JP5656397B2 - カビ検出方法 - Google Patents
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Description
本発明は、カビ検出方法及びせん断力付加装置に関する。
カビは食料を汚染する。特に米などの貯蔵物では、知らぬ間にカビが繁殖して、汚染さていることがある。そのため、このような貯蔵物に対するカビの検査が行われる。例えば、その検査手法として、カビの胞子及び菌糸を培養することでカビを検出する手法がある。また、その他の検査手法として、非特許文献１及び２には、キチナーゼなどの酵素を用いてカビの細胞壁（キチン層など）の一部を溶解させ、ＦＩＳＨ法（fluorescence in situ hybridization）でカビを蛍光染色する手法が開示されている。なお、ＦＩＳＨ法とは、蛍光標識したプローブを、標的微生物のみに反応させることで、標的微生物のみを蛍光染色する手法である。
In Situ Detection of Freshwater Fungi in an Alpine Stream by New Taxon-Specific Fluorescence In Situ Hybridization Probes Christiane BaSchienら、APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Oct. 2008， Vol．74， No．20，p．6427‐6436
Quantitative imaging and statistical analysis of fluorescence hybridization（FISH） of Aureobasidium pullulans Russell N. Spearら、Journal of Microbiological Methods35 (1999) 101-1 10
ところで、上記従来技術では、カビの胞子及び菌糸を培養することでカビを検出している。しかし、この培養法によるカビの検出は、培養に時間がかかるので、迅速な検出ができない。さらに、カビの分類は形態観察や生理試験などで専門性を求められる部分が多いので、一般的には普及することが難しい。また、上記非特許文献１及び２では、キチナーゼなどの酵素を用いてカビの細胞壁（キチン層など）を溶解させ、カビを蛍光染色することでカビを検出している。しかしながら、カビの胞子や菌糸は成熟とともに表面が黒色色素で覆われるので、その場合には酵素が細胞壁成分のキチン層まで到達できない。そのため、カビを蛍光染色することが困難である。
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであり、身のまわりに存在するカビを効率よく検出することを目的とする。
上記目的を達成するために、本発明では、カビ検出方法に係る第１の解決手段として、分子生物学的手法を用いてカビを検出するカビ検出方法であって、「ｃｇｇ ｃｇｔ ｃｔｃ ｔａｇ ａａａ ｃｃａ（１８）」の塩基配列を有する第１のプローブを用いてアルテルナリア（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）属のカビを検出するという手段を採用する。
本発明では、カビ検出方法に係る第２の解決手段として、分子生物学的手法を用いてカビを検出するカビ検出方法であって、「ａｇｔ ｃｇｔ ｔｇｃ ｃａａ ｃｔｃ ｃｃｃ（１８）」の塩基配列を有する第２のプローブを用いてカビの１つであるアスペルギルス フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）を検出するという手段を採用する。
本発明では、カビ検出方法に係る第３の解決手段として、上記第２の解決手段において、前記第２のプローブを用いてアスペルギルス フミガタスを検出し、「ｇｇｔ ｃｇｔｔｇｃ ｃａａ ｃｔｃ ｃｃｃ（１８）」の塩基配列を有する第３のプローブを用いてアスペルギルス フミガタス以外のカビの検出を回避するという手段を採用する。
本発明では、カビ検出方法に係る第４の解決手段として、分子生物学的手法を用いてカビを検出するカビ検出方法であって、「ｇｃｃ ａｔｇ ａｇａ ｔｔｃ ｃｃｃ ａｇａ（１８）」の塩基配列を有する第４のプローブを用いてカビの１つであるアスペルギルス ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）を検出するという手段を採用する。
本発明では、カビ検出方法に係る第５の解決手段として、分子生物学的手法を用いてカビを検出するカビ検出方法であって、「ｃｇｃ ｔｇａ ｔｇａ ｃｇｔ ａｃｇ ｃｔｔ（１８）」の塩基配列を有する第５のプローブを用いてオーレオバシジウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｒｎ）属のカビを検出するという手段を採用する。
本発明では、カビ検出方法に係る第６の解決手段として、上記第５の解決手段において、前記第５のプローブを用いてオーレオバシジウム属のカビを検出し、「ｃｇｃ ｔｇａｔｇａ ｃｇｔ ａｃｔ ｃｔｔ（１８）」の塩基配列を有する第６のプローブを用いてオーレオバシジウム属以外のカビの検出を回避するという手段を採用する。
本発明では、カビ検出方法に係る第７の解決手段として、分子生物学的手法を用いてカビを検出するカビ検出方法であって、「ｃｃｇ ａａｃ ｇｇｇ ｔｃａ ａａａ ｔａｃ（１８）」の塩基配列を有する第７のプローブと、「ｃｃｇ ａｇｃ ｇｇｇ ｔｃａ ａａａ ｔａｃ（１８）」の塩基配列を有する第８のプローブとを用いてクラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）属及びデビディエラ（Ｄａｖｉｄｉｅｌｉａ）属のカビを検出するという手段を採用する。
本発明では、カビ検出方法に係る第８の解決手段として、上記第７の解決手段において、第７のプローブと第８のプローブとを用いてクラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）属及びデビディエラ（Ｄａｖｉｄｉｅｌｉａ）属のカビを検出し、「ｃｃｇ ａａｃ ｇｇｇ ｔｃａ ａａａ ｔａｔ（１８）」の塩基配列を有する第９のプローブと、「ｃｃｇ ａａｃ ｇｇｇ ｔｃａ ａａａ ｔａａ（１８）」の塩基配列を有する第１０のプローブと、「ｃｃｇ ａａｃ ｇｇｇ ｔｃａ ａａａ ｔａｇ（１８）」の塩基配列を有する第１１のプローブと、「ｃｃｇ ａｇｃ ｇｇｇ ｔｃａ ａａａ ｔａａ（１８）」の塩基配列を有する第１２のプローブと、を用いてクラドスポリウム属及びデビディエラ属以外のカビの検出を回避するという手段を採用する。
