触含核酸材料的单个区域。
杆沿着柄30内部的内侧的运动通常借助将板32b拉起而产生，虽然它也能以多种其它的方式实现。
例如，连接到杆的、如图17中示出的销30a可滑动地保持限制在狭槽30b中，以在柄30的外部上突出。用户可借助旋转帽32”移动该杆，该旋转帽32”借助包括旋转运动变直线运动的转变机构的配置结构而连接到该杆。在该杆沿着该狭槽（该狭槽因此容易地限定可检测的位置端）滑动的运动期间，该销使该杆停止。所描述的该杆的运动将薄片28抽吸到附件31的内部中，在图17中附件31呈锥形。
在图17（图17是图11到图16的装置的变体）中，把手32是大致柱形的并且形成为两个部分32’（接合到柄30）和32”（远离柄30）。把手部32”相对于部分32’可旋转并且被连接到柄30和把手32内侧的锁定机构。部分32”相对于部分32’的旋转选择性地启动锁定机构，从而如销30a处于狭槽30b中的位置所示例的那样将杆保持在其收回位置。
然而，不管采用的调节配置如何精确，优选地，在释放柱塞29时，薄片的恢复力导致探头元件22a-22d回复到图11到图16中示出的未受压的、相互隔开的配置，同时柱塞29沿柄30内侧的相反方向移动。
除了前述内容之外，为了将探头元件22a-22d选择性地保持在其邻接结构，可以提供可释放类的其它类型的锁定装置、夹持装置或者定位装置。这些锁定结构等通常将用于将柱塞29保持在对应于描述的邻接尖端部件的配置的位置中。
在其中心部中，薄片28包括通常沿与探头元件相同的方向延伸的（虽然延伸的距离较短）、呈圆形“鱼叉（harpoon）”元件34的形式的防拆封（tamper-evident）固定标签。该部件的目的和操作在以下描述。对于容器的本领域技术人员而言，能想到的其它形式的探头紧固件都处于本发明的范围内。
探头元件22a-22d能够从操纵器23脱离或以别的方式释放。例如，这可借助由易碎的部分限定的薄片28的凸缘与剩余部分之间的联合而实现。在示出的优选配置中，整个薄片28可借助选择性地可释放的夹持机构而在操纵器23上保持暂时限制。
如上所述，在图11到图16或者图17的装置的使用中，柱塞29通过如以上描述的启动器机构的操作而在柄30内侧初始移动，并且在对应于上述尖端部件的一起抽吸而被锁定（如果存在锁定装置的话）在其位置中。根据精确地配置选择，柱塞29的这种运动可以相对于柄30向上或向下。在图11的实施例中，柱塞的锁定是通过旋转上平板32b以使下平板32a的边缘进入槽26c、26d而实现。
柱塞29的运动使得探头元件22a-22d的尖端部件33a-33d采取其邻接结构，以大致呈现具有核酸接触表面的单个探头。
该表面通过利用把手32的操纵可以被插入到含核酸材料中或者抵靠含核酸材料揉擦。鉴于至少尖端部件33a-33d由这些材料制成，这导致核酸或含核酸材料大致均匀地粘附到由尖端部件33a-33d限定的拼合尖端。
在该过程以及事实上随后操作该装置期间，操作员抓住该抓握把手32。这允许操作员避免触碰探头元件，这些探头元件与把手32隔开柄30的长度。
拼合尖端对含核酸材料的揉擦或其它接触导致粘附到每个尖端部件33的核酸的数量接近相等。
一旦出现该情况，则释放柱塞29（例如通过释放锁定装置或者旋转如所描述的上平板32b）。薄片28的弹力导致探头元件采取未加压的、互相隔开的结构，其中它们可与容器21a-21d中的开口27a-27d对齐。该运动的产生是因为柱塞29沿着与导致尖端33的邻接构造的方向相反的方向移动。
在覆盖容器21的金属箔被去除（优选地通过剥除）之后，探头元件22a-22d被插入到容器21的内侧，使得支撑在探头元件上的核酸暴露于放大试剂。容器21a-21d是透明的或者半透明的，使得可以使用光学仪器来评定所导致的反应的结果。
探头元件22a-22d的锥形可选择为使得在插入容器21a-21d中时，探头元件22a-22d由于与容器的内壁表面的顶部区域过盈配合而密封这些容器。
当然，本领域技术人员能够想到的密封容器的其它方法也处于本发明的范围内。由于本发明的装置被期望在例如刑事司法案件（其中证据材料的完整性非常重要）发挥作用，所以确保有效的密封是非常重要的。
