JP5766284B2 - 方法および装置 - Google Patents
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Description
本発明は、核酸増幅反応において使用するための核酸試料を収集するための方法および装置に関する。特に、本発明は、法医学的分析用の試料の収集に有用であり、例えば犯罪現場もしくは事故現場、または生物学的汚染が発生した場所において使用でき、手動的介入を最小限に抑えた使用に適した、方法および装置に関する。
本明細書内の明らかに先行公開された文献の列挙または説明は、その文献が最新技術の一部であるまたは周知の一般的知識であることを認めるものであるとして必ずしも解釈されるべきではない。
現行では、固体生物学的試料から分析を行うための哺乳動物(ヒトを含む)のDNAの標準的な実験室的調整は、以下のもののいくつかまたは全てを必要とする。
試料は、例えば繊維内において乾燥した血液または綿棒上の皮膚細胞等々の中に存在するマトリックスから細胞を取り出すために、ある形態の湿潤化または溶液添加によって、ある態様で処理される必要がある。換言すれば、試料移動が、液体可溶化により達成される。
試料は、タンパク、炭水化物、他の核酸等々の細胞マトリックスからのDNAの分離を促進するために、ある様式で処理されなければならない(すなわちDNAを単離する必要)。
分離されたDNAは、例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)においてDNAを複製するためのDNAポリメラーゼの入手、または他のDNA増幅プロセスに関連する酵素もしくはDNA配列の結合および切断を行うための制限酵素の入手など、DNA分析プロセスを開始することができるように結合タンパク等々を除去することが必要となる(すなわちDNAを洗浄する必要)。
この調製は、阻害因子、DNAses等々を試料から除去する必要がある(すなわちDNA分析を阻害する化学物質の除去の必要)。
乾燥試料は、上述の反応のいずれかが進められるように、溶媒和されることにより細胞物質を溶液へと溶解する必要がある(すなわち細胞/DNAを溶解する必要)。
通常は実施のために実験室環境および訓練された人員をいずれも必要とする上述のプロセスは、試料、調製試薬の測定アリコート等々の注意深い操作を必要とする。
したがって、一般的な理解としては、哺乳動物(ヒトを含む)の細胞は、処理および/または調製操作を行うために溶解状態にあることが必要であり、DNA分析用に細胞を調製するために事前処理を施される必要がある。
細胞溶液を採取して直にDNA分析反応させることは、調製ステップを要さずに行うことが可能であるが、DNA分析の実施のために限定された試料タイプおよび/または特殊な処理を必要とする。唾液は、そのまままたは希釈されてPCR反応させることが可能であり、そのゲノムDNAを分析することが可能であることが立証されている。血液をそのまままたは希釈させてPCR反応させることは、任意の再現可能な成功率で進めるために、特殊な緩衝剤および酵素を必要とすることが様々な形で判明している。細胞溶液中のPCR阻害因子は、しばしば希釈されることにより対処される必要がある。組織培養細胞は、その培養環境から採取される必要があり、PCR反応を受ける前に洗浄されて媒質等々を除去することが必要である。
換言すれば、溶解状態にある細胞は、適切な希釈またはポリメラーゼ酵素学が分析を最適化するために適用される限りにおいては、通常はPCR分析装置への直接的な配置に適したものである。
ガラス表面およびガラス材料は、細胞およびDNA用の親水性結合表面として、またPCR反応をプライミングするまたは保有するのに適した表面として、長きにわたり確立されてきた(例えば、Nanassy等、「Analytical Biochemistry 2007」、365巻、240〜245頁は、ゲノムDNAが非処理スライドガラスから効率的に回収されたことを示している(PCRに適する))。
WO03/057910は、未修飾シリカ表面を有する材料を使用したDNAの単離、およびその後の未修飾シリカの存在下における増幅のための方法に関する。それらの例はいずれも、DNAを入手可能にするために溶解反応が初めに実施されることを示唆する。
WO01/14590は、DNA標的混合物内に配置されたシリカ含有磁気ビーズを使用し、次いで外部磁力を利用してこの混合物からシリカマトリックスに結合されたDNAを分離させる方法を説明している。それらの例は、DNAが、先行する細胞溶解処置によってシリカへと結合可能となることを示唆している。
いずれのガラス採取デバイスも、先行する調製処理を伴わずに、湿潤状態か乾燥状態かに関わらず試料に接触することにより、ソースからの直接的な接触によって細胞をPCR反応へと移動させるようにはとりわけ展開されていない。細胞/DNAを直にDNA/RNA増幅反応へと移動させるために、例えば乾燥した/固体の表面などにこれらの細胞/DNAを塗布することによって細胞/DNAを収集および移動させる、ガラスの公知の特性を利用する採取デバイスは、これまで作製されていない。
DNA/RNA増幅分析に適した、細胞およびDNAを捕獲するための他の固体表面の使用が、研究されており、細菌集落が直に接触され得るようになり(例えば木製楊枝などで)、細菌細胞がいかなる処理も伴わずにPCR反応へと移動され得る(プラスミドおよびゲノムのために)ような微生物培養を可能にすることが、知られている。
例えば切手などの粘着性表面は、舐められると、細胞と結合し得る。この粘着性材料は、PCRへと直に置くのには適しておらず、初めに、(例えばDNA抽出の実施前に切手のキシレン事前処理などにより)膠剤材料を溶解除去するように処理しなければならない。EP1972688は、低pH(3.00〜6.00)の固体表面を使用し、この表面を洗浄して非結合物質を除去し、次いで同一の容器内における連続的なステップによるPCRのためにこの表面を使用する、微生物からの核酸を増幅させる方法を提示している。WO2006/036243およびWO2006/036246は、核酸が後の処理を伴いつつ分析用に後に解放されるのに適したものとなるように細胞溶液を結合するための材料の使用を教示している。好ましい固相サポート材料は、第四オニウム核酸結合部分を使用する。
米国特許第5,496,562号、米国特許第5,807,527号、米国特許第6,27,226号、および米国特許第6,645,717号は、血液または唾液が表面上に配置されると、化学物質に吸収されそれと同時に保存され、乾燥されるように、細胞を溶解させるための化学物質で事前浸透された、セルロースまたはガラス繊維マトリックスに関する。このDNA含有材料は、PCR反応において使用される前に、化学物質を洗浄除去するために事前処理を施されなければならない。
従来より、シリコーン(ならびにサントプレーンおよび他の熱可塑性エラストマー)表面は、DNA捕獲プロセスに対して不活性であり、PCR分析に適した形態においてDNAを元々保持する表面を提供するものと考えられている。シリコーンは、ケイ素-酸素主鎖に付着した側基に応じて多数の形態を成す。ヒドロキシル基などの親水性側基は、DNAと結合するポリマーを形成することが立証されているが、シリコーンは、通常、アルキル基またはアリール基と共に構成されて、生物学的に不活性であると考えられる疎水性ソースを形成する。
IE20040589は、不活性キャリア流体としてのシリコーンの使用を示唆している。特開2007-244389は、PCR用にガラス表面の周囲における流動を可能にするが、漏出を防止するように、溝が切り込まれた不活性層としてのシリコーンの使用を示唆している(すなわちシリコーンは、プロセスにおいて不活性になるものと想定される)。特開2008-012434は、有機溶媒と共に混合された両親媒性溶液を使用してシリコーンの網状構造体内にDNAを入り込ませることによりDNAが中で不動化され、次いでDNAが溶媒の除去により固定される、マトリックスであるシリコーンを示唆している。これは、自然吸収プロセスではない。なぜならば、両親媒性溶媒が、親水性部分および疎水性部分を有し、そのため親水性部分を運ぶために使用され得る、および/または疎水性構造体内に親水性DNAを運ぶために使用され得るからである。次いで、この溶媒は、除去されることによりDNAを析出させ、それによりDNA吸収の想定される阻害を克服する。PDMS(ポリジメチルシロキサン)内に非重合シロキサン分子が存在することにより、マイクロチップ/流体デバイスにおけるDNA溶液のプリントにおいてスタンプとしてのPDMSの使用が改善されることが判明している(Thibault等、「Langmuir 2007」23、10706-10714頁)。このメカニズムは、解明されていないが、非重合シロキサンの溶媒抽出により、スタンププロセスにおけるDNAの(想定される)吸収および移動が低下する。DNAソースとの乾燥接触は、以前は研究されていなかった。
したがって、先述の特許出願および特許公開は、シリコーンおよび熱可塑性エラストマーが、細胞/DNAの結合に関して不活性材料であるが、不活性表面特性が、DNA溶液との液体接触からのDNA吸収度を上昇させるように変質され得るという想定に基づくものと考えられる。
プラスチック表面は、細胞の捕獲プロセスに対して中性であり、PCR分析を可能にする表面を提供するとこれまで考えられてきた。プラスチックは、基本的に疎水性の表面であり、細胞またはDNAを結合するのに適したものとなるように処理が必要となると考えられている。一例としては、組織培養のための細胞付着用にプラスチック表面を処理することが考えられよう。ポリカーボネート表面は、典型的には、親水性表面を形成するために強UVまたはオゾンで処理される。最も適切な結合を得るためにポリスチレン、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレート、およびポリプロピレンの様々な処理を説明している、Yanchao等、(2007)「Anal. Chem. 79」426〜433頁を参照されたい。プラスチック表面上におけるDNAプローブの装着および試料振動を伴うマイクロ流体交雑アレイチャネルデバイスが、Liu & Rauch、「Analytical Biochemistry 2003」、317巻、76〜84頁において記載されている。EP0389063は、グアニジン塩、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、イソチオシアン酸ナトリウム等々のカオトロピック物質の存在下において生物学的物質から核酸を単離するためにポリスチレンを使用し得ることを教示している。ポロプロピレンは、高い不活性性を有するため、PCR反応容器に対して選択される材料として奨励される(Anne van der Valkにより「INSights vol 13(2002)」において報告されたABgeneによる研究を参照されたい)。結合は、5ng未満にて200ngのヒトのゲノムDNAにさらされた全チューブ表面について評価される。
したがって、典型的には、非処理プラスチックは、先行の処理を伴うことなく細胞またはDNAを捕獲するのに適した表面とはならないこととなる。
EP1675511は、チャンバ内に導入されるスワブデバイスについて説明している。このデバイスは、このデバイスを操作することにより、スワブを試薬と接触状態にし、その後試験ストリップと接触状態にするが、核酸分析には使用されない。WO2005/047451は、口腔細胞を収集しそれらをチューブ内の安定化された溶液中に配置するように設計された、取外し可能端部を有するスプーンに関する。DNAは、さらなる分析のために細胞から回収される。米国特許公開第2008/0131876号は、DNA抽出の必要性を伴わずにPCR反応が可能な状態に細胞を変質させる特殊溶液とこれらの細胞を接触させることにより、細胞試料からの核酸を増幅させる方法について記載している。WO2008/006501は、PCR反応を実施するためにマイクロ流体デバイスにリンクされたチャンバ内に直にスワブを送達するデバイスに関する。EP1049801は、DNAと結合し、次いでそのDNAを溶離させ得るように帯電され得るポリマー膜の使用を説明している。Nikiforor & Rogers、(1995)「Anal. Biochem.」227、201〜209頁は、DNA交雑ベースアッセイ用の96ウェルポリスチレンプレートの使用に関する。Inouye & Hondo、(1990)「J. Clin. Microbiol.」28、1469〜1472頁は、増幅されたウイルスDNAセグメントのマイクロプレート交雑に関する。
現行では、犯罪現場試料は、スワブ収集される(例えば血液染みもしくは指紋)か、または材料から切り取られ(例えば下着中の精液染み)、それらのスワブまたは材料が、細胞溶解緩衝液中に置かれ、その後、この緩衝液から、DNAが抽出される(例えばWalsh等、(1991)「Biotechniques」10、506〜513頁を参照)。
WO2005/032377は、抗菌剤を含む生物学的採取キットについて記載している。
米国特許公開第2008/0058676号は、セグメント化された収集器スワブシステムについて記載している。
WO2010/027283は、低量抽出に適した試料収集デバイスについて記載している。
WO2009/129397は、高スループットディスペンサについて記載している。
米国特許公開第2003/0059345号は、2ピン液体採取デバイスについて記載している。
Barbany等、(1999)「Biomolecular Engineering」16、105〜111頁は、ストレプトアビジン被覆されたマニホルドサポートの分子遺伝子学的適用について記載している。
WO99/34214は、固相チップおよびそれに関連する使用について記載している。
米国特許公開第2002/0110812号は、核酸収集バリア方法および装置について記載している。
米国特許第6,103,192号は、核酸配列の特定のためにマトリックス材料上において種を不動化し処理することについて記載している。
Barbaro等、(2004)「Forensic Science International」146S, S127-S128は、IsoCode紙ベースデバイス上に収集された体液からのSTRの検出について記載している。
米国特許公開第2004/0152085号は、核酸の収集および/または純化用の表面について記載している。
Nanassy等、「Analytical Biochemistry 2007」、365巻、240〜245頁
Thibault等、「Langmuir 2007」23、10706-10714頁
Yanchao等、(2007)「Anal. Chem. 79」426〜433頁
Liu & Rauch、「Analytical Biochemistry 2003」、317巻、76〜84頁
Anne van der Valk、「INSights vol 13(2002)」
Nikiforor & Rogers、(1995)「Anal. Biochem.」227、201〜209頁
Inouye & Hondo、(1990)「J. Clin. Microbiol.」28、1469〜1472頁
Walsh等、(1991)「Biotechniques」10、506〜513頁
Barbany等、(1999)「Biomolecular Engineering」16、105〜111頁
Barbaro等、(2004)「Forensic Science International」146S, S127-S128
犯罪、事故、または他の事態の現場において使用することができ、「コンタクト・アンド・ゴー」アプローチもしくは「コレクト・アンド・ゴー」アプローチにおいて最小限の主動的介入により使用するのに適した、法医学分析のために核酸含有試料を収集するのに有用な方法およびデバイスに対する必要性が、依然として存在する。
本発明は、とりわけ、後に増幅試薬内に配置された場合にDNA増幅(PCRまたはその他の)に適する形態の核酸(典型的には哺乳動物のDNA)を捕獲し差し出すために、試料(固体または液体の)の接触のみを必要とする方法およびデバイスを提供する。試薬内にデバイスまたはデバイスの一部が存在することにより、増幅プロセスも後の分析(例えば蛍光)検出プロセスも阻害されることはない。
本明細書に記載される研究は、核酸増幅分析のための哺乳動物(ヒトを含む)の細胞の直接的な捕獲および送達が、プラスチック、シリコーン、およびガラスを含むあるポリマー表面による接触移動(「コンタクト・アンド・ゴー」または「コレクト・アンド・ゴー」)のみによる単一ステップで達成され得ること、標的細胞の湿潤化または溶媒和が、これらの細胞の捕獲または核酸増幅反応への移動に不要であること、ある単純な従来的なプラスチック表面および/またはシリコーン表面が、湿潤状態もしくは乾燥状態の細胞表面または細胞染みから細胞を移動させるための採取デバイスとしてまたは採取デバイスの一部としての役割を果たすのに十分なものである(典型的には変質を伴わないが、UV照射またはエチレンオキサイドガス処理などのポリマーを「DNA殺菌」する処理が利用されてもよい)こと、表面上の細胞の捕獲特性が、DNAがPCR分析に適したものとなり、必要な場合には第2のPCR反応へと置かれるように結合され再利用可能な状態に留まるような特性であること、および、ポリマー採取デバイスまたはポリマー採取デバイスの少なくとも一部が、反応に対して害を及ぼすことなく増幅反応の中に残され得ることを実証する。
さらに、本明細書に記載される研究は、表面上の細胞が、接触され、単一のDNA分析反応のみならず、必要な場合には複数の別個の同時の反応へと移動され得るようなデバイスを提供する。
本発明は、プラスチック、シリコーン、および熱可塑性エラストマーが、核酸に結合するように特殊処理を施されなければならない、またはプラスチック、シリコーン、および熱可塑性エラストマーが、哺乳動物(ヒトを含む)の試料を捕獲し増幅反応を直にプライミングするのに適さない、という定説とは対照的に、あるプラスチック表面およびシリコーン表面が、単に試料をこの表面と直接的に接触状態に置き、次いでこの接触表面をDNA分析反応させることのみによって核酸増幅反応をプライミングするのに適した採取デバイスとしての役割を果たすことが可能であることを立証する。これらの表面は、以下においてさらに詳細に説明するように、非処理のものであってもよく、または核酸増幅および検出反応を阻害する検出可能な核酸を随伴しないようにそれらの表面を「DNA殺菌」するように処理されてもよい。木材、ラテックス、および金属などの他の自然のままの表面を、直接採取デバイスとして試用したが、適さないことが判明した。