本発明では、カビ検出方法に係る第９の解決手段として、分子生物学的手法を用いてカビを検出するカビ検出方法であって、「ｃｃｇ ａｇｃ ｇｇｇ ｔｃａ ｔｔａ ｔａｇ（１８）」の塩基配列を有する第１３のプローブを用いてユーロチウム（Ｅｕｒｏｔｉｕｍ）属及びそれに近縁のアスペルギルス属のカビを検出するという手段を採用する。
本発明では、カビ検出方法に係る第１０の解決手段として、上記第９の解決手段において、前記第１３のプローブを用いてユーロチウム属及びそれに近縁のアスペルギルス属のカビを検出し、「ｃｃｇ ａｇｃ ｇｇｇ ｔｃａ ｔｃａ ｔａｇ（１８）」の塩基配列を有する第１４のプローブを用いてユーロチウム属及びそれに近縁のアスペルギルス属以外のカビの検出を回避するという手段を採用する。
本発明では、カビ検出方法に係る第１１の解決手段として、分子生物学的手法を用いてカビを検出するカビ検出方法であって、「ａａｃ ａｃｇ ｃｃｃ ａａｔ ｃｔｃ ｔａｇ ｔｃ（２０）」の塩基配列を有する第１５のプローブと、「ａａｃ ａｃｔ ｃｃｃ ａａｔ ｃｔｃ ｔａｇ ｔｃ（２０）」の塩基配列を有する第１６のプローブとを用いてリゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属のカビを検出するという手段を採用する。
本発明では、カビ検出方法に係る第１２の解決手段として、分子生物学的手法を用いてカビを検出するカビ検出方法であって、「ｇｃｃ ｔｇｔ ｃｇａ ｔｔｃ ｇａｃ ｔａｇ ｔｔ（２０）」の塩基配列を有する第１７のプローブを用いてトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属及びヒポクレア（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）属のカビを検出するという手段を採用する。
本発明では、カビ検出方法に係る第１３の解決手段として、上記第１２の解決手段において、前記第１７のプローブを用いてトリコデルマ属及びヒポクレア属のカビを検出し、「ｇｃｃ ｔｇｔ ｃｇａ ｔｔｃ ｇａｃ ｃａｇ ｔｔ（２０）」の塩基配列を有する第１８のプローブと、「ｇｃｃ ｔｇｔ ｃｇａ ｔｔｃ ｇａｃ ａａｇ ｔｔ（２０）」の塩基配列を有する第１９のプローブとを用いてトリコデルマ属及びヒポクレア属以外のカビの検出を回避するという手段を採用する。
本発明では、カビ検出方法に係る第１４の解決手段として、分子生物学的手法を用いてカビを検出するカビ検出方法であって、「ｃｃｃ ｃｃｔ ａａｇ ｃｃｃ ａａａ ａａｃ ｔｔ（２０）」の塩基配列を有する第２０プローブを用いてワレミア（Ｗａｌｌｅｍｉａ）属のカビを検出するという手段を採用する。
本発明では、カビ検出方法に係る第１５の解決手段として、カビにせん断力を付加することで前記カビの色素層及び細胞壁を破損させ、その後に当該カビを蛍光染色するという手段を採用する。
本発明では、カビ検出方法に係る第１６の解決手段として、上記第１５の解決手段において、カビとともにビーズを収容器に入れ、当該収容器内を攪拌することでカビにせん断力を付加するという手段を採用する。
本発明では、カビ検出方法に係る第１７の解決手段として、上記第１５の解決手段において、カビとともにビーズを収容器に入れ、棒で前記カビ及び前記ビーズを押し付けながらかき混ぜることでカビにせん断力を付加するという手段を採用する。
本発明では、カビ検出方法に係る第１８の解決手段として、上記第１５〜第１７のいずれかの解決手段において、カビにせん断力を付加した後、当該カビが含まれる標本に細胞壁を分解する分解酵素を添加し、当該カビの細胞壁を分解した後に当該カビを蛍光染色するという手段を採用する。
本発明では、せん断力付加装置に係る第１の解決手段として、カビにせん断力を付加するという手段を採用する。
本発明では、せん断力付加装置に係る第２の解決手段として、上記第１の解決手段において、ピンセット形状をしており、対向する１対の挟圧片の間に配置されたカビを挟みこみながらカビに圧力を付加するとともに圧力方向に対して略垂直方向にずらすという手段を採用する。
本発明では、せん断力付加装置に係る第３の解決手段として、上記第１９の解決手段において、カビを所定の圧力で挟む一対の挟圧片と、圧力方向に対して略垂直方向に前記挟圧片のいずれか一方をずらす挟圧片変動部を具備するという手段を採用する。
本発明によれば、第１〜第２０のプローブを用いて検出対象のカビを検出する。すなわち、検出対象のカビに第１のプローブ、第２のプローブ、第４のプローブ、第７プローブ、第８のプローブ、第１３のプローブ、第１５〜第１７のプローブ及び第２０のプローブを結合させるとともに、第３のプローブ、第６のプローブ、第９〜第１２、第１４のプローブ、第１８のプローブ及び第１９のプローブを検出対象外のカビに結合させる。このようにすることで、第１のプローブ、第２のプローブ、第４のプローブ、第７プローブ、第８のプローブ、第１３のプローブ、第１５〜第１７のプローブ及び第２０のプローブを用いてカビ、すなわち身のまわりに存在するカビを簡単に検出することができるので、従来よりも効率よくカビを検出することができる。また、第３のプローブ、第６のプローブ、第９〜第１２、第１４のプローブ、第１８のプローブ及び第１９のプローブを用いることで、検出対象外のカビを検出対象のカビとして誤検出することを防ぐことができる。
以下、図面を参照して、本発明の一実施形態について説明する。
本実施形態に係るカビ検出方法は、ＦＩＳＨ法を用いて試料からカビを検出する方法であり、以下に説明するように第１〜第１１の工程を有するものである。
カビ検出方法について、図１を参照して、説明する。
〔第１の工程〕
まず、第１の工程において、米の貯蔵袋の穴から浮遊粒子をエアーサンプラーで収集する（ステップＳ１）。ここで用いるエアーサンプラーは、通常の培地に捕集するタイプではなく、水溶液中に浮遊粒子を捕集するタイプが好ましい。