薄片24（容器21a-21d可选择地被模制在其中或以其它方式形成在其中）包括居中的、贯穿的孔。其目的是在探头元件22a-22d插入到容器21a-21d中时或之后容纳（也是可选择的）圆锥形的定位构件34。
定位构件34在薄片28的与探头元件22a-22d相同的一侧上显著地延伸，并且包括倾斜和底切的表面，这些表面允许其在探头元件22a-22d插入到容器中时以扣合的方式锁定在薄片24的孔中。
因此，定位构件34和孔的总体效果是提供探头元件在容器21a-21d中的“防拆封”固定。当本发明的装置需要充当例如刑事司法案件或者公众对疾病暴发的质询中的证据时，该特征是特别有益的。
如本发明的图10a-图10d的实施例的情况一样，在图11到图16的实施例中，容器优选地是半透明或者透明的，从而在不干扰容器内侧的状态的情况下便于放大结果的评定。容器内侧的材料被选择为对于准备在其中运送的试剂而言呈惰性。
图10到图16的实施例的全部特征在于探头以一种方式或另一方式在插入可选择的容器中时形成密封。因此，在DNA放大反应发生的同时，探头元件可保持连接到操纵器。
在以下描述的实施例中，探头元件与容器中的操纵器分开，并且用单独的封罩来密封后者。
图18到图20示出本发明的另一实施例的剖视图和侧向视图，该实施例在某种程度上依靠具有一定程度的弹性变形或“形状记忆”的探头元件。该特征允许探头元件在汇聚的配置与相互隔开的配置之间变形，该变形是上述实施例的特征。
在图18到图20中，探头元件52a-52d被收拢地保持在呈细长的外壳53的形式的操纵器的内侧。探头元件采取长度全部相同的细长杆的形式。这些杆中的每一个均可由所谓的形状记忆合金材料形成，并且每一个在自由端包括可去除的尖端部件54，该尖端部件54由适于核酸取样的在此说明的材料中的一种制成。图20示出了尖端部件54中的一个的放大的立体图。
在它们远离尖端部件的末端处，由于被夹持在外壳53的把手部56的内部中，所以探头元件以一捆固定在一起。
呈中空的、外壳53的圆筒形的鞘部57的形式的探头元件启动器被收拢地可滑动地保持在其上，以便沿着该捆探头元件52a-52d可移动。在供应的条件下，鞘部57覆盖探头元件52a-52d的大部分长度。在它的远离尖端部件54的末端，鞘部57包括呈环51的形式的环形的、可弹性变形的定位装置，该定位装置从其圆筒形壁向内伸入鞘部57的内部中。环51能够可选择地“扣合”到把手部56的将杆夹持在其中的部分的外表面中形成的各个前环形定位槽51a和后环形定位槽51b中。鞘部57沿着把手部56可滑动以使得环51按所需地接合槽51a或槽51b。这进而使得鞘部57可释放地定位在把手56上的两个位置中的任一个。
探头元件52a-52d被弯曲成使得在其未受压状态下，支撑尖端部件54的其自由端张开，从而相互隔开。在该结构中，探头元件52a-52d如上所述那样适于插入到容器21a-21d等容器中。鞘部57可沿着外壳53朝向把手部56收回以实现该状态。
鞘部57沿相反方向朝向尖端部件54运动以接近它们，该运动使得探头元件52a-52d的弯曲部变直。因此，尖端部件54抵抗探头元件的弹性变形而汇聚成彼此靠近并且限定适合与含核酸材料接合的拼合尖端。
通过用手抓握把手部56可使得所形成的拼合尖端与这样的材料接合。鞘部可根据需要手动地操作，从而（借助使得鞘部在其移动范围的一端或另一端暂时停留的上述定位配置）在其收回位置与近邻位置之间移动，因此使探头元件52a-52d在汇聚配置与张开配置之间转换。
限定探头元件52a-52d的杆是中空且末端敞口的。如图20中所示的，每个尖端部件54限定为外径与这些杆中的一个大致相同的圆柱体54a，并且从直径减小的圆柱形柱体54b的一端伸出。
每个柱体54b以摩擦配合进入这些杆中的一个的开口端中。使尖端部件相对于这些杆保持的摩擦可相对容易地由以下描述的推动机构克服。
该推动机构由圆柱形按钮58部分地限定，该圆柱形按钮58从其远离尖端部件54的末端处的把手部56伸出。
按钮58在例如大拇指的压力下可抵抗把手部56的前述端部中形成的细长的圆柱形孔61中的复位弹簧而轴向移动。