本明細書において説明する方法およびデバイスは、可搬性と、短時間内でのおよび核酸試料採取現場での容易な使用および分析とをもたらす。
本発明の第1の態様は、反応混合物および核酸含有物質を収容し、核酸増幅反応を実施することが可能な状態の反応容器を準備するための方法を提供する。この方法は、
(a)核酸増幅反応を実施するための反応混合物を収容する単一のチャンバを有する反応容器を用意するステップであって、反応容器が封止される、ステップと、
(b)採取デバイスを用意するステップと、
(c)核酸含有物質に採取デバイスを接触させることにより、前記接触後に、核酸含有物質が採取デバイスの少なくとも一部に付着するステップと、
(d)反応容器を封止解除するステップと、
(e)核酸含有物質が反応混合物と接触状態になるように、核酸含有物質が付着する採取デバイスまたは採取デバイスの一部を反応容器内に配置するステップと、
(f)反応容器内に依然として存在する、核酸含有物質が付着する採取デバイスまたは採取デバイスの一部により、反応容器を気密状態に再封止するステップと
を含む。
(a)核酸増幅反応を実施するための反応混合物を収容する単一のチャンバを有する反応容器を用意するステップであって、反応容器が封止される、ステップと、
(b)採取デバイスを用意するステップと、
(c)核酸含有物質に採取デバイスを接触させることにより、前記接触後に、核酸含有物質が採取デバイスの少なくとも一部に付着するステップと、
(d)反応容器を封止解除するステップと、
(e)核酸含有物質が反応混合物と接触状態になるように、核酸含有物質が付着する採取デバイスまたは採取デバイスの一部を反応容器内に配置するステップと、
(f)反応容器内に依然として存在する、核酸含有物質が付着する採取デバイスまたは採取デバイスの一部により、反応容器を気密状態に再封止するステップと
を含む。
反応容器は、中で核酸増幅反応を実施するのに適した任意の反応容器であってもよい。典型的には、反応容器は、プラスチック、特にポリプロピレンから作製される。好都合には、反応容器は、50μl〜3mlの、好ましくは100μl〜1.5mlの容積を有する。典型的には、反応容器は、3mm〜10mmの、典型的には約5mmの円形断面を有する。
本方法は、単一の反応容器を使用して実施され得るが、複数の反応容器が、一体的に接合されるかまたは共通のサポート内において支持され、同時に準備されると好都合である。したがって、典型的には、2つ、3つ、4つ、6つ、8つ、または10個の反応容器が、一体的に接合されることによって、規則的配列構成体が形成される。各反応容器は、同一の反応混合物を収容してもよく(例えば同一の遺伝子座の増幅および検出を可能にするための同一のPCR反応混合物など)、または、異なる反応混合物を収容してもよい(例えば異なる遺伝子座の増幅および検出を可能にするための異なるPCR反応混合物など)。反応容器のこの規則的配列構成体は、好都合には、核酸増幅反応および/または産物の検出の実施に適した機器と係合するように構成される。適切な機器には、サーモサイクラ機器および蛍光検出機器が含まれる。いくつかの実施形態においては、反応容器の配列構成体は、対照としての既知のおよび所定の核酸含有物質を既に収容している反応容器を含んでもよい。
核酸含有物質は、核酸含有物質が付着する採取デバイスまたは採取デバイスの一部が反応容器内に位置するように、採取デバイスを使用して反応容器内に配置される。典型的には、核酸含有物質は、採取デバイスまたは採取デバイスの一部の上に保持され、これが、反応混合物内に浸漬される。核酸増幅反応中には、増幅されたDNAコピーは、反応混合物溶液内に放出される。
複数の反応容器が既に論じたように一体的に接合される場合には、典型的には、核酸含有物質が付着する採取デバイスまたは採取デバイスの一部は、複数の反応容器間で核酸含有物質を分配し得るように構成される。したがって、例えば、N個の反応容器が存在する場合には、採取デバイスは、好都合には、これらのN個の反応容器のそれぞれの中に核酸含有物質を分配し得るように構成される。好ましくは、この物質は、反応容器間で実質的に均等に分配される。典型的には、Nは、2、3、4、6、または8であってもよい。好ましくは、Nは、4である。好ましくは、Nが4である場合には、反応容器は、正方形の隅部に配置される。
ステップ(a)において用意される反応容器は、封止されることが理解されよう。典型的には、このシールは、気密である。すなわち、反応混合物は、使用時までは汚染のない状態に保たれ得る。使用時に、シールは、ステップ(e)の前に破かれるが、ステップ(c)および(d)は、任意の順序で実施されてもよいことが理解されよう。シールは、任意の適切なシールであってもよく、好都合には容易に除去され得る。反応容器と共に使用するための典型的なシールは、剥離することのできるフォイルまたはプラスチックフィルムである。また、押込みストッパの形態などの他のシールが、ステップ(a)において用意される反応容器に対して予期される。ステップ(f)においては、反応容器の再封止により、後の分析処置の最中の蒸発またはこぼれが防止される。核酸含有物質は、概して反応混合物と接触状態に留まる。
採取デバイスは、複数の重要な特徴を有する。核酸含有物質と接触すると、核酸含有物質が付着する採取デバイスまたは採取デバイスの一部が反応容器内に配置された場合に核酸増幅を可能にするのに十分な物質が、この採取デバイスに付着し、核酸増幅反応が、実施される。したがって、好都合には、核酸含有物質が付着する採取デバイスまたは少なくとも採取デバイスの一部は、以下においてさらに詳細に説明するように乾燥試料内に存在する細胞物質、特に哺乳動物の細胞物質に結合することが可能である。「付着した」は、核酸含有物質が、別個の付着材料の必要性を伴わずに直接的に採取デバイスまたは採取デバイスの一部に付着した状態となるという意味を含む。これは、例えば核酸含有物質に対してデバイスまたはデバイスの一部を擦り付けることによってなど、この物質に採取デバイスまたは採取デバイスの一部を接触させることによって実現される。採取デバイスまたは採取デバイスの一部は、典型的には非多孔性である。
核酸含有物質が付着する採取デバイスまたは採取デバイスの一部は、核酸増幅反応中には反応容器内に留まるので、核酸増幅反応の条件に適合するものでなければならない。
驚くべきことには、以下のポリマーは、化学誘導体化または事前処理を伴わずに、試料との接触時に十分な核酸含有物質を収集することが可能であり、反応中に存在しても核酸増幅反応を阻害しないことが判明した。さらに、驚くべきことには、核酸増幅反応後には、さらなる核酸増幅反応おいて使用することが可能となるのに十分な核酸物質が、これらのポリマーに付帯した状態に留まることが判明した。試料は、湿潤状態または乾燥状態の試料であってもよい。湿潤状態の試料は、液体付着および移動によりデバイスまたはデバイスの一部に付着し得る。典型的には、試料が乾燥試料である場合には、核酸を含む細胞物質が付着する。好ましくは、試料は、乾燥試料である。
ポリマーは、ガラス、Topasなどの環状オレフィンコポリマー、ポリメチルメタクリレート(PMMA)などのアクリル樹脂、結晶ポリスチレン、ポリプロピレン、高密度ポリエチレン(HDPE)、ポリカーボネート、中耐衝撃性ポリスチレン、ポリ塩化ビニル(PVC)、液体結晶ポリマー30%、トランスアクリロニトリルブタジエンスチレン(Trans ABS)、アセタールコポリマー、ポリエステル、ポリエーテルイミド、ポリエチレン、ナイロン、ポリエーテルポリウレタン、スチレンブタジエンブロックコポリマー、ポリプロピレンランダムコポリマー、エチレンビニルアセテート、ポリメチルジオキセンシロキサン(PDMS)などのシロキサン、およびサントプレーンなどの熱可塑性エラストマーである。好ましくは、ポリマーは、ポリマーから作製されたデバイスまたはデバイスの一部と試料とが接触した際に、細胞物質の乾燥試料などの乾燥核酸含有物質が付着し得るものである。したがって、核酸含有物質が付着する採取デバイスまたは採取デバイスの少なくとも一部は、これらのポリマーの中の1つまたは複数から作製されることが特に好ましい。ポリマーは、発泡体、特に目の粗い発泡体の形態ではないことが好ましい。ポリマーは、ラテックスではない。ポリマーは、ガラスで含浸された上述のポリマー(ガラスを除く)の中のいずれかなど、ガラスで含浸された任意の適切なポリマーであってもよい。典型的には、ポリマーは、100℃の温度に対して耐熱性を有する。例えば、ポリマーは、この温度で分解または変形しない。
ポリマーが、PMMA、ポリプロピレン、ポリカーボネート、およびPDMSの中のいずれかであると、特に好ましい。ポリカーボネートが特に好ましい。
複数の異なる設計の採取デバイス(それらのうちのいくつかは、以下においてより詳細に説明される)が、本発明における使用に適する。これらは、2つの大まかなカテゴリーに分類され、第1のカテゴリーは、核酸含有物質が付着する採取デバイスまたは採取デバイスの一部が、反応容器内に嵌入し(封止解除後に)、ステップ(f)において反応容器を別個のシールで封止させ得るデバイスである。この別個のシールは、例えばフォイル、プラスチックフィルム、または押込みストップであってもよい。第2の好ましいカテゴリーは、核酸含有物質が付着する採取デバイスまたは採取デバイスの一部が、ステップ(f)において反応容器を封止するシールを提供するというものである。このカテゴリーの実施形態は、以下においてさらに詳細に説明される。
好都合には、核酸含有物質が付着する採取デバイスまたは採取デバイスの一部は、採取後の追加的な処理を伴うことなく、反応容器内に直に配置される。
反応混合物は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、または、リガーゼ連鎖反応(LCR)、ループ媒介性等温増幅(LAMP)、転写媒介性増幅(TMA)、RNAシグナル媒介性増幅技術(SMART)、鎖置換増幅(SDA)、ローリングサークル増幅(RCA)、等温多置換増幅(IMDA)、ヘリカーゼ依存性増幅(HDA)、単一プライマー等温増幅(SPIA)、環状ヘリカーゼ依存性増幅(CDHA)および核酸配列ベース増幅(NASBA)などの等温法を含むがこれらに限定されない任意の適切な核酸増幅反応を実施するためのものである。PCRが好ましいが、高温処理(100℃付近)は、増幅のためにDNAを入手可能にするのに必要ではなく、したがって等温であるLAMPなどのより低温の方法が適切であることが、実施例から理解されよう。
したがって、反応混合物は、核酸増幅反応を実施するために、分析すべき核酸を除くあらゆる必要な成分を含む。
したがって、例えば、PCRのためには、反応混合物は、PCRプライマー、デオキシヌクレオチド、DNAポリメラーゼMG2+イオン、および約pH7〜8の緩衝溶液を含む。他の核酸増幅方法のためには、RNAse Hまたはリガーゼなどの他の酵素が存在する。
核酸増幅反応前に核酸含有物質を事前処理することは必須ではないことが判明した。さらに、反応に必要なもの以外に、核酸増幅反応混合物中に特殊な試薬を有することは必須ではないことが判明した。したがって、反応混合物は、カオトロピック剤を実質的に含まないことが好ましい。同様に、反応混合物は、細胞溶解剤を実質的に含まないことが好ましい。しかし、いくつかの実施形態においては、Tween-20などの非イオン洗剤が存在してもよい。前記助剤を「実質的に含まない」ということは、助剤が、存在しないか、または場合によってはカオトロピック効果もしくは細胞溶解効果を発揮しないような低さの濃度で存在することを意味する。反応混合物が、尿素、グアニジン塩(塩酸グアニジン)、洗剤、特にイオン洗剤の中のいずれかを実質的に含まないことが、特に好ましい。
特に好ましい一実施形態においては、反応混合物が、核酸増幅反応の核酸産物の検出を行うための試薬をさらに含む。したがって、典型的には、反応混合物は、検出可能となるように標識化された核酸プローブをさらに含む。特に好ましいプローブは、核酸増幅反応の産物に対して交雑することが可能な蛍光標識化されたオリゴヌクレオチドプローブである。適切なオリゴヌクレオチドプローブおよび蛍光検出システムは、例えばWO2001/73118、WO2007/010268、WO2009/053679などにおいて説明される。これらの文献は、参照により本明細書に組み込まれる。短鎖縦列反復(STR)分析は、例えばヒトのDNA指紋鑑定などにおいて実施されることが、特に好ましい。この検出は、封止された反応容器内における増幅反応の最中または後に実施することが可能である点で有利であることが理解されよう。なぜならば、容器の封止解除が、汚染物質の導入をもたらす可能性があるからである。増幅の結果は、例えば光蛍光によって、または反応混合物溶液から採取し、容器内に採取デバイスを残し、例えばゲル電気泳動などにより増幅されたDNAを分析することによってなど、反応容器内に置いて直接的に観察し得る。
核酸含有物質は、任意のものに由来してもよいが、好ましくは、哺乳動物または植物などの高等真核生物に由来するものである。高等真核生物には、脊椎動物を含む動物が含まれる。ヒトなどの哺乳動物に由来する核酸が好ましい。核酸は、DNAであることが好ましい。核酸は、ゲノムDNAであることが好ましいが、高等真核生物の細胞に由来するウイルス核酸が、「高等真核生物に由来する」という用語に含まれる。典型的には、核酸は、哺乳動物細胞内に存在し、核酸含有物質は、哺乳動物細胞物質である。ヒトを含む哺乳動物の細胞物質には、血液、唾液、精液、皮膚細胞などの細胞、および指紋の一部として残される場合のある固体表面上に付着した細胞物質が含まれる。核酸含有物質は、非核酸物質を実質的に含まなくてもよい。
多数の用途について、核酸含有物質は、実質的に乾燥状態にある。「実質的に乾燥状態にある」とは、試料が、視認可能ないかなる水分の徴候も伴わないことを意味する。例えば、核酸含有物質は、皮膚細胞、乾燥血液、乾燥精液、乾燥唾液、または他の乾燥体液などの細胞であってもよい。驚くべきことには、試料の採取前に乾燥物質を溶媒和することが不要であることが判明しており、乾燥試料が、事前処理を伴わずに反応容器内に直に配置され得ることが判明している。
この使用に限定されないが、本発明は、法医科学における、特に犯罪現場における用途を有することが、容易に理解されよう。遺伝的疾患検査、食品、植物、および動物物質の「ソースまたは起源」検査、等々の臨床用途も想定される。同様に本発明の方法および装置は、例えば疾病汚染現場などの核酸採取をそれらの範囲内に含む。例えば、猛毒性病原菌(鳥インフルエンザ、重症急性呼吸器症候群(SARS)、いわゆる「豚インフルエンザ」、および口蹄疫など)による汚染が発生した場所が考慮され得る。かかる場所では、汚染を生じさせている疾患の菌株を高速特定することが極めて重要となり得る。
本発明の第2の態様は、核酸を増幅するための方法を提供する。この方法は、本発明の第1の態様により反応容器を準備するステップと、反応容器内において核酸増幅反応を実施するステップとを含む。反応容器が、準備され、したがって核酸増幅反応を実施するための試薬を含む反応混合物を収容し、さらに核酸含有物質を収容すると、核酸増幅反応が、反応タイプに応じて通常の様式で実施される。したがって、例えば、PCRは、適切なサーモサイクラーマシンにおいて実施され得る。
上記のように、驚くべきことには、核酸含有物質が付着する採取デバイスまたは採取デバイスの一部をさらなる核酸増幅反応において再利用することが可能であることが判明した。これは、少なくともさらなる核酸増幅反応に十分な物質が、保持されることによるものである。したがって、本発明の第3の態様は、核酸を増幅するための方法を提供する。この方法は、本発明の第1の態様の方法を実施するステップと、採取デバイス(または核酸含有物質が付着する採取デバイスの一部)を除去するステップと、さらなる反応容器内に核酸含有物質が付着する採取デバイスまたは採取デバイスの一部を配置するステップと、さらなる反応容器内において核酸増幅反応を実施するステップとを含む。本発明の第3の態様の一実施形態においては、採取デバイスは、除去され、必要に応じて溶液での洗浄を受けて、さらなる反応容器内に配置される前に第1の反応混合物を除去される。新たな標的配列を検出する異なるプローブが異なる色の蛍光団で標識化される場合には、第1の反応の痕跡が後の分析にとって「視認不能」となるため、採取デバイスに洗浄を受けさせることは必須ではなくなり得る。
本発明の第2の態様の別の実施形態においては、反応混合物は、第1の増幅反応が実施された後に反応容器から除去され、採取デバイスまたは採取デバイスの一部が、反応容器内においてin situ洗浄され、次いで第2の反応混合物が、反応容器に添加される。さらなる一実施形態においては、採取デバイスまたは採取デバイスの一部は、磁性物質を収容してもよく、反応容器内に置ける保持は、適切な磁界を印加することにより実現され得る。
典型的には、さらなる反応容器は、基本的に本発明の第1の態様において説明されるように準備される。一般的には、さらなる核酸増幅反応を実施することは必須ではないであろうが、本発明は、これを可能にし、このことは、さらなる裏付けとなるまたは別個の核酸増幅反応が実施される場合にはとりわけ有用となり得る。これは第1の核酸増幅反応後の何時かに実施され得る。
本発明の第4の態様は、哺乳動物または植物などの高等真核生物の核酸ソースからの核酸を増幅するための方法を提供する。この方法は、
(a)哺乳動物または植物などの高等真核生物の核酸ソースに採取デバイスを接触させることにより、前記接触後に、哺乳動物または植物などの高等真核生物の核酸含有物質が採取デバイスの少なくとも一部に付着するステップであって、核酸含有物質が付着する採取デバイスまたは採取デバイスの一部が、任意の適切なポリマー材料から作製される、ステップと、
(b)核酸含有物質の事前処理を伴うことなく、核酸増幅反応を生じさせるための反応混合物を収容する反応容器内に、核酸含有物質が付着する採取デバイスまたは採取デバイスの一部を導入するステップと、
(c)核酸増幅反応を実施するステップと
を含む。
(a)哺乳動物または植物などの高等真核生物の核酸ソースに採取デバイスを接触させることにより、前記接触後に、哺乳動物または植物などの高等真核生物の核酸含有物質が採取デバイスの少なくとも一部に付着するステップであって、核酸含有物質が付着する採取デバイスまたは採取デバイスの一部が、任意の適切なポリマー材料から作製される、ステップと、