〔第２の工程〕
上記第１の工程が終了すると、次に第２の工程において、浮遊粒子を含む試料に、終濃度が４％になるようにパラホルムアルデヒド溶液を添加し、当該試料を４℃の温度の下で一晩保存することでカビの固定標本を作製する（ステップＳ２）。
本実施形態に係るカビ検出方法は、ＦＩＳＨ法を用いて試料からカビを検出する方法であり、以下に説明するように第１〜第１１の工程を有するものである。
カビ検出方法について、図１を参照して、説明する。
〔第１の工程〕
まず、第１の工程において、米の貯蔵袋の穴から浮遊粒子をエアーサンプラーで収集する（ステップＳ１）。ここで用いるエアーサンプラーは、通常の培地に捕集するタイプではなく、水溶液中に浮遊粒子を捕集するタイプが好ましい。
〔第２の工程〕
上記第１の工程が終了すると、次に第２の工程において、浮遊粒子を含む試料に、終濃度が４％になるようにパラホルムアルデヒド溶液を添加し、当該試料を４℃の温度の下で一晩保存することでカビの固定標本を作製する（ステップＳ２）。
〔第３の工程〕
上記第２の工程が終了すると、次に第３の工程において、上記試料をろ過装置によってろ過することで、カビの固定標本をメンブレンフィルタ上に捕集する（ステップＳ３）。なお、上記メンブレンフィルタは、直径が２５ｍｍの円形であり、孔径が０．２２μｍであるポリカーボネート製のフィルタである。そして、このメンブレンフィルタの中心部の直径１６ｍｍの円形領域が、ろ過に使用される。
〔第４の工程〕
上記第３の工程が終了すると、次に第４の工程において、上記メンブレンフィルタを９９．５％のエタノールに１分間入れることで脱水し、その後に常温の空気中で乾燥させる（ステップＳ４）。
上記第２の工程が終了すると、次に第３の工程において、上記試料をろ過装置によってろ過することで、カビの固定標本をメンブレンフィルタ上に捕集する（ステップＳ３）。なお、上記メンブレンフィルタは、直径が２５ｍｍの円形であり、孔径が０．２２μｍであるポリカーボネート製のフィルタである。そして、このメンブレンフィルタの中心部の直径１６ｍｍの円形領域が、ろ過に使用される。
〔第４の工程〕
上記第３の工程が終了すると、次に第４の工程において、上記メンブレンフィルタを９９．５％のエタノールに１分間入れることで脱水し、その後に常温の空気中で乾燥させる（ステップＳ４）。
〔第５の工程〕
上記第４の工程が終了すると、次に第５の工程において、メンブレンフィルタ上の標本にせん断力を付加することでカビの胞子または菌糸の表面を覆う色素層及び細胞壁を破損させる（ステップＳ５）。第５の工程においてせん断力を加える方法について、３つの方法を説明する。
上記第４の工程が終了すると、次に第５の工程において、メンブレンフィルタ上の標本にせん断力を付加することでカビの胞子または菌糸の表面を覆う色素層及び細胞壁を破損させる（ステップＳ５）。第５の工程においてせん断力を加える方法について、３つの方法を説明する。
≪第１の方法≫
まず、第１の方法について説明する。
第１の方法では、本実施形態に係るせん断力付加装置Ａを使ってメンブレンフィルタ上の標本に含まれるカビにせん断力を付加する。
このせん断力付加装置Ａは、効果的にせん断力を与えるために、図２の（ａ）及び（ｂ）に示すように、先の広いピンセットを加工して簡単にせん断力を与えられるようにしたものである。つまり、せん断力付加装置Ａは、対向する１対の上部挟圧片１及び下部挟圧片２からなる。上部挟圧片１では、柄部１ａと摘み部１ｂとが直線状になっている。また、下部挟圧片２では、柄部２ａが上部挟圧片１とは逆方向に反り上がるとともに摘み部２ｂが上部挟圧片１に向って湾曲している。
まず、第１の方法について説明する。
第１の方法では、本実施形態に係るせん断力付加装置Ａを使ってメンブレンフィルタ上の標本に含まれるカビにせん断力を付加する。
このせん断力付加装置Ａは、効果的にせん断力を与えるために、図２の（ａ）及び（ｂ）に示すように、先の広いピンセットを加工して簡単にせん断力を与えられるようにしたものである。つまり、せん断力付加装置Ａは、対向する１対の上部挟圧片１及び下部挟圧片２からなる。上部挟圧片１では、柄部１ａと摘み部１ｂとが直線状になっている。また、下部挟圧片２では、柄部２ａが上部挟圧片１とは逆方向に反り上がるとともに摘み部２ｂが上部挟圧片１に向って湾曲している。
そして、図３の（ａ）に示すように、このせん断力付加装置Ａの摘み部１ｂの上にメンブレンフィルタＦｌを載せる。その後に、図３の（ｂ）に示すように、摘み部２ｂでメンブレンフィルタＦｌ上の標本に含まれるカビＳｌを挟みこみながらカビＳｌに約１ｋｇ／ｃｍ2 の圧力を付加するとともに圧力方向に対して略垂直方向に約１０回程度ずらすことで、縦方向の圧力とともに横方向へのずれが生じる。これによりカビＳｌにせん断力を付加することができる。
≪第２の方法≫
次に、第２の方法について説明する。
上述のせん断力付加装置Ａでは、使い方によって個人差が生じやすい。そのため、本実施形態に係るせん断力付加装置Ｂ（図４参照）を用いるのが好ましい。
せん断力付加装置Ｂは、図４に示すように、下部支持板１０に支柱１１を介して上部支持板１２が設けられている。さらに、せん断力付加装置Ｂでは、その下部支持板１０上に下部挟圧片１３が保持され、上部支持板１２に押圧用ネジ１５で上部挟圧片１４が下部挟圧片１３に対して所定の圧力を付加できる。そして、せん断力付加装置Ｂでは、下部挟圧片１３及び上部挟圧片１４がメンブレンフィルタＦｌ上のカビＳｌを挟みこみながら圧力を加え、ハンマ（挟圧片変動部）１６で圧力方向に対して略垂直方向に上部挟圧片１４をずらす。これによりカビＳｌにせん断力を付加することができる。このようなせん断力付加装置Ｂは、押圧用ネジ１５で圧力を調整するとともにハンマ１６の殴打力が一定であるので、カビＳｌに対して一定のせん断力を付加することができる。そのため、カビＳｌの破損の程度を一定にすることができる。
次に、第２の方法について説明する。
上述のせん断力付加装置Ａでは、使い方によって個人差が生じやすい。そのため、本実施形態に係るせん断力付加装置Ｂ（図４参照）を用いるのが好ましい。