按钮58将外壳53的内侧刚性地连接到四个柔性推动杆62，所述推动杆62沿着限定探头元件52a-52d的杆的中空的内部延伸，以接合尖端部件54的柱体54b。
因此，显而易见，在鞘部57收回以使得尖端部件54张开以后，以及在涂覆有核酸的尖端部件54插入到各自的容器21a-21d中以后，按钮58的操作使得尖端部件排出到这些容器中。
在探头元件52a-52d收回以后，容器可利用诸如塞子但不限于塞子的封罩而被封闭，结果尖端部件54a-54d在容器内侧单独地密封，然后在容器中会发生PCR放大。
按钮58的释放导致推动杆收回，使得（如果需要的话，在进行清洁以后）新的尖端部件54于是可附接到探头元件52a-52d的开口端。替代性地，整个组件是可废弃的。鞘部57前进到图18中示出的位置导致尖端部件54汇聚并且再次采取所示出的其邻接关系，从而准备执行其它核酸取样操作。
现在参考图21-图24，其示出了该装置的另一变体。
如图21、图22和图24中最佳示出的，把手66包括直径彼此相同的所用上圆筒67和所用下圆筒68。
下圆筒68从其自由端伸出一批呈大致三角形板69a-69d的形式的四个可移动支撑件。
圆筒67、68如图21中的箭头所示那样相对彼此可旋转，从而使得板69a-69d借助以下描述的凸轮作用而运动。在这种样式中，板69a-69d可从初始位置（图21中示出，其中多个尖端部件71a、71b、71c、71d处于靠近该装置的纵向中心轴线的邻接的（核酸取样）配置中）运动到由图24中的虚线表示并且在图22中以立体图示出的随后的尖端排出位置。在后一位置中，尖端部件71全都处于与中心轴线隔开的位置，并且被定位以排出到如以下描述的容器21等各个容器中。
如图32（图23是以两个对半的图像示出的装置的各部分采取各自的操作位置的剖视图）所示，板69a-69d是大致直角三角形板，在图21的初始位置中，这些直角三角形板的斜边（hypoteneuse）汇聚以限定钝点72。
每个三角形板69借助可旋转的枢轴销73从上方枢轴式地悬挂。每个枢轴销73沿着其长度接近一半地将上圆筒67的下侧连接到板69的相邻的非斜边的边缘74。
板69的沿径向向枢轴销73以外的顶部76因弹簧77而相对于下圆筒68被收拢地保持。上圆筒67与下圆筒68相对于彼此收拢，并且能够抵抗（实际上，四个）复位弹簧83的作用而相对于彼此轴向移动，该复位弹簧83被约束在邻近该装置的外周的上圆筒67和下圆筒68之间。为了容纳圆筒67、68的轴向运动，在下圆筒68的中空的内部的内侧形成并且围绕该中空的内部延伸的两个保持环78和79彼此轴向地隔开，并且在它们之间可移动地限制有接纳在下圆筒68中的上圆筒67的部分的外部上形成的环形或部分环形的凸缘。
该配置使得上圆筒67和下圆筒68相对于彼此旋转时，每个支撑件（板）69均围绕由其枢轴销73限定的竖向轴线枢转。
这导致每个板69的竖向延伸的非斜边边缘82同时地从图21、图24以及图23的左半边中示出的居中的、邻接位置转动到图22以及图23的右半边中示出的与该装置的轴线隔开的排出位置。
在每个边缘82附近，每个支撑件69均是中空的并且限定从该支撑件的顶部延伸到底部的细长孔84。
与上述尖端部件54的设计基本上相同的各个尖端部件71借助其柱体被推入到孔中而在每个孔84的如所示的下端处保持受限。
具有半球形帽87的推杆86从孔84的上端伸出并且沿着孔84延伸到刚好尖端部件71的柱体的末端上方的高度。推杆86的最下端与尖端部件54的柱体之间的间隔稍小于半球形帽87的下侧与每个板69的边缘74之间的间隔。
板69到图22的位置的运动将推杆86的每个帽87转动成与从上圆筒67的下侧向下伸出的各个挤压构件88对齐。
一起抵抗复位弹簧83的力的圆筒67、68的压缩导致挤压构件88接合帽87。这将推杆向下驱动以接合柱体，因此将尖端部件71从板69分别排出到容器中，这些容器之后例如可利用塞子或其它封罩而被密封。
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Claims (76)