(b)核酸含有物質の事前処理を伴うことなく、核酸増幅反応を生じさせるための反応混合物を収容する反応容器内に、核酸含有物質が付着する採取デバイスまたは採取デバイスの一部を導入するステップと、
(c)核酸増幅反応を実施するステップと
を含む。
ポリマー材料は、例えばラビングなどによる核酸ソースとの接触後に核酸含有物質が付着するものである。また、ポリマー材料は、このポリマー材料が反応混合物中に存在する際に、核酸増幅反応を防止しないまたは実質的に阻害しないものである。ポリマーが適切なポリマーであるか否かは、例えば実施例において説明するように判定することが可能である。特に、実施例2に説明するプロトコルは、ポリマーの適性を判定するために使用することができる。または実施例11のプロトコルを使用することができるが、その場合には、PMMAが、適性を検査すべき別のポリマーと置き換えられ、D16が利用される。
好ましくは、ポリマー材料は、ガラス、Topasなどの環状オレフィンコポリマー、PMMAなどのアクリル樹脂、結晶ポリスチレン、ポリプロピレン、HDPE、ポリカーボネート、中耐衝撃性ポリスチレン、PVC、液体結晶ポリマー30%、Trans ABS、アセタールコポリマー、ポリエステル、ポリエーテルイミド、ポリエチレン、ナイロン、ポリエーテルポリウレタン、スチレンブタジエンブロックコポリマー、ポリプロピレンランダムコポリマー、エチレンビニルアセテート、PDMSなどのシロキサン、およびサントプレーンなどの熱可塑性エラストマーの中のいずれかである。
好都合には、哺乳動物または植物などの高等真核生物の核酸ソースは、上述のように実質的に乾燥状態にある。好都合には、核酸含有物質が付着する採取デバイスまたは採取デバイスの一部は、ステップ(c)の最中に反応容器内に留まる。
本発明の第5の態様は、哺乳動物または植物などの高等真核生物の核酸ソースからの核酸を増幅するための方法を提供する。この方法は、
(a)哺乳動物または植物などの高等真核生物の核酸ソースに採取デバイスを接触させることにより、前記接触後に、哺乳動物または植物などの高等真核生物の核酸含有物質が採取デバイスの少なくとも一部に付着するステップであって、哺乳動物または植物などの高等真核生物の核酸ソースが、実質的に乾燥状態にある、ステップと、
(b)核酸含有物質の事前処理を伴うことなく、核酸増幅反応を生じさせるための反応混合物を収容する反応容器内に、核酸含有物質が付着する採取デバイスまたは採取デバイスの一部を導入するステップと、
(c)核酸増幅反応を実施するステップと
を含む。
(a)哺乳動物または植物などの高等真核生物の核酸ソースに採取デバイスを接触させることにより、前記接触後に、哺乳動物または植物などの高等真核生物の核酸含有物質が採取デバイスの少なくとも一部に付着するステップであって、哺乳動物または植物などの高等真核生物の核酸ソースが、実質的に乾燥状態にある、ステップと、
(b)核酸含有物質の事前処理を伴うことなく、核酸増幅反応を生じさせるための反応混合物を収容する反応容器内に、核酸含有物質が付着する採取デバイスまたは採取デバイスの一部を導入するステップと、
(c)核酸増幅反応を実施するステップと
を含む。
好都合には、核酸含有物質が付着する採取デバイスまたは採取デバイスの一部は、ガラス、Topasなどの環状オレフィンコポリマー、PMMAなどのアクリル樹脂、結晶ポリスチレン、ポリプロピレン、HDPE、ポリカーボネート、中耐衝撃性ポリスチレン、PVC、液体結晶ポリマー30%、Trans ABS、アセタールコポリマー、ポリエステル、ポリエーテルイミド、ポリエチレン、ナイロン、ポリエーテルポリウレタン、スチレンブタジエンブロックコポリマー、ポリプロピレンランダムコポリマー、エチレンビニルアセテート、PDMSなどのシロキサン、およびサントプレーンなどの熱可塑性エラストマーの中のいずれかから作製される。
好都合には、核酸含有物質が付着する採取デバイスまたは採取デバイスの一部は、ステップ(c)の最中に反応容器内に留まる。
典型的には、本発明の第4の態様および第5の態様における反応混合物は、カオトロピック剤を実質的に含まない、および/または細胞溶解剤を実質的に含まない(本発明の第1の態様に関する上述の記載を参照)。
本発明の第6の態様は、核酸含有物質からの核酸の核酸に対応する遺伝子型を記録するデータキャリアを準備する方法を提供する。この方法は、本発明の第2、第4、または第5の態様の方法を実施するステップと、核酸含有物質中の核酸の遺伝子型を判定するステップと、データキャリア上に遺伝子型を記録するステップとを含む。遺伝子型は、SNP(単一ヌクレオチド多型)に関するものであってもよく、またはSTR(短鎖縦列反復)に関するものであってもよい。遺伝子型は、「DNA指紋鑑定」であってもよい。データキャリアは、任意のデータキャリアであってもよいが、典型的にはコンピュータディスクまたはフラッシュメモリなどの電子データキャリアである。データキャリアおよびその上のデータは、他の試料からの遺伝子型と、またはデータベースに記憶された遺伝子型と、分析される試料からの核酸の遺伝子型とを比較するために使用され得ることが理解されよう。これは、本発明の犯罪検出実施形態および法執行実施形態にとって特に有用である。
本発明の第7の態様は、哺乳動物または植物などの高等真核生物ソースから核酸を取得し、事前処理を伴うことなく核酸増幅用の反応混合物を収容する反応容器内に哺乳動物または植物などの高等真核生物の核酸ソースを導入するための、採取デバイスの使用を提供する。好ましくは、核酸は、採取デバイスまたは採取デバイスの一部に付着し、核酸含有物質が付着する採取デバイスまたは採取デバイスの一部は、ガラス、Topasなどの環状オレフィンコポリマー、PMMAなどのアクリル樹脂、結晶ポリスチレン、ポリプロピレン、HDPE、ポリカーボネート、中耐衝撃性ポリスチレン、PVC、液体結晶ポリマー30%、Trans ABS、アセタールコポリマー、ポリエステル、ポリエーテルイミド、ポリエチレン、ナイロン、ポリエーテルポリウレタン、スチレンブタジエンブロックコポリマー、ポリプロピレンランダムコポリマー、エチレンビニルアセテート、PDMSなどのシロキサン、およびサントプレーンなどの熱可塑性エラストマーの中のいずれかから作製される。好都合には、核酸含有物質が付着する核酸採取デバイスまたは核酸採取デバイスの一部は、核酸増幅反応の際に反応容器内に留まる。
本発明の第8の態様は、(a)核酸増幅反応を実施するための反応混合物を収容する反応容器であって、封止される反応容器と、(b)核酸含有物質との接触後に前記核酸含有物質の少なくとも一部が付着し得る採取デバイスとを備えるキットを提供する。核酸含有物質が付着する採取デバイスまたは採取デバイスの一部は、反応容器内に導入され得るものであり、核酸増幅反応は、核酸含有物質が付着する採取デバイスまたは採取デバイスの一部が存在する状態で容器内において実施され得る。反応容器、反応混合物、採取デバイス、および核酸含有物質等々は、本発明の先述の態様に関連して説明するような任意のものであってもよい。これらの特徴に対する優先性は、本発明のこの態様においても同じである。
典型的には、このキットは、本発明の第1の態様のコンテクストにおいて上述したように、一体的に接合される複数の反応容器を備える。典型的には、核酸含有物質が付着し得る採取デバイスまたは採取デバイスの一部は、本発明の第1の態様のコンテクストにおいて上述したように、核酸含有物質が複数の反応容器間で分配され得るように構成される。
好都合には、いくつかの実施形態においては、核酸含有物質が付着する採取デバイスまたは採取デバイスの一部は、元のシールが除去されると、反応容器のシールを提供する。好ましくは、核酸含有物質が付着し得る採取デバイスまたは採取デバイスの一部は、ガラス、Topasなどの環状オレフィンコポリマー、PMMAなどのアクリル樹脂、結晶ポリスチレン、ポリプロピレン、HDPE、ポリカーボネート、中耐衝撃性ポリスチレン、PVC、液体結晶ポリマー30%、Trans ABS、アセタールコポリマー、ポリエステル、ポリエーテルイミド、ポリエチレン、ナイロン、ポリエーテルポリウレタン、スチレンブタジエンブロックコポリマー、ポリプロピレンランダムコポリマー、エチレンビニルアセテート、PDMSなどのシロキサン、およびサントプレーンなどの熱可塑性エラストマーの中のいずれかから作製される。好都合には、反応容器内に存在する反応混合物は、本発明の先述の態様に関連して上述するような任意の反応混合物である。
本発明の第9の態様によれば、核酸試料を支持するための少なくとも1つのプローブと、プローブの操作などを可能にするためにプローブに装着可能なマニピュレータとを備える、核酸採取装置が提供される。プローブはマニピュレータから独立したものである。
任意には、この装置は、1つまたは複数の試薬および核酸試料を収容するための、封止可能開口を備えるレセプタクルを備え、マニピュレータの操作により、レセプタクル内に試料を配置するようにプローブが開口を通して挿入されるまたは挿入され得る。プローブは、レセプタクル内に試料を配置した際に、核酸含有物質の入出を防止するためにレセプタクルを閉鎖するクロージャを備える。
本発明の装置のさらなる任意の態様は、従属請求項において定義される。特に、本発明の範囲内の含まれる任意の一構成においては、装置は、1つまたは複数の試薬および核酸試料を収容するための、封止可能開口を備えるレセプタクルを備え、マニピュレータの操作により、レセプタクル内に試料を配置するようにプローブが開口を通して挿入されるまたは挿入され得る。
以下の非限定的な実施例、実施形態、および図面を参照として、本発明をさらに詳細に説明する。
本明細書においては、本発明の原理を広範に適用することが可能であることを示唆するために、いくつかの用語が同義的に使用される。以下の用語索引表は、同等の意味を有する用語を概説したものである。
さらに、「シール」および「シール部材」という用語は、コンテクストにおいて許容され得る限りは、本明細書においてはほぼ同義的に使用される。
(実施例)
(実施例1: 他の例に関する材料および方法)
ビーズ生成
以下のプラスチック、すなわち1)Topas、2)アクリル樹脂、3)結晶ポリスチレン、4)ポリプロピレン、5)HDPE、6)ポリカーボネート、7)中耐衝撃性ポリスチレン、8)PVC、9)ポリエチレン-ブロック-ポリエチレングリコール、10)ポリ(エチレン-コ-アクリル酸)、11)ポリ(ビニル-アルコール-コ-エチレン)、および12)ポリ(エチレン-コ-ビニル-アセテート)グラフト無水マレイン酸、13)液体結晶ポリマー30%、14)Trans ABS、15)環状オレフィンコポリマー、16)アセタールコポリマー、17)ポリエステル、18)ポリエーテルイミド、19)ポリエチレン、20)ナイロン、21)ポリエーテルポリウレタン、22)スチレンブタジエンブロックコポリマー、23)ポリプロピレンランダムコポリマー、および24)エチレンビニルアセテートについて、プラスチック顆粒をプラスチック供給業者(Sovereign社; Slough、Matrix Plastics社; Slough、EuroPIaz社; Southminster)から収集した。これらのプラスチックは、非変質状態にて使用し、後の実験時には外科用メスで切断することにより約1.5mm3のサイズの同様のサイズのプラスチック破片にした。全てのプラスチックを、257nmのUV放射で照射して、汚染をもたらすおそれのあるDNAを除去した。これらのプラスチックの簡単な説明をTable1(表2)に示す。
(実施例1: 他の例に関する材料および方法)
ビーズ生成
以下のプラスチック、すなわち1)Topas、2)アクリル樹脂、3)結晶ポリスチレン、4)ポリプロピレン、5)HDPE、6)ポリカーボネート、7)中耐衝撃性ポリスチレン、8)PVC、9)ポリエチレン-ブロック-ポリエチレングリコール、10)ポリ(エチレン-コ-アクリル酸)、11)ポリ(ビニル-アルコール-コ-エチレン)、および12)ポリ(エチレン-コ-ビニル-アセテート)グラフト無水マレイン酸、13)液体結晶ポリマー30%、14)Trans ABS、15)環状オレフィンコポリマー、16)アセタールコポリマー、17)ポリエステル、18)ポリエーテルイミド、19)ポリエチレン、20)ナイロン、21)ポリエーテルポリウレタン、22)スチレンブタジエンブロックコポリマー、23)ポリプロピレンランダムコポリマー、および24)エチレンビニルアセテートについて、プラスチック顆粒をプラスチック供給業者(Sovereign社; Slough、Matrix Plastics社; Slough、EuroPIaz社; Southminster)から収集した。これらのプラスチックは、非変質状態にて使用し、後の実験時には外科用メスで切断することにより約1.5mm3のサイズの同様のサイズのプラスチック破片にした。全てのプラスチックを、257nmのUV放射で照射して、汚染をもたらすおそれのあるDNAを除去した。これらのプラスチックの簡単な説明をTable1(表2)に示す。
採取方法
純化されていない試料の分析に対する様々なプラスチックの適性を評価するために、様々な方法を利用した。
1)ボルテックス法; オムニスワブ(Whatman Ltd社)を使用して新鮮な口腔擦過標本を採取した。UV洗浄されたプラスチックサンプルを、スワブ試料と共に6ml無菌ビージューチューブ内に配置し、ボルテックスにより10秒間にわたり高速で混合して、核酸含有物質にプラスチックサンプルを接触させた。次いで、無菌微細先端ピンセットを使用して反応容器へとプラスチックを移動した。
2)ラビング法; UV洗浄されたプラスチックサンプルを正常な微細先端ピンセットの間に保持した。次いで、これらのサンプルを使用して、プラスチック表面の中の1つを試料(例えば繊維/ガラス上の乾燥血液染み、繊維・ガラス上の乾燥唾液染み、等々)に対して擦り付けて、核酸含有物質にプラスチックを接触させた。次いで、擦り付けられた表面が反応ミックス中へと下方に向くように、反応容器へとこのプラスチック採取表面を移動させた。プラスチック表面は、これらの両方法においてin situ状態のままとした。
純化されていない試料の分析に対する様々なプラスチックの適性を評価するために、様々な方法を利用した。
1)ボルテックス法; オムニスワブ(Whatman Ltd社)を使用して新鮮な口腔擦過標本を採取した。UV洗浄されたプラスチックサンプルを、スワブ試料と共に6ml無菌ビージューチューブ内に配置し、ボルテックスにより10秒間にわたり高速で混合して、核酸含有物質にプラスチックサンプルを接触させた。次いで、無菌微細先端ピンセットを使用して反応容器へとプラスチックを移動した。
2)ラビング法; UV洗浄されたプラスチックサンプルを正常な微細先端ピンセットの間に保持した。次いで、これらのサンプルを使用して、プラスチック表面の中の1つを試料(例えば繊維/ガラス上の乾燥血液染み、繊維・ガラス上の乾燥唾液染み、等々)に対して擦り付けて、核酸含有物質にプラスチックを接触させた。次いで、擦り付けられた表面が反応ミックス中へと下方に向くように、反応容器へとこのプラスチック採取表面を移動させた。プラスチック表面は、これらの両方法においてin situ状態のままとした。
AmpflSTR(C)SGMplus(商標)の概要
AmpflSTR(C)SGMplus(商標)キット(Applied Biosystems社)を用いてSTR標的の増幅および同定を実施した。AmpflSTR(C)SGMplus(商標)キットは、10個のSTR(D16S539、D18S51、D19S433、D2S1338、D21S11、D3S1358、D8S1179、FGA、TH01、およびvWA)と、アメロゲニン性別判定テストとを含む。AmpflSTR(C)SGMplus(商標)キットは、キットのユーザマニュアル内に記載の通りに使用したが、半量反応を利用した。半量反応ミックスは、試料ごとに以下の反応設定条件、すなわち10.5μlのAmpFlSTR PCR Reaction Mix、5.5μlのAmpFlSTR SGM、および0.5μlのPrimer Setを使用する。15μlの反応ミックスおよび10μlの水を各試料に添加したので、合計の反応ミックス容量は25μlとなった。
AmpflSTR(C)SGMplus(商標)キット(Applied Biosystems社)を用いてSTR標的の増幅および同定を実施した。AmpflSTR(C)SGMplus(商標)キットは、10個のSTR(D16S539、D18S51、D19S433、D2S1338、D21S11、D3S1358、D8S1179、FGA、TH01、およびvWA)と、アメロゲニン性別判定テストとを含む。AmpflSTR(C)SGMplus(商標)キットは、キットのユーザマニュアル内に記載の通りに使用したが、半量反応を利用した。半量反応ミックスは、試料ごとに以下の反応設定条件、すなわち10.5μlのAmpFlSTR PCR Reaction Mix、5.5μlのAmpFlSTR SGM、および0.5μlのPrimer Setを使用する。15μlの反応ミックスおよび10μlの水を各試料に添加したので、合計の反応ミックス容量は25μlとなった。
Applied Biosystems 9700機器(Applied Biosystems社)を使用して標的配列の増幅および同定を実施した。ホットスタート酵素を活性化させるための初期変性(95℃、11分)後に、変性(95℃、1分)、プライマーアニーリング(59℃、1分)、および産物の延長(72℃、1分)からなる28サイクルを利用して標的を増幅した。増幅後に、産物のアデニル化を実施した(60℃、45分)。その後、さらなる処理が必要となるまで、試料を4℃に保持した。
Applied Biosystems 3100 (Applied Biosystems社)を使用して標的配列の増幅および同定を実施した。分析を行うために、1μlの増幅産物を、8.9μlのHi-Diホルムアミド(Applied Biosystems社)および0.1μlのGenescan 500 ROX size standardに添加した。試料は、10秒間にわたり3kVにて36cmキャピラリーアレイ中に注入した。試料は、Genemapper IDを使用して分析した。
HyBeacon Probeを使用したSTR分析