せん断力付加装置Ｂは、図４に示すように、下部支持板１０に支柱１１を介して上部支持板１２が設けられている。さらに、せん断力付加装置Ｂでは、その下部支持板１０上に下部挟圧片１３が保持され、上部支持板１２に押圧用ネジ１５で上部挟圧片１４が下部挟圧片１３に対して所定の圧力を付加できる。そして、せん断力付加装置Ｂでは、下部挟圧片１３及び上部挟圧片１４がメンブレンフィルタＦｌ上のカビＳｌを挟みこみながら圧力を加え、ハンマ（挟圧片変動部）１６で圧力方向に対して略垂直方向に上部挟圧片１４をずらす。これによりカビＳｌにせん断力を付加することができる。このようなせん断力付加装置Ｂは、押圧用ネジ１５で圧力を調整するとともにハンマ１６の殴打力が一定であるので、カビＳｌに対して一定のせん断力を付加することができる。そのため、カビＳｌの破損の程度を一定にすることができる。
≪第３の方法≫
次に、第３の方法について説明する。
まず、カットされたメンブレンフィルタとともに直径０．２５〜０．３ｍｍのガラスビーズ２０ｍｇをマイクロチューブに入れる。そして、ペッスル（棒）でメンブレンフィルタ上のカビ及びガラスビーズを押し付けながらかき混ぜることでカビにせん断力を付加する。その際、ペッスルの角度は５度程度であり、押し付ける回数は１〜１０回程度である。
次に、第３の方法について説明する。
まず、カットされたメンブレンフィルタとともに直径０．２５〜０．３ｍｍのガラスビーズ２０ｍｇをマイクロチューブに入れる。そして、ペッスル（棒）でメンブレンフィルタ上のカビ及びガラスビーズを押し付けながらかき混ぜることでカビにせん断力を付加する。その際、ペッスルの角度は５度程度であり、押し付ける回数は１〜１０回程度である。
〔第６の工程〕
上記第５の工程が終了すると、次に第６の工程において、メンブレンフィルタ上の標本にキチナーゼを添加し、キチナーゼの終濃度が０．１〜５ｍｇになるように調整した上で、標本を１〜２０分の間キチナーゼに反応させる（ステップＳ６）。なお、キチナーゼとは、カビの細胞壁の主成分であるキチンを分解する分解酵素である。
上記第５の工程が終了すると、次に第６の工程において、メンブレンフィルタ上の標本にキチナーゼを添加し、キチナーゼの終濃度が０．１〜５ｍｇになるように調整した上で、標本を１〜２０分の間キチナーゼに反応させる（ステップＳ６）。なお、キチナーゼとは、カビの細胞壁の主成分であるキチンを分解する分解酵素である。
〔第７の工程〕
上記第６の工程が終了すると、次に第７の工程において、上記メンブレンフィルタ上の標本に第１のプローブ〜第２０のプローブを添加し、標本にプローブを反応させる（ステップＳ７）。プローブとは、標的微生物であるカビの核酸（多くの場合においてリボソームＲＮＡ（ribosome Ribonucleic acid））に対して相補的なポリヌクレオチド（塩基配列）に蛍光色素を共有結合したものである。
上記第６の工程が終了すると、次に第７の工程において、上記メンブレンフィルタ上の標本に第１のプローブ〜第２０のプローブを添加し、標本にプローブを反応させる（ステップＳ７）。プローブとは、標的微生物であるカビの核酸（多くの場合においてリボソームＲＮＡ（ribosome Ribonucleic acid））に対して相補的なポリヌクレオチド（塩基配列）に蛍光色素を共有結合したものである。
ここで、第１のプローブ〜第２０のプローブについて、詳細に説明する。第１のプローブ〜第２０のプローブの塩基配列は、以下の通りである。
１． 第１のプローブ ：ｃｇｇ ｃｇｔ ｃｔｃ ｔａｇ ａａａ ｃｃａ（１８）
２． 第２のプローブ ：ａｇｔ ｃｇｔ ｔｇｃ ｃａａ ｃｔｃ ｃｃｃ（１８）
３． 第３のプローブ ：ｇｇｔ ｃｇｔ ｔｇｃ ｃａａ ｃｔｃ ｃｃｃ（１８）
４． 第４のプローブ ：ｇｃｃ ａｔｇ ａｇａ ｔｔｃ ｃｃｃ ａｇａ（１８）
５． 第５のプローブ ：ｃｇｃ ｔｇａ ｔｇａ ｃｇｔ ａｃｇ ｃｔｔ（１８）
６． 第６のプローブ ：ｃｇｃ ｔｇａ ｔｇａ ｃｇｔ ａｃｔ ｃｔｔ（１８）
７． 第７のプローブ ：ｃｃｇ ａａｃ ｇｇｇ ｔｃａ ａａａ ｔａｃ（１８）
８． 第８のプローブ ：ｃｃｇ ａｇｃ ｇｇｇ ｔｃａ ａａａ ｔａｃ（１８）
９． 第９のプローブ ：ｃｃｇ ａａｃ ｇｇｇ ｔｃａ ａａａ ｔａｔ（１８）
１０．第１０のプローブ：ｃｃｇ ａａｃ ｇｇｇ ｔｃａ ａａａ ｔａａ（１８）
１１．第１１のプローブ：ｃｃｇ ａａｃ ｇｇｇ ｔｃａ ａａａ ｔａｇ（１８）
１２．第１２のプローブ：ｃｃｇ ａｇｃ ｇｇｇ ｔｃａ ａａａ ｔａａ（１８）
１３．第１３のプローブ：ｃｃｇ ａｇｃ ｇｇｇ ｔｃａ ｔｔａ ｔａｇ（１８）
１４．第１４のプローブ：ｃｃｇ ａｇｃ ｇｇｇ ｔｃａ ｔｃａ ｔａｇ（１８）
１５．第１５のプローブ：ａａｃ ａｃｇ ｃｃｃ ａａｔ ｃｔｃ ｔａｇ ｔｃ（２０）
１６．第１６のプローブ：ａａｃ ａｃｔ ｃｃｃ ａａｔ ｃｔｃ ｔａｇ ｔｃ（２０）
１７．第１７のプローブ：ｇｃｃ ｔｇｔ ｃｇａ ｔｔｃ ｇａｃ ｔａｇ ｔｔ（２０）
１８．第１８のプローブ：ｇｃｃ ｔｇｔ ｃｇａ ｔｔｃ ｇａｃ ｃａｇ ｔｔ（２０）
１９．第１９のプローブ：ｇｃｃ ｔｇｔ ｃｇａ ｔｔｃ ｇａｃ ａａｇ ｔｔ（２０）
２０．第２０のプローブ：ｃｃｃ ｃｃｔ ａａｇ ｃｃｃ ａａａ ａａｃ ｔｔ（２０）
なお、第１〜第２０のプローブの塩基配列の右側に記載する括弧内の数字は、塩基数を示している。また、上記塩基配列における、「ａ」はアデニン、「ｔ」はチミン、「ｃ」はシトシン、「ｇ」はグアニンである。そして、「ａ」は「ｔ」と相補的に結合し、「ｃ」は「ｇ」と相補的に結合する。上記第１のプローブ〜第２０のプローブでは、左端の塩基に５’末端が結合し、右端の塩基「ｔ」に３’末端が結合している。
１． 第１のプローブ ：ｃｇｇ ｃｇｔ ｃｔｃ ｔａｇ ａａａ ｃｃａ（１８）
２． 第２のプローブ ：ａｇｔ ｃｇｔ ｔｇｃ ｃａａ ｃｔｃ ｃｃｃ（１８）
３． 第３のプローブ ：ｇｇｔ ｃｇｔ ｔｇｃ ｃａａ ｃｔｃ ｃｃｃ（１８）
４． 第４のプローブ ：ｇｃｃ ａｔｇ ａｇａ ｔｔｃ ｃｃｃ ａｇａ（１８）
５． 第５のプローブ ：ｃｇｃ ｔｇａ ｔｇａ ｃｇｔ ａｃｇ ｃｔｔ（１８）
６． 第６のプローブ ：ｃｇｃ ｔｇａ ｔｇａ ｃｇｔ ａｃｔ ｃｔｔ（１８）
７． 第７のプローブ ：ｃｃｇ ａａｃ ｇｇｇ ｔｃａ ａａａ ｔａｃ（１８）
８． 第８のプローブ ：ｃｃｇ ａｇｃ ｇｇｇ ｔｃａ ａａａ ｔａｃ（１８）
９． 第９のプローブ ：ｃｃｇ ａａｃ ｇｇｇ ｔｃａ ａａａ ｔａｔ（１８）