1.一种核酸取样装置，包括：探头，用于支撑核酸样本；和操纵器，能够附接到所述探头，从而允许操纵所述探头，所述探头能够与所述操纵器分离，其中，所述探头包括多个探头元件，所述探头元件能够相对于彼此在邻接结构与相互隔开的结构之间运动，每个探头元件均包括尖端部件，当所述探头元件采取其邻接结构时，所述尖端部件与其它尖端部件组合而限定出拼合尖端，所述拼合尖端能够接触核酸以转移该核酸的样本，并且
其中被限定时的所述拼合尖端包括多个核酸触头，所述核酸触头被分别固定到所述尖端部件并在数量上与所述尖端部件对应，使得在所述拼合尖端接触核酸时，所述核酸触头中的每一个均接合大致相同量的核酸。
2.根据权利要求1所述的装置，其中所述操纵器包括探头元件启动器，用于使所述探头元件在邻接结构与相互隔开的结构之间选择性地运动。
3.根据权利要求2所述的装置，其中所述操纵器包括细长的柄；并且所述探头元件启动器能够沿着所述柄移动，从而使得所述探头元件在邻接与相互隔开的结构之间选择性地运动。
4.根据权利要求3所述的装置，其中所述柄是中空的，并且所述探头元件启动器基本上位于所述柄的内部并且能够在所述柄的内部的内侧移动。
5.根据权利要求4所述的装置，其中所述柄包括在其中形成的通孔；并且所述探头元件启动器经由所述通孔能够被接触以使所述探头元件启动器在所述柄的内侧移动。
6.根据权利要求2所述的装置，其中所述操纵器包括能够旋转的构件，所述能够旋转的构件被操作性地连接到所述探头元件启动器，使得所述能够旋转的构件的旋转导致所述探头元件启动器使所述探头元件在邻接结构与相互隔开的结构之间移动。
7.根据权利要求2至6中任一项所述的装置，其中每个探头元件均包括在一端具有所述尖端部件的能够弹性变形的细长构件；其中所述细长构件以一捆的形式设置成通过该捆的相同端处的尖端部件而靠拢彼此延伸；其中每个探头元件是弯曲的，使得所述尖端部件趋于彼此分开；并且其中所述探头元件启动器包括鞘部，所述鞘部环绕该捆并且能够沿着该捆的元件移动，当所述鞘部接近所述尖端部件时，所述鞘部使得所述尖端部件沿着与所述探头元件的弹性变形方向相反的方向汇聚而限定所述拼合尖端，并且当所述鞘部沿着该捆与所述尖端部件隔开时，所述鞘部允许所述尖端部件因其弯曲的形状和弹性变形而彼此分开。
8.根据权利要求7所述的装置，包括一个或多个的能够被释放的定位装置，用于将所述鞘部保持在预定的位置中。
9.根据权利要求2到6中的任一项所述的装置，包括能够弹性变形的薄片，所述薄片支撑多个所述探头元件，每个所述探头元件限定包括所述尖端部件的自由端，其中所述薄片能够在所述尖端部件彼此分开的结构与所述探头元件邻接的变形结构之间变形，使得所述尖端部件限定所述拼合尖端。
10.根据权利要求1所述的装置，还包括容器，所述容器包括能够被密封的开口，用于容纳一种或多种试剂和核酸样本；所述操纵器的操作导致或允许所述探头经由所述开口插入，以便使样本位于所述容器中。
11.根据权利要求10所述的装置，其中所述装置的所述探头包括封罩，在将样本定位在所述容器中时，所述封罩封闭所述容器而防止含核酸物质离开或进入。
12.根据权利要求11所述的装置，其中所述封罩是不透液体的密封件或者包括不透液体的密封件，其被固定到所述探头或者与该探头是一体的。
13.根据权利要求11所述的装置，包括被固定到多个所述探头或者与多个所述探头一体的封罩。
14.根据权利要求11所述的装置，其中所述封罩和所述操纵器选择性地彼此分离。
15.根据权利要求1所述的装置，其中所述操纵器包括：保持多个所述探头使得它们与周围的环境隔离的源部件；以及分配机构，用于相继地显示所述探头，以使与核酸接合的每一个的至少一部分露出。
16.根据权利要求15所述的装置，其中所述源部件是容纳一个或多个探头的厢室或者包括所述厢室，所述厢室包括厢室开口，在所述分配机构操作时，所述探头经由所述厢室开口伸出。
17.根据权利要求16所述的装置，其中在所述分配机构操作时，伸出的探头封闭所述厢室开口。
18.根据权利要求1所述的装置，其中所述操纵器包括一个或多个排出器，用于在它与所述探头分离时从所述操纵器排出至少一个所述探头，所述排出器或者每个排出器均能够从所述操纵器上的远离待排出的探头的位置来操作。