蛍光オリゴヌクレオチドプローブ、非蛍光ブロッカオリゴヌクレオチド、および融解曲線分析を利用するFrench等(2008年)(参考文献1)により公開された方法に基づき、STR標的の増幅および同定を実施した。
蛍光オリゴヌクレオチドプローブ、非蛍光ブロッカオリゴヌクレオチド、および融解曲線分析を利用するFrench等(2008年)(参考文献1)により公開された方法に基づき、STR標的の増幅および同定を実施した。
PCR量は、20μlであり、これは、1つのSpeedSTAR Buffer I(TaKaRa社)または1ユニットのPhire Buffer (Finnzymes社)、1ユニットのSpeedSTAR polymerase(TaKaRa社)または1ユニットのPhire Polymerase(Finnzymes社)、3%BSA(Roche社)、0.5%Tween-20(Sigma社)、および1mMのdNTPs (各0.25mM -GE Healthcare社、英国Amersham)を含むものであった。実施するアッセイに応じて(すなわちD16S539またはD18S51)、1μMの順方向プライマー、0.1μMの逆方向プライマー、および75nMの適切な検査用プローブを使用した。また、D16S539アッセイおよびD18S51アッセイは、それぞれ1μMおよび375nMの非蛍光ブロッカを含んでいた。非対称PCRを利用して、増幅された配列のアニーリングよりもプローブ交雑が優先されるように、標的ストランドの過剰を生成した(WO2007/010268 A2を参照)。
Rotor-Gene 6000 (Corbett Research社)およびCFX96 (Bio-Rad社)を使用して標的配列の増幅および同定を実施した。ホットスタート酵素を活性化させるための初期変性(95℃、1分)後に、変性(95℃、1秒)、プライマーアニーリング(64℃、4秒)、および産物の延長(72℃、4秒)からなる50サイクルを利用して標的を増幅した。増幅後に、反応物を変性し(95℃、1分)、冷却し、(20°、2分)、その後に融解曲線分析を行った。
融解曲線分析は、反応物を20℃から70℃へと加熱することにより、0.5℃刻みで各温度にて5秒の滞留時間により蛍光発光を得ることによって実施した。融解ピークは、温度(x軸)に対する温度(y軸上の-dF/dT)に関する蛍光の負の導関数をプロット化することにより構成した。
SLC6A4遺伝子分析および使用したオリゴヌクレオチドの一覧
Masaomi Iwasaki、Toshihiro Yonekawa等(2003年)2により説明されているようなループ媒介性等温増幅(LAMP)法に基づき、多型SLC6A4遺伝子標的の増幅および検出を実施した。挿入蛍光染料EvaGreenを使用して、リアルタイムでおよび融解曲線分析により標的増幅を検出した。
Masaomi Iwasaki、Toshihiro Yonekawa等(2003年)2により説明されているようなループ媒介性等温増幅(LAMP)法に基づき、多型SLC6A4遺伝子標的の増幅および検出を実施した。挿入蛍光染料EvaGreenを使用して、リアルタイムでおよび融解曲線分析により標的増幅を検出した。
PCR量は、25μlであり、これは、1つのIsothermal Mastermix (Genesys社)、0.8μΜの内部プライマー、0.2μΜの外部プライマー、0.2μΜのループプライマーを含むものであった。
CFX96(Bio-Rad社)の機器を使用して標的配列の増幅および同定を実施した。標的は、CFX96機器(Bio-Rad社)を使用して59℃で30分間にわたりインキュベートすることにより増幅し、30秒ごとに蛍光発光を得た。増幅後には、反応を変性し(95℃、3分)、その後に融解曲線分析を行った。
融解曲線分析は、反応物を40℃から90℃へと加熱することにより、FAMチャネル内において0.5℃刻みで各温度にて5秒の滞留時間により蛍光発光を得ることによって実施した。融解ピークは、温度(x軸)に対する温度(y軸上の-dF/dT)に関する蛍光の負の導関数をプロット化することにより構成した。
ソックスレー抽出されたPDMS表面の生成および方法への言及
ソックスレー抽出器内においてエタノールによりPDMS表面から非結合シロキサンを洗浄した。利用したこの方法は、Thibault等(2007)3により説明されているあたりのものを基礎とした。
ソックスレー抽出器内においてエタノールによりPDMS表面から非結合シロキサンを洗浄した。利用したこの方法は、Thibault等(2007)3により説明されているあたりのものを基礎とした。
非結合シロキサンの影響を検査するために、約20個のPDMS表面を、100mlソックスレーデバイス内の多孔シンブル内に配置した。ソックスレーデバイスは、180mlの絶対エタノールを収容している250mlビーカー内に配置した。ソックスレーデバイスは、12時間の期間にわたり1時間に約8回還流するように設定した。抽出されたシロキサンは、実験の関心対象とはもはやならないため、物質および試薬の秤量は実施しなかった。非結合シロキサン非含有表面を上述のように使用した。
KOH変質した表面の生成
85℃で24時間にわたり1MのKOH(水酸化ナトリウム)内で表面を撹拌することにより、PMMA表面をKOHエッチングした。改質が生じたか否かを検査するために、0.1%のマラカイトグリーンを含有する水の中でこれらの表面を振った(改質されたおよび自然のままの)。10分間のインキュベート後に、浮遊物を除去し、ビーズを水で極度に洗浄した。改質されたビーズの表面のカルボキシル基により、正帯電した染料が維持されるが、自然のままのビーズは、いかなる染料とも結合しない。正常に改質されたビーズは、緑色を呈する。
85℃で24時間にわたり1MのKOH(水酸化ナトリウム)内で表面を撹拌することにより、PMMA表面をKOHエッチングした。改質が生じたか否かを検査するために、0.1%のマラカイトグリーンを含有する水の中でこれらの表面を振った(改質されたおよび自然のままの)。10分間のインキュベート後に、浮遊物を除去し、ビーズを水で極度に洗浄した。改質されたビーズの表面のカルボキシル基により、正帯電した染料が維持されるが、自然のままのビーズは、いかなる染料とも結合しない。正常に改質されたビーズは、緑色を呈する。
(実施例2: スワブデバイスを生成するためのプラスチック材料の評価)
様々な細8図の様々なプラスチック(図1において示唆するような)ビーズ形状体を口腔スワブ(Omniswabs, Whatman社)と共に短時間にわたりボルテックスし、次いで、10個の異なる短鎖縦列反復タイプおよびアメロゲニン性別判定テストを検出するように設計された市販のPCR反応キット(AmpflSTR(C)SGMplus(商標);Applied Biosystems社)内に配置した。この反応は、半量25μL反応における製造業者水晶のサイクリング条件を利用した。生成されたPCR産物は、Applied Biosystems 3100機器を使用してキャピラリー電気泳動により分離した。図1は、いくつかのプラスチック(Topas、アクリル樹脂、結晶ポリスチレン、ポリプロピレン、HDPE、ポリカーボネート、中耐衝撃性ポリスチレン、PVC、液体結晶ポリマー30%、Trans ABS、環状オレフィンコポリマー、アセタールコポリマー、ポリエステル、ポリエーテルイミド、ポリエチレン、ナイロン、ポリエーテルポリウレタン、スチレンブタジエンブロックコポリマー、ポリプロピレンランダムコポリマー、およびエチレンビニルアセテート)を収集し、移動させ、これらのプラスチックにより口腔スワブからの細胞がDNAについて適切に利用可能となり得ることを実証している。本技術の標準的な適用においては、25rfuを超えるピーク高さは、バックグラウンドを上回る実PCR産物を反映するものと見なされる(Custodian Document; CUSTP-GS-003)。多様なプラスチックとの接触により、有意水準の検出が可能となることが理解されよう。いくつかのプラスチックが機能しない(例えばポリエチレン-ブロック-ポリエチレングリコール、ポリ(エチレン-コ-アクリル酸))という本研究における所見は、観察された良好な結果は、スワブからプラスチック上への細胞の機械的せん断の結果によるものではないことを示唆している。データは、1個人から取得した3つの個別の試料から生成した。プラスチック材料から増幅した全ての産物は、スワブドナーに固有のものであった。350ベース対までのおよびそれを上回るDNA断片が、正常に検出され(ドナーのSTRタイプにより判定され)、プラスチック材料は、反応チューブ内に残される場合にPCRを阻害しないことを示唆していた。図1は、広範なプラスチック材料が生物学的物質の吸収に適しており、効率が材料タイプに応じて異なることを実証している。
様々な細8図の様々なプラスチック(図1において示唆するような)ビーズ形状体を口腔スワブ(Omniswabs, Whatman社)と共に短時間にわたりボルテックスし、次いで、10個の異なる短鎖縦列反復タイプおよびアメロゲニン性別判定テストを検出するように設計された市販のPCR反応キット(AmpflSTR(C)SGMplus(商標);Applied Biosystems社)内に配置した。この反応は、半量25μL反応における製造業者水晶のサイクリング条件を利用した。生成されたPCR産物は、Applied Biosystems 3100機器を使用してキャピラリー電気泳動により分離した。図1は、いくつかのプラスチック(Topas、アクリル樹脂、結晶ポリスチレン、ポリプロピレン、HDPE、ポリカーボネート、中耐衝撃性ポリスチレン、PVC、液体結晶ポリマー30%、Trans ABS、環状オレフィンコポリマー、アセタールコポリマー、ポリエステル、ポリエーテルイミド、ポリエチレン、ナイロン、ポリエーテルポリウレタン、スチレンブタジエンブロックコポリマー、ポリプロピレンランダムコポリマー、およびエチレンビニルアセテート)を収集し、移動させ、これらのプラスチックにより口腔スワブからの細胞がDNAについて適切に利用可能となり得ることを実証している。本技術の標準的な適用においては、25rfuを超えるピーク高さは、バックグラウンドを上回る実PCR産物を反映するものと見なされる(Custodian Document; CUSTP-GS-003)。多様なプラスチックとの接触により、有意水準の検出が可能となることが理解されよう。いくつかのプラスチックが機能しない(例えばポリエチレン-ブロック-ポリエチレングリコール、ポリ(エチレン-コ-アクリル酸))という本研究における所見は、観察された良好な結果は、スワブからプラスチック上への細胞の機械的せん断の結果によるものではないことを示唆している。データは、1個人から取得した3つの個別の試料から生成した。プラスチック材料から増幅した全ての産物は、スワブドナーに固有のものであった。350ベース対までのおよびそれを上回るDNA断片が、正常に検出され(ドナーのSTRタイプにより判定され)、プラスチック材料は、反応チューブ内に残される場合にPCRを阻害しないことを示唆していた。図1は、広範なプラスチック材料が生物学的物質の吸収に適しており、効率が材料タイプに応じて異なることを実証している。
(実施例3: スワブデバイスを生成するためのプラスチック材料の評価)
実施例2と同様の実験条件である。この調査では、10個の異なる短鎖縦列反復PCR反応およびアメロゲニン遺伝子座が全て多重反応において検出されるか否かを検査する。全ての標的が正常に増幅される場合には、次いで21個のDNA産物が検出されるはずである。図2は、多様なプラスチック材料が生物学的物質の吸収に適しており、効率が材料タイプに応じて異なることを実証している。最も効率的なものは、Topas、アクリル樹脂、結晶ポリスチレン、ポリプロピレン、HDPE、ポリカーボネート、中耐衝撃性ポリスチレン、PVC、液体結晶ポリマー30%、Trans ABS、環状オレフィンコポリマー、アセタールコポリマー、ポリエステル、ポリエーテルイミド、ポリエチレン、ナイロン、ポリエーテルポリウレタン、スチレンブタジエンブロックコポリマー、ポリプロピレンランダムコポリマー、およびエチレンビニルアセテートであった。性能の最も低いものは、ポリエチレン-ブロック-ポリエチレングリコール、ポリ(エチレン-コ-アクリル酸)、ポリ(ビニル-アルコール-コ-エチレン)、ポリ(エチレン-コ-ビニル-アセテート)グラフト無水マレイン酸であった。
実施例2と同様の実験条件である。この調査では、10個の異なる短鎖縦列反復PCR反応およびアメロゲニン遺伝子座が全て多重反応において検出されるか否かを検査する。全ての標的が正常に増幅される場合には、次いで21個のDNA産物が検出されるはずである。図2は、多様なプラスチック材料が生物学的物質の吸収に適しており、効率が材料タイプに応じて異なることを実証している。最も効率的なものは、Topas、アクリル樹脂、結晶ポリスチレン、ポリプロピレン、HDPE、ポリカーボネート、中耐衝撃性ポリスチレン、PVC、液体結晶ポリマー30%、Trans ABS、環状オレフィンコポリマー、アセタールコポリマー、ポリエステル、ポリエーテルイミド、ポリエチレン、ナイロン、ポリエーテルポリウレタン、スチレンブタジエンブロックコポリマー、ポリプロピレンランダムコポリマー、およびエチレンビニルアセテートであった。性能の最も低いものは、ポリエチレン-ブロック-ポリエチレングリコール、ポリ(エチレン-コ-アクリル酸)、ポリ(ビニル-アルコール-コ-エチレン)、ポリ(エチレン-コ-ビニル-アセテート)グラフト無水マレイン酸であった。
(実施例4: HyBeaconアッセイ内において使用するための材料としてのプラスチック、シリコーン、熱可塑性エラストマー(TPE)、およびガラスの評価
清浄な無菌ピンセットを用いて、均一サイズのPMMA(アクリルプラスチック)表面、PDMS(シリコーン)表面、およびサントプレーン(a TPE)表面を、血液および唾液染みの付いたガラスならびに繊維に対して擦り付けた。採取詳細の第2パートにおいて説明したように、試料は、後に、D16S539と呼ばれる短鎖縦列反復遺伝子座についての単一PCR増幅を含むPCR反応させた(D16S539)。このアッセイ(French等(2008年)1において記載されているものと同種の)は、これらの遺伝子剤用のPCRプライマーだけでなく、識別可能な蛍光オリゴヌクレオチドプローブ(フルオレセインdTで標識化されたD16S539プローブ)および上記において詳述した競合「ブロッカ」オリゴヌクレオチドをも含む、均一系反応である。PCR増幅後に、この反応は、一般的に「融解曲線」として知られている温度範囲(図面のx軸スケールを参照)にわたって処理され、蛍光変化率は、標的からの結合されたプローブの解離を実証するためにプロット化される。これらの結果は、プラスチック表面、シリコーン表面、およびTPE表面が、反応へと直に試料を置くことにより、正確なPCE増幅を支援するだけでなく、後の交雑および蛍光分析を阻害しないことが可能となるのに十分な細胞接触をもたらすことを示唆している。見ての通り、D16S539 STR反復「タイプ」11のみが、D16S539 FAM蛍光チャネルにおける分析を期待されるものとなった。
清浄な無菌ピンセットを用いて、均一サイズのPMMA(アクリルプラスチック)表面、PDMS(シリコーン)表面、およびサントプレーン(a TPE)表面を、血液および唾液染みの付いたガラスならびに繊維に対して擦り付けた。採取詳細の第2パートにおいて説明したように、試料は、後に、D16S539と呼ばれる短鎖縦列反復遺伝子座についての単一PCR増幅を含むPCR反応させた(D16S539)。このアッセイ(French等(2008年)1において記載されているものと同種の)は、これらの遺伝子剤用のPCRプライマーだけでなく、識別可能な蛍光オリゴヌクレオチドプローブ(フルオレセインdTで標識化されたD16S539プローブ)および上記において詳述した競合「ブロッカ」オリゴヌクレオチドをも含む、均一系反応である。PCR増幅後に、この反応は、一般的に「融解曲線」として知られている温度範囲(図面のx軸スケールを参照)にわたって処理され、蛍光変化率は、標的からの結合されたプローブの解離を実証するためにプロット化される。これらの結果は、プラスチック表面、シリコーン表面、およびTPE表面が、反応へと直に試料を置くことにより、正確なPCE増幅を支援するだけでなく、後の交雑および蛍光分析を阻害しないことが可能となるのに十分な細胞接触をもたらすことを示唆している。見ての通り、D16S539 STR反復「タイプ」11のみが、D16S539 FAM蛍光チャネルにおける分析を期待されるものとなった。
この実験は、図1および図2に記載されるものとは異なるPCRプライマーおよび温度サイクリング条件を利用し、これらの実験においては存在しないプローブおよびブロッカオリゴヌクレオチドを含んだことにより、プラスチック接触表面、シリコーン接触表面、およびTPE接触表面へのDNAの結合が、PCR反応特有のものではなく、図3に図示するように、(示唆するような対照DNAのみの入力試料を参照することにより)、蛍光検出もまた複雑な交雑処置の実施も阻害するようなものではないということを実証した。
改質されていない1.5mmのガラスビーズを乾燥した口腔スワブに対して擦り付けた。DNA対照およびスワブの結果は、図25に示される。11および14として示されるピークは、D16S539タイプのアッセイのSTRタイプである。
(実施例5: プラスチック、シリコーン、および熱可塑性エラストマーの評価: 増幅効率への影響)
清浄なPMMA表面、PDMS表面、およびサントプレーン表面を、上述の材料および方法セクションにおいて説明するようなD16S539 HyBeaconアッセイを含む反応容器内に配置した。2ngの抽出されたDNAを、採取表面を含む各反応へと添加した。これらを、採取表面の存在を伴わない2ngの抽出されたゲノムDNAのテンプレートを用いた対照D16S539 HyBeaconアッセイと比較した。見ての通り、STR反復「タイプ」11のみが、D16S539 FAM蛍光チャネルにおける分析を期待されるものとなった。対照反応とPDMSおよびPMMA-meditated反応との間に違いはなかった。ピーク高さの低下が、移動媒体としてのサントプレーンを使用した反応に置いて見られた。これは、材料の不透明性が蛍光検出を阻害していることによるものである可能性がある。PMMAおよびPDMSは、図4に図示するように、D16S539 HyBeaconアッセイの効率に影響を及ぼさない。サントプレーンは、取得される信号の強度を低下させる。