１０．第１０のプローブ：ｃｃｇ ａａｃ ｇｇｇ ｔｃａ ａａａ ｔａａ（１８）
１１．第１１のプローブ：ｃｃｇ ａａｃ ｇｇｇ ｔｃａ ａａａ ｔａｇ（１８）
１２．第１２のプローブ：ｃｃｇ ａｇｃ ｇｇｇ ｔｃａ ａａａ ｔａａ（１８）
１３．第１３のプローブ：ｃｃｇ ａｇｃ ｇｇｇ ｔｃａ ｔｔａ ｔａｇ（１８）
１４．第１４のプローブ：ｃｃｇ ａｇｃ ｇｇｇ ｔｃａ ｔｃａ ｔａｇ（１８）
１５．第１５のプローブ：ａａｃ ａｃｇ ｃｃｃ ａａｔ ｃｔｃ ｔａｇ ｔｃ（２０）
１６．第１６のプローブ：ａａｃ ａｃｔ ｃｃｃ ａａｔ ｃｔｃ ｔａｇ ｔｃ（２０）
１７．第１７のプローブ：ｇｃｃ ｔｇｔ ｃｇａ ｔｔｃ ｇａｃ ｔａｇ ｔｔ（２０）
１８．第１８のプローブ：ｇｃｃ ｔｇｔ ｃｇａ ｔｔｃ ｇａｃ ｃａｇ ｔｔ（２０）
１９．第１９のプローブ：ｇｃｃ ｔｇｔ ｃｇａ ｔｔｃ ｇａｃ ａａｇ ｔｔ（２０）
２０．第２０のプローブ：ｃｃｃ ｃｃｔ ａａｇ ｃｃｃ ａａａ ａａｃ ｔｔ（２０）
なお、第１〜第２０のプローブの塩基配列の右側に記載する括弧内の数字は、塩基数を示している。また、上記塩基配列における、「ａ」はアデニン、「ｔ」はチミン、「ｃ」はシトシン、「ｇ」はグアニンである。そして、「ａ」は「ｔ」と相補的に結合し、「ｃ」は「ｇ」と相補的に結合する。上記第１のプローブ〜第２０のプローブでは、左端の塩基に５’末端が結合し、右端の塩基「ｔ」に３’末端が結合している。
そして、上記第１〜第２０プローブの使用目的は以下（１）〜（１４）の通りである。
（１）第１のプローブは、アルテルナリア（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）属のカビを検出することを目的とする。
（２）第２のプローブは、カビの１つであるアスペルギルス フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）を検出することを目的とする。
（３）第３のプローブは、第２のプローブを使用する時に、第２のプローブに類似する塩基配列をもつアスペルギルス フミガタス以外のカビの検出を回避することを目的とする。
（４）第４のプローブは、カビの１つであるアスペルギルス ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）を検出することを目的とする。
（５）第５のプローブは、オーレオバシジウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｒｎ）属のカビを検出することを目的とする。
（１）第１のプローブは、アルテルナリア（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）属のカビを検出することを目的とする。
（２）第２のプローブは、カビの１つであるアスペルギルス フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）を検出することを目的とする。
（３）第３のプローブは、第２のプローブを使用する時に、第２のプローブに類似する塩基配列をもつアスペルギルス フミガタス以外のカビの検出を回避することを目的とする。
（４）第４のプローブは、カビの１つであるアスペルギルス ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）を検出することを目的とする。
（５）第５のプローブは、オーレオバシジウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｒｎ）属のカビを検出することを目的とする。
（６）第６のプローブは、第５のプローブを使用する時に、第５のプローブに類似する塩基配列をもつオーレオバシジウム属以外のカビの検出を回避することを目的とする。
（７）第７及び第８のプローブは、クラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）属及びデビディエラ（Ｄａｖｉｄｉｅｌｉａ）属のカビを検出することを目的とする。
（８）第９〜第１２のプローブは、第７及び第８のプローブを使用する時に、第７及び第８のプローブに類似する塩基配列をもつクラドスポリウム属及びデビディエラ属以外のカビの検出を回避することを目的とする。
（９）第１３のプローブは、ユーロチウム（Ｅｕｒｏｔｉｕｍ）属及びそれに近縁のアスペルギルス属のカビを検出することを目的とする。
（１０）第１４のプローブは、第１３のプローブを使用する時に、第１３のプローブに類似する塩基配列をもつユーロチウム属及びそれに近縁のアスペルギルス属以外のカビの検出を回避することを目的とする。
（７）第７及び第８のプローブは、クラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）属及びデビディエラ（Ｄａｖｉｄｉｅｌｉａ）属のカビを検出することを目的とする。
（８）第９〜第１２のプローブは、第７及び第８のプローブを使用する時に、第７及び第８のプローブに類似する塩基配列をもつクラドスポリウム属及びデビディエラ属以外のカビの検出を回避することを目的とする。
（９）第１３のプローブは、ユーロチウム（Ｅｕｒｏｔｉｕｍ）属及びそれに近縁のアスペルギルス属のカビを検出することを目的とする。
（１０）第１４のプローブは、第１３のプローブを使用する時に、第１３のプローブに類似する塩基配列をもつユーロチウム属及びそれに近縁のアスペルギルス属以外のカビの検出を回避することを目的とする。
（１１）第１５及び第１６のプローブは、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属のカビを検出することを目的とする。
（１２）第１７のプローブは、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属とヒポクレア（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）属のカビを検出することを目的とする。
（１３）第１８及び第１９のプローブは、第１７のプローブを使用する時に、第１７のプローブに類似する塩基配列をもつトリコデルマ属とヒポクレア属以外のカビの検出を回避することを目的とする。