19.根据权利要求18所述的装置，包括多个所述探头以及用于从所述操纵器排出一个以上的探头的共用排出器。
20.根据权利要求18所述的装置，包括多个所述探头以及对应的多个排出器，各个所述排出器能够被操作成排出每个所述探头。
21.根据权利要求1所述的装置，其中所述探头或者每个探头均包括尖端，或者能够被构造成限定尖端，所述尖端能够用于接触核酸，从而在操作所述操纵器时，将核酸的样本引入到容器中。
22.根据权利要求21所述的装置，其中至少所述尖端由含DNA的物质能够粘附的聚合材料制成或者包含所述聚合材料。
23.根据权利要求21所述的装置，其中至少所述尖端由含高级真核生物核酸的物质能够粘附的聚合材料制成或者包含所述聚合材料。
24.根据权利要求22或23所述的装置，其中，所述聚合材料选自：聚碳酸酯、玻璃、环烯烃共聚物、丙烯酸树脂、结晶聚苯乙烯、聚丙烯、HDPE、中抗冲聚苯乙烯、PVC、液晶聚合物30％、反式ABS、乙缩醛共聚物、聚酯、聚醚酰亚胺、聚乙烯、尼龙、聚醚聚氨酯、苯乙烯丁二烯嵌段共聚物、聚丙烯无规共聚物、乙烯-乙酸乙烯共聚物、硅氧烷和热塑弹性体。
25.根据权利要求24所述的装置，其中所述环烯烃共聚物为Topas。
26.根据权利要求24所述的装置，其中所述丙烯酸树脂为PMMA。
27.根据权利要求24所述的装置，其中所述硅氧烷为PDMS。
28.根据权利要求24所述的装置，其中所述热塑弹性体为山都平。
29.一种用于扩增核酸的方法，所述核酸来自高级真核生物的核酸来源，所述方法包括：
(a)使权利要求1至28中任一项所述的取样装置与所述高级真核生物的核酸来源接触，以致在所述接触后，含高级真核生物核酸的物质粘附到所述取样装置的至少部件上，其中所述取样装置或其粘附有所述含核酸物质的部件由聚合材料制成；
(b)将所述取样装置或其粘附有所述含核酸物质的部件引入容纳有进行核酸扩增反应用反应混合物的反应器，无需对所述含核酸物质进行任何预先处理；和
(c)进行核酸扩增反应。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述高级真核生物为哺乳动物或植物。
31.根据权利要求29或30所述的方法，其中高级真核生物的核酸来源基本上是干的。
32.根据权利要求29或30所述的方法，其中所述反应混合物基本上无离液序列高的试剂。
33.根据权利要求29或30所述的方法，其中所述反应混合物基本上无细胞裂解剂。
34.根据权利要求29或30所述的方法，其中所述取样装置或其粘附有所述含核酸物质的部件提供用于所述反应器的封盖。
35.权利要求1至28中任一项所述的核酸取样装置的用途，所述核酸取样装置的用途是从高级真核生物的核酸来源获得含核酸物质的样品，并且将所述样品引入容纳有核酸扩增用反应混合物的反应器，无需对所述样品进行预先处理，其中，所述取样装置或其粘附有所述含核酸物质的部件由聚合材料制成，该聚合材料在接触时粘附所述含核酸物质。
36.根据权利要求35所述的用途，其中所述高级真核生物为哺乳动物或植物。
37.根据权利要求35或36所述的用途，其中所述高级真核生物的核酸来源基本上是干的。
38.根据权利要求35或36所述的用途，其中所述反应混合物基本上无离液序列高的试剂。
39.根据权利要求35或36所述的用途，其中所述反应混合物基本上无细胞裂解剂。
40.根据权利要求35或36所述的用途，其中所述取样装置或其粘附有所述含核酸物质的部件提供用于所述反应器的封盖。
41.一种用于扩增核酸的方法，所述核酸来自高级真核生物的核酸来源，所述方法包括：
(a)使权利要求1至28中任一项所述的取样装置与所述高级真核生物的核酸来源接触，以致在所述接触后，含高级真核生物核酸的物质粘附到所述取样装置的至少部件上，其中所述高级真核生物的核酸来源基本上是干的；
(b)将所述取样装置或其粘附有所述含核酸物质的部件引入容纳有进行核酸扩增反应用反应混合物的反应器，无需对所述含核酸物质进行任何预先处理；和