清浄なPMMA表面、PDMS表面、およびサントプレーン表面を、上述の材料および方法セクションにおいて説明するようなD16S539 HyBeaconアッセイを含む反応容器内に配置した。2ngの抽出されたDNAを、採取表面を含む各反応へと添加した。これらを、採取表面の存在を伴わない2ngの抽出されたゲノムDNAのテンプレートを用いた対照D16S539 HyBeaconアッセイと比較した。見ての通り、STR反復「タイプ」11のみが、D16S539 FAM蛍光チャネルにおける分析を期待されるものとなった。対照反応とPDMSおよびPMMA-meditated反応との間に違いはなかった。ピーク高さの低下が、移動媒体としてのサントプレーンを使用した反応に置いて見られた。これは、材料の不透明性が蛍光検出を阻害していることによるものである可能性がある。PMMAおよびPDMSは、図4に図示するように、D16S539 HyBeaconアッセイの効率に影響を及ぼさない。サントプレーンは、取得される信号の強度を低下させる。
(実施例6: プラスチック、シリコーン、および熱可塑性エラストマーの評価: 未抽出の生物学的試料における効率細胞溶解に対する影響)
清浄なPMMA表面、PDMS表面、およびサントプレーン表面を、上述の材料および方法セクションにおいて説明するようなD16S539 HyBeaconアッセイを含む反応容器内に配置した。500μlの水希釈剤内においてボルテックスすることにより口腔スワブ(Omniswab, Whatman社)を滲出させた。2μlの滲出されたスワブを、採取表面の存在を伴わない2ngの抽出されたDNAと比較した。見ての通り、「タイプ」11のみが、D16S539 FAM蛍光チャネルにおける分析を期待されるものとなった。対照反応とPDMSおよびPMMA反応との間には、非常にわずかな違いが見られた。サントプレーン移動を利用して生成された産物の品質は、低下した。これは、材料の不透明性によるものである可能性がある。PMMAおよびPDMSは、図5に図示するように、D16S539 HyBeaconアッセイにおける未抽出細胞物質の増幅を変えない。サントプレーンは、取得される信号の強度を低下させる。これは、不透明表面に関する認識をさらに支持する。
清浄なPMMA表面、PDMS表面、およびサントプレーン表面を、上述の材料および方法セクションにおいて説明するようなD16S539 HyBeaconアッセイを含む反応容器内に配置した。500μlの水希釈剤内においてボルテックスすることにより口腔スワブ(Omniswab, Whatman社)を滲出させた。2μlの滲出されたスワブを、採取表面の存在を伴わない2ngの抽出されたDNAと比較した。見ての通り、「タイプ」11のみが、D16S539 FAM蛍光チャネルにおける分析を期待されるものとなった。対照反応とPDMSおよびPMMA反応との間には、非常にわずかな違いが見られた。サントプレーン移動を利用して生成された産物の品質は、低下した。これは、材料の不透明性によるものである可能性がある。PMMAおよびPDMSは、図5に図示するように、D16S539 HyBeaconアッセイにおける未抽出細胞物質の増幅を変えない。サントプレーンは、取得される信号の強度を低下させる。これは、不透明表面に関する認識をさらに支持する。
(実施例7: 複数反応における使用に関するプラスチック、シリコーン、および熱可塑性エラストマーに対する生物学的物質の結合の評価)
清浄なPMMA表面、PDMS表面、およびサントプレーン表面を、清浄かつ以前に接触を受けていないスライドガラス上の乾燥した唾液染みに対して擦り付けた。上述の材料および方法セクションにおいて説明するようなD16S539 HyBeaconアッセイを使用して、試料を分析した。これらの結果は、図6に示される。増幅後に、試薬ミックスを反応容器から除去し、廃棄し、次いで組織培養水を用いたピペット吸引により試料表面を優しく洗浄して、残留D16S539 HyBeaconアッセイ成分および増幅産物を除去した。表面を乾燥させ、次いで清浄な反応容器へと移動させた。次いで、洗浄された試料表面を、上述の材料および方法セクションにおいて説明するようなD18S51 HyBeaconアッセイ用のテンプレートとして使用して、第2の独立標的配列の分析を助長するのに十分な生物学的物質が残っているか否かを判定した。D18S51標的は、D16S539標的とは別個の染色体上に存在し、D18S51プローブは、増幅されたD16S539標的を検出せず、D16S539試薬は、D18S51標的を増幅させない。また、D18S51テストは、D16S539プローブとは異なる染料ラベルを使用することにより、2つのテストが互いに完全に独立したものとなるようにする。
清浄なPMMA表面、PDMS表面、およびサントプレーン表面を、清浄かつ以前に接触を受けていないスライドガラス上の乾燥した唾液染みに対して擦り付けた。上述の材料および方法セクションにおいて説明するようなD16S539 HyBeaconアッセイを使用して、試料を分析した。これらの結果は、図6に示される。増幅後に、試薬ミックスを反応容器から除去し、廃棄し、次いで組織培養水を用いたピペット吸引により試料表面を優しく洗浄して、残留D16S539 HyBeaconアッセイ成分および増幅産物を除去した。表面を乾燥させ、次いで清浄な反応容器へと移動させた。次いで、洗浄された試料表面を、上述の材料および方法セクションにおいて説明するようなD18S51 HyBeaconアッセイ用のテンプレートとして使用して、第2の独立標的配列の分析を助長するのに十分な生物学的物質が残っているか否かを判定した。D18S51標的は、D16S539標的とは別個の染色体上に存在し、D18S51プローブは、増幅されたD16S539標的を検出せず、D16S539試薬は、D18S51標的を増幅させない。また、D18S51テストは、D16S539プローブとは異なる染料ラベルを使用することにより、2つのテストが互いに完全に独立したものとなるようにする。
図7は、移動された表面が、第2の標的配列の増幅を可能にするのに十分な生物学的物質を採取表面上に吸収していたことを示す。見ての通り、「タイプ」11のみが、D16S539 FAM蛍光チャネルにおける分析を期待されるものとなり、見ての通り、「タイプ」19のみが、D18S51 TAMRA蛍光チャネルにおける分析を期待されるものとなった。D16S539テストおよびD18S51テストは、大幅に異なるTmsの融解ピークTmsをもたらした。
(実施例8: 増幅に利用可能な細胞物質の促進に対する増幅の初期95℃変性ステップの評価)
清浄なPDMS表面を、上述の材料および方法セクションにおいて説明するような唾液試料で染み付けられたスライドガラスに対して擦り付けた。PDMS表面は、SLC6A4標的配列を増幅および検出するように企図されたループ媒介性等温増幅(LAMP、Eiken社)テストを利用して三組で分析した。このアッセイは、30分間の等温増幅にわたり59℃で増幅試薬をインキュベートする。増幅された産物は、挿入染料により検出される。3つのPDMS試料を、同一ドナーから抽出したDNA試料である対照と比較した。図8に示す蛍光融解ピークは、プラスチック表面からの標的の正常な増幅を示す。
清浄なPDMS表面を、上述の材料および方法セクションにおいて説明するような唾液試料で染み付けられたスライドガラスに対して擦り付けた。PDMS表面は、SLC6A4標的配列を増幅および検出するように企図されたループ媒介性等温増幅(LAMP、Eiken社)テストを利用して三組で分析した。このアッセイは、30分間の等温増幅にわたり59℃で増幅試薬をインキュベートする。増幅された産物は、挿入染料により検出される。3つのPDMS試料を、同一ドナーから抽出したDNA試料である対照と比較した。図8に示す蛍光融解ピークは、プラスチック表面からの標的の正常な増幅を示す。
これは、95℃変性ステップが、PDMS表面に結合した細胞物質の増幅に不可欠なものではないことを示唆している。
(実施例9: 細胞物質の結合に対するPDMS内の非結合シロキサンの影響の評価)
Thibault等(2007年)3による文書は、DNAをPDMSに結合させることが可能なメカニズムとしての短鎖シロキサンおよび非重合シロキサンについて記載している。清浄なPDMS表面を、ソックスレーデバイス中に配置し、1時間当たり約8フラッシュの割合で12時間にわたりエタノールで還流させた。ソックスレー抽出されたPDMS表面を、DNA非含有無菌ピンセット間に保持し、以前に接触を受けていない清浄なスライドガラス上の乾燥した唾液染みに擦り付けた。これに加えて、試料を、以前に接触を受けていない清浄なスライドガラス上の乾燥した血液染みに対して擦り付けることを実施した。これらを、自然のままのPDMS表面と比較した。全ての試料を、PCRマイクロチューブへ移動し、D16S539 HyBeaconアッセイで増幅した。全方法が、材料および方法セクションにおいて上述されている。図9に示すように、見ての通り、ドナー試料は、11個の対立遺伝子を生成することが予期される。自然のままのPDMS表面と変質されたPDMS表面との間において、得られる結果に顕著な違いはなかった。これは、非結合シロキサンが、生物学的物質をPDMS表面吸収させるための唯一のメカニズムではないことを示している。
Thibault等(2007年)3による文書は、DNAをPDMSに結合させることが可能なメカニズムとしての短鎖シロキサンおよび非重合シロキサンについて記載している。清浄なPDMS表面を、ソックスレーデバイス中に配置し、1時間当たり約8フラッシュの割合で12時間にわたりエタノールで還流させた。ソックスレー抽出されたPDMS表面を、DNA非含有無菌ピンセット間に保持し、以前に接触を受けていない清浄なスライドガラス上の乾燥した唾液染みに擦り付けた。これに加えて、試料を、以前に接触を受けていない清浄なスライドガラス上の乾燥した血液染みに対して擦り付けることを実施した。これらを、自然のままのPDMS表面と比較した。全ての試料を、PCRマイクロチューブへ移動し、D16S539 HyBeaconアッセイで増幅した。全方法が、材料および方法セクションにおいて上述されている。図9に示すように、見ての通り、ドナー試料は、11個の対立遺伝子を生成することが予期される。自然のままのPDMS表面と変質されたPDMS表面との間において、得られる結果に顕著な違いはなかった。これは、非結合シロキサンが、生物学的物質をPDMS表面吸収させるための唯一のメカニズムではないことを示している。
(実施例10: 上述の実証例に含まれない他の成功実験の概要)
Table2(表3)は、上記に示した図面に含まれない、実施した他の実験の詳細を示す。
Table2(表3)は、上記に示した図面に含まれない、実施した他の実験の詳細を示す。
(実施例11: DNA殺菌用のUV照射が採取およびその後の増幅に対して影響を有さないこと)
多様なUV処理を施されたPMMA(アクリルプラスチック)1.64mmビーズを、実施例1の採取方法の第2のパートにおいて説明するように、清浄な無菌ホルダを用いてガラス上の唾液染みに対して擦り付けた。その後、試料を、D16(D16S539)と呼ばれるSTR遺伝子座に対する単一PCR増幅を含むPCR反応させた。French等(2008年)(参考文献1)において説明されているものと同種の)アッセイは、これらの遺伝子座用のPCRプライマーのみならず、識別可能な蛍光オリゴヌクレオチドプローブ(FAMで標識化されたD16S539プローブ)および競合「ブロッカ」オリゴヌクレオチドをも含む、均一系反応である。次いで、PCRの後に、この反応は、ある温度範囲(図26のx軸スケールを参照)にわたって処理され、蛍光変化率は、正常なプロービングの存在を示唆するためにプロット化される。これらの結果は、PMMAのUV処理が、生物学的物質を収集するその材料の能力に対して非常にわずかな影響しか与えないことを示唆している。
多様なUV処理を施されたPMMA(アクリルプラスチック)1.64mmビーズを、実施例1の採取方法の第2のパートにおいて説明するように、清浄な無菌ホルダを用いてガラス上の唾液染みに対して擦り付けた。その後、試料を、D16(D16S539)と呼ばれるSTR遺伝子座に対する単一PCR増幅を含むPCR反応させた。French等(2008年)(参考文献1)において説明されているものと同種の)アッセイは、これらの遺伝子座用のPCRプライマーのみならず、識別可能な蛍光オリゴヌクレオチドプローブ(FAMで標識化されたD16S539プローブ)および競合「ブロッカ」オリゴヌクレオチドをも含む、均一系反応である。次いで、PCRの後に、この反応は、ある温度範囲(図26のx軸スケールを参照)にわたって処理され、蛍光変化率は、正常なプロービングの存在を示唆するためにプロット化される。これらの結果は、PMMAのUV処理が、生物学的物質を収集するその材料の能力に対して非常にわずかな影響しか与えないことを示唆している。
図26は、非UV照射PMMA(平均対照)、30分間にわたりUV照射されたPMMA(平均30分)、24時間超にわたりUV照射されたPMMA(平均24時間)、および2.5ngのDNAより得られたPMMA(ポジ)の4つの複製の平均融解ピークを示す。
(実施例12: PMMA表面に対するKOH変質の影響)
KOH変質されたPMMA表面およびKOH変質されていないPMMA表面を、正常な無菌ホルダを用いてガラス上の唾液染みに対して擦り付けた。その後、試料を、STR遺伝子座D16S539を含むPhireベースPCR反応させた。アッセイ(French等(2008年)において説明されているものと同種の)は、この遺伝子座用のPCRプライマーのみならず、識別可能な蛍光オリゴヌクレオチドプローブ(FAMで標識化されたD16プローブ)および競合「ブロッカ」オリゴヌクレオチドをも含む、均一系反応である。次いで、PCRの後に、この反応は、ある温度範囲(図27のx軸スケールを参照)にわたって処理され、蛍光変化率は、正常なプロービングの存在を示唆するためにプロット化される。これらの結果は、PMMAのKOH処理が、得られるピーク高さにおいて若干の低下をもたらすことを示唆している。
KOH変質されたPMMA表面およびKOH変質されていないPMMA表面を、正常な無菌ホルダを用いてガラス上の唾液染みに対して擦り付けた。その後、試料を、STR遺伝子座D16S539を含むPhireベースPCR反応させた。アッセイ(French等(2008年)において説明されているものと同種の)は、この遺伝子座用のPCRプライマーのみならず、識別可能な蛍光オリゴヌクレオチドプローブ(FAMで標識化されたD16プローブ)および競合「ブロッカ」オリゴヌクレオチドをも含む、均一系反応である。次いで、PCRの後に、この反応は、ある温度範囲(図27のx軸スケールを参照)にわたって処理され、蛍光変化率は、正常なプロービングの存在を示唆するためにプロット化される。これらの結果は、PMMAのKOH処理が、得られるピーク高さにおいて若干の低下をもたらすことを示唆している。
本発明の装置
図10a〜図10dを参照すると、本発明による核酸採取装置11、12、13の第1の実施形態は、主要な構成要素として、図10dにおいて見ることのできる一連のレセプタクル11と、レセプタクル11の個数と対応する個数の複数のプローブ要素12と、変形可能ハンドル13の形態のマニピュレータとを備える。図10a〜図10dの採取装置11、12、13と、以下に記載の他の採取装置は、本明細書において説明し記載する方法および使用を実施するのに適したものであり、またそれらを実施するように意図される。
図10a〜図10dを参照すると、本発明による核酸採取装置11、12、13の第1の実施形態は、主要な構成要素として、図10dにおいて見ることのできる一連のレセプタクル11と、レセプタクル11の個数と対応する個数の複数のプローブ要素12と、変形可能ハンドル13の形態のマニピュレータとを備える。図10a〜図10dの採取装置11、12、13と、以下に記載の他の採取装置は、本明細書において説明し記載する方法および使用を実施するのに適したものであり、またそれらを実施するように意図される。
図10a〜図10dの装置は、それぞれが上方端部において開口して各開口14を画成する一連の(図示する好ましい実施形態においては)4つの中空垂直レセプタクル11を備える。
レセプタクル中の開口14は、以下において説明する構成にしたがって封止可能である。好ましくは、複数のレセプタクル11は、相互に同一であり、フレーム(図示せず)内において図示するように直線状に支持される。好ましくは、レセプタクル11を支持するフレームは、手で運ぶこと、ブリーフケース内に保管すること、および概して手動により作動させることが容易となり得るようなサイズである。
本発明の範囲内の別の構成においては、レセプタクル11は、正方形もしくは他の多角形のパターン、非直線状、または円形もしくは楕円形のパターンで構成されてもよい。
レセプタクル11は、レセプタクル11が中の核酸または増幅反応に影響を及ぼすことがないように、上述の増幅反応のために使用される核酸および試薬に対して不活性であることが知られているポリマーから製造されるか、またはそのようなポリマーで内側表面を少なくともライニング加工されてもよい。フレームは、レセプタクル11の材料と反応しないポリマー、軽合金、または自然発生材料などの軽量材料から製造される。
フレームは、代替的には、レセプタクルと同一の材料から作製されてもよく、レセプタクルと同時に形成されてもよい。
したがって、本発明の好ましい実施形態においては、レセプタクル11は、フレームに固定されるか、またはフレームおよびレセプタクルが一体的に使用および廃棄されるようにフレームと一体的に形成されてもよい。かかる構成は、いくつかの状況においては、試料セットの標識化、試料のトレーサビリティ、および調査活動の完了時の試料の処分または破棄の証拠の作成に関して有利となり得る。
本発明のさらに他の実施形態においては、および図10dに図示するように、フレームは、なくてもよく、レセプタクル11は、「単独」で使用することができる。
既述のように、図10a〜図10dの装置は、細長ハンドル13に固定され、細長ハンドル13により支持される、複数の細長プローブ要素12a〜12dを備える。
図10aは、核酸採取のために装置の使用を開始する際のプローブ要素12およびハンドル13の構成を示す。