（１４）第２０のプローブは、ワレミア（Ｗａｌｌｅｍｉａ）属のカビを検出することを目的とする。
（１２）第１７のプローブは、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属とヒポクレア（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）属のカビを検出することを目的とする。
（１３）第１８及び第１９のプローブは、第１７のプローブを使用する時に、第１７のプローブに類似する塩基配列をもつトリコデルマ属とヒポクレア属以外のカビの検出を回避することを目的とする。
（１４）第２０のプローブは、ワレミア（Ｗａｌｌｅｍｉａ）属のカビを検出することを目的とする。
そして、（１）〜（１４）の目的に基づいて、第１のプローブ、第２のプローブ、第４のプローブ、第５のプローブ、第７プローブ、第８のプローブ、第１３のプローブ、第１５〜第１７のプローブ及び第２０のプローブを、ＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate：蛍光色素）で標識する。また、第３のプローブ、第６のプローブ、第９〜第１２、第１４のプローブ、第１８のプローブ及び第１９のプローブを、ＦＩＴＣで標識しない。これにより、検出対象のカビのみが蛍光を発し、検出対象外のカビは蛍光を発しない。
ここで、上記第１〜第２０のプローブを標本に添加する手法について、具体的に説明する。
まず、上記第１〜第２０のプローブをハイブリダイゼーションバッファに混ぜたプローブ溶液を作製する。なお、上記ハイブリダイゼーションバッファの構成は、ＮａＣｌが０．９％、Ｔｒｉｓ‐Ｃｌが２０ｍＭ、formamideが３５％、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔが２％、ＳＤＳ（Sodium Dodecyl sulphate：界面活性剤）が０．０２％である。
まず、上記第１〜第２０のプローブをハイブリダイゼーションバッファに混ぜたプローブ溶液を作製する。なお、上記ハイブリダイゼーションバッファの構成は、ＮａＣｌが０．９％、Ｔｒｉｓ‐Ｃｌが２０ｍＭ、formamideが３５％、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔが２％、ＳＤＳ（Sodium Dodecyl sulphate：界面活性剤）が０．０２％である。
そして、上記プローブ溶液をマイクロチューブに入れ、カビを捕集したメンブレンフィルタを適当な大きさに裁断し、裁断したメンブレンフィルタをプローブ溶液の中に入れる。これにより、メンブレンフィルタの標本に上記第１〜第２０のプローブが添加される。
さらに、振とう機を使ってマイクロチューブを４６℃の温度下で、約２時間振とうさせる。これにより、標本に対する上記第１〜第２０のプローブの添加が促進される。そして、時間の経過とともに標本に含まれる検出対象のカビと第１のプローブ、第２のプローブ、第４のプローブ、第５のプローブ、第７プローブ、第８のプローブ、第１３のプローブ、第１５〜第１７のプローブ及び第２０のプローブとが結合する。また、検出対象外のカビと第３のプローブ、第６のプローブ、第９〜第１２、第１４のプローブ、第１８のプローブ及び第１９のプローブとが結合する。
さらに、振とう機を使ってマイクロチューブを４６℃の温度下で、約２時間振とうさせる。これにより、標本に対する上記第１〜第２０のプローブの添加が促進される。そして、時間の経過とともに標本に含まれる検出対象のカビと第１のプローブ、第２のプローブ、第４のプローブ、第５のプローブ、第７プローブ、第８のプローブ、第１３のプローブ、第１５〜第１７のプローブ及び第２０のプローブとが結合する。また、検出対象外のカビと第３のプローブ、第６のプローブ、第９〜第１２、第１４のプローブ、第１８のプローブ及び第１９のプローブとが結合する。
〔第８の工程〕
上記第７の工程が終了すると、次に第８の工程において、上記メンブレンフィルタをウォッシングバッファに浸し、メンブレンフィルタ上の未反応のプローブを洗浄する。（ステップＳ８）。
〔第９の工程〕
上記第８の工程が終了すると、次に第９の工程において、上記メンブレンフィルタを９９．５％のエタノールに１分間入れることでメンブレンフィルタを脱水し、その後に常温の空気中で乾燥させる（ステップＳ９）。
〔第１０の工程〕
上記第９の工程が終了すると、次に第１０の工程において、スライドガラス上にメンブレンフィルタを載せ、メンブレンフィルタ上の標本にベクターシールドを滴下し、その上に気泡がはいらないようカバーガラスを載せて、密着させる（ステップＳ１０）。
上記第７の工程が終了すると、次に第８の工程において、上記メンブレンフィルタをウォッシングバッファに浸し、メンブレンフィルタ上の未反応のプローブを洗浄する。（ステップＳ８）。
〔第９の工程〕
上記第８の工程が終了すると、次に第９の工程において、上記メンブレンフィルタを９９．５％のエタノールに１分間入れることでメンブレンフィルタを脱水し、その後に常温の空気中で乾燥させる（ステップＳ９）。
〔第１０の工程〕
上記第９の工程が終了すると、次に第１０の工程において、スライドガラス上にメンブレンフィルタを載せ、メンブレンフィルタ上の標本にベクターシールドを滴下し、その上に気泡がはいらないようカバーガラスを載せて、密着させる（ステップＳ１０）。
〔第１１の工程〕
上記第１０の工程が終了すると、次に第１１の工程において、蛍光顕微鏡にスライドガラスを取り付け、波長４９５ｎｍの青色の励起光をスライドガラス上のメンブレンフィルタに対して蛍光顕微鏡が照射する。すると、検出対象のカビに結合した第１のプローブ、第２のプローブ、第４のプローブ、第５のプローブ、第７プローブ、第８のプローブ、第１３のプローブ、第１５〜第１７のプローブ及び第２０のプローブは波長５２０ｎｍの緑色の蛍光を発光する。蛍光顕微鏡でメンブレンフィルタを見ると、緑色蛍光を発する検出対象のカビを見ることができる。そして、蛍光顕微鏡で撮影した標本の画像から、第１のプローブ、第２のプローブ、第４のプローブ、第５のプローブ、第７プローブ、第８のプローブ、第１３のプローブ、第１５〜第１７のプローブ及び第２０のプローブの蛍光に基づいて検出対象のカビを検出する（ステップＳ１１）。