(c)进行核酸扩增反应。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述高级真核生物为哺乳动物或植物。
43.根据权利要求41或42所述的方法，其中所述反应混合物基本上无离液序列高的试剂。
44.根据权利要求41或42所述的方法，其中所述反应混合物基本上无细胞裂解剂。
45.根据权利要求41或42所述的方法，其中所述取样装置或其粘附有所述含核酸物质的部件提供用于所述反应器的封盖。
46.权利要求1至28中任一项所述的核酸取样装置的用途，所述核酸取样装置的用途是从高级真核生物的核酸来源获得核酸，然后将所述高级真核生物的核酸来源引入容纳有核酸扩增反应混合物的反应器中，无需对所述核酸来源进行任何预先处理，其中所述高级真核生物的核酸来源基本上是干的。
47.根据权利要求46所述的用途，其中所述高级真核生物为哺乳动物或植物。
48.一种用于制备反应器的方法，所述反应器容纳反应混合物和含核酸物质且易于进行核酸扩增反应，所述方法包括：
(a)提供反应器，所述反应器带有容纳进行核酸扩增反应用的反应混合物的单厢室且所述反应器是封闭的；
(b)提供权利要求1至28中任一项所述的取样装置；
(c)使所述取样装置与所述含核酸物质接触以在所述接触后使含核酸物质粘附到所述取样装置的至少部件上；
(d)开启所述反应器；
(e)将所述取样装置或其粘附有所述含核酸物质的部件放入所述反应器以使所述含核酸物质与所述反应混合物接触；以及
(f)再封闭所述反应器使其密封，所述取样装置或其粘附有所述含核酸物质的部件仍存在于所述反应器中。
49.根据权利要求48所述的方法，其中多个反应器连接在一起，且同时制备。
50.根据权利要求48所述的方法，其中所述取样装置或其粘附有所述含核酸物质的部件被构造成使所述含核酸物质在多个反应器之中分布。
51.根据权利要求48或49所述的方法，其中在所述取样装置与所述含核酸物质接触(步骤(c))前开启所述反应器(步骤(d))。
52.根据权利要求48或49所述的方法，其中所述取样装置或其粘附有所述含核酸物质的部件提供步骤(f)中的反应器的封盖。
53.根据权利要求48或49所述的方法，其中所述反应混合物基本上无离液序列高的试剂。
54.根据权利要求48或49所述的方法，其中所述反应混合物基本上无细胞裂解剂。
55.根据权利要求48或49所述的方法，其中将所述取样装置或其粘附有所述含核酸物质的部件直接放入所述反应器，取样后无额外处理。
56.根据权利要求48或49所述的方法，其中所述反应混合物用于进行以下任一种反应：聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、环介导等温扩增(LAMP)、转录介导扩增(TMA)、RNA信号介导扩增技术(SMART)、链置换扩增(SDA)、滚环扩增(RCA)、等温多重置换扩增(IMDA)、解旋酶依赖性扩增(HAD)、单引物等温扩增(SPIA)、环式解旋酶依赖性扩增(CDHA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。
57.根据权利要求48或49所述的方法，其中所述含核酸物质是来自于哺乳动物的来源。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
59.根据权利要求48或49所述的方法，其中所述含核酸物质基本上是干的。
60.一种用于扩增核酸的方法，所述方法包括根据权利要求48至59中任一项所述的方法制备反应器，和在所述反应器内进行核酸扩增反应。
61.一种用于扩增核酸的方法，所述方法包括实施权利要求48至59中任一项所述的方法，移除所述取样装置或其粘附有所述含核酸物质的部件并将其放入进一步的反应器中，以及在所述进一步的反应器中进行核酸扩增反应。
62.根据权利要求61所述的方法，其中根据权利要求29所述的方法制备所述进一步的反应器。
63.根据权利要求29、41、48、60或61所述的方法，其中所述含核酸物质是选自皮肤细胞、干燥的血、干燥的精液、干燥的唾液的任何细胞、或沉积在所接触表面的细胞物质。