ハンドル13は、細長い四分円弧体13a、13b、13c、13dの形態の4つの(図示する実施形態においては4つだが、本発明の範囲内において他の個数も可能である)ハンドルパーツを備える。
四分円弧体13a〜13dはそれぞれ、プローブ/ハンドルの組合せ体12、13の長尺方向に対してほぼ平行に延在する境界面に沿って、少なくとも1つの隣接する四分円弧体に接合される。これらの接合部は、四分円弧体13a〜13dの解除自在な一体的固定を可能にする対合し合う戻り止めピン15aおよび凹部15bの組合せにより形成される四分円弧体の当接面15によって画定される。その結果、一体的に組み合わされると、四分円弧体は、4つの識別可能な円セグメント断面ハンドルパーツ13a〜13dに分離され得る円筒状ハンドル13を画定する。
本発明の範囲内の別の構成においては、ハンドルセグメントは、いわゆる「リビングヒンジ」、すなわち、可撓性となり任意には易損性(frangible)となるように十分な薄さを有する四分円弧体材料からなるヒンジによって連結することが可能である。
四分円弧体13a〜13dのそれぞれの1つの面は、凸状に湾曲する。いずれの例においても、この面は、一体的に連結された場合に共同的に円形断面ハンドル13を画定するように、接合された四分円弧体群の外側に位置する。
使用時には、剛性でテーパ状の細長ロッドの形態の各プローブ要素12a、12b、12c、12dが、各四分円弧体13a〜13dの下方端部から突出する。
これらのロッドは、四分円弧体13a〜13dが一体的に連結された場合に相互の方向に収束するように延在し、同一長さを有する。これらのロッドの自由端部は、四分円弧体が図10aおよび図10bにおいて見ることのできる構成をとる場合に、相互に近接して終端する。この構成においては、要素12a、12b、12c、12dの自由端部は、複合プローブ12を構成する。
ハンドルがかように構成される場合には、ロッド12a、12b、12c、12dの自由端部により画定される複合プローブ12は、核酸ソースに同時に接触し得る。これは、四分円弧体13a〜13dにより画定されるハンドル13の簡単な手動による把持および操作によって達成され得る。プローブ要素12a、12b、12c、12dの自由端部は、例えばパッド、または相互に突出して核酸に接触するための実質的に連続的な係合表面の形態の複合チップを画定する他の突出部を備えてもよい。
この接触により、核酸物質により自由端部がほぼ均一に被覆される。プローブ要素12a〜12dの自由端部への核酸の付着を助長するために、これらの自由端部は、この目的を達成するのに適したものとして本明細書において論じられる材料の任意のものから作製されるか、その材料で被覆されるか、またはその材料で先端を覆われてもよい。
プローブ/ハンドル組合せ体12、13は、図10aおよび図10bに示す構成において供給される。ユーザは、ハンドル13を把持し、これをマニピュレータとして使用することにより、ユーザのDNAをプローブ要素に接触させる重大な危険性を伴うことなく、自由端部によって画定されるプローブ12のチップを核酸含有物質に対してまたはその中に接触させる。この結果として、要素12a〜12dの自由端部の材料のこの選択により、および本明細書において記載および規定するような本発明の原理により、ほぼ均等量の核酸担持物質が各自由端部に付着する。
上述のように任意にはフレーム内に支持されるレセプタクル11が、レセプタクル11中の開口14を封止する弾性的に変形可能な栓、剥離可能なフォイルシール、またはレセプタクル11の内部へのアクセスを可能にするように除去可能な同様のシールを備えて供給されてもよい。
レセプタクル11は、栓または他のシールタイプにより中に保持される、本明細書において論じられる種類など(しかしそれらに限定されない)の核酸増幅反応を引き起こすのに必要とされる試薬を備える。プローブの自由端部による核酸物質への接触後に、四分円弧体13a〜13dを連結構成において固定する任意の保持器または戻り止めが、図10cに示すように解除される。その結果、図10dにその例を見ることができる四分円弧体はそれぞれ、相互に分離されて、図10cおよび図10dに示す解除構成をとる。
この変形は、ユーザがプローブに接触する必要性を伴わずに、四分円弧体を手動により取り扱うことによって実施され得る。その結果、ユーザのDNAが自由端部に接触する可能性は、事実上ゼロとなる。
四分円弧体13a〜13dが、図10cおよび図10dの分離構成をとる場合には、プローブ要素12は、相互に離間される。
したがって、大まかに言えば、図10の装置は、連続的構成と相互に離間された構成との間で相互に移動可能な複数のプローブ要素12a〜12dを備え、各プローブ要素12a、12b、12c、12dは、プローブ要素がこの連続構成をとる場合に、他のチップパーツと組み合わされて、核酸含有物質と接触するために使用される複合チップを画定するチップパーツを備える。
次いで、ハンドル四分円弧体13a〜13dは、上述の一般的種類の任意のシールの除去または開封後に、各レセプタクル11中の開口14の方向へと各プローブ要素12a〜12dを操作するために使用することができる。
プローブ要素12a〜12dは、この構成においては、各開口14a〜14dを通りレセプタクルの内部内へと押し込まれ得る。
装着されたプローブ要素から離れた端部に、各四分円弧体13a〜13dは、四分円弧体の長尺方向に対してほぼ平行に延在するタブ17を備えて形成される。タブ17は、各レセプタクル11中に画成される内部空間内へのプローブ要素12a〜12dの手による微細操作を容易にするために使用することができる。
各プローブ要素12a〜12dは、プローブ要素/ハンドルの組合せ体の正確な構成に応じて、例えば環状カラーの形態でなど一体的に形成されるかまたは固定される円筒状封止部材16により、対応するハンドル四分円弧体13a〜13dに固定される。
各開口14は、断面が円形である。各封止部材16の直径は、装着されたプローブ要素12をレセプタクル11内部に挿入すると、封止部材16が液体、特に核酸を含有または搬送する液体の入出を防ぐようにレセプタクルをしっかりと封止するような直径である。その結果、いずれの例においても、プローブ要素12に付着する核酸は、中の試薬へと差し出されるか、または中の試薬と接触状態に置かれる。その結果、例えば本明細書において論じる種類の核酸増幅反応が生じる。
典型的には、レセプタクル11は、透明もしくは半透明の材料から製造されるか、または1つまたは複数の透明もしくは半透明の窓を備える。その結果、反応結果の光学評価を例えば光学装置などを使用して実施することが可能となる。したがって、フレーム16および/またはレセプタクル11は、かかる装置と共に使用するのに適した形状設定およびサイズ設定をなされ得る。
次に図11〜図16を参照すると、本発明による核酸採取装置21、22、23の別の実施形態が、各図において示される。
図11においては、4つのレセプタクル21a、21b、21c、21dが、核酸に対して不活性である(すなわち影響を有さない)ポリマー材料の剛性シート24の使用時下側から下方に延在する中空裁頭円錐形部材として形成される。本発明の好ましい実施形態においては、レセプタクル21a〜21dは、シート24と一体成形することにより形成される。
図示するようなレセプタクル21a〜21dは、正方形シート24の4つの隅部に隣接して形成されるが、他の個数およびパターンのレセプタクル21も、本発明の範囲内において可能であり、シート24は、図示される実質的に正方形の形状をとる必要はない。
レセプタクル21a〜21dは、レセプタクル21a〜21dの使用時最上端部に形成された開口27a〜27dを閉鎖するフォイルなどの封止部材により初めに封止された形態で供給されてもよい。したがって、レセプタクルは、事前封止された状態で、および例えばPCRまたは他の増幅試薬を収容した状態で、この装置を使用することが求められるまではかかる試薬の純度を確保するような態様で供給されてもよい。使用が求められる時には、本明細書において以下に説明するプローブ要素22a、22b、22c、22dを中に挿入するための穴を開くために、存在するフォイルがシート24から剥離され得る。
プローブ要素22a〜22dは、本発明の原理により核酸が付着し得る、本明細書において論じる中の1つなどの材料からなる各円錐体または円錐セクションとして形成される。しかし、本発明の範囲内の代替的な一構成においては、これらの円錐体は、必要な装置のパーツに対する核酸付着を可能にする材料で被覆されてもよく、または先端を覆われてもよい。さらに、円錐体またはその一部以外の他の形状を成してもよいが、図示するセクション状円錐体が、プローブ要素として特に適したものと考えられる。
プローブ要素22a〜22dは、例えばポリマー材料、特に上述のような核酸に対して「不活性」である材料からなるさらなるシート28の一方の側部から突出する。実際に、典型的には、シート28は、プローブチップと同一の材料から作製される。
また、シート28は、基本的に正方形であり、または各基本的に円形のフランジがプローブ要素22a〜22dを画成する各円錐体の幅広(上方)端部の周囲に延在するように、4つ葉のクローバに類似するような態様で形状設定されてもよい。各プローブ要素の上方端部に隣接するフランジ28または他のシート形成体は、相互に接合されて、既述のシート形状を画定する。
図示するように、4つのプローブ要素は全て、シートが図11〜図16に示すような応力を被っていない構成をとる場合には、基本的に同一方向においてシート28の同一側部から延在する。
プローブ要素22a〜22dから離れた側部では、シート28は、初めて使用される際に、細長マニピュレータ23の一方の端部に取外し自在に固定される。
マニピュレータ23は、手で把持するようにサイズ設定され、多様なプラスチック材料または合金の中の任意のものなどの剛性材料から主に形成される。マニピュレータ23の主要構成材料として、自然発生材料またはガラスを使用することは、除外はされないが、これらの材料は、既述のプラスチックおよび金属と同様に形成および取扱いに好都合なものとは考えられていない。
マニピュレータ23は、シート28が解除可能装着部31にて固定される端部が幅広である細長中空円筒状シャンク30を備える。対向側の端部では、シャンク29は、多様な可能な形態をとり得る把持ハンドル32の形状で終端する。
図示する実施形態においては、このハンドルは、シャンク30の長尺方向に対して直交方向に延在し、補強ステム部材32cによりこの長尺方向において相互に離間された、2つの平行な平坦プレート32a、32bを備える。
シャンク30の上方端部は、その両側部に、シャンク30の両側部上に配設された一対のフランジ26a、26bを備える。
各フランジ26a、26bは、内方に向き、開口した端部を有する溝26c、26dを画成する。各溝26c、26dは、図11に図示するように、シャンク30の両側部において相互に対向する。
プレート32aの使用時下側から延在し、この下側に剛体的に固定される細長プランジャ29は、シャンク30の中空内部内に滑り嵌めされる。プランジャ29は、上方平坦プレート32bを把持することによって、図11に図示するような部分露出位置と、シャンク30の内部内に完全に受けられた状態となるさらに進んだ位置との間において移動可能となる。
後者の位置においては、上方平坦プレート32bは、回転されることにより、平行な下方平坦プレート32aの端部を、フランジ26a、26bにより画成される対向し合う溝内に進入させ、これにより、先述の溝から下方平坦プレート32aの端部を外すように上方プレート32bが意図的に回転されない限りは、プランジャ29が部分露出位置へと戻るのを防止することができる。
次に、この構成の目的を説明する。
シート28は、装着部31の終端外周部に固定される。装着部31は、中空内部を備え、この中に、プランジャ29の使用時下方端部が、シャンクの長尺方向に対して平行な方向に延在する。プランジャ29は、上述の部分露出位置と収納位置との間における移動時に、シート28から遠いチップ33が継続的に接触状態に置かれる構成と、プローブ要素がレセプタクル21a〜21dの間隔に相当する間隔だけ相互に離間される図11〜図16に図示するような構成との間において、プローブ要素22a〜22dを選択的に移動させるためのアクティベータとしての役割を果たす。
プランジャ29は、シート28が可撓性であることにより、この効果を実現する。プランジャ29は、マニピュレータ23が初期状態にある場合には、シート28に固定される。ロッドは、上述のように中空シャンク30内部において移動可能である。したがって、ロッドが収納位置の方向に移動することにより、装着部31の内側の部分的内部に可撓性シート28が引き込まれる。さらに、これにより、チップパーツ33同士が相互の方向に引っ張られて、チップパーツ同士が相互に接触状態にある複合チップを画定し、核酸含有物質を収容するための単一領域を画定する。
通常は、シャンク30の内側に沿ったロッドの移動は、プレート32bを引っ張ることにより実施されるが、複数の他の方式においても実現し得る。
例えば、図17に示すようなロッドに連結されたピン30aは、シャンク30の外側上に突出するようにスロット30b内に摺動自在に捕獲された状態に維持されてもよい。ユーザは、回転運動-線形運動間変換機構を備える構成によりロッドに連結されたキャップ32''を回転させることによって、ロッドを移動させることができる。ロッドの移動中に、ピンは、スロットに沿って摺動するため、このスロットは、ロッド用の容易に検出可能な位置末端停止部を画定する。既述のようなロッドの移動により、シート28は、図17においては円錐形状である装着部31の内側に引き込まれる。
図11〜図16のデバイスの一変形形態である図17においては、ハンドル32は、基本的に円筒形状であり、2つのパーツ32'(シャンク30に接合される)および32''(シャンク30から遠方の)において形成される。ハンドルパーツ32''は、パーツ32'に対して回転自在であり、ハンドル32およびシャンク30の内部のロッキング機構に連結される。パーツ32'に対してパーツ32''を回転させることにより、スロット30b内におけるピン30aの位置により例示されるような引戻り位置にロッドを維持するためのロッキング機構が、選択的に作動される。
しかし、このような調節装置が使用されてもなお、プランジャ29を外した際に、シートの弾性により、プローブ要素22a〜22dが、図11〜図16に図示する応力を被らない相互に離間された構成へと戻り、プランジャ29が、逆方向へとシャンク30内部に移動することが好ましい。
先述のことに加えて、解除可能な種類の他のタイプのロック、クリップ、または戻り止めが、プローブ要素22a〜22dを連続構成に選択的に維持するために用意されてもよい。典型的には、かかるロック等々は、既説の連続チップパーツ構成に対応する位置にプランジャ29を維持する役割を果たす。
シート28は、その中央部分に、ほぼ同一方向に延在するがより短い距離にわたり延在する、円形「銛」要素34の形態の変更防止型固定タグを、プローブ要素として備える。この構成要素の目的および作動は、以下において説明する。レセプタクル分野の当業者には想起されるであろう他の形態のプローブ用取付具が、本発明の範囲内に含まれる。
プローブ要素22a〜22dは、壊して外すことが可能であるか、または他の態様でマニピュレータ23から外される。これは、例えばシート28のフランジと残りの部分との間の連結部が易損性部分により画定されることなどによって、実現され得る。図示する好ましい構成においては、シート28全体が、選択的に解除可能なクランプ機構により、マニピュレータ23上に一時的に捕獲された状態に維持され得る。
図11〜図16または図17の装置の使用時には、プランジャ29は、初めに、上述のものなどのアクティベータ機構の作動によりシャンク30の内部に移動され、上述のようにチップパーツ同士が共に近づく状態に対応した位置においてロックされる(ロックが存在する場合)。プランジャ29のかかる移動は、選択されるそのものの構成に応じて、シャンク30に対して上下方向であってもよい。図11の実施形態においては、プランジャのロックは、上方平坦プレート32bを回転させることにより、下表平坦プレート32aのエッジを溝26c、26d内に進入させることによって、実現される。
プランジャ29のこの移動により、プローブ要素22a〜22dのチップパーツ33a〜33dは、連続構成をとり、それによって、核酸含有表面を有する基本的に単一のプローブの形態を呈する。
この表面は、ハンドル32を使用した操作により、核酸含有物質の中に挿入され得るか、または核酸含有物質に対して擦り付けられ得る。少なくともチップパーツ33a〜33dを作製するための材料を鑑みると、これにより、チップパーツ33a〜33dにより画定される複合チップに対する核酸または核酸を含有する物質の基本的に均一な付着がもたらされる。
このプロセスおよび実際には後の装置の作動の間に、オペレータは、把持ハンドル32を把持する。これにより、オペレータは、シャンク30の長さによりハンドル32から離間されたプローブ要素への接触を回避することが可能となる。
複合チップによる核酸含有物質の擦り付けおよび他の接触により、略均等量の核酸が、チップパーツ33のそれぞれに付着状態となる。
これが行われると、プランジャ29は、外される(例えばロックを解除することによって、または既述のように上方平坦プレート32bを回転させることによって)。シート28の弾性により、プローブ要素は、レセプタクル21a〜21d中の開口27a〜27dと位置合わせされ得る、応力を被らない相互に離間された構成をとる。この動作は、プランジャ29が、チップ33の連続構成をもたらす方向とは逆方向に移動することにより生じる。
レセプタクル21を覆うフォイルの除去(好ましくは剥離による)の後に、プローブ要素22a〜22dは、レセプタクル21の内部に挿入され、プローブ要素上に支持される核酸は、増幅試薬に対して露出された状態となる。レセプタクル21a〜21dは、結果的に得られる反応結果を光学装置を使用して評価し得るように、透明または半透明である。
プローブ要素22a〜22dのテーパ形状は、レセプタクル21a〜21d内への挿入時に、プローブ要素22a〜22dが、レセプタクルの内方壁部表面の頂部領域との間に締り嵌めを生ずることによってレセプタクルを封止するように選択されてもよい。
当然ながら、当業者に想起されるであろうようなレセプタクルを封止する他の方式が、本発明の範囲内に含まれる。本発明の装置は、例えば証拠材料の完全性が非常に重要となる犯罪訴訟事例などにおいて使用を見出すことが期待されるため、効果的な封止が生じるように確保することが主に重要となる。