上記第１０の工程が終了すると、次に第１１の工程において、蛍光顕微鏡にスライドガラスを取り付け、波長４９５ｎｍの青色の励起光をスライドガラス上のメンブレンフィルタに対して蛍光顕微鏡が照射する。すると、検出対象のカビに結合した第１のプローブ、第２のプローブ、第４のプローブ、第５のプローブ、第７プローブ、第８のプローブ、第１３のプローブ、第１５〜第１７のプローブ及び第２０のプローブは波長５２０ｎｍの緑色の蛍光を発光する。蛍光顕微鏡でメンブレンフィルタを見ると、緑色蛍光を発する検出対象のカビを見ることができる。そして、蛍光顕微鏡で撮影した標本の画像から、第１のプローブ、第２のプローブ、第４のプローブ、第５のプローブ、第７プローブ、第８のプローブ、第１３のプローブ、第１５〜第１７のプローブ及び第２０のプローブの蛍光に基づいて検出対象のカビを検出する（ステップＳ１１）。
以上のように、本実施形態では、標本にせん断力を付加することでカビの胞子または菌糸の周囲の色素層及び細胞壁を破損させ、さらにキチナーゼでカビの細胞壁を分解する。その上で、第１〜第２０のプローブを標本に添加する。そして、検出対象のカビに第１のプローブ、第２のプローブ、第４のプローブ、第５のプローブ、第７プローブ、第８のプローブ、第１３のプローブ、第１５〜第１７のプローブ及び第２０のプローブを結合させるとともに、第３のプローブ、第６のプローブ、第９〜第１２、第１４のプローブ、第１８のプローブ及び第１９のプローブを検出対象外のカビに結合させる。このようにすることで、第１のプローブ、第２のプローブ、第４のプローブ、第５のプローブ、第７プローブ、第８のプローブ、第１３のプローブ、第１５〜第１７のプローブ及び第２０のプローブを用いてカビ、すなわち身のまわりに存在するカビを簡単に検出することができるので、従来よりも効率よくカビを検出することができる。また、第３のプローブ、第６のプローブ、第９〜第１２、第１４のプローブ、第１８のプローブ及び第１９のプローブを用いることで、検出対象外のカビを検出対象のカビとして誤検出することを防ぐことができる。
以上、本発明の一実施形態について説明したが、本発明は上記実施形態に限定されることなく、例えば以下のような変形が考えられる。
（１）上記実施形態では、ろ過により試料からメンブレンフィルタ上にカビを捕集した後に、第５の工程において当該カビに対してせん断力を付加し、第６の工程においてチキナーゼを添加したが、本発明はこれに限定されない。
例えば、第２の工程が終了した後に、カビが含まれる試料とともに直径０．２５〜０．３ｍｍガラスビーズ０．１５０ｇを試験管に入れ、当該試験管を試験管用ミキサーで３０〜１２０秒間攪拌する。そして、試料にキチナーゼを添加する。その後、ガラスビーズは試験管の底に沈降するので、沈降したガラスビーズ以外の試料を使って第３の工程を実行するようにしてもよい。
（１）上記実施形態では、ろ過により試料からメンブレンフィルタ上にカビを捕集した後に、第５の工程において当該カビに対してせん断力を付加し、第６の工程においてチキナーゼを添加したが、本発明はこれに限定されない。
例えば、第２の工程が終了した後に、カビが含まれる試料とともに直径０．２５〜０．３ｍｍガラスビーズ０．１５０ｇを試験管に入れ、当該試験管を試験管用ミキサーで３０〜１２０秒間攪拌する。そして、試料にキチナーゼを添加する。その後、ガラスビーズは試験管の底に沈降するので、沈降したガラスビーズ以外の試料を使って第３の工程を実行するようにしてもよい。
（２）上記実施形態では、ＦＩＴＣを第１のプローブ、第２のプローブ、第４のプローブ、第５のプローブ、第７プローブ、第８のプローブ、第１３のプローブ、第１５〜第１７のプローブ及び第２０のプローブの蛍光色素として使用したが、本発明はこれに限定されない。
例えば、ＦＩＴＣの代わりに、Ｃｙ３を蛍光色素として使用してもよい。
例えば、ＦＩＴＣの代わりに、Ｃｙ３を蛍光色素として使用してもよい。
（３）上記実施形態では、第１〜第２０のプローブは、４種類の塩基「ａ（アデニン）」、「ｔ（チミン）」、「ｃ（シトシン）」及び「ｇ（グアニン）」から構成したが、本発明はこれに限定されない。当然ではあるが、「ｔ」は、「ｕ（ウラシル）」であってもよい。
（４）上記実施形態では、ＦＩＳＨ法に第１〜２０のプローブを用いたが、本発明はこれに限定されない。
例えば、ＰＣＲ（polymerase chain reaction）法、ＦＩＳＨ法以外のハイブリダイゼーション法及びＤＮＡチップに第１〜２０のプローブを用いてカビを検出するようにしてもよい。すなわち、本発明は、分子生物学的手法を用いたあらゆるカビ検出方法に適用することができる。
例えば、ＰＣＲ（polymerase chain reaction）法、ＦＩＳＨ法以外のハイブリダイゼーション法及びＤＮＡチップに第１〜２０のプローブを用いてカビを検出するようにしてもよい。すなわち、本発明は、分子生物学的手法を用いたあらゆるカビ検出方法に適用することができる。
（５）上記実施形態では、米からのカビの胞子検出を行ったが、本発明はこれに限定されない。
例えば、室内環境中のカビ胞子の測定や、ふき取り検査により食物や壁から採取したカビの胞子や菌糸の検出同定にも用いることができる。
例えば、室内環境中のカビ胞子の測定や、ふき取り検査により食物や壁から採取したカビの胞子や菌糸の検出同定にも用いることができる。
Ａ，Ｂ…せん断力付加装置、１…上部挟圧片、２…下部挟圧片、１ａ…柄部、１ｂ…摘み部、２ａ…柄部、２ｂ…摘み部、１０…下部支持板、１１…支柱、１２…上部支持板、１３…下部挟圧片、１４…上部挟圧片、１５…押圧用ネジ、１６…ハンマ（挟圧片変動部）
Claims (20)
- 分子生物学的手法を用いてカビを検出するカビ検出方法であって、
カビにせん断力を付加することで前記カビの色素層及び細胞壁を破損させ、その後に「ｃｇｇ ｃｇｔ ｃｔｃ ｔａｇ ａａａ ｃｃａ（１８）」の塩基配列を有する第１のプローブを用いてアルテルナリア（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）属のカビを検出することを特徴とするカビ検出方法。 - カビとともにビーズを収容器に入れ、当該収容器内を攪拌することでカビにせん断力を付加することを特徴とする請求項１に記載のカビ検出方法。
- カビとともにビーズを収容器に入れ、棒で前記カビ及び前記ビーズを押し付けながらかき混ぜることでカビにせん断力を付加することを特徴とする請求項１に記載のカビ検出方法。