64.根据权利要求35或46所述的用途，其中所述含核酸物质是选自皮肤细胞、干燥的血、干燥的精液、干燥的唾液的任何细胞、或沉积在所接触表面的细胞物质。
65.一种试剂盒，所述试剂盒包含：(a)反应器，所述反应器容纳进行核酸扩增反应用反应混合物，所述反应器是封闭的；和(b)权利要求1至28中任一项所述的取样装置，所述取样装置与含核酸物质接触后，所述含核酸物质能够粘附到所述取样装置的至少部件上，其中，所述取样装置或其粘附有所述含核酸物质的部件能够被引入所述反应器中，且能够在所述取样装置或其粘附有所述含核酸物质的部件存在下在所述反应器内进行核酸扩增反应。
66.根据权利要求65所述的试剂盒，所述试剂盒包含连接在一起的多个反应器。
67.根据权利要求65或66所述的试剂盒，其中所述取样装置或其能够粘附有所述含核酸物质的部件被构造成使所述含核酸物质在多个反应器之中分布。
68.根据权利要求65或66所述的试剂盒，其中所述取样装置或其能够粘附有所述含核酸物质的部件在初始封盖移除时提供所述反应器的封盖。
69.根据权利要求65所述的试剂盒，其中所述反应器中存在的所述反应混合物如权利要求53中所限定。
70.根据权利要求65所述的试剂盒，其中所述反应器中存在的所述反应混合物如权利要求54中所限定。
71.根据权利要求65所述的试剂盒，其中所述反应器中存在的所述反应混合物如权利要求56中所限定。
72.一种制备数据载体的方法，所述数据载体记录与所述含核酸物质的核酸相关的基因型，所述方法包括实施权利要求29、41或60所述的方法，测定所述含核酸物质中的核酸的基因型并在所述数据载体上记录所述基因型。
73.根据权利要求1所述的装置，其中，所述取样装置被处理成DNA灭菌的，或用于支撑所述核酸样本的探头被处理成DNA灭菌的。
74.根据权利要求29、41、48、60、61或72所述的方法，其中，所述取样装置或其粘附有所述含核酸物质的部件被处理成DNA灭菌的。
75.根据权利要求35或46所述的用途，其中，所述取样装置或其粘附有所述含核酸物质的部件被处理成DNA灭菌的。
76.根据权利要求65所述的试剂盒，其中，所述取样装置或其粘附有所述含核酸物质的部件被处理成DNA灭菌的。
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Assignee: Binjiang Huakang Biotechnology Co., Ltd. (Beijing)

Assignor: LGC Ltd.

Contract record no.: 2017990000210

Denomination of invention: Methods for direct pcr using a polymeric material as sample carrier

Granted publication date: 20160120

License type: Common License

Record date: 20170602

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EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract

Application publication date: 20130424

Assignee: Beijing Zhuo Chenghui biological Polytron Technologies Inc

Assignor: LGC Ltd.

Contract record no.: 2018990000166

Denomination of invention: Methods for direct pcr using a polymeric material as sample carrier

Granted publication date: 20160120

License type: Common License

Record date: 20180629