任意には、レセプタクル21a〜21dが中に成形または他の態様で形成されるシート24は、中央貫通孔を備える。この孔の目的は、レセプタクル21a〜21d内にプローブ要素22a〜22dを挿入する際または挿入後に(やはり任意のものである)円錐状戻り止め部材34を受けることである。
戻り止め部材34は、プローブ要素22a〜22dと同じシート28の側において主に延在し、傾斜表面およびアンダーカット表面を備える。これらの傾斜表面およびアンダーカット表面により、戻り止め部材34は、レセプタクル内にプローブ要素22a〜22dをかように挿入した際に、シート24中の孔内にスナップ嵌めの態様でロックされた状態となり得る。
したがって、戻り止め部材34および孔の全体的な効果は、レセプタクル21a〜21d内におけるプローブ要素の「変更防止」固定を可能にすることである。この特徴は、本発明の装置が、例えば犯罪訴訟事例または病気の発生に対する公的調査などにおける証拠としての役割を果たすことが必要となる場合には、特に有用となる。
本発明の図10a〜図10dの例におけるように、図11〜図16の実施形態においては、好ましくは、レセプタクルは、レセプタクル内部の状況の阻害を伴うことなく増幅結果の評価を容易化するために、半透明または透明である。レセプタクルの内部の材料は、中に保持されるように意図された試薬に対して不活性となるように選択される。
図10〜図16の実施形態は全て、オプションのレセプタクル内への挿入時に何らかの形においてシールを形成するプローブの特徴を特徴とする。その結果、プローブ要素は、DNA増幅反応が生じている間、マニピュレータに連結された状態に留まり得る。
以下において説明する実施形態においては、プローブ要素は、レセプタクル内においてマニピュレータから分離され、独立したクロージャが、レセプタクルを封止するために使用される。
図18〜図20は、ある程度の弾性変形性または「形状記憶」を有するプローブ要素に幾分か依拠する本発明の他の一実施形態を断面図および側方立面図において示す。この特徴により、上述の実施形態の特徴である集束構成と相互に離間された構成との間においてプローブ要素を変形させることが可能となる。
図18〜図20においては、プローブ要素52a〜52dは、細長ハウジング53の形態のマニピュレータの内部に捕獲された状態で維持される。プローブ要素は、全てが同一長さの細長ロッドの形態をとる。これらのロッドはそれぞれ、いわゆる形状記憶合金材料から形成され、核酸採取に適したものとして本明細書において説明する材料の中の1つから作製された取外し可能なチップパーツ54を自由端部に備える。図20は、拡大斜視図においてこのチップパーツ54の中の1つを示す。
プローブ要素は、ハウジング53のハンドル部分56の内側にクランプ固定されることにより、チップパーツから遠く離れた端部にて束状に一体的に固定される。
ハウジング53の中空円筒状シース部分57の形態のプローブ要素アクティベータが、プローブ要素52a〜52dの束に沿って移動可能となるように、上に摺動自在に捕獲された状態に維持される。供給時のままの状態においては、シース部分57は、プローブ要素52a〜52dの長さの殆どにわたってプローブ要素52a〜52dに重なる。シース部分57は、チップパーツ54から遠く離れた端部に、シース部分57の円筒状壁部からシース部分57の内側へ内方に突出するリング51の形態の環状の弾性変形可能な戻り止めを備える。リング51は、ロッドがクランプ固定されるハンドル部分56の部分の外方表面中に形成された前方環状戻り止め溝51aおよび後方環状戻り止め溝51bのそれぞれの中に選択的に「スナップ嵌め」されることが可能である。シース部分57は、所望に応じて溝51aまたは溝51bのいずれかにリング51を係合させるように、ハンドル部分56に沿って摺動自在である。さらに、これにより、シース部分57は、ハンドル56上の2つの位置のいずれかに解除自在に保持される。
プローブ要素52a〜52dは、応力を被らない状態においては、チップパーツ54を支持する自由端部が広がってチップパーツ54の相互間に間隔をもたらすように、屈曲状である。この構成においては、プローブ要素52a〜52dは、上述のレセプタクル21a〜21dなどのレセプタクル内への挿入に適したものとなる。シース部分57は、ハウジング53に沿ってハンドル部分56の方向に引っ張られることにより、この状況を実現することができる。
チップパーツ54への方向へと逆方向にシース部分57を移動させてチップパーツ54の近傍にシース部分57を配置することにより、プローブ要素52a〜52dの屈曲部分は直線状になる。その結果、チップパーツ54同士は、プローブ要素の弾性変形性に逆らって収束して、相互に隣接した状態となり、核酸含有物質との係合に適した複合チップを画定する。
結果的に得られる複合チップは、ハンドル部分56を手で把持することによりかかる物質に係合され得る。シース部分は、所望に応じて手動により作動されることにより、引戻り位置と近位位置との間で移動され(上述の戻り止め構成を有する場合には、シース部分が移動範囲の一方または他方の端部にて一時的に保持される)、したがって収束構成と分岐構成との間でプローブ要素52a〜52dを変換させ得る。
プローブ要素52a〜52dを画定するロッドは、中空で開口端部を有する。図20に図示するように、各チップパーツ54は、ロッドの中の1つの実質的に同一の外径のシリンダ54aとして定義され、一方の端部からより小径の円筒状スタッド54bが突出する。
各スタッド54bは、ロッドの中の1つの開口端部中に摩擦嵌めされる。ロッドに対してチップパーツを保持するこの摩擦は、以下において説明する押出機構により比較的容易に克服され得る。
押出機構は、部分的には、チップ部分54から遠く離れた端部にてハンドル部分56から突出する円筒状押しボタン58として定義される。
押しボタン58は、ハンドル部分56の前記端部中に形成された細長円筒状ボア61内において、例えば保持ばね59に対する親指の押圧などの下で軸方向に移動可能である。
押しボタン58は、ハウジング53内部にて、プローブ要素52a〜52dを画定するロッドの中空内部に沿って延在する4つの可撓性押出ロッド62に剛体的に連結されて、チップパーツ54のスタッド54bに係合する。
したがって、チップパーツ54を広げさせるためにシース部分57を引いた後に、および核酸で被覆されたチップパーツ54を各レセプタクル21a〜21d内に挿入した後に、押しボタン58を作動させることにより、チップパーツがこれらのレセプタクル内に突き出されることが明らかであろう。
レセプタクルは、プローブ要素52a〜52dを引いた後に、例えば栓など(しかしこれに限定されない)のクロージャを使用して閉鎖されてもよく、それにより、チップパーツ54a〜54dは、レセプタクル内部において個別に封止された状態となり、次いで、これらのレセプタクル内でPCR増幅が行われ得る。
押しボタン58を解除することにより、押出ロッドが引かれて、必要である場合には洗浄後に、新しいチップパーツ54をプローブ要素52a〜52dの開口端部へと装着することができる。あるいは、アセンブリ全体が廃棄され得る。図18に図示する位置へとシース部分57を前進させることにより、チップパーツ54同士は、収束し、さらなる核酸採取操作の実施が可能な図示する連続的関係を再び呈する。
次に図21〜図24を参照すると、装置の別の変形形態が図示される。
図21、図22、および図24により最も良好に図示されるように、ハンドル66は、相互に同一の直径を有する使用時上方円筒状バレル67および使用時下方円筒状バレル68を備える。
下方バレル68は、自由端部から突出する、基本的に三角形のプレート69a〜69dの形態の一連の4つの可動サポートを有する。
バレル67、68は、以下において説明するカム動作によってプレート69a〜69dを移動させるように、図21において矢印で示されるように相互に対して回転可能である。このように、プレート69a〜69dは、複数のチップ部分71a、71b、71c、71dが装置の長手方向中心軸に近い連続(核酸採取)構成となる図21に示す初期位置から、図24において破線により示す、および図22の斜視図において示す後のチップ突出し位置へと移動可能となる。後者の位置においては、全てのチップ部分71は、中心軸から離間されて位置し、以下において説明するレセプタクル21などの各レセプタクル内への突出しを行うように位置決めされる。
プレート69a〜69dは、デバイスの複数部分が2分された図の中で各作動位置を呈しているのを図示する断面図である図23に示すように、基本的に直角を有する三角形プレートであり、図21の初期位置においては、この直角三角形の斜辺は、鈍端部72を画定するように収束する。
三角形プレート69はそれぞれ、回転自在枢動ピン73により上方から枢動自在に懸下される。各枢動ピン73は、上方バレル67の下側を、プレート69の隣接する非斜辺エッジ74に、このエッジ74長さに沿ったほぼ中間において連結する。
枢動ピン73のラジアル方向に外方に位置するプレート69の頂端部76は、ばね77により下方バレル68に対して捕獲された状態に維持される。上方バレル67および下方バレル68は、相互に対して捕獲され、デバイスの外方外周部に隣接する上方バレル67と下方バレル68との間に捕獲された保持ばね83(実際には4つの)の作用に逆らって相互に対して軸方向に移動することが可能である。バレル67、68の軸方向移動を許容するために、下方バレル68内部に形成される保持リング78および下方バレル68の中空内部の周囲に延在する保持リング79の2つのリングが、相互から軸方向に離間され、それらの間に、下方バレル68内に受けられる上方バレル67の一部の外側に形成された環状フランジまたは部分環状フランジを可動的に捕捉する。
この構成では、上方バレル67および下方バレル68を相互に対して回転させると、各サポート(プレート)69は、枢動ピン73により規定される垂直軸を中心として枢動する。
これにより、各プレート69の垂直方向に延在する非斜辺エッジ82は、図21、図24、および図23の左半分に示す中央当接位置から、図22および図23の右半分に示すデバイス軸から離間された突出し位置へと、同時に搖動する。
各エッジ82の近傍においては、各サポート69は、中空であり、サポートの上部から下部へと延在する細長ボア84を画成する。
上述のチップパーツ54と基本的に同一設計の各チップパーツ71は、そのスタッドがボア84内に押し込まれることにより、各ボア84の図示するような下方端部に捕獲された状態に維持される。
ドーム状キャップ87を有する押出ロッド86が、ボア84の上方端部から突出し、チップパーツ54のスタッドの端部の真上の高さまでこのボア84に沿って延在する。押出ロッド86の最下端部とチップパーツ54のスタッドとの間の間隔は、ドーム状キャップ87の下側と各プレート69のエッジ74との間の間隔よりも若干狭い。
図22の位置にプレート69を移動させることにより、押出ロッド86の各キャップ87は、搖動して、上方バレル67の下側から下方に突出する各押圧部材88と整列状態になる。
保持ばね83の力に逆らってバレル67および68を共に押し付け合うことにより、押圧部材88は、キャップ87に係合する。これにより、押出ロッドは、下方に駆動されて、スタッドに係合し、それによりプレート69からレセプタクル内へとチップパーツ71をそれぞれ突き出す。これらのレセプタクルは、後に例えば栓または他のクロージャを使用して封止され得る。
11 レセプタクル
12 プローブ要素
12a プローブ要素
12b プローブ要素
12c プローブ要素
12d プローブ要素
13 変形可能ハンドル
13a 四分円弧体
13b 四分円弧体
13c 四分円弧体
13d 四分円弧体
14 開口
15 当接面
15a 戻り止めピン
15b 凹部
16 円筒状封止部材
17 タブ
21 レセプタクル
21a レセプタクル
21b レセプタクル
21c レセプタクル
21d レセプタクル
22a プローブ要素
22b プローブ要素
22c プローブ要素
22d プローブ要素
23 細長マニピュレータ
24 剛性シート
26a フランジ
26b フランジ
26c 溝
26d 溝
27a 開口
27b 開口
27c 開口
27d 開口
28 シート
29 プランジャ
30 シャンク
30a ピン
30b スロット
31 解除可能装着部
32 把持ハンドル
32' パーツ
32'' キャップ、パーツ
32a 下方平坦プレート
32b 上方平坦プレート
32c 補強ステム部材
33 チップパーツ
33a チップパーツ
33b チップパーツ
33c チップパーツ
33d チップパーツ
34 円錐状戻り止め部材
51 リング
51a 前方環状戻り止め溝
51b 後方環状戻り止め溝
52a プローブ要素
52b プローブ要素
52c プローブ要素
52d プローブ要素
53 ハウジング
54 チップパーツ
54a シリンダ
54b 円筒状スタッド
54c チップパーツ
54d チップパーツ
56 ハンドル部分
57 シース部分
58 押しボタン
59 保持ばね
61 細長円筒状ボア
62 可撓性押出ロッド
66 ハンドル
67 使用時上方円筒状バレル
68 使用時下方円筒状バレル
69a プレート
69b プレート
69c プレート
69d プレート
71 チップパーツ
71a チップ部分
71b チップ部分
71c チップ部分
71d チップ部分
72 鈍端部
73 回転自在枢動ピン
74 非斜辺エッジ
76 頂端部
77 ばね
78 保持リング
79 保持リング
82 非斜辺エッジ
83 保持ばね
84 ボア
86 押出ロッド
87 キャップ
88 押圧部材
12 プローブ要素
12a プローブ要素
12b プローブ要素
12c プローブ要素
12d プローブ要素
13 変形可能ハンドル
13a 四分円弧体
13b 四分円弧体
13c 四分円弧体
13d 四分円弧体
14 開口
15 当接面
15a 戻り止めピン
15b 凹部
16 円筒状封止部材
17 タブ
21 レセプタクル
21a レセプタクル
21b レセプタクル
21c レセプタクル
21d レセプタクル
22a プローブ要素
22b プローブ要素
22c プローブ要素
22d プローブ要素
23 細長マニピュレータ
24 剛性シート
26a フランジ
26b フランジ
26c 溝
26d 溝
27a 開口
27b 開口
27c 開口
27d 開口
28 シート
29 プランジャ
30 シャンク
30a ピン
30b スロット
31 解除可能装着部
32 把持ハンドル
32' パーツ
32'' キャップ、パーツ
32a 下方平坦プレート
32b 上方平坦プレート
32c 補強ステム部材
33 チップパーツ
33a チップパーツ
33b チップパーツ
33c チップパーツ
33d チップパーツ
34 円錐状戻り止め部材
51 リング
51a 前方環状戻り止め溝
51b 後方環状戻り止め溝
52a プローブ要素
52b プローブ要素
52c プローブ要素
52d プローブ要素
53 ハウジング
54 チップパーツ
54a シリンダ
54b 円筒状スタッド
54c チップパーツ
54d チップパーツ
56 ハンドル部分
57 シース部分
58 押しボタン
59 保持ばね
61 細長円筒状ボア
62 可撓性押出ロッド
66 ハンドル
67 使用時上方円筒状バレル
68 使用時下方円筒状バレル
69a プレート
69b プレート
69c プレート
69d プレート
71 チップパーツ
71a チップ部分
71b チップ部分
71c チップ部分
71d チップ部分
72 鈍端部
73 回転自在枢動ピン
74 非斜辺エッジ
76 頂端部
77 ばね
78 保持リング
79 保持リング
82 非斜辺エッジ
83 保持ばね
84 ボア
86 押出ロッド
87 キャップ
88 押圧部材
Claims (77)
- 核酸試料を支持するためのプローブと、前記プローブの操作を可能にするように前記プローブに装着可能なマニピュレータであって、前記プローブは前記マニピュレータから独立したものである、マニピュレータとを備える、核酸採取装置であって、前記プローブは、連続構成と相互に離間された構成との間において相互に移動可能な複数のプローブ要素を備え、各プローブ要素は、前記プローブ要素が連続構成をとる場合に、他のチップパーツと組み合わされることにより、核酸の試料を搬送するために前記核酸に接触することが可能な複合チップを画定するチップパーツを備える、核酸採取装置。
- 前記複合チップは、画定された場合に、前記チップパーツにそれぞれ固定され、前記チップパーツと個数において一致する、複数の核酸接触部を備え、各前記核酸接触部は、前記複合チップが核酸に接触した際に、ほぼ同一量の核酸に係合する、請求項1に記載の装置。
- 前記マニピュレータは、前記連続構成と前記相互に離間された構成との間における前記プローブ要素の選択的移動を生じさせるためのプローブ要素アクティベータを備える、請求項1または2に記載の装置。
- 前記マニピュレータは、細長シャンクを備え、前記プローブ要素アクティベータは、前記連続構成と前記相互に離間された構成との間において前記プローブ要素の選択的移動を生じさせるように、前記シャンクに沿って移動可能である、請求項2に記載の装置。
- 前記シャンクは、中空であり、前記プローブ要素アクティベータは、前記シャンクの内部内に実質的に位置し、前記シャンクの内部で移動可能である、請求項4に記載の装置。
- 前記シャンクは、中に形成された貫通孔を備え、前記プローブ要素アクティベータは、前記シャンク内部において前記シャンクを移動させるために、前記貫通孔を経由して接触可能である、請求項5に記載の装置。
- 前記マニピュレータは、前記プローブ要素アクティベータに作動的に連結される回転自在部材を備え、前記回転自在部材を回転させることにより、前記プローブ要素アクティベータは、前記連続構成と前記相互に離間された構成との間において前記プローブ要素を移動させる、請求項3に記載の装置。
- 各プローブ要素は、一方の端部に前記チップパーツを有する弾性変形可能な細長部材を備え、前記細長部材同士は、前記チップパーツが同一端部に位置する状態で相互に横付けされて延在する束状部として構成され、各プローブ要素は、前記チップパーツ同士が相互に分岐する傾向となるように屈曲状であり、前記プローブ要素アクティベータは、前記束状部を包囲し、前記束状部の各要素に沿って移動可能なシース部分を備え、前記シース部分は、前記チップパーツの近傍に位置する場合には、前記チップパーツ同士を前記プローブ要素の弾性変形性に逆らって収束させて前記複合チップを画定させ、前記シース部分は、前記束状部に沿って前記チップパーツから離間されている場合には、前記プローブ要素の屈曲状形状および弾性変形性により前記チップパーツ同士を相互から分岐させ得る、請求項3または請求項7に記載の装置。