- せん断力付加装置によって前記カビにせん断力を付加することを特徴とする請求項１に記載のカビ検出方法。
- 前記せん断力付加装置は、ピンセット形状をしており、対向する１対の挟圧片の間に配置されたカビを挟み込みながらカビに圧力を付加するとともに圧力方向に対して略垂直方向にずらすことを特徴とする請求項４に記載のカビ検出方法。
- 前記せん断力付加装置は、カビを所定の圧力で挟む一対の挟圧片と、圧力方向に対して略垂直方向に前記挟圧片のいずれか一方をずらす挟圧片変動部を具備することを特徴とする請求項４に記載のカビ検出方法。
- カビにせん断力を付加した後、当該カビが含まれる標本に細胞壁を分解する分解酵素を添加することを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載のカビ検出方法。
- 「ａｇｔ ｃｇｔ ｔｇｃ ｃａａ ｃｔｃ ｃｃｃ（１８）」の塩基配列を有する第２のプローブを用いてカビの１つであるアスペルギルス フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）を検出することを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載のカビ検出方法。
- 前記第２のプローブを用いてアスペルギルス フミガタスを検出し、「ｇｇｔ ｃｇｔｔｇｃ ｃａａ ｃｔｃ ｃｃｃ（１８）」の塩基配列を有する第３のプローブを用いてアスペルギルス フミガタス以外のカビの検出を回避することを特徴とする請求項８に記載のカビ検出方法。
- 「ｇｃｃ ａｔｇ ａｇａ ｔｔｃ ｃｃｃ ａｇａ（１８）」の塩基配列を有する第４のプローブを用いてカビの１つであるアスペルギルス ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）を検出することを特徴とする請求項１〜９のいずれか一項に記載のカビ検出方法。
- 「ｃｇｃ ｔｇａ ｔｇａ ｃｇｔ ａｃｇ ｃｔｔ（１８）」の塩基配列を有する第５のプローブを用いてオーレオバシジウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｒｎ）属のカビを検出することを特徴とする請求項１〜１０のいずれか一項に記載のカビ検出方法。
- 前記第５のプローブを用いてオーレオバシジウム属のカビを検出し、「ｃｇｃ ｔｇａｔｇａ ｃｇｔ ａｃｔ ｃｔｔ（１８）」の塩基配列を有する第６のプローブを用いてオーレオバシジウム属以外のカビの検出を回避することを特徴とする請求項１１に記載のカビ検出方法。
- 「ｃｃｇ ａａｃ ｇｇｇ ｔｃａ ａａａ ｔａｃ（１８）」の塩基配列を有する第７のプローブと、「ｃｃｇ ａｇｃ ｇｇｇ ｔｃａ ａａａ ｔａｃ（１８）」の塩基配列を有する第８のプローブとを用いてクラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）属及びデビディエラ（Ｄａｖｉｄｉｅｌｉａ）属のカビを検出することを特徴とする請求項１〜１２のいずれか一項に記載のカビ検出方法。
- 前記第７のプローブ及び前記第８のプローブを用いてクラドスポリウム属及びデビディエラ属のカビを検出し、「ｃｃｇ ａａｃ ｇｇｇ ｔｃａ ａａａ ｔａｔ（１８）」
の塩基配列を有する第９のプローブと、「ｃｃｇ ａａｃ ｇｇｇ ｔｃａ ａａａ ｔ
ａａ（１８）」の塩基配列を有する第１０のプローブと、「ｃｃｇ ａａｃ ｇｇｇ ｔ
ｃａ ａａａ ｔａｇ（１８）」の塩基配列を有する第１１のプローブと、「ｃｃｇ ａ
ｇｃ ｇｇｇ ｔｃａ ａａａ ｔａａ（１８）」の塩基配列を有する第１２のプローブ
とを用いてクラドスポリウム属及びデビディエラ属以外のカビの検出を回避することを特
徴とする請求項１３に記載のカビ検出方法。 - 「ｃｃｇ ａｇｃ ｇｇｇ ｔｃａ ｔｔａ ｔａｇ（１８）」の塩基配列を有する第１３のプローブを用いてユーロチウム（Ｅｕｒｏｔｉｕｍ）属及びそれに近縁のアスペルギルス属のカビを検出することを特徴とする請求項１〜１４のいずれか一項に記載のカビ検出方法。
- 前記第１３のプローブを用いてユーロチウム属及びそれに近縁のアスペルギルス属のカビを検出し、「ｃｃｇ ａｇｃ ｇｇｇ ｔｃａ ｔｃａ ｔａｇ（１８）」の塩基配列を有する第１４のプローブを用いてユーロチウム属及びそれに近縁のアスペルギルス属以外のカビの検出を回避することを特徴とする請求項１５に記載のカビ検出方法。
- 「ａａｃ ａｃｇ ｃｃｃ ａａｔ ｃｔｃ ｔａｇ ｔｃ（２０）」の塩基配列を有する第１５のプローブと、「ａａｃ ａｃｔ ｃｃｃ ａａｔ ｃｔｃ ｔａｇ ｔｃ（２０）」の塩基配列を有する第１６のプローブとを用いてリゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属のカビを検出することを特徴とする請求項１〜１６のいずれか一項に記載のカビ検出方法。
- 「ｇｃｃ ｔｇｔ ｃｇａ ｔｔｃ ｇａｃ ｔａｇ ｔｔ（２０）」の塩基配列を有する第１７のプローブを用いてトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属及びヒポクレア（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）属のカビを検出することを特徴とする請求項１〜１７のいずれか一項に記載のカビ検出方法。
- 前記第１７のプローブを用いてトリコデルマ属及びヒポクレア属のカビを検出し、「ｇ
ｃｃ ｔｇｔ ｃｇａ ｔｔｃ ｇａｃ ｃａｇ ｔｔ（２０）」の塩基配列を有する第
１８のプローブと、「ｇｃｃ ｔｇｔ ｃｇａ ｔｔｃ ｇａｃ ａａｇ ｔｔ（２０）
」の塩基配列を有する第１９のプローブとを用いてトリコデルマ属及びヒポクレア属以外
のカビの検出を回避することを特徴とする請求項１８に記載のカビ検出方法。 - 「ｃｃｃ ｃｃｔ ａａｇ ｃｃｃ ａａａ ａａｃ ｔｔ（２０）」の塩基配列を有する第２０プローブを用いてワレミア（Ｗａｌｌｅｍｉａ）属のカビを検出することを特徴とする請求項１〜１９のいずれか一項に記載のカビ検出方法。
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