- 前記シース部分を所定位置に保持するための1つまたは複数の解除自在戻り止めを備える、請求項8に記載の装置。
- 前記チップパーツを備える自由端部をそれぞれが画定する複数の前記プローブ要素を支持する弾性変形可能シートを備え、前記シートは、前記チップパーツ同士が相互に分岐する構成と、前記チップパーツ同士が前記複合チップを画定するように前記プローブ要素同士が連続状態となる変形構成との間において変形可能である、請求項3または請求4から7のいずれかに記載の装置。
- 1つまたは複数の試薬および核酸試料を収容するための、封止可能開口を備えるレセプタクルをさらに備え、前記マニピュレータの操作により、前記レセプタクル内に前記試料を配置するように前記プローブが前記開口を通して挿入されるまたは挿入され得る、請求項1から10のいずれかに記載の装置。
- 前記プローブは、前記レセプタクル内に前記試料を配置した際に、核酸含有物質の入出を防止するために前記レセプタクルを閉鎖するクロージャを備える、請求項11に記載の装置。
- 前記クロージャは、前記プローブに固定されるかまたは前記プローブと一体である液密封止部材であるか、または前記液密封止部材を備える、請求項12に記載の装置。
- 複数の前記プローブに固定されるかまたは複数の前記プローブと一体であるクロージャを備える、請求項12に記載の装置。
- 前記クロージャおよび前記マニピュレータは、相互に選択的に分離可能である、請求項11から14のいずれかに記載の装置。
- 前記マニピュレータは、周囲環境から複数の前記プローブを隔離するように複数の前記プローブを保持するソースと、核酸と係合させるためにそれぞれの少なくとも一部を露出させるように逐次的に前記プローブを差し出すためのディスペンス機構とを備える、請求項1から15のいずれかに記載の装置。
- 前記ソースは、1つまたは複数のプローブを収容するチャンバであるか、または前記チャンバを備え、前記チャンバは、前記ディスペンス機構の作動時に前記プローブを通して突出させ得るチャンバ開口を備える、請求項16に記載の装置。
- 突出するプローブが、ディスペンス時に前記チャンバ開口を閉鎖する、請求項17に記載の装置。
- 前記マニピュレータは、前記プローブから前記マニピュレータを分離させた際に、前記マニピュレータから少なくとも1つの前記プローブを突き出させる1つまたは複数のイジェクタを備え、前記イジェクタまたは各イジェクタは、突き出されるべき前記プローブから遠く離れた前記マニピュレータ上の位置から操作可能である、請求項1から18のいずれかに記載の装置。
- 複数の前記プローブと、前記マニピュレータから2つ以上のプローブを突き出させせるための共有イジェクタとを備える、請求項19に記載の装置。
- 複数の前記プローブと、対応する個数の複数のイジェクタとを備え、前記イジェクタがそれぞれ、各前記プローブを突き出させるように操作可能である、請求項19に記載の装置。
- 前記プローブまたは各プローブは、前記マニピュレータの操作時にレセプタクル内に核酸の試料を導入するために、使用時に前記核酸に接触することが可能なチップを備えるか、または前記チップを画定するように構成可能である、請求項1から21のいずれかに記載の装置。
- 少なくとも前記チップは、DNAまたは高等真核生物の核酸含有物質が付着するポリマー材料から作製されるか、または前記ポリマー材料を含む、請求項22に記載の装置。
- 前記ポリマー材料は、ポリカーボネート、ガラス、環状オレフィンコポリマー、アクリル樹脂、結晶ポリスチレン、ポリプロピレン、HDPE、中耐衝撃性ポリスチレン、PVC、液体結晶ポリマー30%、Trans ABS、アセタールコポリマー、ポリエステル、ポリエーテルイミド、ポリエチレン、ナイロン、ポリエーテルポリウレタン、スチレンブタジエンブロックコポリマー、ポリプロピレンランダムコポリマー、エチレンビニルアセテート、シロキサン、および熱可塑性エラストマーを含むリストから選択される、請求項22に記載の装置。
- 環状オレフィンコポリマーがTopasである、請求項24に記載の装置。
- アクリル樹脂がPMMAである、請求項24に記載の装置。
- シロキサンがPDMSである、請求項24に記載の装置。
- 熱可塑性エラストマーがサントプレーンである、請求項24に記載の装置。
- 高等真核生物の核酸ソースからの核酸を増幅するための方法であって、
(a)高等真核生物の前記核酸ソースに、請求項1から28のいずれかに記載の採取装置を接触させることにより、前記接触後に、高等真核生物の核酸含有物質が前記採取装置の少なくとも一部に付着するステップであって、前記核酸含有物質が付着する前記採取装置または前記採取装置の一部は、ポリマー材料から作製される、ステップと、
(b)前記核酸含有物質の事前処理を伴うことなく、核酸増幅反応を生じさせるための反応混合物を収容する反応容器内に、前記核酸含有物質が付着する前記採取装置または前記採取装置の一部を導入するステップと、
(c)核酸増幅反応を実施するステップと
を含む、方法。 - 高等真核生物ソースから核酸含有物質の試料を取得し、事前処理を伴うことなく核酸増幅用の反応混合物を収容する反応容器内に前記試料を導入するための、請求項1から28のいずれかに記載の採取装置の使用であって、前記核酸含有物質が付着する前記採取装置または前記採取装置の一部は、接触時に前記核酸含有物質が付着するポリマー材料から作製される、使用。
- 前記ポリマー材料は、ポリカーボネート、ガラス、環状オレフィンコポリマー、アクリル樹脂、結晶ポリスチレン、ポリプロピレン、HDPE、中耐衝撃性ポリスチレン、PVC、液体結晶ポリマー30%、Trans ABS、アセタールコポリマー、ポリエステル、ポリエーテルイミド、ポリエチレン、ナイロン、ポリエーテルポリウレタン、スチレンブタジエンブロックコポリマー、ポリプロピレンランダムコポリマー、エチレンビニルアセテート、シロキサン、および熱可塑性エラストマーの中のいずれかから選択される、請求項29に記載の方法または請求項30に記載の使用。
- 高等真核生物の核酸ソースは、実質的に乾燥状態にある、請求項29もしくは31に記載の方法または請求項30もしくは31に記載の使用。
- 高等真核生物の核酸ソースからの核酸を増幅するための方法であって、
(a)高等真核生物の前記核酸ソースに、請求項1から28のいずれかに記載の採取装置を接触させることにより、前記接触後に、高等真核生物の核酸含有物質が前記採取装置の少なくとも一部に付着するステップであって、高等真核生物の前記核酸ソースは、実質的に乾燥状態にある、ステップと、
(b)前記核酸含有物質の事前処理を伴うことなく、核酸増幅反応を生じさせるための反応混合物を収容する反応容器内に、前記核酸含有物質が付着する前記採取装置または前記採取装置の一部を導入するステップと、
(c)核酸増幅反応を実施するステップと
を含む、方法。 - 前記核酸含有物質が付着する前記採取装置または前記採取装置の一部は、ガラス、ポリカーボネート、環状オレフィンコポリマー、アクリル樹脂、結晶ポリスチレン、ポリプロピレン、HDPE、中耐衝撃性ポリスチレン、PVC、液体結晶ポリマー30%、Trans ABS、アセタールコポリマー、ポリエステル、ポリエーテルイミド、ポリエチレン、ナイロン、ポリエーテルポリウレタン、スチレンブタジエンブロックコポリマー、ポリプロピレンランダムコポリマー、エチレンビニルアセテート、シロキサン、および熱可塑性エラストマーの中のいずれかから作製される、請求項33に記載の方法。
- 前記反応混合物は、カオトロピック剤を実質的に含まない、請求項29から34のいずれかに記載の方法または使用。
- 前記反応混合物は、細胞溶解剤を実質的に含まない、請求項29から35のいずれかに記載の方法または使用。
- 前記核酸含有物質が付着する前記採取装置または前記採取装置の一部は、前記反応容器に対してシールを提供する、請求項29から36のいずれか一項に記載の方法または使用。
- 高等真核生物の核酸ソースから核酸を取得し、次いで事前処理を伴うことなく核酸増幅反応混合物を収容する反応容器内に高等真核生物の核酸ソースを導入するための、請求項1から28のいずれかに記載の核酸採取装置の使用であって、高等真核生物の前記核酸ソースは、実質的に乾燥状態にある、使用。
- 高等真核生物が、哺乳動物または植物である、請求項29、32、もしくは33に記載の方法、または請求項38に記載の使用。
- 前記核酸は、前記採取装置または前記採取装置の一部に付着され、前記核酸含有物質が付着する前記採取装置または前記採取装置の一部は、ポリカーボネート、ガラス、環状オレフィンコポリマー、アクリル樹脂、結晶ポリスチレン、ポリプロピレン、HDPE、中耐衝撃性ポリスチレン、PVC、液体結晶ポリマー30%、Trans ABS、アセタールコポリマー、ポリエステル、ポリエーテルイミド、ポリエチレン、ナイロン、ポリエーテルポリウレタン、スチレンブタジエンブロックコポリマー、ポリプロピレンランダムコポリマー、エチレンビニルアセテート、シロキサン、および熱可塑性エラストマーの中のいずれかから作製される、請求項38または39に記載の使用。
- 反応混合物および核酸含有物質を収容し、核酸増幅反応を実施することが可能な状態にある、反応容器を準備するための方法であって、
(a)核酸増幅反応を実施するための前記反応混合物を収容する単一のチャンバを有する反応容器を用意するステップであって、前記反応容器は封止される、ステップと、
(b)請求項1から28のいずれかに記載の採取装置を用意するステップと、
(c)前記核酸含有物質に前記採取装置を接触させることにより、前記接触後に、核酸含有物質が前記採取装置の少なくとも一部に付着するステップと、
(d)前記反応容器を封止解除するステップと、
(e)前記核酸含有物質が前記反応混合物と接触状態になるように、前記核酸含有物質が付着する前記採取装置または前記採取装置の一部を前記反応容器内に配置するステップと、
(f)前記反応容器内に依然として存在する、前記核酸含有物質が付着する前記採取装置または前記採取装置の一部により、前記反応容器を気密状態に再封止するステップと
を含む、方法。 - 複数の反応容器が、一体的に接合され、同時に準備される、請求項41に記載の方法。
- 前記核酸含有物質が付着する前記採取装置または前記採取装置の一部は、前記核酸含有物質が前記複数の反応容器間で分配され得るように構成される、請求項41に記載の方法。
- 前記反応容器を封止解除する前記ステップ(d)は、前記核酸含有物質に前記採取装置を接触させる前記ステップ(c)の前に実施される、請求項41または42に記載の方法。
- 前記核酸含有物質が付着する前記採取装置または前記採取装置の一部は、前記ステップ(f)において前記反応容器の前記シールを提供する、請求項41から44のいずれかに記載の方法。
- 前記核酸含有物質が付着する前記採取装置または前記採取装置の一部は、ガラス、環状オレフィンコポリマー、アクリル樹脂、結晶ポリスチレン、ポリプロピレン、HDPE、ポリカーボネート、中耐衝撃性ポリスチレン、PVC、液体結晶ポリマー30%、Trans ABS、アセタールコポリマー、ポリエステル、ポリエーテルイミド、ポリエチレン、ナイロン、ポリエーテルポリウレタン、スチレンブタジエンブロックコポリマー、ポリプロピレンランダムコポリマー、エチレンビニルアセテート、シロキサン、および熱可塑性エラストマーの中のいずれかから作製される、請求項41から45のいずれか一項に記載の方法。
- 環状オレフィンコポリマーがTopasである、請求項31、34、もしくは46に記載の方法、または請求項40に記載の使用。
- アクリル樹脂がPMMAである、請求項31、34、もしくは46に記載の方法、または請求項40に記載の使用。
- シロキサンがPDMSである、請求項31、34、もしくは46に記載の方法、または請求項40に記載の使用。
- 熱可塑性エラストマーがサントプレーンである、請求項31、34、もしくは46に記載の方法、または請求項40に記載の使用。
- 前記反応混合物は、カオトロピック剤を実質的に含まない、請求項41から50のいずれかに記載の方法。
- 前記反応混合物は、細胞溶解剤を実質的に含まない、請求項41から50のいずれかに記載の方法。
- 前記核酸含有物質が付着する前記採取装置または前記採取装置の一部は、前記採取後に追加的な処理を伴うことなく前記反応容器内に直に配置される、請求項41から52のいずれかに記載の方法。
- 前記反応混合物は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、ループ媒介性等温増幅(LAMP)、転写媒介性増幅(TMA)、RNAシグナル媒介性増幅技術(SMART)、鎖置換増幅(SDA)、ローリングサークル増幅(RCA)、等温多置換増幅(IMDA)、ヘリカーゼ依存性増幅(HDA)、単一プライマー等温増幅(SPIA)、環状ヘリカーゼ依存性増幅(CHDA)、または核酸配列ベース増幅(NASBA)の中のいずれかを実施するためのものである、請求項41から53のいずれかに記載の方法。
- 前記核酸含有物質は、哺乳動物起源のものである、請求項41から54のいずれかに記載の方法。
- 前記核酸含有物質は、ヒト起源のものである、請求項55に記載の方法。
- 前記核酸含有物質は、実質的に乾燥状態である、請求項41から56のいずれかに記載の方法。
- 請求項41から57のいずれかに規定される反応容器を準備するステップと、前記反応容器内において核酸増幅反応を実施するステップとを含む、核酸を増幅するための方法。
- 請求項41から57のいずれかに記載の方法を実施するステップと、前記核酸含有物質が付着する前記採取装置または前記採取装置の一部を除去するステップと、さらなる反応容器内に前記核酸含有物質が付着する前記採取装置または前記採取装置の一部を配置するステップと、前記さらなる反応容器内において核酸増幅反応を実施するステップとを含む、核酸を増幅するための方法。
- 前記さらなる反応容器が、請求項29にしたがって準備される、請求項59に記載の方法。
- 前記核酸含有試料は、接触により表面上に付着された細胞である、請求項29から60のいずれかに記載の方法または使用。
- 前記核酸含有試料は、接触により表面上に付着された皮膚細胞、乾燥血液、乾燥精液、乾燥唾液、または細胞物質のいずれかである、請求項61に記載の方法または使用。
- (a)核酸増幅反応を実施するための反応混合物を収容する反応容器であって、封止される、反応容器と、(b)核酸含有物質との接触後に前記核酸含有物質の少なくとも一部が付着し得る、請求項1から28のいずれかに記載の採取装置とを備えるキットであって、前記核酸含有物質が付着する前記採取装置または前記採取装置の一部は、前記反応容器内に導入され得るものであり、核酸増幅反応は、前記核酸含有物質が付着する前記採取装置または前記採取装置の一部が存在する状態で前記容器内において実施され得る、キット。
- 一体的に接合される複数の反応容器を備える、請求項63に記載のキット。
- 前記核酸含有物質が付着し得る前記採取装置または前記採取装置の一部は、前記核酸含有物質が前記複数の反応容器間で分配され得るように構成される、請求項63または64記載のキット。
- 前記核酸含有物質が付着し得る前記採取装置または前記採取装置の一部は、元のシールが除去されると、前記反応容器のシールを提供する、請求項63から65のいずれかに記載のキット。
- 前記核酸含有物質が付着し得る前記採取装置または前記採取装置の一部は、ポリカーボネート、ガラス、環状オレフィンコポリマー、アクリル樹脂、結晶ポリスチレン、ポリプロピレン、HDPE、中耐衝撃性ポリスチレン、PVC、液体結晶ポリマー30%、Trans ABS、アセタールコポリマー、ポリエステル、ポリエーテルイミド、ポリエチレン、ナイロン、ポリエーテルポリウレタン、スチレンブタジエンブロックコポリマー、ポリプロピレンランダムコポリマー、エチレンビニルアセテート、シロキサン、および熱可塑性エラストマーの中のいずれかから作製される、請求項63から66のいずれかに記載のキット。
- 環状オレフィンコポリマーがTopasである、請求項67に記載のキット。
- アクリル樹脂がPMMAである、請求項67に記載のキット。
- シロキサンがPDMSである、請求項67に記載のキット。
- 熱可塑性エラストマーがサントプレーンである、請求項67に記載のキット。
- 前記反応容器内に存在する前記反応混合物は、請求項51、52、または54のいずれかに記載のものとして定義される、請求項63から66のいずれかに記載のキット。
- 核酸含有物質からの核酸に対応する遺伝子型を記録するデータキャリアを準備する方法であって、請求項29、33、または58のいずれかに記載の方法を実施するステップと、前記核酸含有物質中の前記核酸の前記遺伝子型を判定するステップと、前記データキャリア上に前記遺伝子型を記録するステップとを含む、方法。
- 前記核酸含有物質が付着する前記採取装置もしくは前記採取装置の一部は、DNA不活性となるように処理されるか、または、前記核酸試料を支持するための前記プローブは、DNA不活性となるように処理される、請求項29、31から37、39、41から62のいずれかに記載の方法。
- 前記核酸含有物質が付着する前記採取装置もしくは前記採取装置の一部は、DNA不活性となるように処理されるか、または、前記核酸試料を支持するための前記プローブは、DNA不活性となるように処理される、請求項30から32、35から40、47から50、61及び62のいずれかに記載の使用。
- 前記核酸含有物質が付着する前記採取装置もしくは前記採取装置の一部は、DNA不活性となるように処理されるか、または、前記核酸試料を支持するための前記プローブは、DNA不活性となるように処理される、請求項63から72のいずれかに記載のキット。
- 前記核酸含有物質が付着する前記採取装置もしくは前記採取装置の一部は、DNA不活性となるように処理されるか、または、前記核酸試料を支持するための前記プローブは、DNA不活性となるように処理される、請求項1から28のいずれかに記載の装置。
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